基于適體修飾多孔氧化鋁膜的李斯特菌高靈敏檢測新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用靶分子與其適體之間的特異性識別的性質(zhì)，構(gòu)建的基于納米通道限域特性的單核增生李斯特菌快速超靈敏檢測器。本發(fā)明還涉及將經(jīng)單核增生李斯特菌的DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜作為電極，組裝自制電解池；鐵氰化鉀離子作為探針離子，對單核增生李斯特菌進(jìn)行檢測的方法。當(dāng)LM存在且濃度較低時，電流升高值隨其濃度的增加顯著下降；隨LM濃度的增加，電流變化值下降；LM濃度在100?1250CFU/mL范圍內(nèi)時，與電流升高值之間呈線性關(guān)系；當(dāng)其濃度大于1500CFU/mL時，電流變化值趨于穩(wěn)定。因此，該檢測方法對LM的最低檢測限可達(dá)100CFU/mL，線性范圍100?1250CFU/mL，可在10分鐘內(nèi)完成檢測。經(jīng)108CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對照實驗，表明其對李斯特菌具有高度選擇性。
【專利說明】
基于適體修飾多孔氧化鋁膜的李斯特菌高靈敏檢測新方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用靶分子與其適體之間的特異性識別的性質(zhì)，構(gòu)建的基于納米 通道限域特性的單核增生李斯特菌超靈敏檢測器。本發(fā)明還涉及將經(jīng)單核增生李斯特菌的 DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜作為電極，組裝自制電解池;鐵氰化鉀離子作為探針離子，對 單核增生李斯特菌進(jìn)行快速、靈敏檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增生李斯特菌(學(xué)名：Listeria monocytogenes)，是一種兼性厭氧細(xì)菌， 為李斯特菌癥的病原體;是革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門。單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下均簡 稱LM)是一種人畜共患病的病原菌。它與大腸桿菌0157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌一起 被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性致病菌。李斯特菌病就是由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起 的一種罕見卻嚴(yán)重的疾病。這種病原菌能在正常的烹飪溫度下被殺死，也能在冷藏溫度低 至〇°C的條件下緩慢生長。大多數(shù)健康的人可能會發(fā)生沒有表現(xiàn)出臨床癥狀但被感染李斯 特菌的情況，但是一些易感人群，例如孕婦、老年人和免疫力低下的人(如艾滋病患者、糖尿 病患者等），會面臨十分嚴(yán)重的健康危險。食品中的LM的存在可能是源于其成分(特別是原 材料)或者來自于周圍的環(huán)境，包括設(shè)備，成品和原材料之間的交叉污染。如果在溫度等環(huán) 境條件，尤其是酸度和水分含量的允許下，LM可以通過長期貯存的過程大量繁殖生長。LM的 生長對于環(huán)境的要求不高，不管有氧還是缺氧的環(huán)境都可以；其生長的溫度范圍比較廣范， 但是它的最適生長溫度為37°C，在4°C時生長就比較緩慢，-18°C時可以存活;耐高鹽且耐酸 性強(qiáng):20%的氯化鈉、pH值的范圍為4.4~9.6的條件下都可以生長;在氧分壓略低、二氧化 碳壓力略高的條件下生長良好。這些性質(zhì)導(dǎo)致了 LM在自然環(huán)境中幾乎無處不在。因為LM是 最致命的食源性病原菌之一，可以造成20~30%的臨床感染者死亡，所以，對LM的檢測有很 大的必要性。
[0003] 目前，LM的檢測方法有很多，可以分為以下幾種:①傳統(tǒng)的分離與鑒定的方法;② 顯色培養(yǎng)基的快速鑒定技術(shù);③全自動微生物分析系統(tǒng)④分子生物學(xué)的方法;⑤免疫學(xué)方 法等。食品中的李斯特菌的傳統(tǒng)檢測方法有3個主要環(huán)節(jié):增菌、分離、鑒定，整個過程中有 一系列的生化反應(yīng)和其它實驗。這個方法不僅耗時還特別繁瑣。顯色培養(yǎng)基的快速鑒定技 術(shù)則是針對LM的葡萄糖苷酶和毒力因子。全自動微生物分析系統(tǒng)是微生物檢測的發(fā)展方向 之一，它的過程則比較簡單、便捷，且準(zhǔn)確率比較高。然而在LM的檢測過程中，如果被檢測樣 品中的目標(biāo)細(xì)菌的數(shù)量比較少，這使得檢測有一定的難度。通過人們的努力，基于核酸基礎(chǔ) 的分子生物學(xué)檢測方法出現(xiàn)了。這個方法通過擴(kuò)增少量目標(biāo)細(xì)菌的特定基因信號而完成檢 測，可以達(dá)到李斯特菌屬或種的水平上的檢測。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在食品檢測中的應(yīng)用 使得它不僅可以利用DNA分子，還可以用RNA分子。這些探針試劑盒的檢測速度快且檢測結(jié) 果準(zhǔn)確。免疫學(xué)的檢測方法是基于抗體對于抗原之間的自然親和力，但這個檢測方法所需 要的樣品是必須經(jīng)過純化才能準(zhǔn)確的檢測出LM。然而它和PCR檢測相比，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 檢測結(jié)果更加容易受樣品的影響。這種檢測方法是很快速和準(zhǔn)確的，且操作過程比較簡單。 不過，它的不足就是靈敏度低、特異性差。因此，希望研究出一種對于LM的檢測更加準(zhǔn)確、更 加靈敏和更加便捷的方法。
[0004] 新興的納米材料因其特殊性質(zhì)被關(guān)注而加以運(yùn)用。張廣騰等人利用金納米顆粒的 玻碳電極固定巰基修飾的DNA探針于其表面，制備了檢測LM的電化學(xué)生物傳感器。這個方法 的最低檢出限達(dá)到了 1.0乂1(^12111〇1/1(0嫩濃度計）。鐘子清等人利用經(jīng)表面修飾的納米免 疫磁珠對檢樣中的LM進(jìn)行富集，在磁場作用下被吸附分離以消除干擾因素;從而提高了檢 測靈敏度，達(dá)到高檢出率并縮短了檢測時間。本發(fā)明使用經(jīng)LM適體修飾的多孔氧化鋁膜納 米材料作電極，對LM進(jìn)行電化學(xué)檢測。
[0005] 金屬鋁化學(xué)性質(zhì)活潑，易被氧化而在鋁表面形成一層致密的氧化鋁膜層。氧化鋁 膜層較穩(wěn)定，能防止內(nèi)部的鋁繼續(xù)被氧化，對鋁起到保護(hù)作用。經(jīng)研究，氧化鋁膜層是納米 多孔結(jié)構(gòu)，能夠保持固定的形狀和結(jié)構(gòu)特征。將鋁加入一些酸性介質(zhì)中作為陽極進(jìn)行電化 學(xué)反應(yīng)，生成多孔氧化錯膜，又稱多孔陽極氧化錯膜(porous aluminium oxide film，簡稱 PAA膜hPAA膜具有六角的微孔，形成特別的、自組織的高度有序的納米陣列結(jié)構(gòu);這些微孔 垂直于鋁基體。微孔的直徑隨著陽極氧化條件的變化發(fā)生改變。根據(jù)不一樣的氧化條件，微 孔的直徑可以在10~500nm之間變化。隨著人們對PAA膜的微觀結(jié)構(gòu)和性能的了解和認(rèn)識， PAA膜逐漸被大量用作傳感器材料、分離膜材料、抗菌膜材料、催化材料、光學(xué)及光電元件、 磁性記錄材料等等。本發(fā)明使用PAA膜作電化學(xué)檢測中的傳感器基體元件。
[0006] 適配體傳感器是生物傳感器的一種。生物傳感器涵蓋了生物、化學(xué)和信號處理等 技術(shù)，具有高度的特異性、準(zhǔn)確度和精密度。它分為很多種類:適配體傳感器、微生物傳感 器、免疫傳感器和酶傳感器等等。在食品的安全檢測方面，適配體傳感器的應(yīng)用越來越被人 們關(guān)注了。本發(fā)明使用適配體傳感器進(jìn)行實驗。適體是一段單鏈DNA或者RNA寡聚核苷酸鏈， 能夠特異性結(jié)合具有高親和力的靶細(xì)胞。與抗體相比，適體具有極大的潛力。高親和力的抗 體的生產(chǎn)是昂貴且費(fèi)時的。因此，對于任何一個目標(biāo)分子的抗體的制備都是不容易的。但親 和力高，特異性高，穩(wěn)定性高，簡單的標(biāo)記，PCR定向擴(kuò)增核酸和低成本生產(chǎn)等都是適體相對 于抗體的優(yōu)勢方面。在對目標(biāo)分子的進(jìn)行識別的過程中，核酸適體有比較明確的三維結(jié)構(gòu)。 自從1990年第一個適體被發(fā)現(xiàn)后，不同類型的適體已經(jīng)在體外進(jìn)行了評估，有蛋白質(zhì)、毒 素、ATP，甚至病毒和細(xì)胞表面標(biāo)志。因此，由于其高度的選擇性和靈敏度，基于幾乎所有類 型的適體的生物傳感器和納米生物傳感器已被廣泛研究。本發(fā)明中所使用的適體是DNA適 體。它是一段DNA單核苷酸鏈，有47個氨基，其中"5' "端修飾了一個醛基（5' -CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3')以便于將其固定在多 孔氧化鋁膜的納米通道內(nèi)表面。此適體可以通過體外人工合成、方法簡單;可以進(jìn)行靶向識 另IJ;與LM有高度的親和力;有極高的選擇性。這也是適配體傳感器一個重要的優(yōu)勢。因此，本 發(fā)明方法能準(zhǔn)確，簡單，高度適宜地檢測LM。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及基于納米通道限域特性的單核增生李斯特菌超靈敏檢測器，制備該檢 測器的方法，以及該檢測器對單個單核增生李斯特菌進(jìn)行檢測的用途。
[0008] 一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)單核增生李斯特菌的DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜電極， 其中所述多孔氧化鋁膜電極為表面經(jīng)單核增生李斯特菌的DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜， 并且在其另一面鍍金。具體地，所述多孔氧化鋁膜的孔徑為20nm。更具體地，所述DNA適體是 DNA單核苷酸鏈，有47個氨基，其中"5〃'端修飾了一個醛基(5Y-CH0-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3')。另外，更具體地，所述鍍金是通過使 用真空離子濺射儀實現(xiàn)的。
[0009] 另一方面，本發(fā)明提供了制備上述多孔氧化鋁膜電極的方法，所述方法包括：（1) 將多孔氧化鋁膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修飾官能團(tuán)；（2)用真空離子濺射儀在多孔氧化鋁 膜一面鍍金、過塑制成膜電極；（3)將與單核增生李斯特菌特異性結(jié)合的適體修飾在多孔氧 化鋁膜的通道內(nèi)表面上。具體地，所述多孔氧化鋁膜的孔徑為20nm。更具體地，在步驟（1) 中，使用30%的過氧化氫來修飾羥基;使用3-氨丙基三乙氧基硅烷來修飾氨基。在步驟(3) 中，所使用的適體是DNA單核苷酸鏈，有47個氨基，其中"5'"端修飾了一個醛基(5' -CH0-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-37)〇
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供了基于納米通道限域特性的單核增生李斯特菌超靈敏檢測 器，其包括上述多孔氧化鋁膜電極和電解池，其中所述電解池含有磷酸二氫鈉與磷酸氫二 鈉配制的pH值為7的PBS緩沖溶液，以及作為探針離子的鐵氰化鉀離子。具體地，所述PBS緩 沖溶液的濃度為ImM;鐵氰化鉀離子的濃度為更優(yōu)選為ImM。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供了上述多孔氧化鋁膜電極在定性檢測樣品中的單核增生李 斯特菌的用途。具體地，該樣品中還可任選含有金黃色葡萄球菌(低于108CFU/mL)和大腸桿 菌(低于 108CFU/mL)。
[0012] 另一方面，本發(fā)明還提供了上述檢測器在定量檢測樣品中的單核增生李斯特菌的 用途。具體地，該樣品中還可任選含有金黃色葡萄球菌(低于108CFU/mL)和大腸桿菌(低于 108CFU/mL)〇
[0013] 本發(fā)明通過研究基于納米通道限域特性的李斯特菌檢測技術(shù)，利用經(jīng)LM適體修飾 的多孔氧化鋁膜作電極組裝自制電解池對單核增生李斯特菌進(jìn)行定量檢測。從實驗得出， 基于納米限域空間的電化學(xué)檢測方法用來檢測樣液中的單核增生李斯特菌是可行的。
[0014] 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和LM的濃度為108CFU/mL。如附圖所示，檢測高濃度的 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌而產(chǎn)生的電流變化值與LM的電流變化值有顯著差異，能夠明確 地分辨出來。如上，本發(fā)明用的LM適體有很高的選擇性，當(dāng)樣品中存在大量的金黃色葡萄球 菌、大腸桿菌的情況下，仍對LM的檢測也沒影響。
【附圖說明】
[0015] 圖1是適體修飾的多孔氧化鋁膜檢測LM的原理示意圖。
[0016] 圖2是LM適體修飾在多孔氧化鋁膜表面的示意圖。
[0017] 圖3是多孔氧化鋁膜(PAA)的掃描電子顯微鏡SEM圖。
[0018] 圖4是適體修飾的多孔氧化鋁膜檢測LM的實驗結(jié)果。（a)不同濃度LM的電流響應(yīng)曲 線；（b)電流升高值隨LM濃度變化曲線圖，由圖4(a)中的電流響應(yīng)曲線整理得出。
[0019] 圖5是金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(E.coli)和LM的對照電流實驗圖。（a)不同 類型菌的電流響應(yīng)曲線；（b)不同類型菌電流升高值的變化圖，由圖5(a)中的電流響應(yīng)曲線 整理得出。
[0020] 圖6是金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(E.coli)和LM的對照SEM圖。（a)對照實驗； (b)103CFU/mL LM;(c)108CFU/mL E.coli;(d)108CFU/mL SA。
【具體實施方式】
[0021] 下面，將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的 描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā) 明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實 施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022] 需要說明的是，在本文中，術(shù)語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排 他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而 且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有 的要素。
[0023] 1材料與方法
[0024] 1.1材料與儀器
[0025]表 1
[0027]表 2

[0030] 金片、電爐、PET膜、2mm的手握式打孔器、高壓滅菌鍋、（Varioskan Flash)全自動 酶標(biāo)儀等。實驗用水均為超純水（> 18.2M Ω，Mi 11 ipore France)。1^適體在"5' "端修飾有 一個醛基官能團(tuán)。電解池中所用緩沖溶液為磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配制的PBS緩沖溶液， pH值為7.0 〇 [0031] 1.2實驗方法
[0032]本發(fā)明中運(yùn)用了適體與單核增生李斯特菌的特異性結(jié)合與電化學(xué)檢測。首先，用 PAA膜制備金電極。將孔徑為20nm的多孔氧化鋁膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修飾官能團(tuán)。然 后，用真空離子濺射儀在多孔氧化鋁膜一面鍍金、過塑制成膜電極;再修飾LM適體于納米孔 徑內(nèi)表面。將制備好的單核增生李斯特菌的菌懸液加入自制電解池內(nèi)與安裝好的膜電極反 應(yīng)，進(jìn)行檢測。
[0033]圖1所示為適體修飾的多孔氧化鋁膜檢測LM的原理。在自制電解池中，進(jìn)樣池中的 鐵氰化鉀離子能夠通過納米通道從而到達(dá)檢測池這面的金膜上，使得高價鐵被還原，產(chǎn)生 電流。李斯特菌的存在時，李斯特菌與適體特異性結(jié)合而附在PAA膜表面上，阻礙了鐵氰化 鉀離子通過納米通道，這就使得產(chǎn)生的電流的大小發(fā)生變化。因為納米通道的孔徑為20nm， 而單核增生李斯特菌的大小為0.4~0.5μπιΧ 0.5~2. Ομπι; LM則附在PAA膜表面，造成LM本身 堵塞納米孔道使鐵氰化鉀離子通過納米通道的數(shù)量會下降。其次，在LM周圍形成的負(fù)電場 (LM表面存在磷酸和羧酸等基團(tuán)，導(dǎo)致LM帶-14.2mV的表面電荷)與鐵氰化鉀離子相互作用 使得其附近的納米通道傳輸鐵氰化鉀離子的量也減少。由此，我們就可以通過利用基于納 米材料的電化學(xué)適配體傳感器來對單核增生李斯特菌進(jìn)行定量檢測。
[0034] 1.2.1多孔氧化鋁膜電極的制備
[0035] 圖2所示的LM適體修飾的多孔氧化鋁膜電極的制備，其具體步驟如下：
[0036] (1)清洗:取一片PAA膜于10mL小燒杯內(nèi)。在通風(fēng)櫥中用丙酮清洗PAA膜3-4次，用時 約5min，結(jié)束后用超純水清洗。
[0037] (2)修飾羥基:在燒杯中加入10mL的30 %的過氧化氫溶液，在電爐上煮沸。保持微 沸狀態(tài)30min，倒掉燒杯內(nèi)剩余的過氧化氫溶液，用超純水清洗PAA膜。
[0038] (3)修飾氨基:在(2)中的燒杯里分別加入0.5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 和9.5mL的丙酮。保鮮膜封口，放進(jìn)干燥器中靜置24h。
[0039] (4)干燥：在通風(fēng)櫥內(nèi)用丙酮浸洗PAA膜4-5次，約5min，除去殘余的未結(jié)合的 APTES。然后用超純水清洗，將清洗干凈的PAA膜用氮?dú)獯蹈伞?br>[0040] (5)鍍金：吹干的PAA膜用真空離子濺射儀在其一面上鍍金。鍍金條件：電流為 10mA，時間200s。需要注意的是，區(qū)分鍍金面和未鍍金面。
[00411 (6)封塑：用打孔器在PET膜上打一個直徑2mm的圓孔。將PAA膜夾在PET膜中間，使 圓孔位于PAA膜中間位置。細(xì)長的金導(dǎo)線放在PAA膜的鍍金面邊上，與膜重疊。用過塑機(jī)封 塑，剪去多余部分。PAA膜電極制成待用。
[0042] 1.2.2 LM適體溶液的配制與修飾
[0043] LM適體使用前需要離心，離心條件:轉(zhuǎn)速5000r/min，時間5min。然后在10D的LM適 體中加入200yL的0.1M PBS (pH = 7.0)溶液，配制成1 ΟμΜ的溶液。將電解池組裝好(鍍金面朝 著檢測池，未鍍金面是進(jìn)樣池）。在進(jìn)樣池和檢測池里分別加入2.5mL的PBS緩沖溶液，靜置 半小時。吸去緩沖溶液，將電解池豎立起來，進(jìn)樣池在上面。接著，在進(jìn)樣池和PAA膜接觸的 面上滴幾滴DNA適體溶液(注意排掉接觸面的空氣）。將其放在密閉空間里24小時，旁邊放半 杯水以防LM適體溶液揮發(fā)。修飾好LM適體的PAA膜保存于4°C的PBS溶液中。
[0044] 1.2.3 LM、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液的制備
[0045] 李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)。用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)進(jìn)行LM培養(yǎng)，培養(yǎng)液配制為:3.6g(TSB-YE)/100mL;而大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均用 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液配制為：1.9g/100mL。接種后在生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。將 培養(yǎng)好的菌液各取lmL分別進(jìn)行稀釋(0.85的滅菌生理鹽水），稀釋至實驗用細(xì)菌濃度，待 用。然后用酶標(biāo)儀測菌液的0D600值，同時用相應(yīng)的菌液進(jìn)行平板計數(shù)法數(shù)菌落數(shù)，得出 0D600值與細(xì)菌濃度的關(guān)系圖，以便下次使用。
[0046] 1.2.4檢測方法
[0047] (1)空白實驗：修飾有LM適體的PAA膜在自制電解池中通過電化學(xué)工作站進(jìn)行檢 測。電解池兩邊所加電勢為0V。
[0048] (2)對照實驗:將制好的大腸桿菌菌懸液加入進(jìn)樣池里，檢測池空著。靜置半小時， 注意排除菌液與PAA膜接觸面的氣體。用超純水清洗電解池，進(jìn)行檢測。金黃色葡萄球菌的 檢測與大腸桿菌步驟相同。
[0049] (3)李斯特菌的檢測:將制備好的李斯特菌菌懸液加入進(jìn)樣池，從低濃度到高濃度 依次進(jìn)行檢測。每個濃度的菌懸液都要同（2)中一樣加入進(jìn)樣池靜置半小時，清洗干凈，再 檢測。各個菌懸液的濃度用平板菌落計數(shù)法進(jìn)行測定。
[0050] 2結(jié)果與討論
[0051] 2.1多孔氧化鋁膜的結(jié)構(gòu)
[0052]圖3是PAA膜的掃描電子顯微鏡(SEM)圖片，為高度有序的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑尺寸約為 20nm〇
[0053] 2.2單核增生李斯特菌的檢測
[0054]在優(yōu)化的條件下，配制ImM濃度的roS溶液和鐵氰化鉀溶液。李斯特菌菌懸液按濃 度梯度由低到高依次進(jìn)行檢測。將其加入進(jìn)樣池中，室溫下靜置l〇min。清洗干凈，進(jìn)行檢 測，結(jié)果如圖4所示。
[0055] 由圖4(a)得出結(jié)論：電流隨時間先快速升高，到達(dá)峰值，再下降至趨于穩(wěn)定。電流 變化值隨LM濃度的增大而變小。鐵氰化鉀通過PAA膜的納米通道到達(dá)金膜上，鐵氰化鉀離子 被金還原產(chǎn)生電流;而鐵氰化鉀離子通過納米通道到達(dá)金膜的速度先增加到峰值然后慢慢 下降至穩(wěn)定。LM濃度變大，PAA膜上附著的LM越多，納米通道傳輸?shù)蔫F氰化鉀離子越少。圖4 (b)是電流升高值隨LM濃度變化曲線圖，由圖4(a)中的電流響應(yīng)圖整理得出。當(dāng)LM存在且濃 度較低時，電流升高值隨其濃度的增加顯著下降；隨LM濃度的增加，電流變化值下降；LM濃 度在100-1250CFU/mL范圍內(nèi)時，與電流升高值之間呈線性關(guān)系；當(dāng)其濃度大于1500CFU/mL 時，電流變化值趨于穩(wěn)定。因此，該檢測方法對LM的最低檢測限可達(dá)100CFU/mL，線性范圍 100-1250CFU/mL，可在10分鐘內(nèi)完成檢測。
[0056] 2.3對照實驗
[0057]在優(yōu)化的實驗條件下，配制相應(yīng)濃度的PBS溶液和鐵氰化鉀溶液。依次在進(jìn)樣池中 加入制好的大腸桿菌菌懸液和金黃色葡萄球菌菌懸液。室溫下靜置半小時。清洗干凈，然后 進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖所示：圖5是金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(E.coli)和LM的對照 實驗圖。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和LM的濃度為108CFU/mL。由圖得，檢測高濃度的金黃色 葡萄球菌和大腸桿菌而產(chǎn)生的電流變化值與LM的電流變化值有顯著差異，能夠明確地分辨 出來。這說明本實驗用的LM適體有很高的選擇性，當(dāng)樣品中存在大量的金黃色葡萄球菌、大 腸桿菌，仍對LM的檢測也沒影響。
[0058]圖6是LM適體修飾的PAA膜在不同菌液中浸泡后的SEM圖。圖6(a)為空白對照，圖6 (b)、圖6(c)和圖6(d)是經(jīng)LM適體修飾的PAA膜分別在103CFU/mL李斯特菌、108CFU/mL大腸 桿菌和108CFU/mL金黃色葡萄球菌溶液中浸泡后的SEM圖。圖6(a)、圖6(b)、圖6(c)、圖6(d) 與圖5相對應(yīng)，從而驗證了圖5所得結(jié)論。
[0059] 3結(jié)論
[0060]本發(fā)明通過研究基于納米通道限域特性的單個李斯特菌檢測技術(shù)，利用經(jīng)LM適體 修飾的多孔氧化鋁膜作電極組裝自制電解池對單核增生李斯特菌進(jìn)行定性檢測。從實驗得 出，基于納米限域空間的電化學(xué)檢測方法用來檢測樣液中的單個單核增生李斯特菌是可行 的。這種方法對LM的檢測不僅有高度的親和力和選擇性，還有很高的靈敏度。當(dāng)LM存在且濃 度較低時，電流升高值隨其濃度的增加顯著下降；隨LM濃度的增加，電流變化值下降；LM濃 度在100-1250CFU/mL范圍內(nèi)時，與電流升高值之間呈線性關(guān)系；當(dāng)其濃度大于1500CFU/mL 時，電流變化值趨于穩(wěn)定。因此，該檢測方法對LM的最低檢測限可達(dá)100CFU/mL，線性范圍 100-1250CFU/mL，可在10分鐘內(nèi)完成檢測。這說明本實驗采用的方法對LM的檢測的顯著優(yōu) 點是高靈敏度和選擇性，其次是操作簡捷，省時，成本低廉。
【主權(quán)項】
1. 經(jīng)單核增生李斯特菌的DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜電極，其中所述多孔氧化鋁膜 電極為表面經(jīng)單核增生李斯特菌的DNA適體修飾的多孔氧化鋁膜，并且在其電極的外側(cè)面 鍍金。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多孔氧化鋁膜電極，其中所述多孔氧化鋁膜的孔徑為20nm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的多孔氧化鋁膜電極，其中所述DNA適體是DNA單核苷酸鏈，有47 個氨基，其中 "5"'端修飾了一個醛基（S'-CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3,）。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的多孔氧化鋁膜電極，所述鍍金是通過使用真空離子濺 射儀實現(xiàn)的。5. 制備權(quán)利要求1的多孔氧化鋁膜電極的方法，所述方法包括： 步驟(1):將多孔氧化鋁膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修飾官能團(tuán)； 步驟(2):用真空離子濺射儀在多孔氧化鋁膜一面鍍金、過塑制成膜電極； 步驟(3):將與單核增生李斯特菌特異性結(jié)合的適體修飾在多孔氧化鋁膜的納米通道 表面上。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述多孔氧化鋁膜的孔徑為20nm。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中，在步驟（1)中，使用30%的過氧化氫來修飾羥基;使 用3-氨丙基三乙氧基硅烷來修飾氨基。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項的方法，在步驟(3)中，所使用的適體是DNA單核苷酸鏈， 有47個氨基，其中 "5"'端修飾了一個醛基（5'CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3,）。9. 基于納米通道限域特性的單核增生李斯特菌超靈敏檢測器，其包括權(quán)利要求1-4中 任一項的多孔氧化鋁膜電極和電解池，其中所述電解池含有磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配制 的pH值為7的PBS緩沖溶液，以及作為探針離子的鐵氰化鉀離子。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的檢測器，所述PBS緩沖溶液的濃度為ImM;鐵氰化鉀離子的濃度為 lmM〇11. 根據(jù)權(quán)利要求1-4的多孔氧化鋁膜電極在定量檢測樣品中的單核增生李斯特菌的 用途。12. 根據(jù)權(quán)利要求11的用途，該樣品中還可任選含有低于108CFU/mL的金黃色葡萄球菌 和低于10 8CFU/mL的大腸桿菌。13. 根據(jù)權(quán)利要求9或10的檢測器在定量檢測樣品中的單核增生李斯特菌的用途。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的用途，該樣品中還可任選含有低于108CFU/mL的金黃色葡萄球菌 和低于10 8CFU/mL的大腸桿菌。
【文檔編號】G01N27/26GK106018508SQ201610333218
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】李承勇, 周濃, 周春霞, 王娟
【申請人】廣東海洋大學(xué)