一種熟肉制品中n?二甲基亞硝胺檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熟肉制品中N?二甲基亞硝胺檢測方法，所述檢測方法包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液溶液配制、待測樣品溶液的制備、待測樣品定性檢測和定量檢測等步驟。本發(fā)明通過簡便、快速、高效的待測樣品制備方法，并利用GC?MS/MS分析儀，通過外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測、計算得到N?二甲基亞硝胺的含量。該方法與傳統(tǒng)的氣相色譜?質(zhì)譜儀法相比，省去水蒸氣蒸餾和水浴濃縮等步驟，操作更簡單，所需儀器減少；且檢出限更低，準(zhǔn)確性更高。
【專利說明】
一種熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002 ] N-二甲基亞硝胺在環(huán)境中廣泛存在。在魚、肉等動植食品中可達(dá)0.1 _300yg/kg。在 煙草、蔬菜、谷類中均可檢出，屬高毒，已確定為動物致癌物，經(jīng)消化道、呼吸道吸收迅速，經(jīng) 皮膚吸收緩慢，靶器官主要為肝和腎。
[0003 ] 酒類、肉及魚類腌制品、豆制品等食品中含有N-二甲胺亞硝基、N-二乙胺亞硝基等 等。亞硝胺類化合物有一定的急性毒性、強(qiáng)致癌性，主要引起肝壞死出血，其致癌性更為人 們所關(guān)注，迄今已發(fā)現(xiàn)的亞硝胺有300多種；其中N-二甲基亞硝胺是極具代表性的物質(zhì)之 一。食物中的亞硝胺的來源如下：（1)腌制時鹽中亞硝酸鹽的作用，如咸魚、咸肉等；（2)在加 熱干燥時，空氣中氮氣被氧化成氮氧化物的作用，如啤酒、奶粉、豆制品。近年來對于揮發(fā)性 亞硝胺的檢測顯示食品和飲料以及肉類、酒類中存在的N-二甲胺亞硝胺在yg/kg或yg/L數(shù) 量級，所以需要建立一種高靈敏度和高選擇性的方法對痕量N-二甲胺亞硝胺進(jìn)行檢測。
[0004] 我國曾規(guī)定肉類中的N-二甲胺亞硝胺含量應(yīng)該蘭3yg/kg，目前，GB/T5009.26-2003規(guī)定的儀器檢測方法中氣相色譜-質(zhì)譜儀法，N-二甲基亞硝胺分離步驟繁瑣，儀器成本 高;最新食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》征求意見稿采用三種方法： 第一法為氣相色譜一氮化學(xué)反光檢測器法、第二法為氣相色譜-熱能分析儀法、第三法為氣 相色譜高分辨質(zhì)譜法，這些方法最大缺點就是對儀器的特異性要求高，檢測物分離步驟繁 瑣，時間成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，能夠減少分離 步驟，減少時間成本低，提高準(zhǔn)確率。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，所述檢測方法包括如下步驟：
[0008] (1)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稱取N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn) 品，用乙腈配制成N-二甲基亞硝胺的濃度為1000mg/L的儲備液，于4°C冰箱中避光保存;然 后將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈配制成濃度為〇? 5ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn) 品曲線點備用；
[0009] (2)待測樣品溶液的制備：
[0010] A、稱取待測樣品5.00g，加入乙腈中含1%醋酸的溶液10mL，在2500r/min轉(zhuǎn)速下的 渦混振蕩器中渦混5min;
[0011 ] B、再加入5g無水硫酸鎂、lg氯化鈉和lg梓檬酸二鈉后禍混3min，然后在5000r/min 轉(zhuǎn)速下離心5min后收集上清液；
[0012] C、吸取6mL上清液移入裝有0? 5gPSA、0? SgC^Plg無水硫酸鎂的15mL離心管中，渦 混3min，5000r/min離心5min后再次收集上清液；
[0013] D、再次取上清液，用〇. 22mi有機(jī)濾膜過濾后作為待測樣品溶液；
[0014] (3)待測樣品定性和定量檢測：
[0015] A、取1.0此待測樣品溶液進(jìn)樣，用三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，得 到待測樣品溶液的總離子流色譜圖、定量離子對色譜圖和定性離子對相對豐度色譜圖；
[0016] B、將步驟（1)配制的不同濃度的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用三重四級桿氣相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，檢測條件與待測樣品溶液相同，獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流色 譜圖、定量離子色譜圖和定性離子對相對豐度色譜圖；
[0017] C、以N-二甲基亞硝胺的定量離子對和定性離子對的色譜峰制作得到N-二甲基亞 硝胺標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] D、根據(jù)待測樣品溶液中N-二甲基亞硝胺的定量離子對和定性離子對的色譜峰，結(jié) 合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣液中N-二甲基亞硝胺的濃度C，并按以下公式計算得到熟肉制 品中N-二甲基亞硝胺的含量X，含量計算公式為：
[0019] X = C*V/(M*1000)
[0020] 其中X為待測樣品中N-二甲基亞硝胺的含量，單位為mg/kg;C是待測樣品中N-二甲 基亞硝胺的濃度，單位為ng/mL;V是待測樣品溶解體積，單位為mL;M是待測樣品質(zhì)量，單位 為g。
[0021] 優(yōu)選地，所述定量離子對為74-42.1，定性離子對為73.9-42.1。
[0022]優(yōu)選地，三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測時所采用的參數(shù)分別為：
[0023] A、色譜條件
[0024]色譜柱為安捷倫HP-IN0WAX毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度250 °C，不分流進(jìn)樣，載氣 (氦氣多99.999 % )流速0.887mL/min，進(jìn)樣量1此;程序升溫:初始溫度60°C保持lmin，以40 °(：/1^11升到120°(：，然后再以5°(：/111111升到250°(：保持3111111。
[0025] B、質(zhì)譜條件
[0026] 離子源:230°C，四級桿：150°C，傳輸線：250°C，掃描模式MRM，電離能量70eV，溶劑 延遲 4.5min〇
[0027]其中，上述待測樣品為N-二甲基亞硝胺的判定方法為：待測樣品和N-二甲基亞硝 胺標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相同，在相同的定量離子對為74-42.1、定性離子對為73.9-42.1條件 下，兩者的定量離子對和定性離子對相對豐度比值在80%_120%之間，判定為待測樣品為 N-二甲基亞硝胺。
[0028]本發(fā)明的有益效果是：
[0029]與GB/T5009.26-2003中所提到的氣相色譜-質(zhì)譜儀法相比，省去水蒸氣蒸餾和水 浴濃縮等步驟，操作更簡單，所需儀器減少;且檢出限更低，準(zhǔn)確性更高。
【附圖說明】
[0030]圖1是樣品溶液的總離子流色譜圖；
[0031 ]圖2是樣品溶液的定量離子對色譜圖；
[0032]圖3是樣品溶液的定性離子對相對豐度色譜圖；
[0033]圖4是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流色譜圖；
[0034] 圖5是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的定量離子對色譜圖；
[0035] 圖6是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的定性離子對相對豐度色譜圖；
[0036] 圖7是N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0037] 下面將通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。提供這些實施例是為了能夠更 透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
[0038] 如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"或"包括"為一開放式用語，故應(yīng) 解釋成"包含但不限定于"。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃 以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán) 利要求所界定者為準(zhǔn)。以下通過具體實驗對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋。
[0039] -、試劑和儀器
[0040] 色譜柱：安捷倫GC-MS 7890B-7000C，離心機(jī)：SIGMA 3K15,渦混振蕩器：德國 heidolph，移液槍:德國eppendorf，禍混振蕩器:V0RTEXGEIE2,超聲振蕩器，十萬分之一天 平：METTER TOLEDO XS205,萬分之一天平：METTER TOLEDO ME204E，PSAAgela，C18Agela， 0.22mi有機(jī)濾膜Age la，N-二甲基亞硝銨(色譜純），50mL離心管，熟肉制品(超市購買）。
[0041] 二、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
[0042] 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:稱取N-二甲基亞硝銨標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1000mg/L的儲備液，于4 °C冰箱中避光保存；
[0043]標(biāo)準(zhǔn)品溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋至濃度分別為0.5ng/mL，Ing/mL，2.5ng/ mL，4ng/mL和5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。
[0044]三、待測樣品溶液的制備
[0045] A、稱取待測樣品5.00g，加入乙腈中含1%的醋酸的溶液10mL，在2500r/min轉(zhuǎn)速下 渦混振蕩器中渦混5min;
[OO46] B、再加入5g無水硫酸鈉、lg氯化鈉和lg梓檬酸二鈉后禍混3min，然后在5000r/min 轉(zhuǎn)速下離心5min后收集上清液；
[0047] C、吸取6mL上清液移入裝有0.5gPSA、0.5g C^Plg無水硫酸鎂的15mL離心管中，渦 混3min，5000r/min離心5min后再次收集上清液；
[0048] D、再次取上清液，用0.22mi有機(jī)濾膜過濾后作為待測樣品溶液。
[0049] 四、樣品定性和定量檢測
[0050] 將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液按照以下三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的工作參數(shù)進(jìn) 行測定。
[0051] 三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測時所采用的參數(shù)分別為：
[0052] A、色譜條件
[0053]色譜柱為安捷倫HP-IN0WAX毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度250 °C，不分流進(jìn)樣，載氣 (氦氣多99.999 % )流速0.887mL/min，進(jìn)樣量1此;程序升溫:初始溫度60°C保持lmin，以40 °(：/1^11升到120°(：，然后再以5°(：/111111升到250°(：保持3111111。
[0054] B、質(zhì)譜條件
[0055] 離子源:230°C，四級桿：150°C，傳輸線：250°C，掃描模式MRM，電離能量70eV，溶劑 延遲 4.5min〇
[0056] C、表1為標(biāo)準(zhǔn)出峰時間(保留時間）和離子對、碰撞能量表 [0057] 表1標(biāo)準(zhǔn)出峰時間和離子對、碰撞能量表
[0059] 首先根據(jù)待測樣品和N-二甲基亞硝銨標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相同，定量離子對為74- 42.1、定性離子對為73.9-42.1條件下，兩者的定量離子對和定性離子對相對豐度比值在 80 %-120 %之間，判定為同一化合物。
[0060] D、待測樣品定性和定量具體檢測如下：
[0061] A、取1.0此待測樣品溶液進(jìn)樣，用三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，得 到待測樣品溶液的總離子流色譜圖（圖1 )、定量離子對色譜圖（圖2)和定性離子對相對豐度 色譜圖（圖3);
[0062] B、將步驟（1)配制的不同濃度的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用三重四級桿氣相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，檢測條件與待測樣品溶液相同，獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流色 譜圖（圖4)、定量離子對色譜圖（圖5)和定性離子對相對豐度色譜圖（圖6)。
[0063] C、以N-二甲基亞硝胺的定量離子對74-42.1和定性離子對73.9-42.1的色譜峰 制作得到N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7);并且得出Y = 6375.486881*X-967.980516,線性 相關(guān)系數(shù)R2 = 〇. 9954，檢出限為0.5ng/mL，定量限為1.5ng/mL，其中：X表示樣品濃度，Y表示 響應(yīng)值；
[0064] D、根據(jù)待測樣品溶液中N-二甲基亞硝胺的定量離子對74-42.1和定性離子對 73.9-42.1的色譜峰，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣液中N-二甲基亞硝胺的濃度C，并按 以下公式計算得到熟肉制品中N-二甲基亞硝胺的含量X，含量計算公式為：
[0065] X = C*V/(M*1000);其中X為待測樣品中N-二甲基亞硝胺的含量，單位為mg/kg;C是 待測樣品中N-二甲基亞硝胺的濃度，單位為ng/mL; V是待測樣品溶解體積，單位為mL; M是待 測樣品質(zhì)量，單位為g。
[0066] 根據(jù)含量的多少和國家標(biāo)準(zhǔn)來確定所檢測的熟肉制品是否屬于合格品。
[0067] 以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括如下步 驟： (1) 配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液:首先制備標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稱取N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品， 用乙腈配制成N-二甲基亞硝胺的濃度為1000mg/L的儲備液，于4°C冰箱中避光保存;然后將 標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈配制成濃度分別為0 · 5ng/mL、Ing/mL、2 · 5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn) 品溶液備用； (2) 待測樣品溶液的制備： A、 稱取待測樣品5.00g，加入乙腈中含1%醋酸的溶液10mL，在2500r/min轉(zhuǎn)速下的渦混 振蕩器中渦混5min; B、 再加入5g無水硫酸鎂、lg氯化鈉和lg梓檬酸二鈉后禍混3min，然后在5000r/min轉(zhuǎn)速 下的離心機(jī)中離心5min后收集上清液； C、 吸取6mL上清液移入裝有0.58?5六、0.58(：18和4無水硫酸鎂的1511^離心管中，渦混 3min，在5000r/min轉(zhuǎn)速下的離心機(jī)中再離心5min后收集上清液； D、 再次取上清液，用0.22μπι有機(jī)濾膜過濾后作為待測樣品溶液； (3) 待測樣品定性和定量檢測： Α、取l.OyL待測樣品溶液進(jìn)樣，用三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，得到待 測樣品溶液的總離子流色譜圖、定量離子對色譜圖和定性離子對相對豐度色譜圖； B、 將步驟（1)配制的不同濃度的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測，檢測條件與待測樣品溶液相同，獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流色譜圖、 定量離子色譜圖和定性離子對相對豐度色譜圖； C、 以N-二甲基亞硝胺的定量離子對和定性離子對的色譜峰制作得到N-二甲基亞硝胺 標(biāo)準(zhǔn)曲線； D、 根據(jù)待測樣品溶液中N-二甲基亞硝胺的定量離子對和定性離子對的色譜峰，結(jié)合標(biāo) 準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣液中N-二甲基亞硝胺的濃度C，并按以下公式計算得到熟肉制品中 N-二甲基亞硝胺的含量X，含量計算公式為： X = C*V/(M*1000) 其中X為待測樣品中N-二甲基亞硝胺的含量，單位為mg/kg;C是待測樣品中N-二甲基亞 硝胺的濃度，單位為ng/mL;V是待測樣品溶解體積，單位為mL;M是待測樣品質(zhì)量，單位為g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，其特征在于，所述定量 離子對為74-42.1，定性離子對為73.9-42.1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，其特征在于，三重四級 桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測時所采用的參數(shù)分別為： A、 色譜條件 色譜柱為安捷倫HP-IN0WAX毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度250 °C，不分流進(jìn)樣，載氣流速 0.887mL/min，進(jìn)樣量lyL;程序升溫：初始溫度60°C保持lmin，以40°C/min升到120°C，然后 再以5°C/min升到250°C保持3min。 B、 質(zhì)譜條件 離子源：230°C，四級桿：150°C，傳輸線：250°C，掃描模式MRM，電離能量70eV，溶劑延遲 4.5min〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，其特征在于，所述載氣 中氦氣彡99.999%。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法，其特征在于，待測樣品 為N-二甲基亞硝胺的判定方法為:待測樣品和N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品保留時間相同，在相 同的定量離子對為74-42.1、定性離子對為73.9-42.1條件下，兩者的定量離子對和定性 離子對相對豐度比值在80%-120%之間，判定為待測樣品為N-二甲基亞硝胺。
【文檔編號】G01N30/02GK106053634SQ201610345727
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】劉清亮, 姜利成, 孫艷麗, 張爽爽, 周秀枝, 代玲玲
【申請人】山東拜爾檢測有限公司