一種測定胰島素的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定胰島素的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：Tris緩沖液、聚乙二醇?8000、吐溫?20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白，試劑R2：Tris緩沖液、氯化鈉、疊氮鈉、牛血清白蛋白、膠乳包被抗胰島素抗體。制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合；用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的胰島素的濃度。本發(fā)明具有檢測準(zhǔn)確度高等優(yōu)點。
【專利說明】
一種測定胰島素的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定胰島素的試劑盒及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島0細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)，例如葡萄糖、乳糖、核糖、 精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的 激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。
[0003] 1型糖尿病患者在確診糖尿病之前，大部分患者胰島0細(xì)胞發(fā)生自身免疫性破壞， 導(dǎo)致餐時和基礎(chǔ)胰島素分泌均減少，2型糖尿病患者胰島0細(xì)胞功能異常進展緩慢，常表現(xiàn) 為外周胰島素抵抗，因此胰島素的檢測對于糖尿病患者的診斷和分型以及治療的監(jiān)測均有 著重要的意義。
[0004] 目前，胰島素的檢測方法有免疫電泳法、免疫沉淀法、放射免疫法等，免疫電泳法和 免疫沉淀法操作繁瑣，需要特殊的儀器和專業(yè)的操作，對技術(shù)人員要求較高，不適合臨床快速 檢測，放射免疫法含有放射性元素，對環(huán)境有很大的污染，同時也存在檢測準(zhǔn)確度不高的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜、污染環(huán)境以及測定準(zhǔn) 確度低的缺陷，而提供一種測定胰島素的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定胰島素的試 劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐溫-20 10-35 g/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸鈉 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 氯化鈉 150~350 mmol/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體1~8g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定胰島素的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 20 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 乙二胺四乙酸鈉 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體4g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的膠乳包被抗胰島素抗體的制備方法為:先用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80~500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì) 量濃度為1%_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化 二亞胺鹽酸鹽，在20°C_37°C的條件下反應(yīng)1小時，反應(yīng)完成后使用離心機，在25000 rpm/ min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，然后將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，然后使用超 聲分散儀進行超聲分散，再使用離心機，在25000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉 淀用50 mmo 1/L的MES緩沖液稀釋，直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%-3%為止，超聲 分散，然后邊分散邊加入等體積的含8 mg/mL抗胰島素抗體的MES緩沖液，混合攪拌，在20 °C_37°C的條件下反應(yīng)2小時，直至聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量濃度為1%時為止，然后加入牛 血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C條件下封閉24小時，即可制備得 到膠乳包被抗胰島素抗體。
[0009] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定胰島素的試劑盒的制備方法和使用方法，包 括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20~60 g/L 吐溫-20 10-35 g/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸納 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 氯化鈉 150~350 mmol/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的胰島素的濃度。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為2:1; 作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:2到 1:20之間。
[0011]本發(fā)明的檢測原理是:本發(fā)明利用抗原抗體反應(yīng)，在膠乳顆粒上包被抗胰島素抗 體，胰島素膠乳抗體和樣本中的胰島素發(fā)生凝集反應(yīng)，形成抗原抗體免疫復(fù)合物并產(chǎn)生一 定濁度，該濁度的高低與樣本中的胰島素濃度成相關(guān)，通過測定吸光度值并根據(jù)校準(zhǔn)曲線 計算出胰島素的含量。
式中：A At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A As以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中INS的濃度。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點：本發(fā)明在試劑R1中添加了乙二胺四 乙酸鈉，能夠有效去除來自樣本中金屬離子的干擾，因此檢測的準(zhǔn)確度比較高，且通過在R1 中添加了聚乙二醇-8000作為加速劑，促進了反應(yīng)迅速進行，靈敏度比較高，因此檢測的準(zhǔn)確 性比較好，而且本發(fā)明不含有任何放射性元素，不會對環(huán)境產(chǎn)生污染，另外操作也比較方便。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實施例進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0015] 實施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 20 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 乙二胺四乙酸鈉 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體4g/L 其溶劑為純化水。
[0016] 實施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 150 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 25g/L 疊氮鈉 〇.3g/L 乙二胺四乙酸鈉 6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 氯化鈉 350 mmol/L 疊氮鈉 1.7 g/L 牛血清白蛋白 10 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體3g/L 其溶劑為純化水。 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗胰島素抗體的制備:先用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的聚苯 乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為5%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在37°C的條件下反應(yīng)1小時，反 應(yīng)完成后使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，然后將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，然后使用超聲分散儀進行超聲分散，再使用離心機，在25000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，直至溶液中聚 苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%為止，超聲分散，然后邊分散邊加入等體積的含8 mg/mL抗胰島 素抗體的MES緩沖液，混合攪拌，在37°C的條件下反應(yīng)2小時，直至聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量 濃度為1%時為止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C條 件下封閉24小時，即可制備得到膠乳包被抗胰島素抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 20 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 乙二胺四乙酸鈉 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體4g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測步驟 (a) 取160yl試劑R1與20yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入80yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中的胰島素(INS)的活性（uIU/mL)計算出樣本中 的胰島素的濃度。
[0017] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、膠乳包被抗胰島素抗體的制備:先用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的聚苯 乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為5%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在37°C的條件下反應(yīng)1小時，反 應(yīng)完成后使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，然后將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，然后使用超聲分散儀進行超聲分散，再使用離心機，在25000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，直至溶液中聚 苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%為止，超聲分散，然后邊分散邊加入等體積的含8 mg/mL抗胰島 素抗體的MES緩沖液，混合攪拌，在37°C的條件下反應(yīng)2小時，直至聚苯乙烯微球的最終質(zhì)量 濃度為1%時為止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C條 件下封閉24小時，即可制備得到膠乳包被抗胰島素抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 150 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 25g/L 疊氮鈉 〇.3g/L 乙二胺四乙酸鈉 6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 氯化鈉 350 mmol/L 疊氮鈉 1.7 g/L 牛血清白蛋白 10 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體3g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測步驟 (a) 取160yl試劑R1與20yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入80yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中的胰島素(INS)的活性（uIU/mL)計算出樣本中 的胰島素的濃度。
[0018]表1為實施例1所制得的測定胰島素的試劑盒以及實施例2所制得的測定胰島素的 試劑盒分別對質(zhì)控品1進行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的胰島素的濃度為18.14 uIU/mL， 測定結(jié)果見表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定胰島素的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差較小，因 此測定準(zhǔn)確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0019] 表2為實施例1所制得的測定胰島素的試劑盒以及實施例2所制得的測定胰島素的試劑 盒分別對質(zhì)控品2進行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的胰島素的濃度為58.10 uIU/mL，測定 結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定胰島素的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差較小，因 此測定準(zhǔn)確度高，而且實施例1為最優(yōu)的選擇。
[0020] 表3為實施例3所制得的測定胰島素的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復(fù)測 定以及實施例4所制得的測定胰島素的試劑盒對同一待測樣本進行的多次反復(fù)測定，對所 得的結(jié)果進行SD和CV的計算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測定胰島素的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知，實 施例3為最優(yōu)的選擇。
[0021]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 一種測定胰島素的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組 分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐溫-20 10-35 g/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸納 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 氯化鈉 150~350 mmol/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體1~8g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定胰島素的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑 R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐溫-20 20 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 乙二胺四乙酸鈉 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 疊氮鈉 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體4g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定胰島素的試劑盒，其特征在于:所述的試劑R2中， 所述的膠乳包被抗胰島素抗體的制備方法為：先用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80~ 500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1 %-5%的溶液，然后每毫 升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20°C_37°C的條 件下反應(yīng)1小時，反應(yīng)完成后使用離心機，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清， 然后將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，然后使用超聲分散儀進行超聲分散，再使用離 心機，在25000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋， 直至溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%_3%為止，超聲分散，然后邊分散邊加入等體積的 含8 mg/mL抗胰島素抗體的MES緩沖液，混合攪拌，在20°C-37°C的條件下反應(yīng)2小時，直至聚 苯乙烯微球的最終質(zhì)量濃度為1%時為止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終 濃度達(dá)到15 g/L，4°C條件下封閉24小時，即可制備得到膠乳包被抗胰島素抗體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定胰島素的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐溫-20 10-35 g/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸納 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 氯化鈉 150~350 mmol/L 疊氮鈉 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 膠乳包被抗胰島素抗體1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的胰島素的濃度。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測定胰島素的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為2:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測定胰島素的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:2到1:20之間。
【文檔編號】G01N21/31GK106053364SQ201610358104
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司