一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法，具體涉及一種基于HILIC色譜柱串聯(lián)三重四級桿質譜，檢測動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法。其特征在于：樣品經(jīng)過提取、固相萃取、經(jīng)ZIC?HILIC色譜柱分離后，由三重四級桿質譜測定。所檢測的新霉素、大觀霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素、慶大霉素的濃度在10ug/kg?500ug/kg范圍內(nèi)線性關系良好，20μg/kg濃度下響應值良好S/N＞10，樣品真度無明顯基質效應，樣品中濃度檢出限可降低至100ug/kg，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述方法，具有樣品前期處理時間短成本低、方法簡便、基質覆蓋全面、準確度高等特點。
【專利說明】
一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法，具體涉及一種利用ZIC-HILIC色譜柱串聯(lián)三重四極桿質譜，檢測6種氨基糖苷類抗生素在動物源食品中殘留量的檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 氨基糖苷類抗生素（Aminoglyeosides)，是一種由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連 接而成的苷類抗生素藥物。對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有顯著的抗菌效果， 可以有效抑制細菌的生長和繁殖，也常被添加在飼料中促進動物生長發(fā)育，是目前我國畜 牧業(yè)中常用獸藥。該類藥物具有耳毒性和腎毒性等毒副作用，人類長期食用殘留超標的畜 廣品將直接造成傷害。
[0003] 為了保障食品安全，2002年我國農(nóng)業(yè)部在《動物組織中獸藥殘留最高限量》中規(guī) 定慶大霉素、壯觀霉素、鏈霉素、二氫鏈霉素和潮霉素在動物肌肉中的最高殘留限量分別為 100、500、600、600 yg/kg及不得檢出，安普霉素在豬腎臟中的最高殘留限量為100yg/kg。
[0004] 氨基糖苷類抗生素是一類強極性的堿性化合物，目前這類抗生素痕量殘留的同時 檢測通常采用反相離子對色譜-串聯(lián)質譜法。但是所用的離子對試劑七氟丁酸會造成離子 抑制，污染質譜。另外，目前關于氨基糖苷類抗生素的樣品檢測方法，不僅檢測時間長，而且 樣品檢測前處理步驟復雜，對檢測人員的技術性要求過高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術中采用反向離子色譜，其使用的離子 對試劑七氟丁酸會造成離子抑制，污染質譜的問題及現(xiàn)有檢測技術前期樣品處理時間長， 步驟繁瑣的技術問題。
[0006] 本發(fā)明所要實現(xiàn)的技術目的是提供一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量 的檢測方法，通過ZIC-HILIC色譜柱串聯(lián)三重四極桿質譜的方法進行快速、簡便、高靈敏度 的定量檢測。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)： 一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (一)樣品前處理： 稱取試料（2.5±0.02)g，于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（10 mM乙酸銨+0.4 mM EDTA+1%氯化鈉+5%三氯乙酸），禍旋混合30 s，振蕩混合10 min，4000 r/min離心5 min，上 清液用20%的氫氧化鈉或1 M的鹽酸水溶液調pH至6.5。
[0008] (二）固相萃?。?固相萃取SPE柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取上述步驟中的上清液過柱處理，用 5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸銨(pH=3)5 mL洗脫，收集洗脫液，渦旋混勻，經(jīng)0.22 _濾膜過 濾，即為待測樣品。
[0009] (三)ZIC-HILIC色譜柱-三重四極桿質譜檢測： 三重四級桿質譜檢測參數(shù)為： 離子源:ESI源，霧化氣流速:3L/min，加熱氣流速:10L/min，離子源溫度:300 °C，DL管溫 度:250°C，加熱模塊溫度:400°C，干燥氣流量:10L/min。
[0010] 基于ZIC-HILIC色譜柱的檢測參數(shù)為： 色譜柱：ZIC-HILIC，規(guī)格為3 ? 5_ 150*4 ? 6mm;流動相A: 175 mmol/L甲酸銨（pH=4 ? 5); 流動相B:含有0.3%甲酸的乙腈;流速:0.55 mL/min;進樣體積:20 yL;柱溫箱溫度:45°C ;洗 脫方式:梯度洗脫，初始濃度為B相60%;清洗液:80%乙腈水溶液： 所述洗脫中梯度時間程序如表1所示： 表1:洗脫梯度時間程序表
(四）通過繪制標準曲線，及測算，得出樣品中氨基糖苷類抗生素的含量。
[0011] 所述氨基糖苷類抗生素為慶大霉素、安普霉素、新霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、大觀 霉素。
[0012] 所述6種氨基糖苷類抗生素選用乙腈+水（1+1)作為稀釋溶劑，濃度點依次為lOiig/ kg、20yg/kg、50yg/kg、100yg/kg、200yg/kg、500yg/kg，得出線性關系良好，R2>0 ? 99，六種化 合物20yg/kg響應值良好S/N> 10。
[0013] 具體如表2所示： 表2:六種氨基糖苷類抗生素標準品的線性關系
根據(jù)樣品在色譜和質譜條件下測定，記錄峰值面積，繪制峰面積-濃度標準曲線，根據(jù) 樣品添加回收試驗的結果，計算得出上述6種氨基糖苷類抗生素的檢出限為lOOug/kg，滿足 樣品檢出限的需要。
[0014]本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果： 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述的一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方 法，通過ZIC-HILIC色譜柱串聯(lián)三重四極桿質譜的方法進行檢測，具有檢測方法簡單、準確 度高、前期樣品處理簡單，避免了七氟丁酸會造成離子抑制，污染質譜的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容進行進一步闡述，實施例只起到解釋說明作 用，并不能限定本發(fā)明的范圍，一般技術人員對本
【發(fā)明內(nèi)容】
做出的一般性改動，只要未超出 本發(fā)明所述范圍，都將等價落在本發(fā)明權利要求書所限定的范圍內(nèi)。 實施例
[0016] 1、實驗儀器與試劑如下： 試劑：甲酸銨，乙酸銨，乙二胺四乙酸二鈉，氯化鈉，三氯乙酸，氫氧化鈉，鹽酸， Cleanert PWCX 固相萃取SPE柱。
[0017] 儀器：島津LC-MSMS 8050色譜-質譜儀，湘儀L550離心機，EYEL 4分液漏斗振蕩 器。
[0018] 2、試驗方案如下： 用慶大霉素、安普霉素、新霉素、鏈霉素、雙氣鏈霉素、大觀霉素標準品制定標準曲線， 并根據(jù)標準品確定色譜-質譜的最佳條件。
[0019] 選用空白鴨肝進行真度檢測試驗、選用空白鴨肉進行樣品添加回收試驗，得出檢 測下限。
[0020] 3、試驗方法如下： (一)樣品前處理： 稱取試料（2.5±0.02)g，于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（10 mM乙酸銨+0.4 mM EDTA+1%氯化鈉+5%三氯乙酸），禍旋混合30 s，振蕩混合10 min，4000 r/min離心5 min，上 清液用20%的氫氧化鈉或1 M的鹽酸水溶液調pH至6.5。
[0021] (二）固相萃?。?固相萃取SPE柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取上述步驟中的上清液過柱處理，用 5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸銨(pH=3)5 mL洗脫，收集洗脫液，渦旋混勻，經(jīng)0.22 _濾膜過 濾，即為待測樣品。
[0022](三)ZIC-HILIC色譜柱-三重四極桿質譜檢測： 三重四級桿質譜檢測參數(shù)為： 離子源:ESI源，霧化氣流速:3L/min，加熱氣流速:10L/min，離子源溫度:300 °C，DL管溫 度:250°C，加熱模塊溫度:400°C，干燥氣流量:10L/min。
[0023] 基于ZIC-HILIC色譜柱的檢測參數(shù)為： 色譜柱：ZIC-HILIC，規(guī)格為3 ? 5_ 150*4 ? 6mm;流動相A: 175 mmol/L甲酸銨（pH=4 ? 5); 流動相B:含有0.3%甲酸的乙腈;流速:0.55 mL/min;進樣體積:20 yL;柱溫箱溫度:45°C ;洗 脫方式:梯度洗脫，初始濃度為B相60%;清洗液:80%乙腈水溶液。
[0024](四）通過繪制標準曲線，及測算，得出樣品中氨基糖苷類抗生素的含量。
[0025] 4、結果分析 4.1標準物質線性及穩(wěn)定性 乙腈+水(1+1)作為稀釋溶劑，稀釋6種氨基糖苷類抗生素藥物(慶大霉素、安普霉素、新 霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、大觀霉素)混標，濃度點依次為l〇yg/kg、20yg/kg、50yg/kg、100y g/kg、200iig/kg、500iig/kg，并進行儀器分析。
[0026]得出上述6種抗生素的線性關系如表2所示，線性關系良好，經(jīng)液相色譜-質譜檢 測，所述6種化合物標準品在20ug/kg值時的響應值良好，S/N> 10，穩(wěn)定性良好。
[0027] 4.2真度及選擇性 選擇空白鴨肝樣品進行前處理，分別進行空白提取液稀釋標準品及溶劑稀釋標準品分 析實驗，真度A=提取液稀釋標準品峰面積A1/溶劑稀釋標準品A2 *100%，以此作為簡單實驗 參數(shù)量化機制效應。
[0028] 真度A值:A<100%，基質抑制效應；A~100%，無明基質制效應；A>100%，基質增 強效應，6種抗生素的檢測結果多為無明顯基質效應，如表3所示： 表3:六種氨基糖苷類抗生素基質效應檢測結果
4.3添加回收穩(wěn)定性試驗： 鴨肉空白樣品進行樣品添加回收試驗，萃取液中濃度為50ug/kg、100ug/kg、500ug/kg, 得出結果如表4、表5、表6所不： 表4:萃取液中濃度50ug/kg的添加回收試驗結果
表5:萃取液中濃度lOOug/kg的添加回收試驗結果
表6:萃取液中濃度500ug/kg的添加回收試驗結果
由上述數(shù)據(jù)可以看出，空白鴨肉在添加回收中濃度為50ug/kg樣品時，6種抗生素的添 加回收率多數(shù)較高，穩(wěn)定性RSD落在3.8至6.7區(qū)間內(nèi)，穩(wěn)定值良好。
[0029] 綜合上述試驗結果，得出上述6種抗生素的檢測下限為lOOug/kg。
【主權項】
1. 一種動物源食品中氨基糖苷類抗生素殘留量的檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟： (一) 樣品前處理 稱取試料（2.5±0.02)g，于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（10 mM乙酸銨+0.4 mM EDTA+1%氯化鈉+5%三氯乙酸），禍旋混合30 s，振蕩混合10 min，4000 r/min離心5 min，上 清液用20%的氫氧化鈉或1 Μ的鹽酸水溶液調pH至6.5; (二） 固相萃取 固相萃取SPE柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取上述步驟中的上清液過柱處理，用 5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸銨(pH=3)5 mL洗脫，收集洗脫液，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μπι濾膜過 濾，即為待測樣品； (三) ZIC-HILIC色譜柱-三重四極桿質譜檢測 三重四級桿質譜檢測參數(shù)為： 離子源:ESI源，霧化氣流速:3L/min，加熱氣流速：10L/min，離子源溫度:300°C，DL管溫 度:250°C，加熱模塊溫度:400°C，干燥氣流量:10L/min; 基于ZIC-HILIC色譜柱的檢測參數(shù)為： 色譜柱：ZIC-HILIC，規(guī)格為3 · 5μπι 150*4 · 6mm;流動相A: 175 mmol/L甲酸銨（pH=4 · 5); 流動相B:含有0.3%甲酸的乙腈;流速:0.55 mL/min;進樣體積:20 yL;柱溫箱溫度:45°C ;洗 脫方式:梯度洗脫，初始濃度為B相60%;清洗液:80%乙腈水溶液； (四） 通過繪制標準曲線及測算，得出樣品中氨基糖苷類抗生素的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK106053638SQ201610355016
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】劉剛
【申請人】杭州海潤泰合檢測技術有限公司