一種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，包括性狀、鑒別、檢查、含量測定，本發(fā)明在原標準基礎(chǔ)上增加了肌苷化合物、氨基酸的檢測指標，并對原質(zhì)量標準進行了修訂，解決了原質(zhì)量標準存在的系列技術(shù)問題，能從根本上控制心脈隆注射液原料的質(zhì)量。本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法的測定結(jié)果有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準確性且保證了美洲大蠊較高的質(zhì)量標準水平。
【專利說明】
_種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥材檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 美洲大蠊是中體積最大的昆蟲。成蟲體長29~40毫米，紅褐色，翅長于腹部末端。 很長，前胸背板中間有較大的蝶形褐色斑紋，斑紋的后緣有完整的黃色帶紋。大蠊原產(chǎn)于非 洲北部，公元17世紀前后經(jīng)由船只帶到美洲，并于18世紀被人在美洲發(fā)現(xiàn)。食性廣泛、喜食 糖和淀粉、污染食物、傳播病菌和，是世界性衛(wèi)生害蟲。在南方地區(qū)為室內(nèi)優(yōu)勢品種，主要生 存于、暖氣溝、廁所、浴室及釀造廠、醬品廠等陰暗潮濕的環(huán)境，善爬行，飛行能力差。美洲大 蠊乙醇提取物體外對慢性髓源性白血病(K562)、原髓細胞白血病(HL60)、白血病(P388D1)， (CNE)、肺癌(A549)、口腔(KB)細胞株，卵巢癌(H08910)、宮頸癌(Hela)和前列腺癌(PC3)細 胞株，食管癌(Ecal09)、（BGC823)、結(jié)腸癌(LS174T)細胞株具有生長抑制作用；體外對胃癌 BGC-823細胞的抑制作用與順鉑(DDP)相似，且呈時間和濃度依賴關(guān)系。隨著社會的不斷發(fā) 展，對美洲大蠊的研究也逐步深入，對其在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用產(chǎn)生的巨大的影響，目前的美洲 大蠊質(zhì)量標準已遠遠不能滿足市場需求，不能完全有效控制美洲大蠊質(zhì)量、保證最終產(chǎn)品 的療效，因此急需開發(fā)一種能解決上述技術(shù)問題的檢測方法以有效控制和保證美洲大蠊的 質(zhì)量和療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法如下： 1) 性狀:本品呈類橢圓形，長27-32mm，寬10_30mm，赤褐色，前胸背板6_9mm，略呈梯形， 前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明顯；其后緣中央微向后延伸，雄蟲 肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板無毛茸；雌蟲肛上板略呈長 三角形，不透明，后緣呈三角形切口； 2) 鑒別：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加熱回流20~40min，取出，放至室溫，濾過， 濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作為對照品溶 液;照中國藥典一部的薄層色譜法進行試驗，吸取上述兩種溶液各如1，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以體積配比為4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上， 顯相同顏色的斑點； 3) 檢查： a、 雜質(zhì):不得過2.0%(《中國藥典》一部附錄）； b、 水分:照中國藥典一部的水分測定法進行試驗，水分含量不得過10%; c、 總灰分:照中國藥典一部的總灰分測定法進行試驗，總灰分不得過8%; d、 酸不溶性灰分:找中國藥典一部的酸不溶性灰分測定法進行試驗，酸不溶性灰分不 得過1.6%; e、指紋圖譜:色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下 表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30分鐘 內(nèi)的色譜圖； 供試品色譜圖應(yīng)與標準指紋圖譜基本一致。將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相 似度評價系統(tǒng)(2004，1.0B版)與標準指紋圖譜相比較，計算相似度。相似度應(yīng)不低于0.90。
[0005] f、重金屬及有害元素照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（中國藥典通則2321原子吸收分 光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法)測定，鉛不得過5mg/kg;鎘不得過0.3mg/kg;砷不得 過2mg/kg;萊不得過0 ? 2mg/kg;銅不得過20mg/kg。
[0006] g、微生物限度：照中國藥典一部的微生物限度檢查法進行檢查，大腸埃希菌每lg 不得檢出，沙門菌每1 〇g不得檢出； 4) 浸出物:照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95%的乙 醇作為溶劑，浸出物不得少于20%; 5) 含量測定： a、肌苷照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄)測定。
[0007] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動 相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行 梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5y 1，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果計算：
式中： C:每1 OOg供試品中肌苷的含量(mg); Cx:供試品液肌苷含量(mg); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(200倍） 本品按干燥品計算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)應(yīng)為60~120mg; b、氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以相應(yīng)試劑為空白，在570nm波長處測定吸收度， 以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取指紋圖譜項下殘渣精密加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，離心或 過濾的供試品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制 備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出 供試品溶液中游離氨基酸的含量&，按下式計算，即得； 結(jié)果計算： 式中：
C游:每lg供試品中游離氨基酸含量(mg); Ci:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(5000倍）。
[0008]結(jié)合氨基酸精密量取含量測定肌苷項下供試品溶液0.4ml于水解管中，加鹽酸 0.4ml，封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時 后，取出，冷卻。打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去 離子水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取 lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收 度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量C 2,按下式計算，即得； 結(jié)果計筧：
式中： C結(jié):每lg供試品中結(jié)合氨基酸含量(mg); C2:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(5000倍）。
[0009] 本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C3H7N02)計，應(yīng)不低于6.0mg;每g 含結(jié)合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，應(yīng)不低于5.0mg。
[0010] 本發(fā)明在原標準（云YCBZ0042-2005)基礎(chǔ)上增加了雜質(zhì)、重金屬及有害元素的檢 查，還增加了肌苷化合物、氨基酸的限定指標，建立美洲大蠊干品指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)， 然后對原質(zhì)量標準進行了修訂，解決了原質(zhì)量標準存在的系列技術(shù)問題，能從根本上控制 心脈隆注射液原料的質(zhì)量。本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法的測定結(jié)果有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和 準確性且保證了美洲大蠊較高的質(zhì)量標準水平。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制， 基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012]本發(fā)明所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法如下： 1) 性狀:本品呈類橢圓形，長27-32mm，寬10_30mm，赤褐色，前胸背板6_9mm，略呈梯形， 前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明顯；其后緣中央微向后延伸，雄蟲 肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板無毛茸；雌蟲肛上板略呈長 三角形，不透明，后緣呈三角形切口； 2) 鑒別：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加熱回流20~40min，取出，放至室溫，濾過， 濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作為對照品溶 液;照中國藥典一部的薄層色譜法進行試驗，吸取上述兩種溶液各如1，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以體積配比為4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上， 顯相同顏色的斑點； 3) 檢查： a、 水分:照中國藥典一部的水分測定法進行試驗，水分含量不得過10%; b、 總灰分:照中國藥典一部的總灰分測定法進行試驗，總灰分不得過8%; c、 酸不溶性灰分:找中國藥典一部的酸不溶性灰分測定法進行試驗，酸不溶性灰分不 得過1.6%; d、 指紋圖譜:色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下 表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30分鐘 內(nèi)的色譜圖； 供試品色譜圖應(yīng)與標準指紋圖譜基本一致。將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相 似度評價系統(tǒng)(2004，1.0B版)與標準指紋圖譜相比較，計算相似度。相似度應(yīng)不低于0.90。
[0013] e、微生物限度：照中國藥典一部的微生物限度檢查法進行檢查，大腸埃希菌每lg 不得檢出，沙門菌每1 〇g不得檢出； 4) 浸出物:照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95%的乙 醇作為溶劑，浸出物不得少于20%; 5) 含量測定： a、肌苷照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄)測定。
[0014] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動 相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行 梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5y 1，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果計算：
式中： C:每1 OOg供試品中肌苷的含量(mg); Cx:供試品液肌苷含量(mg); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(200倍） 本品按干燥品計算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)應(yīng)為60~120mg; b、氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以相應(yīng)試劑為空白，在570nm波長處測定吸收度， 以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取指紋圖譜項下殘渣精密加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，離心或 過濾的供試品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制 備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出 供試品溶液中游離氨基酸的含量&，按下式計算，即得； 結(jié)果計算：
式中： C游:每lg供試品中游離氨基酸含量(mg); Ci:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(5000倍）。
[0015]結(jié)合氨基酸精密量取含量測定肌苷項下供試品溶液0.4ml于水解管中，加鹽酸 0.4ml，封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時 后，取出，冷卻。打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去 離子水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取 lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收 度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量C 2,按下式計算，即得； 結(jié)果計算：
式中： C結(jié):每lg供試品中結(jié)合氨基酸含量(mg); C2:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； n:稀釋倍數(shù)(5000倍）。
[0016] 本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C3H7N02)計，應(yīng)不低于6.0mg;每g 含結(jié)合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，應(yīng)不低于5.0mg。
[0017] 所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于還包括雜質(zhì)檢查，照中國藥典一部 的中藥材雜質(zhì)檢查進行檢測，雜質(zhì)不得過2%。
[0018] 所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于還包括重金屬及有害元素照鉛、 鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法)測定，鉛 不得過5mg/kg;鎘不得過0 ? 3mg/kg;砷不得過2mg/kg;萊不得過0 ? 2mg/kg;銅不得過20mg/ kg〇
[0019] 3)中色譜柱為Agilent Zorbax SB，5um，4? 6 X 150mm;所述的0 ? 05mol/L乙酸鈉緩 沖液的pH值為5.0，其配置方法為:稱取醋酸鈉(NaAc. 3H20) 6.80g溶于800ml水中，以lmol/ L醋酸調(diào)整PH值至5.0，加水至1000ml，即得。
[0020] 3)中所述的強堿性陰離子交換樹脂層析柱為DoweX2，Cl一型，200目，內(nèi)徑1.5cm， 柱長2.5cm;濕法裝柱，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液10ml洗脫，再用水10ml洗脫得到。
[0021] 5)中色譜柱為Agilent Zorbax SB，5um，4.6X 150mm。
[0022] 5)中所述的0.05mol/L乙酸鈉緩沖液的pH值為5.0，其配置方法為：稱取醋酸鈉 (NaAc ? 3H20) 6 ? 80g溶于800ml水中，以lmol/L醋酸調(diào)整PH值至5 ? 0，加水至1000ml，即得。 [0023] 5)中所述的強堿性陰離子交換樹脂層析柱為DoweX2，Cl一型，200目，內(nèi)徑1.5cm， 柱長2.5cm;濕法裝柱，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液10ml洗脫，再用水10ml洗脫得到。
[0024] 5)中所述的0.2mol/L枸櫞酸緩沖液的pH值為5.0，其配置方法為:稱取21.01g枸櫞 酸溶于200ml水中，加200ml的lmol/L氫氧化鈉溶液，加水稀釋成500ml，即得。
[0025] 5)中所述的茚三酮溶液，其配置方法為：取茚三酮1.25g溶于25ml乙二醇獨甲醚 中，另取氰化鉀液(〇. 〇lmo 1 /L) 2.5ml加乙二醇獨甲醚使成125ml，然后將兩種溶液混合，置 試劑瓶中，放置過夜備用。本液顯淺黃色微帶青光，在一周內(nèi)穩(wěn)定。
[0026]下面以具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明： 實施例1 從騰沖美蠊科技有限責任公司供貨的批號為20160201美洲大蠊干品2000kg中取樣 500g進行檢測，結(jié)果如下： 1)性狀：隨機取供試品50只美洲大蠊進行檢測，結(jié)果本品呈橢圓形，長27-30mm，寬11-28mm，赤褐色，前胸背板7-9mm，略呈梯形，前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑;其 后緣中央微向后延伸，雄蟲肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板 無毛茸；雌蟲肛上板略呈長三角形，不透明，后緣呈三角形切口。體輕、質(zhì)脆、氣微腥，味微 咸。
[0027] 2)鑒別：將供試品粉碎，稱取粉末2.04g，加乙醇20ml，加熱回流40min，取出，放至 室溫，濾過，濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 為對照品溶液;吸取上述兩種溶液各5iU，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積配比為4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加熱至 斑點顯色清晰。檢測結(jié)果為，顯色后，供試品色譜與丙氨酸對照品色譜在相應(yīng)位置上有同色 斑點。
[0028] 3)檢查： a、雜質(zhì):將500g供試品攤開，用肉眼觀察，揀選得到非藥用部分8g計入雜質(zhì)中，即含雜 質(zhì)為1.6%。
[0029] b、水分：采用烘干法進行檢測，將供試品粉碎，分別精密稱取3.3238g和3.0820g 平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過l〇mm，精密稱定，分別為21.6848g和 22.0259g。開啟瓶蓋在105°C干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30分鐘，精密稱定，分 別為21.5861g和21.9346g，再在105°C干燥lh，放冷，稱重，分別為21.5856g和21.9332g，經(jīng) 計算含水率都為3.0%，本品水分為3.0%。
[0030] C、總灰分、酸不容性灰分將供試品粉碎，分別精密稱取4.0921g和4.1033g，置熾 灼至恒重的坩堝中，稱定重量分別為23.6025g和24.1113g，緩慢熾熱至完全炭化，逐漸升高 溫度至600°C恒溫5h，放冷，稱重，分別為19.6414g和20.1393g，計算得到供試品中總灰分的 含量為3.2%。取上項所得的灰分，在坩堝中加入稀鹽酸10ml，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上 加熱lOmin，表面皿用熱水5ml沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘渣用水 洗于濾紙上，洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼 至恒重，經(jīng)稱重分別為19.5186g和20.0204g，計算含酸不溶性灰分率分別為0.2%和0.3%，平 均值為〇. 3%，檢測結(jié)果，本品酸不溶性灰分為0.3%。
[0031 ] d、指紋圖譜供試品溶液的制備：將供試品粉碎，分別精密稱取19.8138g和 20.0147g，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液100ml減壓濃縮至干，殘渣精密 加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換 樹脂層析柱，用水l〇ml洗脫，棄去水洗脫液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液 5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液。
[0032] 對照品溶液的制備：取肌苷對照品，精密稱定6.92mg，加甲醇100ml制成每1ml含 69.2yg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。
[0033] 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30 分鐘內(nèi)的色譜圖。將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004,1.0B版） 與標準指紋圖譜相比較，計算相似度。相似度為〇. 94。
[0034]其中，所述的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以 甲醇為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30 °C， 按下表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
e、重金屬及有害元素照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（中國藥典通則2321原子吸收分光光 度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法)測定，其中，原子熒光光譜儀型號為PF6非色散原子熒光 光度計、原子吸收光譜儀型號為ICE3300原子吸收光譜儀。測定結(jié)果為含鉛1.2mg/kg;鎘不 得過0 mg/kg;砷不得過Omg/kg;萊不得過Omg/kg;銅不得過1 lmg/kg。
[0035] f、微生物限度參照《中國藥典》增加美洲大蠊微生物限度檢查法(通則1106)，每 1 g美洲大蠊干品未檢出大腸埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未檢出沙門菌。
[0036] 4)浸出物:照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95% 的乙醇作為溶劑，檢測結(jié)果為本品浸出物為33.8%。
[0037] 5)含量測定： a、 肌苷照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄)測定。
[0038]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動 相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行 梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
測定法:供試品溶液和對照品溶液同"d、指紋圖譜"項下的檢測液，分別精密吸取對照 品溶液與供試品溶液各5y 1，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果:本品按干燥品計算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)為95mg; b、 氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以水為空白，在570nm波長處測定吸收度，以吸收 度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml" 起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果 為本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)計為6.Omg; 結(jié)合氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml于水解管中，加鹽酸 0.4ml，封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時 后，取出，冷卻。打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去 離子水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取 lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收 度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果為本品按干燥品 計算，每g含結(jié)合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，為5.8mg。
[0039] 實施例2 從騰沖美蠊科技有限責任公司供貨的批號為20160202美洲大蠊干品1800kg中取樣 450g進行檢測，結(jié)果如下： 1)性狀：隨機取供試品60只美洲大蠊進行檢測，結(jié)果本品呈橢圓形，長28-32mm，寬10-28mm，赤褐色，前胸背板6-9mm，略呈梯形，前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑；其 后緣中央微向后延伸，雄蟲肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板 無毛茸；雌蟲肛上板略呈長三角形，不透明，后緣呈三角形切口。體輕、質(zhì)脆、氣微腥，味微 咸。
[0040] 2)鑒別：將供試品粉碎，稱取粉末3.45g，加乙醇35ml，加熱回流40min，取出，放至 室溫，濾過，濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 為對照品溶液;吸取上述兩種溶液各5iU，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積配比為4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加熱至 斑點顯色清晰。檢測結(jié)果為，顯色后，供試品色譜與丙氨酸對照品色譜在相應(yīng)位置上有同色 斑點。
[0041 ] 3)檢查： a、雜質(zhì):將600g供試品攤開，用肉眼觀察，揀選得到非藥用部分10g計入雜質(zhì)中，即含 雜質(zhì)為1.7%。
[0042] b、水分：采用烘干法進行檢測，將供試品粉碎，分別精密稱取4.5163g和3.9272g 平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過l〇mm，精密稱定，分別為22.7469g和 22.8747g。開啟瓶蓋在105°C干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30分鐘，精密稱定，分 別為22.4071g和22.6146，再在105°C干燥lh，放冷，稱重，分別為22.3864g和22.5643g，經(jīng)計 算含水率都為7.9%，本品水分為7.9%。
[0043] c、總灰分、酸不容性灰分將供試品粉碎，分別精密稱取3.9586g和4.0563g，置熾 灼至恒重的坩堝中，稱定重量分別為23.4874g和24.0098g，緩慢熾熱至完全炭化，逐漸升高 溫度至600 °C恒溫5h，放冷，稱重，分別為19.8397g和20.2734g，計算得到供試品中總灰分的 含量為7.8%。取上項所得的灰分，在坩堝中加入稀鹽酸10ml，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上 加熱lOmin，表面皿用熱水5ml沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘渣用水 洗于濾紙上，洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼 至恒重，經(jīng)稱重分別為19.5852g和20.0122g，計算含酸不溶性灰分率為1.4%。
[0044] d、指紋圖譜供試品溶液的制備：將供試品粉碎，分別精密稱取20. 1769g和 20.3723g，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液100ml減壓濃縮至干，殘渣精密 加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換 樹脂層析柱，用水l〇ml洗脫，棄去水洗脫液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液 5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液。
[0045] 對照品溶液的制備：取肌苷對照品，精密稱定7.06mg，加甲醇100ml制成每lml含 70.6yg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。
[0046] 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30 分鐘內(nèi)的色譜圖。將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004,1.0B版） 與標準指紋圖譜相比較，計算相似度。相似度為〇. 98。
[0047] 其中，所述的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以 甲醇為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30 °C， 按下表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
e、重金屬及有害元素照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（中國藥典通則2321原子吸收分光光 度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法)測定，其中，原子熒光光譜儀型號為PF6非色散原子熒光 光度計、原子吸收光譜儀型號為ICE3300原子吸收光譜儀。測定結(jié)果為含鉛0.8mg/kg;鎘不 得過0 mg/kg;砷不得過Omg/kg;萊不得過Omg/kg;銅不得過10mg/kg。
[0048] f、微生物限度參照《中國藥典》增加美洲大蠊微生物限度檢查法(通則1106)，每 1 g美洲大蠊干品未檢出大腸埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未檢出沙門菌。
[0049] 4)浸出物:照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95% 的乙醇作為溶劑，檢測結(jié)果為本品浸出物為36.6%。
[0050] 5)含量測定： a、 肌苷照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄)測定。
[0051] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動 相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行 梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
測定法:供試品溶液和對照品溶液同"d、指紋圖譜"項下的檢測液，分別精密吸取對照 品溶液與供試品溶液各5y 1，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果:本品按干燥品計算，每1 〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)為104mg; b、 氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以水為空白，在570nm波長處測定吸收度，以吸收 度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml" 起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果 為本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)計為8.3mg; 結(jié)合氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml于水解管中，加鹽酸 0.4ml，封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時 后，取出，冷卻。打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去 離子水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取 lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收 度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果為本品按干燥品 計算，每g含結(jié)合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，為6.2mg。
[0052] 實施例3 從騰沖美蠊科技有限責任公司供貨的批號為20160203美洲大蠊干品2000kg中取樣 500g進行檢測，結(jié)果如下： 1)性狀：隨機取供試品50只美洲大蠊進行檢測，結(jié)果本品呈橢圓形，長27-31mm，寬10-30mm，赤褐色，前胸背板6-9mm，略呈梯形，前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑；其 后緣中央微向后延伸，雄蟲肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板 無毛茸；雌蟲肛上板略呈長三角形，不透明，后緣呈三角形切口。體輕、質(zhì)脆、氣微腥，味微 咸。
[0053] 2)鑒別：將供試品粉碎，稱取粉末3.97g，加乙醇40ml，加熱回流40min，取出，放至 室溫，濾過，濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 為對照品溶液;吸取上述兩種溶液各5iU，分別點于同一硅膠G薄層板上，以體積配比為4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加熱至 斑點顯色清晰。檢測結(jié)果為，顯色后，供試品色譜與丙氨酸對照品色譜在相應(yīng)位置上有同色 斑點。
[0054] 3)檢查： a、雜質(zhì):將500g供試品攤開，用肉眼觀察，揀選得到非藥用部分7g計入雜質(zhì)中，即含雜 質(zhì)為1.4%。
[0055] b、水分：采用烘干法進行檢測，將供試品粉碎，分別精密稱取4.3726g和4.4782g 平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過l〇mm，精密稱定，分別為22.5218g和 23.9538g。開啟瓶蓋在105°C干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30分鐘，精密稱定，分 別為22.2631g和23.8146，再在105°(：干燥111，放冷，稱重，分別為22.12278和23.54388，經(jīng)計 算含水率都為9.1%，本品水分為9.1%。
[0056] c、總灰分、酸不容性灰分將供試品粉碎，分別精密稱取4.1358g和4.3685g，置熾 灼至恒重的坩堝中，稱定重量分別為23.7046g和23.8563g，緩慢熾熱至完全炭化，逐漸升高 溫度至600°C恒溫5h，放冷，稱重，分別為19.7682g和19.7007g，計算得到供試品中總灰分的 含量為4.8%。取上項所得的灰分，在坩堝中加入稀鹽酸10ml，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上 加熱lOmin，表面皿用熱水5ml沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘渣用水 洗于濾紙上，洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼 至恒重，經(jīng)稱重分別為19.5842g和19.5038g，計算含酸不溶性灰分率為0.4%。
[0057] d、指紋圖譜供試品溶液的制備：將供試品粉碎，分別精密稱取20.5836g和 20.8020g，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液100ml減壓濃縮至干，殘渣精密 加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換 樹脂層析柱，用水l〇ml洗脫，棄去水洗脫液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液 5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液。
[0058] 對照品溶液的制備：取肌苷對照品，精密稱定7.03mg，加甲醇100ml制成每1ml含 70.3yg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。
[0059] 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30 分鐘內(nèi)的色譜圖。將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004,1.0B版） 與標準指紋圖譜相比較，計算相似度。相似度為0.96。
[0060]其中，所述的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以 甲醇為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30 °C， 按下表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
e、重金屬及有害元素照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（中國藥典通則2321原子吸收分光光 度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法)測定，其中，原子熒光光譜儀型號為PF6非色散原子熒光 光度計、原子吸收光譜儀型號為ICE3300原子吸收光譜儀。測定結(jié)果為含鉛1.0mg/kg;鎘不 得過0 mg/kg;砷不得過Omg/kg;萊不得過Omg/kg;銅不得過1 lmg/kg。
[0061 ] f、微生物限度參照《中國藥典》增加美洲大蠊微生物限度檢查法(通則1106)，每 1 g美洲大蠊干品未檢出大腸埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未檢出沙門菌。
[0062] 4)浸出物:照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95% 的乙醇作為溶劑，檢測結(jié)果為本品浸出物為40.5%。
[0063] 5)含量測定： a、 肌苷照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄)測定。
[0064]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動 相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行 梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;
測定法:供試品溶液和對照品溶液同"d、指紋圖譜"項下的檢測液，分別精密吸取對照 品溶液與供試品溶液各5y 1，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果:本品按干燥品計算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)為95mg; b、 氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以水為空白，在570nm波長處測定吸收度，以吸收 度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml" 起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果 為本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)計為11.4mg; 結(jié)合氨基酸精密量取"d、指紋圖譜"項下的供試品溶液0.4ml于水解管中，加鹽酸 0.4ml，封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時 后，取出，冷卻。打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去 離子水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取 lml，照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收 度，從標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量，計算，即得。結(jié)果為本品按干燥品 計算，每g含結(jié)合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，為6.8mg。
[0065] 試驗例1 本發(fā)明所述檢測方法的精密度、準確度實驗 實驗方法:選擇5個批美洲大蠊試樣，分別按本發(fā)明所述的方法進行測定，計算相對標 準偏差，每一樣品平行分析5次，由實驗結(jié)果可知，本發(fā)明所述檢測方法的分析結(jié)果偏差小、 精密度、準確度均能滿足分析要求，具有較高的推廣價值，具體檢測方法如下： 1)性狀：根據(jù)《云南省中藥材標準》(2005年版)及實物觀察描述。
[0066] 2)鑒別：參照《云南省中藥材標準》(2005年版)收載"蜚蠊"薄層色譜鑒別項，以及 國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的云南騰藥制藥股份有限公司《心脈隆注射液》標準薄層鑒 別項，進行丙氨酸薄層鑒別，并進行優(yōu)化。其次，增加"蜚蠊對照藥材"對照鑒別，對照品為中 國食品藥品檢定研究院2015年新增"蜚蠊對照藥材"編號121696,同時納入標準對照鑒別。 [0067] 3)檢查： a、雜質(zhì)：根據(jù)《中國藥典》建立雜質(zhì)鑒別項，不得過2%，《云南省藥品標準》(2005年版） 收載"蜚蠊"，對5批美洲大蠊樣品進行測定，均未檢出雜質(zhì)，符合規(guī)定。納入標準。
[0068] b、水分：《云南省中藥材標準》(2005年版)收載"蜚蠊標準"規(guī)定不得過13.0%，《湖 南省中藥材標準》(2009年版)收載"美洲大蠊標準"規(guī)定不得過13.0%，《四川省中藥材標準》 (2010年版)收載"美洲大蠊標準"規(guī)定不得過9.0%，云南騰藥制藥股份有限公司對接近標準 上限的樣品進行留樣考察，在3個月內(nèi)出現(xiàn)不同程度的霉變現(xiàn)象。對水分約為10%的樣品進 行考察，考察期內(nèi)均為出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象，故修訂水分為不得過10. 〇%納入標準。
[0069] 測定了 5批美洲大蠊樣品，測定結(jié)果分別為2.2%、2.6%、2.6%、2.4%、3.8%，平均值為 2.7%，根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊藥材水分限度定為不得過10.0%，納入標準。
[0070] C、總灰分、酸不容性灰分《云南省藥品標準》（2005年版)收載"蜚蠊"，《湖南省中 藥材標準》(2009年版）、《四川省中藥材標準》(2010年版)收載"美洲大蠊"均有規(guī)定:總灰分 的限度為不得過8.0%;酸不溶性灰分的限度定為不得過1.6%。對云南騰藥制藥股份有限5批 樣品進行測定，均符合規(guī)定。納入標準。
[0071] d、指紋圖譜參照云南騰藥制藥股份有限公司申報獲批的《心脈隆浸膏》、《心脈隆 注射液》國家標準指紋圖譜項下制訂。本法采用強堿性陰離子交換樹脂層析柱對樣品進行 純化，再以HPLC法進行檢測。測定了5批美洲大蠊樣品，測定結(jié)果分別為0.97、0.97、0.98、 0.98、0.97,平均值為0.97,根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊指紋圖譜相似度限度定為應(yīng)大于 0.90,納入標準。
[0072] e、重金屬及有害元素《云南省藥品標準》(2005年版)收載"蜚蠊"，《湖南省中藥材 標準》（2009年版)收載"美洲大蠊"均未規(guī)定。云南騰藥制藥股份有限公司參照《中國藥典》 該項控制的藥材進行檢驗，測定了 5批美洲大蠊樣品，結(jié)果符合要求，即："鉛、鎘、砷、汞、銅 測定法（通則2321原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法）測定，鉛不得過5mg/ kg;鎘不得過0 ? 3mg/kg;砷不得過2mg/kg;萊不得過0 ? 2mg/kg;銅不得過20mg/kg"。納入標 準。
[0073] f、微生物限度參照《中國藥典》增加美洲大蠊微生物限度檢查法(通則1106)，大 腸埃希菌每lg不得檢出；沙門菌每l〇g不得檢出，納入標準。對云南騰藥制藥股份有限公司5 批樣品進行測定，均為檢出。納入標準。
[0074] 4)浸出物：《云南省藥品標準》(2005年版)收載"蜚蠊"規(guī)定熱浸法測定，以稀乙醇 作溶劑，浸出物不得少于20.0%?！逗鲜≈兴幉臉藴省?2009年版)收載"美洲大蠊"規(guī)定熱浸 法測定，50%乙醇作為溶劑，浸出物不得少于20.0%?！端拇ㄊ≈兴幉臉藴省罚?010年版)收載 "美洲大蠊標準"規(guī)定冷浸法測定，以95%的乙醇作溶劑，浸出物不得少于8.0%?？紤]到美洲 大蠊為原料的"康復(fù)新液"、"肝龍膠囊"、"心脈隆注射液"三個藥品提取工序均以95%的乙醇 做溶媒，故將浸出物測定方法修訂為:溶媒為95%乙醇。納入標準。
[0075] 測定了 5批蜚蠊藥材樣品，測定結(jié)果分別為30 ? 2%、21 ? 2%、20 ? 0、32 ? 2%、38 ? 6%，平均 值為24.8%。根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊藥材浸出物限度定為不得少于28.4%。納入標準。 [0076] 5)含量測定： a、肌苷含量測定《云南省中藥材標準》(2005年版）、《湖南省中藥材標準》(2009年版）、 《四川省中藥材標準》(2010年版)均未收載肌苷的測定。云南騰藥制藥股份有限公司參照已 申報獲批的《心脈隆浸膏》、《心脈隆注射液》國家標準肌苷、尿嘧啶、次黃嘌呤的含量測定項 下，取指紋圖譜項下供試品溶液作為該含量測定供試液，分別進行測定，結(jié)果:尿嘧啶、次黃 嘌呤含量均較少，且批與批之間波動大，不宜建議限度范圍，而肌苷則相反，適宜于建立在 標準中。
[0077]測定了 5批美洲大蠊樣品，測定肌苷含量結(jié)果分別為84mg/100g、106mg/100g、 761^/10(^、811^/10(^、781^/10(^，平均值為8511^/10(^，根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊(供注 射用)肌苷含量限度定為60mg/100g~120mg/100g;納入標準。
[0078] b、氨基酸含量測定《云南省中藥材標準》(2005年版）、《湖南省中藥材標準》(2009 年版)均未收載氨基酸的測定?！端拇ㄊ≈兴幉臉藴省?2010年版)收載"美洲大蠊標準"進行 總氨基酸測定，規(guī)定總氨基酸不得少于0.45%，即4.5mg/g。
[0079] 云南騰藥制藥股份有限公司參照已申報獲批的《心脈隆浸膏》、《心脈隆注射液》國 家標準氨基酸含量測定項下，取指紋圖譜項下供試品溶液作為氨基酸含量測定供試液，分 別進行游離氨基酸測定和結(jié)合氨基酸測定，并規(guī)定游離氨基酸含量不得少于6. Omg/g，結(jié)合 氨基酸含量不得少于5. Omg/g。
[0080]測定了5批美洲大蠊樣品，測定游離氨基酸含量結(jié)果分別為8.4 mg/g、8.9 mg/g、 7.3 mg/g、8.8 mg/g、6.0 mg/g，平均值為7.9mg/g，根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊游離氨基酸 限度定為不得少于6. Omg/g;測定結(jié)合氨基酸含量結(jié)果分別為7. Omg/g、5.8mg/g、5.2mg/g、 6.9mg/g、5.2mg/g，平均值為6.0mg/g，根據(jù)測定結(jié)果，將美洲大蠊結(jié)合氨基酸限度定為不得 少于5 ? 0mg/g;納入標準。
【主權(quán)項】
1. 一種美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法如下： 1) 性狀:本品呈類橢圓形，長27-32111111，寬1〇-3〇1]1111，赤褐色，前胸背板6-91]1111，略呈梯形， 前窄后寬，后緣緩弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明顯；其后緣中央微向后延伸，雄蟲 肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角形缺口，腹部第一背板無毛茸；雌蟲肛上板略呈長 三角形，不透明，后緣呈三角形切口； 2) 鑒別：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加熱回流20~40min，取出，放至室溫，濾過， 濾液作為供試品溶液，另取丙氨酸對照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作為對照品溶 液;照中國藥典一部的薄層色譜法進行試驗，吸取上述兩種溶液各如1，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以體積配比為4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上， 顯相同顏色的斑點； 3) 檢查： a、 水分:照中國藥典一部的水分測定法進行試驗，水分含量不得過10%; b、 總灰分:照中國藥典一部的總灰分測定法進行試驗，總灰分不得過8%; c、 酸不溶性灰分:找中國藥典一部的酸不溶性灰分測定法進行試驗，酸不溶性灰分不 得過1.6%; d、 指紋圖譜:色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 為流動相A，以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下 表進行梯度洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，記錄30分鐘 內(nèi)的色譜圖； 供試品色譜圖應(yīng)與標準指紋圖譜基本一致，將供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相 似度評價系統(tǒng)與標準指紋圖譜相比較，計算相似度，相似度應(yīng)不低于〇. 90; e、 微生物限度：照中國藥典一部的微生物限度檢查法進行檢查，大腸埃希菌每lg不得 檢出，沙門菌每l〇g不得檢出； 4) 浸出物：照中國藥典一部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法進行測定，使用95%的乙 醇作為溶劑，浸出物不得少于20%; 5) 含量測定： a、肌苷高效液相色譜法測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A， 以0.05mol/L乙酸鈉緩沖液為流動相B;流速為每分鐘0.6ml，柱溫為30°C，按下表進行梯度 洗脫;檢測波長為254nm，理論板數(shù)按肌苷峰計，應(yīng)不低于5000;對照品溶液的制備：取肌苷對照品適量，精密稱定，加流動相A制成每lml含70yg的溶 液，搖勻，作為對照品溶液； 供試品溶液的制備：取本品粉末20g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 稱定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減少的重量，搖勻，濾 過，取續(xù)濾液l〇〇ml減壓濃縮至干，殘渣精密加水20ml于60 °C充分溫溶，搖勻，冷卻，離心或 過濾，取續(xù)濾液5ml，通過強堿性陰離子交換樹脂層析柱，用水10ml洗脫，棄去水洗脫液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脫，棄去初洗脫液5ml，收集續(xù)洗脫液25ml，搖勻，作為供試品溶液； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5yl，注入液相色譜儀，測定即得； 結(jié)果計算：式中： C:每100g供試品中肌苷的含量(mg ); Cx:供試品液肌苷含量(mg); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； 11:稀釋倍數(shù)(200倍）； 本品按干燥品計算，每l〇〇g含肌苷(C-4O5)應(yīng)為60~120mg; b、氨基酸： 標準曲線的制備取谷氨酸對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加水150~170ml溫 熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別 置具塞試管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml與茚三酮試液1.0ml， 搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，立即冷卻，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，搖勻， 照中國藥典一部的紫外-可見分光光度法，以相應(yīng)試劑為空白，在570nm波長處測定吸收度， 以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線； 游離氨基酸精密量取指紋圖譜項下殘渣精密加水20ml于60°C充分溫溶，搖勻，離心或 過濾的供試品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取lml，照標準曲線的制 備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出 供試品溶液中游離氨基酸的含量&，按下式計算，即得； 結(jié)果計算：式中： 0?:每1 g供試品中游離氨基酸含量(mg); Ci:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； 11:稀釋倍數(shù)(5000倍）； 結(jié)合氨基酸精密量取含量測定肌苷項下供試品溶液〇. 4ml于水解管中，加鹽酸0.4ml， 封口或擰緊螺絲蓋，將已封口的水解管放在11 〇 °C ± 1°C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解8小時后，取 出，冷卻；打開水解管，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用去離子水多次沖洗水解管，蒸干，殘渣加去離子 水適量使溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品水解液;精密量取lml， 照標準曲線的制備方法，自"各加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液1.0ml"起，依法測定吸收度，從 標準曲線上讀出供試品溶液中游離氨基酸的含量C 2,按下式計算，即得； 結(jié)果計算：式中： C結(jié):每lg供試品中結(jié)合氨基酸含量(mg); C2:供試品反應(yīng)液的濃度(mg/ml); S:供試品取樣量(mg); W(%):供試品水分含量； 11:稀釋倍數(shù)(5000倍）； 本品按干燥品計算，每g含游離氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，應(yīng)不低于6. Omg;每g含結(jié) 合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計，應(yīng)不低于5.0mg。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于還包括雜質(zhì)檢查，照中 國藥典一部的中藥材雜質(zhì)檢查進行檢測，雜質(zhì)不得過2%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于還包括重金屬及有 害元素照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì) 譜法)測定，鉛不得過5mg/kg;鎘不得過0.3mg/kg;砷不得過2mg/kg;萊不得過0.2mg/kg;銅 不得過20mg/kg。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于3)中色譜柱為Agilent Zorbax SB，5wn，4.6 X 150mm;所述的0.05mol/L乙酸鈉緩沖液的pH值為5.0，其配置方法為： 稱取醋酸鈉（NaAc.3H20) 6.80g溶于800ml水中，以lmol/L醋酸調(diào)整PH值至5.0,加水至 1000ml，即得。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于3)中所述的強堿性陰 離子交換樹脂層析柱為Dowe X 2，C1 一型，200目，內(nèi)徑1.5cm，柱長2.5cm;濕法裝柱，用 0.5mo 1 /L氫氧化鈉溶液10ml洗脫，再用水10ml洗脫得到。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于5)中色譜柱為Agilent Zorbax SB，5um，4.6X 150mm〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于5)中所述的0.05mol/L 乙酸鈉緩沖液的pH值為5.0，其配置方法為：稱取醋酸鈉(NaAc . 3H20) 6.80g溶于800ml水 中，以lmol/L醋酸調(diào)整PH值至5.0，加水至1000ml，即得。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于5)中所述的強堿性陰 離子交換樹脂層析柱為Dowe X 2，C1 一型，200目，內(nèi)徑1.5cm，柱長2.5cm;濕法裝柱，用 0.5mo 1 /L氫氧化鈉溶液10ml洗脫，再用水10ml洗脫得到。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于5)中所述的0.2mol/L 枸櫞酸緩沖液的pH值為5.0，其配置方法為:稱取21.Olg枸櫞酸溶于200ml水中，加200ml的 lmol/L氫氧化鈉溶液，加水稀釋成500ml，即得。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲大蠊的質(zhì)量檢測方法，其特征在于5)中所述的茚三酮溶 液，其配置方法為：取茚三酮1.25g溶于25ml乙二醇獨甲醚中，另取氰化鉀液(0.01m 〇l/L) 2.5ml加乙二醇獨甲醚使成125ml，然后將兩種溶液混合，置試劑瓶中，放置過夜備用，本液 顯淺黃色微帶青光，在一周內(nèi)穩(wěn)定。
【文檔編號】G01N33/15GK106053744SQ201610608653
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】萬德生, 邵維在, 段治尚, 周永斌
【申請人】云南騰藥制藥股份有限公司