微生物抗藥性的質(zhì)譜快速檢測(cè)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測(cè)定微生物對(duì)抗生素的抗藥性的方法和儀器，所述微生物特別是產(chǎn)生β?內(nèi)酰胺酶的微生物。通過(guò)在質(zhì)譜樣品載板上培養(yǎng)與一定劑量的合適的抗生素(例如β?內(nèi)酰胺抗生素亞胺培南)混合的少量微生物，然后以質(zhì)譜法直接測(cè)量微生物酶對(duì)抗生素的分解，所述方法在一個(gè)小時(shí)內(nèi)即可測(cè)定微生物的抗藥性。
【專利說(shuō)明】
微生物抗藥性的質(zhì)譜快速檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物對(duì)抗生素的抗藥性的測(cè)定，所述微生物特別是產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶 的那些微生物。
【背景技術(shù)】
[0002] 出版物冊(cè) 2011154517厶1(]\1.1(〇81^26￥&、1(.]\1;[(311611]1&1111和1(.3卩&1'13161')及同族出版 物DE 102010023452B4和US 20130095511A1介紹了一種微生物內(nèi)酰胺酶抗藥性測(cè)定方 法，其基于質(zhì)譜測(cè)量微生物內(nèi)酰胺酶對(duì)內(nèi)酰胺抗生素(或具有相似結(jié)構(gòu)的底物)的酶催 化改變。為此，向含有內(nèi)酰胺抗生素(或具有相似結(jié)構(gòu)的底物)的溶液中引入細(xì)菌，并進(jìn)行 培養(yǎng)例如大約三小時(shí)。然后優(yōu)選通過(guò)離心或過(guò)濾分離細(xì)菌。之后將一至兩微升不含細(xì)菌的 溶液施加至質(zhì)譜樣品載板上，干燥并包被基質(zhì)溶液以進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。 在具有MALDI離子源的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中測(cè)量生成質(zhì)譜，可通過(guò)它來(lái)確定是否存在經(jīng)酶催 化改變的抗生素或底物，特別是內(nèi)酰胺環(huán)的水解分裂，這表示微生物具有抗藥性。
[0003] 在出版物WO 2012/023845Al(Luider等人）中介紹了一種類似方法，其大體上通過(guò) 質(zhì)譜測(cè)定微生物酶導(dǎo)致的抗生素的改變。
[0004] 這些文件所述的方法都有較多的單獨(dú)步驟，特別是離心或過(guò)濾，這既需要很長(zhǎng)時(shí) 間，通常又涉及人工操作過(guò)程。已知方法通常需要三個(gè)小時(shí)左右。對(duì)于工作量更小、更易于 自動(dòng)化且速度更快、能夠以較少樣品數(shù)量產(chǎn)生高樣品通量的微生物抗藥性測(cè)定方法，始終 存在需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的
[0006] 本發(fā)明目的是提供這樣的方法和儀器，通過(guò)該方法和儀器，可以通過(guò)質(zhì)譜，只使用 很少的單獨(dú)步驟，優(yōu)選在一個(gè)小時(shí)內(nèi)，測(cè)定基于抗生素的酶催化改變的微生物抗藥性。
[0007] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0008] 本發(fā)明提供一種用于測(cè)定微生物樣品對(duì)抗生素的抗藥性方法，其中在樣品載板的 測(cè)試點(diǎn)上在一定體積的液體中將所述微生物樣品和所述抗生素混合，并且在所述測(cè)試點(diǎn)上 通過(guò)質(zhì)譜測(cè)量分析所述抗生素是否經(jīng)酶催化改變。質(zhì)譜測(cè)量的質(zhì)量范圍優(yōu)選小于1000道爾 頓，特別是介于250至750道爾頓。
[0009] 抗生素可以是選自青霉素類(芐青霉素、口服青霉素(oral penicillins)、氨基青 霉素、異惡?；嗝顾兀?8〇13〇丫1?611；[0；[11；[118)、酰氨基青霉素）、頭孢菌素類、單環(huán)0-內(nèi)酰 胺類或碳青霉烯類的組中的內(nèi)酰胺抗生素。微生物樣品還可以與包含內(nèi)酰胺抗生素和 內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方藥品混合，所述復(fù)方藥品例如克拉維酸與阿莫西林的組合、他佐 巴坦與哌拉西林的組合、或舒巴坦與內(nèi)酰胺抗生素的組合。微生物樣品還可以在測(cè)試點(diǎn) 上與多于一種抗生素混合。
[0010] 例如可通過(guò)由相應(yīng)的質(zhì)量信號(hào)所顯示出的抗生素減少或一種或多種分解產(chǎn)物的 增多，或二者，來(lái)測(cè)定抗生素的酶催化改變。特別地，可通過(guò)與參考物質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)進(jìn)行比 較來(lái)確定抗生素的減少。在這種情況中，在微生物樣品與抗生素混合之前，測(cè)試點(diǎn)可以已經(jīng) 包被有參考物質(zhì)。還可以在它們混合之后或在制備適合質(zhì)譜測(cè)量的樣品（例如MALDI樣品） 期間添加參考物質(zhì)。
[0011] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀(特別是飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）中進(jìn) 行質(zhì)譜測(cè)量，其中質(zhì)譜樣品載板是平的并具有多個(gè)測(cè)試點(diǎn)。
[0012] 在另一實(shí)施方案中，微生物樣品優(yōu)選具有完整的微生物細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的方 法中，微生物細(xì)胞在一定體積的液體中的培養(yǎng)期小于一小時(shí)，例如優(yōu)選僅約半小時(shí)。在一定 體積的液體中的培養(yǎng)優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。施加至測(cè)試點(diǎn)上的微生物細(xì)胞的數(shù)目?jī)?yōu)選介于 10 3至107。當(dāng)使用完整的微生物細(xì)胞時(shí)，在制備用于質(zhì)譜測(cè)量的樣品期間，特別是制備MALDI 樣品期間，微生物細(xì)胞仍保持完整(即未被消化)是有利的。
[0013] 微生物樣品可包括取自平板培養(yǎng)基(例如瓊脂平板)的菌落的完整微生物細(xì)胞，或 通過(guò)離心或過(guò)濾從液體培養(yǎng)基分離出的完整微生物細(xì)胞。特別地，液體營(yíng)養(yǎng)基可以是陽(yáng)性 血液營(yíng)養(yǎng)基，其中血細(xì)胞優(yōu)選在離心或過(guò)濾前被破壞。微生物樣品還可以是未經(jīng)培養(yǎng)的體 液樣品，例如血液樣品、尿液樣品、或脊髓液樣品或涂片樣品。涂片樣品是取自傷口或粘膜 (口、鼻、尿道、陰道、肛門(mén)）表面的用于分析的內(nèi)源物質(zhì)。
[0014] 在另一實(shí)施方案中，微生物樣品包括被消化的微生物細(xì)胞(細(xì)胞裂解產(chǎn)物），在這 種情況中，也可在測(cè)試點(diǎn)進(jìn)行微生物消化。如果通過(guò)在測(cè)試點(diǎn)制備MALDI樣品來(lái)消化微生物 樣品中的完整微生物細(xì)胞，或者如果微生物樣品是細(xì)胞裂解產(chǎn)物，那么在質(zhì)譜測(cè)量中還可 采集微生物蛋白質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)。這些信號(hào)還可用于微生物分類學(xué)鑒定和/或在其抗藥性方 面對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步表征。微生物樣品還可通過(guò)以下方法獲得，使用不含任何抗生素的液體 對(duì)平板培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行微生物細(xì)胞采樣，然后將樣品液體(作為微生物樣品）與樣品載 板上的抗生素混合。
[0015] 在另一實(shí)施方案中，測(cè)試點(diǎn)上的所述一定體積的液體小于10微升，優(yōu)選小于5微 升，特別是介于1至3微升。在樣品載板的測(cè)試點(diǎn)上混合微生物樣品和抗生素之后，樣品載板 優(yōu)選保持在潮濕環(huán)境中，或向測(cè)試點(diǎn)添加額外的液體，以防止所述一定體積的液體在指定 培養(yǎng)期或反應(yīng)時(shí)間內(nèi)干燥殆盡。
[0016] 此外，本發(fā)明還提供了用于微生物樣品的抗藥性質(zhì)譜測(cè)定的樣品載板，其中所述 樣品載板具有多個(gè)測(cè)試點(diǎn)，并且至少一個(gè)測(cè)試點(diǎn)包被有一定劑量的一種或多種抗生素。不 同的測(cè)試點(diǎn)可以包被有不同的抗生素。此外，每個(gè)測(cè)試點(diǎn)還可包被有一種或多種參考物質(zhì)。
[0017] 原則上，可以使用任何質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量，例如四極過(guò)濾器(特別是三重四極質(zhì) 譜儀）、正交離子注入飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(0T0F)、離子回旋共振質(zhì)譜儀（ICR-MS)、靜電Kingdon 質(zhì)譜儀或離子阱質(zhì)譜儀。特別有利的是，使用目前常用于鑒定微生物(特別是細(xì)菌）、并且通 常在線性模式下運(yùn)行且無(wú)反射器的相同MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
[0018] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于，僅使用少量微生物和少量體積的液體，只需要很少的簡(jiǎn)單的單 獨(dú)步驟，特別是非?？焖佟Ｌ貏e地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得不需要通過(guò)離心或過(guò)濾從一定體 積的液體中分離出微生物細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)抗藥性質(zhì)譜測(cè)定。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1上方的MALDI質(zhì)譜顯示亞胺培南的質(zhì)量信號(hào)，其在與e-內(nèi)酰胺酶陰性株系孵育 后尚未分解（由箭頭標(biāo)出）。下方的MALDI質(zhì)譜示出在樣品載板上與內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株系孵 育半小時(shí)后，亞胺培南的質(zhì)量信號(hào)消失。豎線示出參考物質(zhì)的位置。
[0020]圖2為示出六個(gè)e-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株系和兩個(gè)e-內(nèi)酰胺酶陰性株系的商logRQ的箱 線圖，各陽(yáng)性株系的l〇gRQ>0.4，各陰性株系的logRQ〈0.2。示出了多次測(cè)量的中位數(shù)和跨度 (spread)〇
[0021 ]圖3示例性示出了微量滴定板大小的具有96個(gè)測(cè)試點(diǎn)（10)的樣品載板，其包被有 一定劑量的抗生素。對(duì)于其他類型的質(zhì)譜儀，也有不同的樣品載板(通常更?。?。特別有利的 是其測(cè)試點(diǎn)（10)具有嵌入疏水環(huán)境中的親水表面的樣品載板。所加入的任何液體即會(huì)自動(dòng) 流到測(cè)試點(diǎn)邊緣。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 通過(guò)以下方法可以快速容易地對(duì)許多微生物種類，特別是細(xì)菌、古生菌和單細(xì)胞 真菌，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，所述方法為從以普通方法培養(yǎng)的菌落或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌落取少量 微生物，將其轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板上，在其上用基質(zhì)溶液消化，干燥，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解 吸電離進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量。使用在各情況中包含大約40至80種蛋白質(zhì)（質(zhì)量范圍通常介于3000 至20000道爾頓)的譜圖，通過(guò)與數(shù)千個(gè)參考譜進(jìn)行近似度分析，來(lái)確定微生物種類。這里所 用術(shù)語(yǔ)"鑒定"視為表示系統(tǒng)分類，即確定其科、屬和種，可能還有亞種。同時(shí)還有在醫(yī)學(xué)和 法律上得到許的包含數(shù)千種微生物物種的參考譜庫(kù)，其包括幾乎所有的臨床相關(guān)物種。
[0023] 然而，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不僅存在快速鑒定的問(wèn)題，而且還存在檢測(cè)出對(duì)常用抗生素的 抗藥的問(wèn)題。如不了解抗藥性，通常無(wú)法對(duì)感染進(jìn)行快速防控。因此，不僅需要快速鑒定微 生物的方法，還需要快速確定并表征其抗藥性的方法。
[0024]自從首次使用青霉素(0-內(nèi)酰胺抗生素）后，細(xì)菌已逐漸發(fā)展出不同類型的抗藥 性。細(xì)菌抵抗內(nèi)酰胺的一種方式是形成酶(0-內(nèi)酰胺酶），這種酶通過(guò)水解作用催化破壞 打開(kāi)內(nèi)酰胺環(huán)，并因此致使內(nèi)酰胺失效。這些酶的催化作用意味著少量的內(nèi)酰胺酶 就足夠破壞大量的內(nèi)酰胺抗生素。目前已知數(shù)百種由不同種類的細(xì)菌形成的內(nèi)酰胺酶 變體。最初通過(guò)突變而產(chǎn)生的酶合成遺傳信息通過(guò)染色體或質(zhì)粒遺傳。質(zhì)粒信息通過(guò)不同 的機(jī)制也可在細(xì)菌之間傳遞，甚至可在不同種類的細(xì)菌之間傳遞（"水平傳遞"），因此可以 使抗藥性細(xì)菌快速蔓延。
[0025]目前有大量?jī)?nèi)酰胺抗生素的衍生物，其中包括若干種青霉素(節(jié)青霉素、口服青 霉素、氨基青霉素、異惡?；嗝顾亍Ⅴ０被嗝顾兀?、以及頭孢菌素、單環(huán)內(nèi)酰胺類和碳 青霉烯類，在此按照功效范圍以升序列出。最有效的內(nèi)酰胺抗生素通常以具有較大的化 學(xué)基團(tuán)作為衍生物，以便對(duì)內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生空間位阻作用。另一方面，新的更有效的內(nèi)酰 胺酶則通過(guò)細(xì)菌突變而不斷形成。令人生畏的"超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBL)"和"碳青霉烯酶" 可以分解大范圍的內(nèi)酰胺抗生素。ESBL最初由內(nèi)酰胺酶上的點(diǎn)突變形成。ESBL和碳青 霉烯酶的基因見(jiàn)于可從細(xì)菌到細(xì)菌水平傳遞的質(zhì)粒。
[0026]攜帶ESBL的細(xì)菌對(duì)青霉素、頭孢菌素（1-4代)及單環(huán)內(nèi)酰胺類有抗藥性。主要是 攜帶ESBL基因的大腸桿菌(E.coli)和克雷伯桿菌屬(Klebsiella)(革蘭氏陰性菌）。微生物 學(xué)家們憂心忡忡，因?yàn)檫@些ESBL抗藥性和碳青霉烯抗藥性快速蔓延。除了甲氧西林抗藥性 金黃色葡萄球菌(MRSA)外，這是感染研究中最令人擔(dān)心的問(wèn)題之一，例如可以參見(jiàn)""Rapid Spread of Carbapenem-Re sis tant Klebsiella pneumoniae in New York City，a New Threat to Our Antibiotic Armamentarium"，S.Bratu et al，Arch Intern Med 2005， 165(12)，1430-1435"。
[0027] 內(nèi)酰胺酶抑制劑是對(duì)抗內(nèi)酰胺酶的一種手段。它們與內(nèi)酰胺類一起施用， 以減弱存在于細(xì)菌中的內(nèi)酰胺酶的作用。已確立的組合用藥為例如克拉維酸+阿莫西林、 舒巴坦+氨芐青霉素、他佐巴坦+哌拉西林。不是所有的組合都有最佳的效果。然而，這些治 療僅可在仔細(xì)鑒定細(xì)菌并謹(jǐn)慎確定其抗藥性后使用，因?yàn)榭梢灶A(yù)見(jiàn)這種手段也會(huì)非?？焖?地失效。
[0028] 本發(fā)明提供一種方法，其只需少量細(xì)菌，并且根據(jù)微生物酶對(duì)抗生素的催化效果， 可以特別簡(jiǎn)單快速地測(cè)量微生物抗藥性。例如，微生物內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致相應(yīng)抗生素的內(nèi) 酰胺環(huán)水解分裂。本方法在一小時(shí)內(nèi)便可測(cè)定微生物抗藥性。優(yōu)選在質(zhì)譜樣品載板上使少 量完整微生物細(xì)胞與一定劑量的抗生素混合，并在其上進(jìn)行培養(yǎng)。借助質(zhì)譜測(cè)量微生物酶 的催化作用所致的抗生素分解。出人意料的是，培育期可以短于一小時(shí)，通常半小時(shí)左右即 可。出人意料的是，優(yōu)選只在室溫和潮濕環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)即可，以防樣品干燥殆盡。
[0029] 此外，本發(fā)明還包括質(zhì)譜樣品支持物(樣品載板)及其制造方法。根據(jù)本發(fā)明的樣 品載板如圖3所示;其優(yōu)選是平的并有多個(gè)測(cè)試點(diǎn)（10)，每個(gè)測(cè)試點(diǎn)均制備有至少一層按計(jì) 量添加的抗生素。樣品載板可以包括具有不同抗生素的層的測(cè)試點(diǎn)，可用于同時(shí)測(cè)試微生 物樣品的不同抗藥性。還可包括具有多層抗生素和抑制劑的測(cè)試點(diǎn)，以用于微生物酶反應(yīng)。 各層還可包含一定劑量的參考物質(zhì)，其既可用于重新校正質(zhì)量標(biāo)度，又可用于測(cè)定抗生素 (包括其分解產(chǎn)物)質(zhì)量信號(hào)的量變。
[0030] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選直接在質(zhì)譜樣品載板上混合少量微生物和定量的合 適的抗生素并在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以此方式測(cè)定微生物抗藥性。在此方面出人意料的是， 在室溫下只經(jīng)過(guò)半小時(shí)的培養(yǎng)期，然后干燥并制備MALDI樣品后，即可檢測(cè)微生物酶對(duì)抗生 素的分解，如果在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀中直接檢測(cè)MALDI樣品，則不需要從樣品載板 移除微生物。
[0031]最優(yōu)選的方法如下所述(詳細(xì)地分解成單獨(dú)的方法步驟）：
[0032] (a)提供樣品載板，所述樣品載板至少在一個(gè)測(cè)試點(diǎn)上具有包含一定劑量的抗生 素的層；
[0033] (b)將微生物施加至所述抗生素的層上，然后將液體施加在此測(cè)試點(diǎn)上；
[0034] (c)在測(cè)試點(diǎn)上進(jìn)行培養(yǎng)，特別是在潮濕環(huán)境及室溫條件下；
[0035] (d)干燥；
[0036] (e)制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)的樣品；
[0037] (f)在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀(特別是飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)中進(jìn)行質(zhì)譜的測(cè)量;和
[0038] (g)評(píng)估質(zhì)譜以鑒定抗藥性。
[0039] 測(cè)試點(diǎn)上的層包含例如大約0.1至2微克（優(yōu)選0.5微克）的抗生素。還可包含已知 量的參考物質(zhì)。與分類學(xué)鑒定類似，只將大約1〇3至1〇7個(gè)微生物涂到各測(cè)試點(diǎn)上。將一至三 微升(優(yōu)選約兩微升)液體施加到各測(cè)試點(diǎn)上以進(jìn)行培養(yǎng)。同一樣品載板的不同測(cè)試點(diǎn)可以 包含具有不同抗生素的層。各層不僅可含抗生素，還可含其他抑制劑以降低微生物酶的效 力。
[0040] 微生物細(xì)胞既可人工涂抹，也可自動(dòng)化施加（例如通過(guò)接種系統(tǒng)）。對(duì)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 表面上的微生物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法已在文件DE 102012011647A1中披露，其中通過(guò)直接 接觸將微生物細(xì)胞從平板營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的表面轉(zhuǎn)移到樣品載板的接觸表面上。本文所述樣品 載板既可以是表面積大的平板，也可以是端面與菌落的微生物細(xì)胞接觸的針狀樣品載板。 針狀樣品載板的接觸表面很小，只有單個(gè)菌落的微生物才能轉(zhuǎn)移到針狀樣品載板上。微生 物細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，使針狀樣品載板的端面基本與轉(zhuǎn)接板的表面平齊，從而可將針狀樣品載板 插入轉(zhuǎn)接板。在本發(fā)明中，針狀樣品載板的末端可以包被一種或多種抗生素。
[0041] 下文以廣譜亞胺培南的一個(gè)例子(碳青霉烯），介紹根據(jù)本發(fā)明的方法：
[0042]質(zhì)譜MALDI樣品載板通常有很多（48-386)明確標(biāo)記的測(cè)試點(diǎn)（直徑兩至四毫米）。 疏水環(huán)境下的親水測(cè)試點(diǎn)是特別有利的。圖3舉例說(shuō)明有96個(gè)測(cè)試點(diǎn)（10)的此類樣品載板； 它為微量滴定板的大小，但更小型號(hào)的樣品載板也是市售可得的。為了制備根據(jù)本發(fā)明的 樣品載板，樣本載板的至少一些測(cè)試點(diǎn)可各自包被有兩微升的亞胺培南溶液(或相當(dāng)?shù)目?生素)并干燥，以使樣本載板在各情況中每個(gè)測(cè)試點(diǎn)含有〇. 5微克的亞胺培南。干燥后，采取 防潮措施存放樣本載板，例如使用收縮包裝或提供干燥劑。以此方式制備的樣品載板市售 可得，所以不需要在實(shí)驗(yàn)室完成這一制備步驟。
[0043]使用適當(dāng)?shù)墓ぞ撸ɡ缧l(wèi)生清潔牙簽），以與微生物鑒定涂片制備相同的方式，將 在瓊脂板上以菌落方式生長(zhǎng)的細(xì)菌人工涂到干亞胺培南層上。這可在同一步驟中完成，并 且可以使用用于制備微生物鑒定樣品的相同牙簽。用于鑒定測(cè)的試點(diǎn)沒(méi)有抗生素。當(dāng)所研 究的所有細(xì)菌都施加到樣品載板的測(cè)試點(diǎn)后，將2微升10毫摩爾的碳酸氫銨緩沖液(pH 8) 移液到各測(cè)試點(diǎn)，由此亞胺培南與細(xì)菌彼此混合，并且細(xì)菌細(xì)胞大多未被消化。隨后在保持 潮濕的箱中在室溫下培養(yǎng)樣品載板30分鐘，以防測(cè)試點(diǎn)上的樣品過(guò)早干燥殆盡。培養(yǎng)期過(guò) 后，在樣品載板上干燥樣品，然后包被只含極少量三氟乙酸的基質(zhì)溶液，以使細(xì)菌細(xì)胞不被 消化。使用的基質(zhì)是在水的混合物中濃度為10毫克/毫升的氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、 50%乙腈和0.2%三氟乙酸。再次干燥后，以普通的方法使用MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀獲得該 制備樣品的質(zhì)譜。
[0044]通常求出差異值LogRQn以評(píng)估質(zhì)譜：
[0045]
對(duì)于內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性微生物，結(jié)果通常為大 于零的值，對(duì)于內(nèi)酰胺酶陰性微生物，則為小于零的值。
[0046] 圖1上方示出使用根據(jù)本發(fā)明的方法和樣品載板，由對(duì)亞胺培南易感的微生物測(cè) 得的MALDI質(zhì)譜。圖中箭頭示出尚未分解的亞胺培南的質(zhì)量信號(hào)。圖1下方示出測(cè)得的抗藥 性微生物的MALDI質(zhì)譜，其酶在半小時(shí)內(nèi)便將亞胺培南定量水解，所以箭頭所示的亞胺培南 質(zhì)量信號(hào)已消失。酶的分解反應(yīng)非常迅速，提是其未受到底物逐漸減少的影響，每個(gè)分子反 應(yīng)的時(shí)間大約是1到100毫秒，不同e-內(nèi)酰胺酶的特征差異也有所不同。
[0047]所示出的亞胺培南的例子的不同尋常之處在于，酶水解的亞胺培南在MALDI質(zhì)譜 中沒(méi)有質(zhì)量信號(hào)，這使得在這種情況中需要檢測(cè)亞胺培南分子的分解。這需要內(nèi)部參考物 質(zhì)，其最好已被添加到樣品載板上的亞胺培南制備物中。例如，硫胺可用作內(nèi)部參考物質(zhì)。 圖1所示兩個(gè)質(zhì)譜中的豎線示出參考物質(zhì)的位置。在此應(yīng)該注意，也可隨后將參考物質(zhì)添加 到例如基質(zhì)溶液中。
[0048] 在評(píng)估質(zhì)譜時(shí)，內(nèi)部參考物質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)一方面可用于重新校準(zhǔn)質(zhì)譜的質(zhì)量軸； 另一方面(特別是對(duì)亞胺培南來(lái)說(shuō)），還可用于計(jì)算分解率(水解率）。如上所述，亞胺培南是 一種特殊情況，因?yàn)榧词顾鼈兇嬖?，在MALDI質(zhì)譜中也檢測(cè)不到水解產(chǎn)物(對(duì)于例如電噴霧 電離(ESI)等其他類型的電離，可以檢測(cè)到水解產(chǎn)物）。為了至少檢測(cè)到非水解的亞胺培南
峰的降低，使用內(nèi)部參考物質(zhì)計(jì)算水解率： 在將水解率歸 〇 一化至合適的負(fù)控和正控后，歸一化的水解率norm. logRQ>0.4表示抗藥性微生物，而對(duì)易 感微生物測(cè)得norm. logRQ的值〈0.2。圖2顯示兩種易感和六種抗藥性微生物的結(jié)果，其使用 包被在根據(jù)上述制備方法的樣品載板上的亞胺培南測(cè)得。
[0049] 原則上，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用任何質(zhì)譜儀均可進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量，但使用目前 常用于鑒定微生物(特別是細(xì)菌），并且通常在線性模式下運(yùn)行的MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀特 別有利。圖1所示的質(zhì)譜是使用MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在線性模式下獲得的。
[0050]通常，先以瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)待分析的樣品微生物直至其形成菌落，以便隨后 使用工具將其施加到樣品載板的測(cè)試點(diǎn)，以供鑒定和測(cè)定抗藥性。對(duì)于鑒定，通常需要注 意，只對(duì)單一菌落的微生物取樣。然而，對(duì)于測(cè)定抗藥性，通常有利的是混合多個(gè)菌落的微 生物(至少五個(gè)左右），以便同時(shí)獲得混合抗藥性的有用結(jié)果。
[0051]另一種重要的培養(yǎng)基類型是血液培養(yǎng)基，其用于診斷的或疑似的膿毒血癥。通常 使用非常廣譜的亞胺培南立即治療患者，因?yàn)槟摱狙Y極其危險(xiǎn)，死亡率很高。培養(yǎng)數(shù)小時(shí) 后，血細(xì)胞通過(guò)適當(dāng)方法破壞，并且膿毒血癥微生物可通過(guò)小心的離心或過(guò)濾進(jìn)行沉淀，以 不破壞微生物。一些微生物細(xì)胞可用于分類學(xué)鑒定，另一些可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)對(duì)亞胺培南 的抗藥性。如果存在對(duì)亞胺培南的抗藥性，則可通過(guò)組合用藥繼續(xù)治療，藥物選擇可以更加 明確，因?yàn)橥ㄟ^(guò)同時(shí)進(jìn)行的鑒定已經(jīng)知道微生物種類。
[0052] 一般來(lái)說(shuō)，不只關(guān)注對(duì)單一抗生素的抗藥性。通過(guò)引入多種不同類型的抗生素(其 可沉積到同一樣品載板的不同測(cè)試點(diǎn)上，也可沉積到一個(gè)單一的測(cè)試點(diǎn)上），根據(jù)本發(fā)明的 方法還可開(kāi)發(fā)出多重抗藥性測(cè)試?？芍苽浜幌盗胁煌股氐臉悠份d板，如果需要?jiǎng)t使 用參考物質(zhì)。還可在其他測(cè)試點(diǎn)與抑制劑一起施加抗生素(組合用藥）。在在不同測(cè)試點(diǎn)采 用不同抗生素的抗藥性測(cè)試中，可使用相同的工具將待測(cè)微生物分布到各個(gè)測(cè)試點(diǎn)上。緩 沖液的移液操作、培養(yǎng)、制備和質(zhì)譜測(cè)量如在上例中說(shuō)明的那樣進(jìn)行?？墒褂眠@樣的程序完 成評(píng)估，該程序還控制質(zhì)譜儀的測(cè)量，并了解對(duì)于不同測(cè)試點(diǎn)的質(zhì)譜評(píng)估的略微不同的參 數(shù)。由此一次性測(cè)得對(duì)不同抗生素的抗藥性，所需時(shí)間只比測(cè)定對(duì)一種抗生素的抗藥性略 長(zhǎng)。
[0053]還存在混合樣品的情況，其中關(guān)注點(diǎn)較少專注于鑒定，而是更多地專注于立即測(cè) 定抗藥性。例如，了解鼻粘膜拭子或鼻分泌物中是否存在抗藥性細(xì)菌是至關(guān)重要的。通常的 程序是，使用鼻或口腔黏膜拭子研究住院患者或醫(yī)院?jiǎn)T工是否為微生物抗藥性的載體。此 類拭子或鼻分泌物可以作為微生物樣品直接施加在樣品載板的經(jīng)適當(dāng)預(yù)制的測(cè)試點(diǎn)上，對(duì) 于此目的，鑒于醫(yī)院中此類抗藥性測(cè)定的數(shù)量大，測(cè)試點(diǎn)優(yōu)選有多于一種抗生素。對(duì)于其他 類型的感染(例如傷口化膿），情況與此類似。
[0054]本發(fā)明不限于此處所述實(shí)施方案或例子。例如，可由平的樣品載板借助DESI(解吸 電噴霧電離)進(jìn)行電離，或者還可從平板培養(yǎng)基的表面（用作樣品載板，并且其上施加有含 有抗生素的液體)直接進(jìn)行。除MALDI電離外，例如，還可由平的樣品載板進(jìn)行激光解吸，然 后進(jìn)行化學(xué)電離。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于測(cè)定微生物樣品對(duì)抗生素的抗藥性的方法，其中在樣品載板的測(cè)試點(diǎn)上在 一定體積的液體中將所述微生物樣品和所述抗生素混合，并且在所述測(cè)試點(diǎn)上通過(guò)質(zhì)譜測(cè) 量進(jìn)行分析，從而確定所述抗生素是否經(jīng)酶催化改變。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物樣品含有完整的微生物細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所述一定體積的液體中的培養(yǎng)期小于一個(gè)小時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中在室溫下進(jìn)行在所述一定體積的液體中的培 養(yǎng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4所述的方法，其中對(duì)每個(gè)測(cè)試點(diǎn)施加103個(gè)至107個(gè)微生物細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求2至5所述的方法，其中在所述微生物不被消化的條件下，在所述測(cè)試 點(diǎn)上制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離的測(cè)量樣品。7. 根據(jù)權(quán)利要求2至6之一所述的方法，包括以下步驟： (a) 提供樣品載板，所述樣品載板至少在一個(gè)測(cè)試點(diǎn)上具有包含一定劑量的所述抗生 素的層； (b) 將所述完整的微生物細(xì)胞施加至所述抗生素的層上，并且施加所述液體； (c) 在所述測(cè)試點(diǎn)上進(jìn)行培養(yǎng)； (d) 干燥； (e) 制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)的測(cè)量樣品； (f) 在具有MALDI離子源的質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)譜的測(cè)量;和 (g) 評(píng)估所述質(zhì)譜以鑒定抗藥性。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述測(cè)試點(diǎn)上的所述層包含大約0.1微克至2微克 的抗生素，優(yōu)選0.5微克的抗生素。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述測(cè)試點(diǎn)上制備用于基質(zhì)輔助激光解吸電離 的測(cè)量樣品，其中所述微生物樣品中的微生物被消化，在質(zhì)譜測(cè)量中同時(shí)采集微生物蛋白 質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)，所述質(zhì)量信號(hào)使得可對(duì)微生物進(jìn)行分類學(xué)鑒定和/或在其抗藥性方面進(jìn)行 進(jìn)一步表征。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物樣品包含被消化的微生物。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10之一所述的方法，其中在所述混合之后將所述樣品載板保持在 潮濕環(huán)境中，或者在所述混合之后向所述測(cè)試點(diǎn)上的所述一定體積的液體中添加額外的液 體，從而防止所述一定體積的液體在指定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)干燥殆盡。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11之一所述的方法，其中所述一定體積的液體小于10微升。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12之一所述的方法，其中在所述測(cè)試點(diǎn)上在所述一定體積的液體 中，將所述微生物樣品與多于一種抗生素混合。14. 用于微生物樣品的抗藥性質(zhì)譜測(cè)定的樣品載板，其中所述樣品載板具有多個(gè)測(cè)試 點(diǎn)，并且至少一個(gè)測(cè)試點(diǎn)包被有一定劑量的一種或多種抗生素。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的樣品載板，其中不同的測(cè)試點(diǎn)包被有不同的抗生素。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的樣品載板，其中所述至少一個(gè)測(cè)試點(diǎn)還包被有一種或 多種參考物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK106053586SQ201610216917
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月8日 公開(kāi)號(hào)201610216917.4, CN 106053586 A, CN 106053586A, CN 201610216917, CN-A-106053586, CN106053586 A, CN106053586A, CN201610216917, CN201610216917.4
【發(fā)明人】卡特里·斯帕比爾, 貝婭特麗克絲·韋格曼
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