吖啶標(biāo)記結(jié)合物及其制備方法、化學(xué)發(fā)光試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種吖啶標(biāo)記結(jié)合物及其制備方法、化學(xué)發(fā)光試劑盒，吖啶標(biāo)記結(jié)合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白；所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸；所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽。這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物的多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接，待標(biāo)記蛋白上的氨基與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成?NH?CO?結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一起，結(jié)合位點(diǎn)相對確定，避免了吖啶取代物對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干擾，這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物的活性相對較高。
【專利說明】
吖啶標(biāo)記結(jié)合物及其制備方法、化學(xué)發(fā)光試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及體外檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種吖啶標(biāo)記結(jié)合物及其制備方法、化學(xué)發(fā) 光試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)，是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記 抗原、半抗原或抗體的免疫分析方法。用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)包括吖啶取代物，根據(jù)取代 基的不同，吖啶取代物分為兩類:吖啶酯(acridinium ester，AE)和吖啶磺酰胺，二者均為 有效的發(fā)光標(biāo)記物，通過起動發(fā)光試劑(Na0H、H20 2)作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘 內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。
[0003] 吖啶取代物作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物用于免疫分析，其化學(xué)反應(yīng)簡單、快速、無須催化 劑，檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低，與大 分子的結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。這類化合物從發(fā)光的機(jī)理來說特點(diǎn) 是：1、發(fā)光反應(yīng)中在形成電子激發(fā)態(tài)中間體之前，聯(lián)結(jié)于吖啶環(huán)上的不發(fā)光的取代基部分 從口丫啶環(huán)上脫尚開來，即未發(fā)光部分與發(fā)光部分分尚，因而其發(fā)光效率基本不受取代基結(jié) 構(gòu)的影響。2、吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物化學(xué)發(fā)光不需要催化劑，在有H 202的稀堿性溶液 中即能發(fā)光。因此應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測具有許多優(yōu)越性，優(yōu)點(diǎn)主要有:①背景發(fā)光低，信噪 比高;②發(fā)光反應(yīng)干擾因素少;③光釋放快速集中、發(fā)光效率高、發(fā)光強(qiáng)度大;④易于與蛋白 質(zhì)聯(lián)結(jié)且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少;⑤標(biāo)記物穩(wěn)定(在2-8°C下可保存數(shù)月之久）。因此吖啶取 代物是一類非常有效、非常好的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
[0004] 吖啶標(biāo)記結(jié)合物為吖啶取代物與待標(biāo)記物(抗體、抗原，等)結(jié)合得到的復(fù)合物?？谘?啶標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵 的試劑。
[0005] 目前常用的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法是碳二亞胺交聯(lián)法，以碳二亞胺交聯(lián)劑為 橋，使吖啶取代物與待標(biāo)記蛋白結(jié)合。然而，傳統(tǒng)方法制得的吖啶標(biāo)記結(jié)合物中，吖啶取代 物與待標(biāo)記蛋白通過碳二亞胺結(jié)合，吖啶取代物往往會對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干 擾，造成吖啶標(biāo)記結(jié)合物的活性降低，影響免疫分析的靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，有必要提供一種活性相對較高的吖啶標(biāo)記結(jié)合物及其制備方法、化學(xué)發(fā) 光試劑盒。
[0007] -種吖啶標(biāo)記結(jié)合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白；
[0008] 所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚 氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接；
[0009] 所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標(biāo)記蛋白 上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨基酸和所述 待標(biāo)記蛋白連接到一起。
[0010] 在一個實(shí)施例中，所述吖啶取代物為吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。
[0011] 在一個實(shí)施例中，所述多聚氨基酸為聚合度大于25的多聚賴氨酸。
[0012] 在一個實(shí)施例中，所述待標(biāo)記蛋白為抗原、半抗原或抗體。
[0013] -種上述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)，充分反應(yīng)后得到吖啶取代物-多 聚氨基酸結(jié)合物，其中，所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸 通過所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接；
[0015] 對所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物進(jìn)行純化；
[0016] 用交聯(lián)劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物上的羧基進(jìn)行活化；以 及
[0017] 用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白交聯(lián)，充分反 應(yīng)后得到吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其中，所述吖啶標(biāo)記結(jié)合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨 基酸和待標(biāo)記蛋白，所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述 待標(biāo)記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨 基酸和所述待標(biāo)記蛋白連接到一起。
[0018] 在一個實(shí)施例中，所述用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)的操作中， 所述活化后的吖啶取代物和所述多聚氨基酸的摩爾比為1~10000:1。
[0019] 在一個實(shí)施例中，所述用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待 標(biāo)記蛋白交聯(lián)的操作中，所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與所述待標(biāo)記蛋白的摩爾比 為5:1~1:5 〇
[0020] 在一個實(shí)施例中，所述用交聯(lián)劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物 上的羧基進(jìn)行活化的操作中，所述交聯(lián)劑包括碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺。
[0021] 在一個實(shí)施例中，所述碳二亞胺選自二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N，N'_二異丙基碳二亞胺中的至少一種，所述碳二亞胺與所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物的摩爾比為5~1000:1;
[0022] 所述羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺中的至少 一種，所述碳二亞胺與所述羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為10:1~1:20。
[0023] -種化學(xué)發(fā)光試劑盒，用于結(jié)合待標(biāo)記蛋白形成如上述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物，所述 化學(xué)發(fā)光試劑盒包括:吖啶取代物和多聚氨基酸；
[0024] 所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸可以通過所述 多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接；
[0025] 所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標(biāo)記蛋白 上的氨基可以與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨基酸和 所述待標(biāo)記蛋白連接到一起。
[0026] 這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白，多 聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接，待標(biāo)記蛋白上的氨 基與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一 起，結(jié)合位點(diǎn)相對確定，避免了叮啶取代物對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干擾，這種吖啶 標(biāo)記結(jié)合物的活性相對較高。此外，多聚氨基酸可使吖啶標(biāo)記結(jié)合物的空間位阻增大，從而 增加了吖啶標(biāo)記結(jié)合物的使用靈敏度。
【附圖說明】
[0027] 圖1為一實(shí)施方式的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法的流程圖；
[0028] 圖2為測試?yán)?中得到的系列濃度TSH抗原樣本檢驗結(jié)果散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí) 施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于 充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施 的限制。
[0030] -種吖啶標(biāo)記結(jié)合物，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白。 [0031]多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨 基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0032]本實(shí)施方式中，多聚氨基酸可以為聚合度大于25的多聚賴氨酸。優(yōu)選的，多聚氨基 酸為聚合度為100~200的多聚賴氨酸。
[0033]待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待標(biāo)記蛋白上的氨基 與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一 起。
[0034] 待標(biāo)記蛋白可以為本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以為通過修飾后引入氨基 的改性蛋白或改性多肽。
[0035] 本實(shí)施方式中，待標(biāo)記蛋白為抗原、半抗原或抗體。
[0036] 吖啶取代物可以為吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-叮啶甲酸）、吖啶酰胺或 吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根據(jù)吖啶取代物的具體不同，多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代 物上的不同基團(tuán)（羧基、琥珀酰亞胺酯等)反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0037] 具體的，叮啶酯可以為AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亞胺酯甲酸酯）、01^_ NHS(2 '，6 ' -二甲基-4 ' -(N-琥珀酰亞胺氧羰基）苯基-叮啶-9-甲酸酯）、ME-DMAE-NHS(2 '， 6 二甲基羰基苯基-10-甲基-9-叮啶甲酸酯-4 ' -N-琥珀酰亞胺酯-三氟甲基磺酸鹽)等。 [0038]以吖啶酯為AE-NHS，多聚氨基酸為多聚賴氨酸為例，此時，吖啶標(biāo)記結(jié)合物具有如 下結(jié)構(gòu)式：
[0040]
|為待標(biāo)記蛋白，待標(biāo)記蛋白上帶有氣基殘基，n為大于25的整數(shù)， 優(yōu)選為100~200的整數(shù)。
[0041] 這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白，多 聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接，待標(biāo)記蛋白上的氨 基與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一 起，結(jié)合位點(diǎn)相對確定，避免了叮啶取代物對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干擾，這種吖啶 標(biāo)記結(jié)合物的活性相對較高。
[0042] 此外，多聚氨基酸可使吖啶標(biāo)記結(jié)合物的空間位阻增大，從而增加了吖啶標(biāo)記結(jié) 合物的使用靈敏度。
[0043]與傳統(tǒng)技術(shù)相比，這種含有多聚氨基酸的吖啶標(biāo)記結(jié)合物中，待標(biāo)記蛋白的活性 位點(diǎn)得到有效保護(hù)，避免待標(biāo)記蛋白失活，通過化學(xué)鍵將吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記 蛋白依次連接，具有穩(wěn)定、連接量可控等特點(diǎn)。
[0044] 這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物可以直接用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的檢測和定量分析，并且能 解決傳統(tǒng)的碳二亞胺交聯(lián)法等方法制備的吖啶標(biāo)記結(jié)合物原料失活、信號差等缺點(diǎn)。
[0045] 如圖1所示的上述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，包括如下步驟：
[0046] S10、用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)，充分反應(yīng)后得到吖啶取代 物-多聚氨基酸結(jié)合物。
[0047] 用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)的操作中，活化后的吖啶取代物和 多聚氨基酸的摩爾比為1~10000:1。
[0048] 優(yōu)選的，吖啶取代物和多聚氨基酸的摩爾比為10~200:1。
[0049] 活化后的吖啶取代物可以為羧基活化的吖啶取代物?；罨蟮倪灌と〈锟梢詾?采用碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺活化，具體的活化操作如下:在緩沖液中加入吖啶取代物， 充分溶解后，加入EDC和NHS，于25°C反應(yīng)lOmin，得到活化后的吖啶取代物。其中，緩沖液為 磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、2-(N-嗎啉代）乙磺酸(MES)緩沖液或哌嗪-N，N'雙(2-乙磺 酸）（PIPES)緩沖液，反應(yīng)過程的pH為4~10。
[0050] 多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨 基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0051] 本實(shí)施方式中，多聚氨基酸可以為聚合度大于25的多聚賴氨酸。優(yōu)選的，多聚氨基 酸為聚合度為100~200的多聚賴氨酸。
[0052] 吖啶取代物可以為吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-叮啶甲酸）、吖啶酰胺或 吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根據(jù)吖啶取代物的具體不同，多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代 物上的不同基團(tuán)（羧基、琥珀酰亞胺酯等)反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0053] 具體的，叮啶酯可以為AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亞胺酯甲酸酯）、01^_ NHS(2 '，6 ' -二甲基-4 ' -(N-琥珀酰亞胺氧羰基）苯基-叮啶-9-甲酸酯）、ME-DMAE-NHS(2 '， 6 二甲基羰基苯基-10-甲基-9-叮啶甲酸酯-4 ' -N-琥珀酰亞胺酯-三氟甲基磺酸鹽)等。 [0054]以吖啶酯為AE-NHS，多聚氨基酸為多聚賴氨酸為例，吖啶取代物和多聚氨基酸共 價交聯(lián)得到吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物的反應(yīng)式如下：
[0056] 上述反應(yīng)式的具體反應(yīng)過程為:在緩沖液中加入多聚氨基酸，充分溶解后加入過 量的吖啶酯，于4°C~37 °C反應(yīng)0.5h~12h，反應(yīng)后經(jīng)過純化得到吖啶酯-多聚氨基酸結(jié)合 物。其中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、2-(N-嗎啉代）乙磺酸(MES)緩沖液或哌 嗪-N，N '雙(2-乙磺酸）（PIPES)緩沖液，反應(yīng)過程的pH為4~10。
[0057] 由于吖啶酯相對于多聚氨基酸是過量的，因此多聚氨基酸上的氨基可以視為反應(yīng) 完全，不會與下一步中待標(biāo)記蛋白上的氨基進(jìn)行競爭，從而可以不必封閉吖啶酯-多聚氨基 酸結(jié)合物上的氨基。
[0058] S20、對S10得到的吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物進(jìn)行純化。
[0059] 對吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物進(jìn)行純化的操作可以為超濾純化、脫鹽柱純化 和透析純化幾種操作中的一種或幾種聯(lián)用。
[0060] S30、用交聯(lián)劑對S20得到的純化后的吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物上的羧基進(jìn) 行活化。
[0061 ]交聯(lián)劑包括碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺，碳二亞胺與吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié) 合物的摩爾比為5~1000:1，碳二亞胺與羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為10:1~1:20。
[0062] 優(yōu)選的，碳二亞胺選自二環(huán)己基碳二亞胺、1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺 和N，N'_二異丙基碳二亞胺中的至少一種。
[0063]優(yōu)選的，碳二亞胺與吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物的摩爾比為20~500:1。
[0064] 優(yōu)選的，羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺中的至 少一種。
[0065]優(yōu)選的，碳二亞胺與羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為3:1~1:10。
[0066]以吖啶酯為AE-NHS，多聚氨基酸為多聚賴氨酸為例，采用碳二亞胺和羥基琥珀酰 亞胺對吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物的羧基進(jìn)行活化的反應(yīng)式如下：
-)
[0068] 其中，n為大于25的整數(shù)，優(yōu)選為100~200的整數(shù)。
[0069] 上述反應(yīng)式的具體反應(yīng)過程為:在緩沖液中加入吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物， 充分溶解后，加入H)C和NHS，于25°C反應(yīng)lOmin，得到羧基活化后的吖啶取代物-多聚氨基酸 結(jié)合物。其中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液或 哌嗪-N，N '雙(2-乙磺酸）（PIPES)緩沖液，反應(yīng)過程的pH為4~10。
[0070] 優(yōu)選的，S30還包括在吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物上的羧基被活化后，加入巰 基化合物(巰基乙醇、巰基蘇糖醇、半胱氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽，等)淬滅交聯(lián)劑活性(或者經(jīng) 純化除去交聯(lián)劑），得到羧基活化后的吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物，并且該羧基活化后 的吖啶取代物_多聚氨基酸結(jié)合物中的氨基封閉。
[0071] S40、用S30得到的羧基活化后的吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白交 聯(lián)，充分反應(yīng)后得到吖啶標(biāo)記結(jié)合物。
[0072] 得到的吖啶標(biāo)記結(jié)合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白。 [0073]待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待標(biāo)記蛋白上的氨基 與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一 起。
[0074] 待標(biāo)記蛋白可以為本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以為通過修飾后引入氨基 的改性蛋白或改性多肽。
[0075] 本實(shí)施方式中，待標(biāo)記蛋白為抗原、半抗原或抗體。
[0076] 用羧基活化后的吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白交聯(lián)的操作中，口丫 啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白的摩爾比為5:1~1:5。
[0077]優(yōu)選的，吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白的摩爾比為2:1~1:2。
[0078]以吖啶酯為AE-NHS，多聚氨基酸為多聚賴氨酸為例，羧基活化后的吖啶取代物-多 聚氨基酸結(jié)合物和待標(biāo)記蛋白交聯(lián)，得到吖啶標(biāo)記結(jié)合物的反應(yīng)式如下：
[0080]
為待標(biāo)記蛋白，待標(biāo)記蛋白上帶有氣基殘基，n為大于25的整數(shù)，優(yōu) 選為100~200的整數(shù)。
[0081] 上述反應(yīng)式的具體反應(yīng)過程為:在緩沖液中加入羧基活化后的吖啶取代物-多聚 氨基酸結(jié)合物，充分溶解后，加入待標(biāo)記蛋白，于4°C~37°C反應(yīng)0.5h~12h，反應(yīng)后經(jīng)過純 化得到吖啶標(biāo)記結(jié)合物。其中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、2-(N-嗎啉代）乙磺 酸(MES)緩沖液或哌嗪-N，N'雙(2-乙磺酸）（PIPES)緩沖液，反應(yīng)過程的pH為4~10。
[0082] 這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨基與吖啶取 代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接，待標(biāo)記蛋白上的氨基與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一起，結(jié)合位點(diǎn)相對確定，避免了吖啶取代物 對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干擾，這種吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法制得的吖啶標(biāo)記結(jié) 合物的活性相對較高。
[0083]此外，多聚氨基酸可使吖啶標(biāo)記結(jié)合物的空間位阻增大，從而增加了吖啶標(biāo)記結(jié) 合物的使用靈敏度。
[0084] 本發(fā)明還公開了一種化學(xué)發(fā)光試劑盒，用于結(jié)合待標(biāo)記蛋白形成上述的吖啶標(biāo)記 結(jié)合物。
[0085] 化學(xué)發(fā)光試劑盒包括:吖啶取代物和多聚氨基酸。
[0086] 吖啶取代物可以為吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-叮啶甲酸）、吖啶酰胺或 吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根據(jù)吖啶取代物的具體不同，多聚氨基酸上的氨基與吖啶取代 物上的不同基團(tuán)（羧基、琥珀酰亞胺酯等)反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0087] 具體的，叮啶酯可以為AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亞胺酯甲酸酯）、01^_ NHS(2 '，6 ' -二甲基-4 ' -(N-琥珀酰亞胺氧羰基）苯基-叮啶-9-甲酸酯）、ME-DMAE-NHS(2 '， 6 二甲基羰基苯基-10-甲基-9-叮啶甲酸酯-4 ' -N-琥珀酰亞胺酯-三氟甲基磺酸鹽)等。
[0088] 多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，多聚氨基酸通過多聚氨基酸上的氨 基與吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接。
[0089] 本實(shí)施方式中，多聚氨基酸可以為聚合度大于25的多聚賴氨酸。優(yōu)選的，多聚氨基 酸為聚合度為100~200的多聚賴氨酸。
[0090] 本實(shí)施方式中，多聚氨基酸可以為牛血清白蛋白、雞血清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
[0091] 待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待標(biāo)記蛋白上的氨基 與多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-C0-結(jié)構(gòu)從而將多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白連接到一 起。
[0092] 待標(biāo)記蛋白可以為本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以為通過修飾后引入氨基 的改性蛋白或改性多肽。
[0093] 本實(shí)施方式中，待標(biāo)記蛋白為抗原、半抗原或抗體。
[0094] 優(yōu)選的，這種化學(xué)發(fā)光試劑盒還包括離心脫鹽柱和離心超濾管中的至少一種。
[0095] 這種化學(xué)發(fā)光試劑盒可以通過吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo)記蛋白依次形成化 學(xué)鍵連接，結(jié)合位點(diǎn)相對確定，避免了吖啶取代物對待標(biāo)記蛋白上的活性位點(diǎn)形成干擾，形 成的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的活性相對較高。
[0096] 此外，多聚氨基酸可使吖啶標(biāo)記結(jié)合物的空間位阻增大，從而增加了吖啶標(biāo)記結(jié) 合物的使用靈敏度。
[0097] 以下為具體實(shí)施例。
[0098] 實(shí)施例中，除非特殊說明，否則所使用的試劑購自Sigma-aldrich公司，為分析純。
[0099] 實(shí)施例中出現(xiàn)的吖啶酯均為羧基活化的吖啶酯，具體活化操作如下:在pH為7的磷 酸鹽緩沖液中加入吖啶酯，充分溶解后，加入摩爾比為1:1的EDC和NHS，其中，NHS與吖啶酯 的摩爾比為100:1，于25 °C反應(yīng)lOmin，得到活化后的吖啶取代物。
[0100] 實(shí)施例1
[0101] 將多聚賴氨酸溶解于lmL150mM PBS緩沖液(pH 7.4)中，終濃度1〇11111〇1/1，加入1(^ L溶解于DMSO溶劑的10mm〇l/L吖啶酯，于25°C反應(yīng)lh，用5mL 7KD截留分子量的脫鹽柱 (Thermo f ish公司）以150mM PBS(pH7.4)緩沖液作為換液緩沖液，過柱3遍，除去游離的吖 啶酯及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到吖啶-多聚賴氨酸溶液。
[0102]向上述純化過的吖啶-多聚賴氨酸溶液中加入EDC (終濃度為5mmo 1 /L)和NHS (終濃 度為10mm〇l/L)。加入25°C反應(yīng)30分鐘后，加入終濃度為10mM的巰基乙醇，得到活化后的吖 啶-多聚賴氨酸；
[0103] 在加入111^抗?1'11單克隆抗體(廠家:41311〇￥3，貨號:？4135103,6.67111]1〇1)，混勾，置于 25°(：反應(yīng)111，用51^71(0截留分子量的脫鹽柱(11^111〇打811公司）以15011^?83化117.4)緩沖 液作為換液緩沖液，過柱3遍，除去游離的NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到結(jié)合物吖啶酯-多聚賴氨 酸-PTH單克隆抗體溶液。
[0104] 實(shí)施例2
[0105] 將多聚賴氨酸溶解于lmL150mM PBS緩沖液(pH 7.4)中，終濃度1〇11111〇1/1，加入1(^ L溶解于DMS0溶劑的10mm〇l/L吖啶酯，于25°C反應(yīng)lh，用5mL 7KD截留分子量的脫鹽柱 (Thermo f ish公司）以150mM PBS(pH7.4)緩沖液作為換液緩沖液，過柱3遍，除去游離的吖 啶酯及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到吖啶-多聚賴氨酸溶液。
[0106]向上述純化過的吖啶-多聚賴氨酸溶液中加入EDC (終濃度為5mmo 1 /L)和NHS (終濃 度為10mmol/L)。加入25°C反應(yīng)30分鐘后，用5mL 7KD截留分子量的脫鹽柱(Thermo fish公 司）以150mM PBS(pH 7.4)緩沖液作為換液緩沖液，過柱3遍，除去游離的吖啶酯及反應(yīng)副產(chǎn) 物，得到吖啶-多聚賴氨酸溶液。在加入lmg抗PTH單克隆抗體(廠家:Abnova，貨號:PAB5103， 6.67nmol)，混勻，置于25°C反應(yīng)lh，用5mL 7KD截留分子量的脫鹽柱（Thermo fish公司）以 150mM PBS(pH 7.4)緩沖液作為換液緩沖液，過柱3遍，除去游離的NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到 結(jié)合物吖啶酯-多聚賴氨酸-PTH單克隆抗體溶液。
[0107] 實(shí)施例3
[0108] 將多聚賴氨酸溶解于lmL150mM PBS緩沖液(pH 7.4)中，終濃度1〇11111〇1/1，加入1(^ L溶解于DMS0溶劑的lOmmo 1/L吖啶酯，于25 °C反應(yīng)lh，，用4mL 30KD截留分子量的超濾管 (Mi 11 ipore公司），以150mM PBS(pH 7.4)緩沖液作為換液緩沖液，超濾3遍，除去游離的吖 啶酯及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到吖啶-多聚賴氨酸溶液。
[0109]向上述純化過的吖啶-多聚賴氨酸溶液中加入EDC (終濃度為5mmo 1 /L)和NHS (終濃 度為10mm〇l/L)。加入25°C反應(yīng)30分鐘后，用4mL 30KD截留分子量的超濾管(Millipore公 司），以150mM PBS (pH 7.4)緩沖液作為換液緩沖液，超濾3遍，得到活化后的吖啶-多聚賴氨 酸；
[0110] 在加入111^抗?1'11單克隆抗體(廠家:41311〇￥3，貨號:？4135103,6.67111]1〇1)，混勾，置于 25°(：反應(yīng)111，用41^301(0截留分子量的超濾管(]^111口〇代公司），以1501111?83化117.4)緩 沖液作為換液緩沖液，超濾3遍，除去游離的NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到結(jié)合物叮啶酯-多聚賴 氨酸-PTH單克隆抗體溶液。
[0川]對比例
[0112]將 lmg 抗 PTH 單克隆抗體（廠家:Abnova，貨號：？485103,6.67腦〇1)溶解于111^15〇111]\1 PBS緩沖液(pH 7.4)中，加入1 OyL溶解于DMS0溶劑的1 Ommo 1 /L吖啶酯，于25 °C反應(yīng)1 h，用5mL 7仰截留分子量的脫鹽柱(111奸111〇^811公司）以15〇11^?85化117.4)緩沖液作為換液緩沖 液，過柱3遍，除去游離的吖啶酯及反應(yīng)副產(chǎn)物，得到吖啶酯-PTH單克隆抗體溶液。
[0113]測試?yán)?
[0114]將實(shí)施例1~3以及對比例中得到的結(jié)合物用于PTH的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測。向 1000pg/mL的PTH樣本中，加入50yg抗PTH單克隆抗體包被的磁珠，再分別加入各方法制備的 lpmol叮啶酯標(biāo)記抗PTH抗體，孵育反應(yīng)后清洗，先后加入lOOyL HN03-H2〇2溶液和100此的氫 氧化鈉溶液，用iFlash3000型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測量發(fā)光值，平行進(jìn)行3份測量，取平均 值;結(jié)果見表1。免疫分析所得結(jié)果的發(fā)光值越大，說明吖啶酯標(biāo)記物的活性越好。
[0115]表1:各方法標(biāo)記的吖啶酯標(biāo)物檢測PTH對比結(jié)果
[0117]由表1結(jié)果可知，采用實(shí)施例1~3制備的吖啶酯標(biāo)記試劑，試劑的活性顯著優(yōu)于對 比例制備的。
[0118] 測試?yán)?
[0119] 將實(shí)施例1中得到的吖啶酯-多聚賴氨酸-抗PTH的單克隆抗體溶液用于系列濃度 的PTH的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測。向系列濃度的PTH樣本溶液中分別加入50yg PTH單克隆抗 體包被的磁珠試劑和lpmol叮啶酯-多聚賴氨酸-抗PTH單克隆抗體試劑，孵育反應(yīng)后清洗， 先后加入1〇〇此HN0 3-H2〇2溶液和100此的氫氧化鈉溶液，用iFlash3000型化學(xué)發(fā)光免疫分 析儀測量發(fā)光值;結(jié)果見表2。以PTH抗原濃度為X軸，以相對發(fā)光值為Y軸，由表2數(shù)據(jù)作圖， 得圖2。
[0120] 表2:系列濃度TSH抗原樣本的免疫檢測結(jié)果
[0122] 由表2和圖2結(jié)果可知，實(shí)施例1制備的吖啶酯-多聚賴氨酸-抗體可應(yīng)用于化學(xué)發(fā) 光免疫分析且效果良好。實(shí)施例1的吖啶酯-多聚賴氨酸-標(biāo)記物制備方法具有良好的適用
性。
[0123] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其特征在于，包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待標(biāo) 記蛋白； 所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過所述多聚氨基 酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接； 所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標(biāo)記蛋白上的 氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨基酸和所述待標(biāo) 記蛋白連接到一起。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其特征在于，所述吖啶取代物為吖啶酯、口丫 啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其特征在于，所述多聚氨基酸為聚合度大于 25的多聚賴氨酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其特征在于，所述待標(biāo)記蛋白為抗原、半 抗原或抗體。5. -種權(quán)利要求1~4中任一項所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟： 用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)，充分反應(yīng)后得到吖啶取代物-多聚氨 基酸結(jié)合物，其中，所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通過 所述多聚氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接； 對所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物進(jìn)行純化； 用交聯(lián)劑對純化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物上的羧基進(jìn)行活化；以及 用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白交聯(lián)，充分反應(yīng)后 得到吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其中，所述吖啶標(biāo)記結(jié)合物包括依次連接的吖啶取代物、多聚氨基酸 和待標(biāo)記蛋白，所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標(biāo) 記蛋白上的氨基與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨基酸 和所述待標(biāo)記蛋白連接到一起。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述用活化后的吖 啶取代物和多聚氨基酸共價交聯(lián)的操作中，所述活化后的吖啶取代物和所述多聚氨基酸的 摩爾比為1~10000:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述用羧基活化后 的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物與待標(biāo)記蛋白交聯(lián)的操作中，所述吖啶取代物-多聚 氨基酸結(jié)合物與所述待標(biāo)記蛋白的摩爾比為5:1~1:5。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述用交聯(lián)劑對純 化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物上的羧基進(jìn)行活化的操作中，所述交聯(lián)劑包括 碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的吖啶標(biāo)記結(jié)合物的制備方法，其特征在于，所述碳二亞胺選自 二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N，N'_二異丙基碳二亞胺中的 至少一種，所述碳二亞胺與所述吖啶取代物-多聚氨基酸結(jié)合物的摩爾比為5~1000:1; 所述羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺中的至少一種， 所述碳二亞胺與所述羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為10:1~1:20。10.-種化學(xué)發(fā)光試劑盒，用于結(jié)合待標(biāo)記蛋白形成如權(quán)利要求1~4中任一項所述的 吖啶標(biāo)記結(jié)合物，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光試劑盒包括:吖啶取代物和多聚氨基酸； 所述多聚氨基酸為含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸可以通過所述多聚 氨基酸上的氨基與所述吖啶取代物反應(yīng)形成化學(xué)鍵連接； 所述待標(biāo)記蛋白為含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待標(biāo)記蛋白上的 氨基可以與所述多聚氨基酸上的羧基反應(yīng)形成-NH-CO-結(jié)構(gòu)從而將所述多聚氨基酸和所述 待標(biāo)記蛋白連接到一起。
【文檔編號】C07K19/00GK106053443SQ201610522664
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】錢純亙, 肖成勇, 祝亮, 劉陶旭, 夏福臻
【申請人】深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司