一種α?甘草次酸含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種α?甘草次酸含量的檢測方法，包括（1）設(shè)定高效液相色譜條件；（2）制備對照品溶液；（3）制備供試品溶液；（4）含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算α?甘草次酸的含量。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對α?甘草次酸的質(zhì)量檢測，經(jīng)過試驗(yàn)表明，該方法線性關(guān)系、重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率均較好，且本發(fā)明所述方法準(zhǔn)確、簡便、快捷，能夠更有效、全面的控制α?甘草次酸的質(zhì)量。
【專利說明】
一種a-甘草次酸含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種a-甘草次酸含量的檢測方法，屬于醫(yī)藥化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘草為豆科植物甘草的干燥根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、調(diào)和 諸藥之功效，素有"十藥九草"、"無草不藥"之稱。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、 生物堿、氨基酸等化學(xué)成分，具有廣泛的生理活性。甘草酸是甘草中最為重要的化學(xué)成分， 具有消毒、消炎、抗過敏、治療潰瘍、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤和防治病毒肝炎、高血脂癥和抗癌癥等疾 病的作用，引起藥理學(xué)家和化學(xué)家的極大重視。
[0003] 天然甘草中的甘草酸存在兩種差向異構(gòu)體18a體和1邪體，其中以1邪體為主。由于 構(gòu)型上的差異，18a體的位阻效應(yīng)，使其親脂性大于18例本，在體內(nèi)易與受體蛋白結(jié)合。甘草 次酸是從天然植物藥甘草(Glycyrrhiza Uralensis)的根中提取的甘草酸經(jīng)過水解后精制 而得。藥理實(shí)驗(yàn)證明，甘草次酸作為甘草酸在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，在血液中能夠得到很好的吸 收，其藥理應(yīng)用因而也比較廣泛。甘草次酸通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化、阻滯細(xì)胞周 期、抑制腫瘤多藥耐藥性以及抑制促癌劑的誘癌作用等方式，對肝癌、肺癌、胃癌及白血病 等多種腫瘤細(xì)胞系的體外生長具有廣泛的抑制作用，同時(shí)對正常體細(xì)胞的毒性較小。目前 市場上的a構(gòu)型的甘草酸類成分藥品多以a-甘草酸二銨鹽或異甘草酸鎂等為主要成分，其 療效已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)，而以甘草次酸，尤其是甘草次酸為主要成分的藥品則未見上 市或報(bào)道，因此，對于其進(jìn)行的相關(guān)研究則顯得更為重要。藥品的研究必然需要有高效可行 的檢測方法來進(jìn)行分析處理，因而，開發(fā)研究一種甘草次酸的檢測方法則成為必然，也為 其質(zhì)量控制提供了保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，具有良好的精密度、重 現(xiàn)性和可靠性，可用于甘草次酸的質(zhì)量控制的甘草次酸含量的檢測方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種a-甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)設(shè)定高效液相色譜條件:色譜柱為Agilent TC-C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以水為 流動相A，以乙腈為流動相B，溶劑為甲醇，洗脫方式為梯度洗脫，流速為l.OmL ? min-1，柱 溫為30°C，檢測波長為244nm，進(jìn)樣量5yl; 所述的梯度洗脫中流動相A和流動相B在不同的時(shí)間段的濃度關(guān)系如下表所示：
[0006] (2)制備對照品溶液：稱取a-甘草次酸對照品，置于容量瓶中，加入質(zhì)量比為1:1 的流動相A和流動相B，稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.980mg ? ml-1的溶液，得到對照品 溶液； (3) 制備供試品溶液：稱取a_甘草次酸供試品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解a_甘 草次酸供試品粉末，超聲提取30min，靜置，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45wii微孔濾膜 濾過，即得供試品溶液； (4) 含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液各5iU，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液 相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算甘草次酸的含量。
[0007] 上述的步驟（1)中，優(yōu)選，洗脫時(shí)的流速為l.OmL ^化―S柱溫為30°C，檢測波長為 244nm〇
[0008] 此外，a-甘草次酸含量的檢測方法還包括對a-甘草次酸對照品溶液濃度和峰面積 積分值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸的步驟。
[0009] 具體方法為:取不同濃度的a-甘草次酸對照品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液 相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，得到線性回歸方程為：A = 8.20 X 106C+11350.2，R = 0.9999，且所述的A為峰面積積分值，而所述的C為a-甘草次酸對照品溶液濃度。
[0010] 當(dāng)然，還可以包括對高效液相色譜儀進(jìn)行精密度檢測的步驟、對供試品溶液的穩(wěn) 定性進(jìn)行檢測的步驟、檢驗(yàn)甘草次酸的含量檢測方法的重復(fù)性的步驟、進(jìn)行加樣回收率 實(shí)驗(yàn)的步驟或進(jìn)行a-甘草次酸最低檢測濃度測定的步驟。
[0011]且所述的a-甘草次酸最低檢測濃度為0.0261lig ? mL-工。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述檢測方法以純的甲醇作提取溶劑，較之于稀乙 醇、稀甲醇、流動相等其他溶劑，提取效率更高更完全;且本發(fā)明所述檢測方法以乙腈和水 的二元高壓梯度為流動相，該方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，樣品分離度、對稱性及峰形均 較好，且保留時(shí)間適中，更加適合于常規(guī)檢測。
【附圖說明】
[0013] 圖1為a-甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖； 圖2為某一批次的a_甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖； 圖3為另一批次的a_甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0015] 實(shí)施例1:設(shè)定高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent TC_C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以水為流動相A，以乙腈為流動相 B，溶劑為甲醇，洗脫方式為梯度洗脫，流速為1 .OmL ? mirT1，柱溫為30°C，檢測波長為 244nm，進(jìn)樣量 5yl， 所述的梯度洗脫中流動相A和流動相B在不同的時(shí)間段的濃度關(guān)系如下表所示：
[0016]實(shí)施例2:制備對照品溶液 稱取a-甘草次酸對照品49. Omg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加入流動相稀釋至刻 度，搖勻，制成濃度為0.980mg ? mr1的溶液，得到對照品溶液(儲備液）。
[0017] 實(shí)施例3:制備供試品溶液 稱取a-甘草次酸供試品粉末30mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加入甲醇溶解a-甘草 次酸供試品粉末，超聲提取30min，靜置，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45wii微孔濾膜濾 過，即得供試品溶液。
[0018] 實(shí)施例4:對a-甘草次酸對照品溶液濃度和峰面積積分值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸 精密量取對照品貯備液〇.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL容量瓶中，加質(zhì)量比為1: 1的流動相A和流動相B稀釋至刻度，搖勻，得到含a-甘草次酸分別為〇. 0196、0.0588、0.098、 0.1372、0.1764 mg ? ml/1的對照品溶液，分別精密吸取上述各對照品溶液5此，按上述色譜 條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值(A)對對照品溶液濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A = 8.20X 106C+11350.2(R=0.9999)〇
[0019] 圖1為a-甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖。
[0020] 如圖1所示:a-甘草次酸檢測濃度在0.0196-0.1764 mg ? mL-1范圍內(nèi)與峰面積積 分值呈良好的線性關(guān)系。
[0021] 實(shí)施例5:對高效液相色譜儀進(jìn)行精密度檢測 精密吸取濃度為0.098 mg ?ml/1的對照品溶液5此，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測 定峰面積積分值分別為：819797、818425、810797、823438、821032、819467。結(jié)果，RSD = 0.52 %，表明儀器精密度良好。
[0022] 實(shí)施例6:對供試品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測 精密量取同一供試品溶液5yL，分別在0、1、2、3、4、24h進(jìn)樣測定，測得峰面積積分值分 別為：1546674、1568425、1540797、1536771、1547698、1572801，均值為 1552194 ? 3，結(jié)果：RSD = 0.96%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
[0023] 實(shí)施例7:檢驗(yàn)a-甘草次酸的含量檢測方法的重復(fù)性 稱取同一甘草樣品粉末約30 mg，平行6份，精密稱定，按實(shí)施例3所述方法制備供試品 溶液，精密吸取5yL，按上述色譜條件測定，測得峰面積積分值分別為：787463、802338、 799935、785958、780341、786885，均值為790486.7;結(jié)果，RSD= 1.10%，表明本發(fā)明所述方 法重復(fù)性較好。
[0024]實(shí)施例8:加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的a-甘草次酸供試品9份，每份約30 mg，精密稱定，加入相應(yīng)量的對照品， 按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。
[0025]表1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 9)
[0026 ]實(shí)施例9: a -甘草次酸最低檢測濃度測定 將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為3:1時(shí)，甘草酸的最低檢測濃度為0.0261 yg* mL_1〇
[0027] 實(shí)施例10:樣品含量測定 取5個(gè)不同批次的a-甘草次酸樣品各30 mg，精密稱定，按照實(shí)施例3的方法制成供試品 溶液，分別取供試品溶液各5iU，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜 圖，然后，利用色譜圖計(jì)算a-甘草次酸的含量。
[0028] 圖2為某一批次的a_甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖；圖3為另一批次的a_ 甘草次酸對照品溶液的高效液相色譜圖。
[0029] 根據(jù)圖2和圖3的高效液相色譜圖，得到各批次的a-甘草次酸樣品含量測定結(jié)果如 表2所示： 表2不同批次的a-甘草次酸樣品含量測定結(jié)果
上述a-甘草次酸含量測定方法實(shí)現(xiàn)了對a-甘草次酸的質(zhì)量檢測，經(jīng)過試驗(yàn)表明，該方 法線性關(guān)系、重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率均較好，且本發(fā)明所述方法準(zhǔn)確、簡便、快捷， 能夠更有效、全面的控制甘草次酸的質(zhì)量。
[0030] 以上【具體實(shí)施方式】不以任何形式限制本發(fā)明，凡是以等同替換或等效變換的方式 所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種a-甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 設(shè)定高效液相色譜條件:色譜柱為Agilent TC-C18:4.6 mmX 250 mm，5 um，以水為 流動相A，以乙腈為流動相B，溶劑為甲醇，洗脫方式為梯度洗脫，流速為l.OmL ?mirT1，柱 溫為30°C，檢測波長為244nm，進(jìn)樣量5yl， 所述的梯度洗脫中流動相A和流動相B在不同的時(shí)間段的濃度關(guān)系如下表所示：(2) 制備對照品溶液：稱取a-甘草次酸對照品，置于容量瓶中，加入質(zhì)量比為1:1的流 動相A和流動相B，稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.980mg ? ml-1的溶液，得到對照品溶 液； (3) 制備供試品溶液：稱取a_甘草次酸供試品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解a_甘 草次酸供試品粉末，超聲提取30min，靜置，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45wii微孔濾膜 濾過，即得供試品溶液； (4) 含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液各5iU，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液 相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算甘草次酸的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟（1) 中，洗脫時(shí)的流速為1 .OmL ? min-、柱溫為30°C，檢測波長為244nm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括對a_甘 草次酸對照品溶液濃度和峰面積積分值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸的步驟。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種a-甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，對a-甘草次酸 對照品溶液濃度和峰面積積分值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸的方法為:取不同濃度的a-甘草次酸對照 品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，得到線性回歸方程 為:A = 8.20 X 106C+11350.2，R = 0.9999，且所述的A為峰面積積分值，而所述的C為a-甘草 次酸對照品溶液濃度。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括對高效 液相色譜儀進(jìn)行精密度檢測的步驟。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括對供試 品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測的步驟。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括檢驗(yàn)a_ 甘草次酸的含量檢測方法的重復(fù)性的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括進(jìn)行加 樣回收率實(shí)驗(yàn)的步驟。 9 .根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種a_甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，還包括進(jìn)行a_ 甘草次酸最低檢測濃度測定的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘草次酸含量的檢測方法，其特征在于，所述的a_甘 草次酸最低檢測濃度為〇.〇261邱.1111/1。
【文檔編號】G01N30/02GK106053649SQ201610406470
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】季浩, 張宇, 于燕燕, 闞建偉, 劉佳, 徐娟
【申請人】江蘇天晟藥業(yè)股份有限公司