一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法
【專利摘要】為解決以往手工過分析柱收集或淀粉與非淀粉成分分離純化過程中預糊化對淀粉的損失的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法。一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，該方法包括如下步驟：步驟1：稻米粉的前處理：碾精度為85?95%的精米磨成過0.42 mm或0.59 mm細度篩的精米粉；步驟2：淀粉純化:脫去脂肪和可溶性糖；步驟3:糊化淀粉和直、支鏈分離，步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)，采用pH=4.75的0.05 mol/L 乙酸銨溶液作為流動相，流速為1.0 ml/min；步驟5：系列標樣設(shè)置和標準曲線繪制。
【專利說明】
一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種淀粉的測定方法，特別涉及一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法。
【背景技術(shù)】
[0002]食用稻米胚乳中的最主要成分是淀粉，約為80%。稻米淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉是D-葡萄糖基以a-(l，4)糖苷鍵連接的多糖鏈，分子中有200個左右葡萄糖基，分子量I?2 X 15，聚合度990，空間構(gòu)象卷曲成螺旋形，每一回轉(zhuǎn)為6個葡萄糖基，為直鏈狀分子，很少分枝。支鏈淀粉分子中除有a-(I，4)糖苷鍵的糖鏈外，還有a-(I，6)糖苷鍵連接的分支，分子中含300?400個葡萄糖基，分子量>2 X 17，聚合度7200;是高度分枝的葡萄糖苷鏈，支鏈平均長度約為20個葡萄糖殘基。淀粉級分的比例及其分子量、分子結(jié)構(gòu)等對天然淀粉的特性((Lie C，et al.,Cereal Chem，1996，73(4):415-420))，稻米食品的膨脹率、吸水率、粘度和硬度等物化特性都有較大的影響(李天真，糧食與飼料工業(yè)，1998，(5):7-9;熊善柏等，糧食與飼料加工.2001，(5): 14-16)。如熊善柏等2003年報道稻米支鏈淀粉的分子量為47 X 106g/mol (秈稻)?235 X 106g/mol (糯稻)，直鏈淀粉的分子量為0.44 X106g/mol(秈稻)?1.62\10%/!1101(粳稻);且淀粉分子特性與碘蘭值、特征粘度有較大相關(guān)性((熊善柏等，中國糧油學報，2003，18 (2): 5-8))。大米淀粉主要由支鏈淀粉、中間級分和直鏈淀粉組成，大米支鏈淀粉的平均相對分子質(zhì)量為49.67 X 106g/mol?957.69xl06g/mol，大米直鏈淀粉的平均相對分子質(zhì)量為1.9xl06g/mol?5.91xl06g/mol，支鏈淀粉的分子量分布比直鏈淀粉窄。大米淀粉的各級分含量不同，其中中間級分含量最大，在研究范圍內(nèi)，支鏈淀粉含量為11.52-48.62 %，中間級分含量為28.74-69.33% ,直鏈淀粉含量為6.26-40.77%。天然淀粉的特征粘度與直鏈淀粉及支鏈淀粉的平均分子量、摩爾比之間呈較好的指數(shù)模型(程科，2006，大米淀粉物化特性、分子結(jié)構(gòu)及其相關(guān)性研究，碩士論文)。李玥等2007年得到不同品種的大米淀粉中分離出的直鏈淀粉的重均分子量范圍為3.29 X 15?2.75X 106((農(nóng)業(yè)工程學報，2007,23(11): 36-41))。但已報道的前處理方法步驟多，容易帶來淀粉損失或污染，尤其有些方法采用磁性攪拌子攪拌會破壞淀粉結(jié)構(gòu)而影響淀粉結(jié)構(gòu)分子量測定結(jié)果。Ward等(2006) (B1macromolecules, 2006,7:866-876)(報道用的多角度激光散色儀來測定熱水溶性淀粉的分子量，但此檢測器價格昂貴，測定的絕對分子質(zhì)量。張衛(wèi)東等(2015)(藥物分析雜志，2015，35(7):1213-1216)報道多角度激光散色儀法測定普魯蘭糖的重均相對分子質(zhì)量結(jié)果與凝膠滲透法測定結(jié)果接近，后者只需配示差檢測器和標樣，因此成本低也易操作。2013年楊小雨等(中國農(nóng)業(yè)科學，46(6):3488-3495)報道用高效液相提幾排阻色譜法測定稻米支鏈淀粉鏈長的相對分子質(zhì)量，用的是Shodex SB色譜柱和Tris+Nacl為流動相，用的是丁醇沉淀法提取支鏈淀粉，一則是前處理復雜，會影響或破壞原生態(tài)淀粉，二是測樣時間長，要I小時。因此本發(fā)明簡化前處理，最大程度保留淀粉原狀態(tài);采用水溶性柱效高的Ultrahydrogel 120和250色譜柱，采用醋酸銨為流動相，用系列由高到低的不同分子量的普魯蘭多糖標樣作標準曲線而來計算預測直鏈和支鏈淀粉的相對分子量。此發(fā)明不僅可以同時測定直支淀粉的相對分子量，而且樣品測定時間約半小時，數(shù)據(jù)重復性好，容易操作，具有在稻米品質(zhì)鑒定和品種篩選育種及食品淀粉加工行業(yè)中均有著很好的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決以往手工過分析柱收集或淀粉與非淀粉成分分離純化過程中預糊化對淀粉的損失的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0005]—種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，該方法包括如下步驟:
[0006]步驟I:稻米粉的前處理:碾精度為85-95 %的精米磨成過0.42mm或0.59mm細度篩的精米粉；
[0007]步驟2:淀粉純化:脫去脂肪和可溶性糖
[0008]精米粉與100%色譜純甲醇混勻并于100°C加熱10分鐘后于10，000g離心5分鐘后收集沉淀物，此步驟重復2-3次，并合并沉淀物;精米粉與甲醇的用量比為0.6mg/l.0ml;
[0009]步驟3:糊化淀粉和直、支鏈分離
[0010]步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)
[0011]采用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)柱子，采用ρΗ = 4.75的0.05moVL乙酸銨溶液作為流動相，流速為1.0ml/min，柱保溫箱溫度為40 V和示差檢測器；
[0012]步驟5:系列標樣設(shè)置和標準曲線繪制
[0013]采用系列分子量的糖多聚物為標樣(varian,Polysaccaride calibrat1n kit)，繪制標準曲線和預測所測樣品直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對分子量大小。
[0014]作為優(yōu)選，所述步驟3的具體參數(shù)是:取沉淀物加入0.25mol/LNaOH溶液中，沉淀物與NaOH溶液的比例為50mg: 1.0ml，糊化完全，混勻后加入適量pH=4.0的0.5mol/L醋酸鈉溶液，再入適量異淀粉酶(酶活大于250U)于40°C反應2hr以上，直至反應完全;然后，沸水加熱5分鐘，10，OOOg離心5-10分鐘，取上清液;加入適量離子交換樹脂AG501-X8，于50°C水浴搖床30min，后16000g離心10分鐘，過0.45ym PVDF小柱，保持40°C后進行凝膠滲透色譜進樣測定。
[0015]作為優(yōu)選，糊化的方法是沸水浴5-10分鐘或50°C烘箱2-3小時或室溫過夜至溶液清澈。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟5的具體參數(shù)是:采用Mp為344000，107000，47100，9600和5900
五點標準曲線，得到標準曲線，并由此預測所測樣品的直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對分子量。
[0017]本發(fā)明利用凝膠滲透色譜儀，簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量，克服以往手工過分析柱收集或淀粉與非淀粉成分分離純化過程中預糊化對淀粉的損失，或是分析柱子串聯(lián)多而導致分析時間過長，基線漂移等問題。本新型提供了簡化淀粉純化步驟，用異淀粉酶分離直、支淀粉，利用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)水溶性色譜柱子和分布范圍較廣的系列不同相對分子量的普魯蘭多糖標樣，該方法快速高效，數(shù)據(jù)重復性好，在水稻品質(zhì)改良和食品淀粉加工等中均有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0018]圖1是水稻樣本一的直鏈淀粉和支鏈淀粉圖；
[0019]圖2是水稻樣本二的直鏈淀粉和支鏈淀粉圖；
[0020]圖3是水稻樣本三的直鏈淀粉和支鏈淀粉圖。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
[0022]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0023]實施例1
[0024]—種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，步驟如下:
[0025]步驟1:稻米粉的前處理:采用精米粉過0.42mm細度篩的米粉；
[0026]步驟2:精米粉脫除脂肪和可溶性糖
[0027]精米粉稱樣量為50mg入1ml離心管，加入30ml 100%色譜純甲醇，于沸水浴10分鐘，10，OOOg離心5分鐘，倒去懸浮液。沉淀物重復步驟2，2-3次，合并沉淀物。
[0028]步驟3:稱1mg沉淀物于2ml離心管后加入0.2ml 0.25mol/L NaOH，50°C烘箱2小時?；靹蚝蠹尤?0μ1 0.5mol/L醋酸鈉(ρΗ = 4.0)，再加入20μ1異淀粉酶(酶活大于250U)于40°C恒溫水浴搖床反應2hr。后，沸水加熱5分鐘，10，OOOg離心5分鐘，取上清液;加入0.2g左右離子交換樹脂AG501-X8，于50°C水浴搖床30min,后16000g離心10分鐘，過0.45μπι PVDF小柱，保持40°C后直接進樣測定。
[0029]步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)采用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)柱子，采用
0.05mol/L乙酸銨(PH=4.75),0.02%疊氮化鈉，流速為1.0ml/min，柱保溫箱溫度為40 °C和示差檢測器。
[0030]步驟5:糖多聚糖的標樣，采用質(zhì)均相對分子量Mp為344000,107000,47100,9600和5900五點標準曲線，得到的直鏈淀粉的質(zhì)均相對分子量Mp為253252，支鏈淀粉的長鏈和短中鏈的質(zhì)均相對分子量分別為6345和1053。經(jīng)18度激光散色的檢測器測定比較，兩者的直鏈淀粉和支鏈淀粉的質(zhì)均相對分子量之間的相對相差4.3%。數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。
[0031 ]圖1是水稻樣本一的直鏈和支鏈淀粉圖，其中第一峰，保留時間在14.8min為直鏈淀粉;第二和第三峰均為支鏈淀粉部分，保留時間分別為18.4050mir^P19.65min，分別為支鏈淀粉的長鏈和中短鏈部分。
[0032]實施例2
[0033]—種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，步驟如下:
[0034]步驟1:稻米粉的前處理:采用精米粉過0.42mm細度篩的米粉；
[0035]步驟2:精米粉脫除脂肪和可溶性糖
[0036]精米粉稱樣量為10mg入1ml離心管，加入60ml 100 %色譜純甲醇，于沸水浴10分鐘，10，OOOg離心5分鐘，倒去懸浮液。沉淀物重復步驟2，2次，合并沉淀物。
[0037]步驟3:稱2011^沉淀物于21111離心管后加入0.41111 0.25mol/L NaOH，50°C烘箱2小時。混勻后加入80μ1 0.5mol/L醋酸鈉(ρΗ = 4.0)，再加入20μ1異淀粉酶(酶活大于250U)于40°C恒溫水浴搖床反應2hr。后，沸水加熱5分鐘，10，OOOg離心5分鐘，取上清液;加入0.35g左右離子交換樹脂AG501-X8，于50°C水浴搖床30min，后16，OOOg離心1分鐘，過0.45μηιPVDF小柱，保持40 0C后直接進樣測定。
[0038]步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)采用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)柱子，采用
0.05mol/L乙酸銨(pH=4.75),0.02%疊氮化鈉，流速為I.0ml/min，柱保溫箱溫度為40 °C和示差檢測器。
[0039]步驟5:糖多聚糖的標樣，采用Mp為344000,107000,47100,9600和5900五點標準曲線。此樣品為糯稻，沒有直鏈淀粉含量，得到支鏈淀粉的長鏈和短中鏈的質(zhì)均相對分子量分別為5429和951。經(jīng)18度激光散色的檢測器測定比較，兩者的直鏈淀粉和支鏈淀粉的質(zhì)均相對分子量之間的相對相差5.3%。數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。圖2是水稻樣本二的直鏈和支鏈淀粉圖。
[0040]實施例3
[0041]—種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，步驟如下:
[0042]步驟1:稻米粉的前處理:采用精米粉過0.42mm細度篩的米粉；
[0043]步驟2:精米粉脫除脂肪和可溶性糖
[0044]精米粉稱樣量為10mg入1ml離心管，加入60ml 100 %色譜純甲醇，于沸水浴10分鐘，10，OOOg離心5分鐘，倒去懸浮液。沉淀物重復步驟2，3次，合并沉淀物。
[0045]步驟3:稱2011^沉淀物于21111離心管后加入0.41111 0.25mol/L NaOH，50°C烘箱2小時?；靹蚝蠹尤?0μ1 0.5mol/L醋酸鈉(ΡΗ = 4.0)，再加入20μ1異淀粉酶(酶活大于250U)于40°C恒溫水浴搖床反應2hr。后，沸水加熱5分鐘，10，OOOg離心5分鐘，取上清液;加入0.35g左右離子交換樹脂AG501-X8，于50°C水浴搖床30min，后16，OOOg離心1分鐘，過0.45μηιPVDF小柱，保持40 0C后直接進樣測定。
[0046]步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù)采用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)柱子，采用
0.05mol/L乙酸銨(PH=4.75),0.02%疊氮化鈉，流速為1.0ml/min，柱保溫箱溫度為40 °C和示差檢測器。
[0047]步驟5:糖多聚糖的標樣，采用Mp為344000,107000,47100,9600和5900五點標準曲線。得到的直鏈淀粉質(zhì)均相對分子量為221657，，得到支鏈淀粉的長鏈和短中鏈的質(zhì)均相對分子量分別為7428和1420。經(jīng)18度激光散色的檢測器測定比較，兩者的直鏈淀粉和支鏈淀粉的質(zhì)均相對分子量之間的相對相差4.8%。數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。圖3是水稻樣本三的直鏈和支鏈淀粉圖。
[0048]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權(quán)項】
1.一種簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，其特征在于該方法包括如下步驟: 步驟I:稻米粉的前處理:碾精度為85-95%的精米磨成過0.42 mm或0.59 mm細度篩的精米粉； 步驟2:淀粉純化:脫去脂肪和可溶性糖 精米粉與100%色譜純甲醇混勻并于100°C加熱10分鐘后于10，000 g離心5分鐘后收集沉淀物，此步驟重復2-3次，并合并沉淀物;精米粉與甲醇的用量比為0.6mg/1.0ml ； 步驟3:糊化淀粉和直、支鏈分離； 步驟4:凝膠滲透色譜儀器參數(shù) 采用Ultrahydrogel 120和250串聯(lián)柱子，采用ρΗ=4.75的0.05 mo I/L乙酸銨溶液作為流動相，流速為1.0 ml/min,柱保溫箱溫度為40°C和示差檢測器； 步驟5:系列標樣設(shè)置和標準曲線繪制 采用系列分子量的糖多聚物為標樣，繪制標準曲線和預測所測樣品直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對分子量大小。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，其特征在于所述步驟3的具體參數(shù)是:取沉淀物加入0.25 mol/L NaOH溶液中，沉淀物與NaOH溶液的比例為50 mg: 1.0 ml，糊化完全，混勻后加入適量pH=4.0的0.5 mol/L醋酸鈉溶液，再入適量異淀粉酶(酶活大于250 U)于40°C反應2 hr以上，直至反應完全;然后，沸水加熱5分鐘，10，000 g離心5-10分鐘，取上清液;加入適量離子交換樹脂AG501-X8，于50°C水浴搖床30 min,后16000 g離心10分鐘，過0.45μπι PVDF小柱，保持40°C后進行凝膠滲透色譜進樣測定。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，其特征在于:糊化的方法是沸水浴5-10分鐘或50 °C烘箱2-3小時或室溫過夜至溶液清澈。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡化測定水稻直鏈淀粉和支鏈淀粉相對分子量的凝膠滲透色譜法，其特征在于:所述步驟5的具體參數(shù)是:采用Mp為344000，107000，47100，9600和5900五點標準曲線，得到標準曲線，并由此預測所測樣品的直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對分子量。
【文檔編號】G01N30/02GK106053617SQ201610235197
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】謝黎虹, 胡培松, 唐紹清, 魏祥進, 焦桂愛, 邵高能, 圣忠華
【申請人】中國水稻研究所