強力霉素現(xiàn)場檢測試紙及其制備、使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗生素檢測技術(shù)的改進，具體涉及現(xiàn)場檢測試紙及其制備、使用方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。包括：保藏號為CCTCC—C201680雜交瘤細(xì)胞DC?C所分泌的抗強力霉素、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C，帶有不干膠的載體板，在載體板的兩端部，分別設(shè)有加樣端吸水層和手持端吸水層，在該載體板中部設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測層，在該檢測層與加樣端吸水層交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊，玻璃纖維層塊的一端設(shè)置在加樣端吸水層之下，另一端設(shè)置在檢測層之上，在與玻璃纖維層塊延續(xù)的檢測層上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線和質(zhì)控線處分別包被有DC?OVA和羊抗鼠IgG。本發(fā)明能夠現(xiàn)場快速、簡便、準(zhǔn)確檢測強力霉素，可用于現(xiàn)場對強力霉素藥物殘留的檢測。CCTCC NO:C20168020160520
【專利說明】
強力霉素現(xiàn)場檢測試紙及其制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抗生素檢測技術(shù)的改進，具體涉及現(xiàn)場檢測試紙及其制備、使用方法， 屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 機制與四環(huán)素相同，主要是干擾敏感菌的蛋白質(zhì)合成。它可以特異性地與細(xì)菌核 糖體30S亞基在A位置結(jié)合，從而抑制氨基酰-tRNA在該位置上的聯(lián)結(jié)，阻止肽鏈的延長;強 力霉素還可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的核苷酸及其他重要成分漏出，從而抑 制細(xì)菌DNA的復(fù)制。強力霉素對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、淋球菌、腦膜 炎球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀菌屬、耶爾森菌、單核細(xì)胞李斯特菌等有較強抗菌活性， 對立克次體、支原體、衣原體、放線菌等也有一定作用?？咕V與四環(huán)素、土霉素基本相同。 體內(nèi)、外抗菌力均較四環(huán)素強。
[0003] 強力霉素被吸收后廣泛分布于各組織和體液，分布容積約為0.7L/kg。因脂溶性較 高，強力霉素對組織的穿透力較強，在胸導(dǎo)管淋巴液、腹腔積液、腸組織、眼和前列腺組織中 的藥物濃度均較高，約為血藥濃度的60 %~75 %，膽汁中的藥物濃度可達(dá)血藥濃度的10~ 20倍;在乳汁中也能達(dá)到較高的藥物濃度;強力霉素也可以分布于肝臟、脾臟、骨髓、骨骼、 牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)中。強力霉素在體內(nèi)蛋白結(jié)合率為80%~95%，清除半衰期為12~22h，腎 功能減退者半衰期延長不明顯。藥物主要在肝臟內(nèi)代謝滅活，通過腎小球濾過隨尿液排泄， 當(dāng)腎功能損害時，強力霉素從胃腸道的排泄量增加，成為主要的代謝途徑。強力霉素不能經(jīng) 透析清除。
[0004] 強力霉素目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)作為一種較為普遍的抗感染藥物使用，有著很好地 治療作用，但在實際生產(chǎn)中往往會出現(xiàn)強力霉素過量的情況，導(dǎo)致水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水體中存 在殘留。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》明確規(guī)定，動物 性食品肌肉中殘留量為100yg/kg，皮脂中最大殘留量為300 yg/kg，肝臟中最大殘留量為 300iig/kg，腎臟中最大殘留量為600iig/kg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對強力霉素殘留的現(xiàn)狀，以及其對人體的危害，設(shè)計發(fā)明提供一種能夠 現(xiàn)場快速、簡便、準(zhǔn)確檢測強力霉素的檢測試紙及其制備、使用方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)如下
[0007] 強力霉素快速檢測試紙條，其特殊之處在于包括:保藏號為CCTCC 一 C201680雜交 瘤細(xì)胞DC-C所分泌的抗強力霉素、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡稱:金標(biāo)單抗C)，包被原強 力霉素-雞卵清蛋白（DC-0VA)和羊抗鼠IgG，帶有不干膠的載體板3，在載體板3的兩端部，分 別設(shè)有加樣端吸水層1和手持端吸水層7,在該載體板3中部段設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢 測層6,在該檢測層6與加樣端吸水層1交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊2,玻璃纖 維層塊2的一端設(shè)置在加樣端吸水層1之下，另一端設(shè)置在檢測層6之上，在與玻璃纖維層塊 2延續(xù)的檢測層6上設(shè)有檢測線4和質(zhì)控線5,檢測線4和質(zhì)控線5處分別包被有DC-OVA和羊抗 鼠 IgG;
[0008] 所述金標(biāo)單抗C是由小分子半抗原強力霉素(DC)與牛血清白蛋白（BSA)通過戊二 醛(GA)法偶聯(lián)合成的強力霉素-牛血清白蛋白（DC-BSA)完全抗原，將其作為免疫原而制備 的抗強力霉素單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記后而致；
[0009] 所述的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備步驟如下：
[0010] 1、以公知的膠體金的制備工藝制備膠體金溶液，制得的膠體金的顆粒大小為18-20nm;
[0011] 2、將單克隆抗體C(3g/L抗體蛋白），按200yl-3ml加入到上述的100ml膠體金溶液 中，慢攪混勻；
[0012] 3、向混合溶液中加入PEG20000,使其終濃度為1-5%，靜置過夜；
[0013] 4、離心8000-10000轉(zhuǎn)/分，1-1 ? 5小時，棄上清；
[0014] 5、取離心沉淀，用含有1-5 %PEG20000、0 ? 05-0 ? 25 %吐溫-20、0 ? 02 %疊氮鈉的 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標(biāo)單抗C;
[0015]所述磷酸鹽緩沖液的1^值為7.4，其中含有1((：10.28、他(：18.(^、1(1^〇4〇.2 8、 Na2HP〇4l2H20 2.9g、蒸餾水 1000ml;
[0016]所述步驟1中膠體金溶液的制備方法為按一定的配比將氯金酸與檸檬酸三鈉混合 并加熱制備成膠體金溶液；
[0017]所述步驟2中單克隆抗體C與膠體金溶液慢攪混勾30-60min。
[0018] 強力霉素快速檢測試紙條的使用方法，其特殊之處在于包括以下步驟：
[0019] 將該試紙的加樣端吸水層1插入或在其上滴加被檢測樣品，5-10min在位于檢測層 6下端的檢測線4處不顯色，檢測層上端的質(zhì)控線5顯示紅色，表示樣品中殘有強力霉素;檢 測線4處顯示紅色，質(zhì)控線5顯色，表示樣品中沒有強力霉素殘留或是強力霉素濃度低于 0.2ug/ml〇
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)的實際特點，研制了一種強力霉素殘留快 速現(xiàn)場檢測試紙及其制備、使用方法，采用動物血液或是內(nèi)臟如肝臟加適量的生理鹽水碾 碎制備成檢測樣品液，對其進行檢測，原理是采用競爭ELISA原理，即由金標(biāo)單抗C同檢測樣 品液中的抗原反應(yīng)，形成金標(biāo)單抗C-強力霉素的復(fù)合物，此時，金標(biāo)單抗C已經(jīng)與強力霉素 結(jié)合，就不能夠與檢測線4處的DC-0VA結(jié)合，因此，金標(biāo)單抗C與DC-0VA競爭結(jié)合強力霉素， 金標(biāo)單抗C-強力霉素通過層析作用至質(zhì)控線5處，羊抗鼠IgG能夠與金標(biāo)單抗C結(jié)合，膠體金 顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色;若待測液中不含強力霉素，金標(biāo)單抗C會與檢測 線4處的DC-0VA結(jié)合出現(xiàn)紅色，質(zhì)控線顯色代表該試紙條有效。
[0021] 本發(fā)明的特點是：1、本發(fā)明的強力霉素現(xiàn)場檢測試紙，從實際的養(yǎng)殖需要出發(fā)，將 藥物殘留的檢測搬到的養(yǎng)殖現(xiàn)場，使用時無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適合普通養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖 現(xiàn)場檢測，應(yīng)用簡單。2、具有檢測快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點，并具有較高的穩(wěn)定性，在5-10min之內(nèi)便可顯示檢測結(jié)果，一旦檢出超標(biāo)可以將養(yǎng)殖動物多養(yǎng)一段時間，讓藥物代謝直 至殘留低于國家標(biāo)準(zhǔn)，可以安全上市，是最方便的一種解決藥殘問題的方法，減少了因藥物 殘留對人體的傷害和養(yǎng)殖戶因藥殘超標(biāo)被退貨造成巨大的損失。改善了因藥殘留送檢麻 煩，周期長，收費高等原因造成99%以上養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖動物上市前是不送檢藥殘留的情況。
【附圖說明】
[0022]圖1:本發(fā)明強力霉素快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖2:本發(fā)明強力霉素快速檢測試紙條的檢測結(jié)果示意圖。
[0024]雜交瘤細(xì)胞株DC-C，其保藏編號為:CCTCC N0:C201680;保藏單位全稱及簡稱：中 國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);保藏單位地址:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中 心;保藏日期：2016年5月20日。
【具體實施方式】 [0025] 實施例1
[0026] 強力霉素完全抗原的制備:稱取100mg BSA加入到10mL PBS(pH 7.4)中，稱取3〇11^ DC溶于10ml PBS中，在DC溶液緩慢攪拌下逐滴加入BSA溶液，隨后緩慢滴加200yL的GA(濃度 25% )，加入的同時要不斷攪拌，在避光及4°C條件下反應(yīng)24小時，以4000rpm轉(zhuǎn)速離心5min， 取上清液裝入提前處理好的透析袋中，PBS為透析液透析3d，每8h更換一次透析液，透析完 全后，偶聯(lián)產(chǎn)物分裝，-20 °C保存。相同的方法制備包被原DC-0VA。合成原理如下所示：
[0028] 實施例2
[0029]抗強力霉素的單克隆抗體的制備:本發(fā)明的分泌抗強力霉素的單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞，其制備與選擇的方法如下：
[0030] (1)用戊二醛法合成強力霉素完全抗原，包括免疫原DC-BSA，包被原DC-0VA;
[0031] (2)用免疫原DC-BSA免疫Balb/c小白鼠；
[0032] (3)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，培養(yǎng)得166株雜交瘤細(xì)胞；
[0033] (4)用包被原DC-0VA包板間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株；
[0034] (5)采用有限稀釋法對其中1株陽性最強的雜交瘤細(xì)胞進行了克??；
[0035] (6)通過間接ELISA法篩選出效價最高的抗強力霉素的單抗1B7-1F9二次克隆的細(xì) 胞株制備的抗體，制備金標(biāo)單抗。見表1 [0036] 表1:單克隆抗體篩選結(jié)果
[0037]
[0038] 實施例3
[0039] 本發(fā)明的強力霉素單抗C的特異性鑒定:為了確定單克隆抗體是否能夠特異性結(jié) 合強力霉素，就要對所得抗體做特異性檢測及交叉實驗，確定單抗與其他抗生素是否存在 交叉現(xiàn)象。分別配置〇.lμg/ml的強力霉素、土霉素、新諾明、鹽酸諾氟沙星及氟苯尼考，采用 競爭ELISA的檢測方法，對各種藥物進行交叉實驗。以DC-0VA為包被原，純化后的單抗為第 一抗體，加入一抗后立即加入上述幾種藥物，每孔加lOOyl，以PBS作為對照，加入二抗及底 物緩沖液后，測定各個孔的0D值.結(jié)果顯示強力霉素單抗C與這四種藥物均不存在交叉現(xiàn) 象，強力霉素與陽性對照比較，存在差異，說明本實驗制備的單抗與強力霉素發(fā)生特異性結(jié) 合，與其他抗生素不能夠特異結(jié)合。實驗結(jié)果參見表2。
[0040] 表2:抗強力霉素單克隆抗體特異性實驗(&士 s，n = 6)
[0041]
[0042] 注強力霉素組與陽性相比較，其P值為0.0232<0.05,說明存在顯著差異。
[0043] 實施例4
[0044]強力霉素快速檢測試紙條，參見附圖1，其包括:保藏號為CCTCC 一 C201680雜交瘤 細(xì)胞DC-C所分泌的抗強力霉素、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡稱:金標(biāo)單抗C)，包被原(DC-0VA)和羊抗小鼠IgG(簡稱:羊抗鼠IgG)，帶有不干膠的載體板3,在載體板3的兩端部，分別 設(shè)有加樣端吸水層1和手持端吸水層7,在該載體板3中部段設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測 層6,在該檢測層6與加樣端吸水層1交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊2,玻璃纖維 層塊2的一端設(shè)置在加樣端吸水層1之下，另一端設(shè)置在檢測層6之上，在與玻璃纖維層塊2 延續(xù)的檢測層6上設(shè)有檢測線4和質(zhì)控線5,檢測線4和質(zhì)控線5處分別包被有DC-0VA(360ug/ ml)和羊抗鼠 IgG(lμg/ml)。
[0045] 實施例5
[0046] 膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備步驟如下：
[0047] (1)膠體金的制備：18-20nm膠體金顆粒制備，將濃度為0.01 %氯金酸溶液250ml與 1 %檸檬酸鈉6.65mr混合，加熱至100攝氏度，制成膠體金溶液，該溶液的pH值：用0.2M碳酸 鐘調(diào)至8.2，備用；
[0048] (2)金標(biāo)單抗C的制備：
[0049]抗強力霉素單抗?jié)舛葹?g/L時，100ml膠體金標(biāo)記的最適單抗量為1.5ml，按此比 例將抗強力霉素單抗加入到膠體金溶液中，慢攪50min，加入5%PEG20000，4°C過夜;然后將 其在4°C下，8000r離心60min;取離心沉淀，用含有含5%?￡620000、0.25%吐溫20的 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(KCL 0.2g，NaCL 8.0g，KH2P04 0.2g，Na2HP0412H20 2.9g，蒸餾水 1000ml，pH 7.4)懸起，再加疊氮鈉將濃度調(diào)至0.02%，即制成金標(biāo)單抗C。
[0050] 實施例6
[0051]本發(fā)明的強力霉素現(xiàn)場檢測試紙檢測層制備方法為:將DC-0VA360ug/ml用噴膜機 將其噴于硝酸纖維膜上，形成檢測線4;同樣，將羊抗小鼠IgG配成200iig/ml，用噴膜機將其 噴于硝酸纖維膜上，形成質(zhì)控線5。兩線相距5mm，質(zhì)控線5近手持端吸水層，檢測線4近加樣 端吸水層。室溫下晾干，再用pH 7.4,含5%PEG20000的O.Olmol/LPBS 37°C封閉30min，PBS 漂洗晾干。
[0052] 實施例7
[0053]本發(fā)明的強力霉素快速檢測條檢測的最低殘留量為0.2ug/ml，低于農(nóng)業(yè)部2002年 12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最尚殘留限量》規(guī)定的皮脂中最大殘留量為300iig/kg，肝臟 中最大殘留量為300lig/kg，腎臟中最大殘留量為600iig/kg;尚于動物性食品肌肉中殘留量 為100yg/kg，達(dá)到池邊快速檢測的目標(biāo)。見表3 [0054]表3:強力霉素現(xiàn)場檢測試紙靈敏的測定 「00551
[0056]注:+表示檢測線顏色為紅色，檢測結(jié)果為陽性;-表示檢測線為無色，檢測結(jié)果為 陰性。
[0057] 實施例8
[0058] 本發(fā)明的強力霉素快速檢測試紙條的使用方法，檢測步驟如下:首先，從養(yǎng)殖的池 中取活魚一條，取肝臟，按重量/體積(w/v)比1:2加入生理鹽水或pH 6.0-8.0的磷酸鹽緩沖 液，將肝臟碾碎，制備成檢測樣品；然后，將試紙的加樣端1吸水層浸入試管的檢測樣品中 (液面不得超過吸水紙1的2/3)，5min讀結(jié)果。
[0059]陽性結(jié)果:檢驗層6下部檢測線4不顯色，檢驗層6上部質(zhì)控線5顯示紅色線，表示樣 品有中殘有強力霉素；
[0060]陰性結(jié)果:檢驗層6下部檢測線4顯示紅色線，檢驗層6上部質(zhì)控線5顯色，表示樣品 表示檢測不到強力霉素或是強力霉素濃度低于〇.2ug/ml。詳見附圖2。
【主權(quán)項】
1. 強力霉素現(xiàn)場快速檢測試紙，其特征在于包括:保藏號為CCTCC 一 C201680雜交瘤細(xì) 胞DC-C所分泌的抗強力霉素、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡稱金標(biāo)單抗C)，包被原DC-OVA 和羊抗鼠 IgG，帶有不干膠的載體板(3)，在載體板(3)的兩端部，分別設(shè)有加樣端吸水層（1) 和手持端吸水層(7)，在該載體板(3)中部設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測層(6)，在該檢測層 (6)與加樣端吸水層（1)交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊(2)，玻璃纖維層塊(2) 的一端設(shè)置在加樣端吸水層（1)之下，另一端設(shè)置在檢測層(6)之上，在與玻璃纖維層塊(2) 延續(xù)的檢測層(6)上設(shè)有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，檢測線(4)和質(zhì)控線(5)處分別包被有DC-OVA和羊抗鼠 IgG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的強力霉素現(xiàn)場快速檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)單抗C是由 小分子半抗原強力霉素(DC)與牛血清白蛋白（BSA)通過戊二醛法偶聯(lián)合成完全抗原DC-BSA 作為免疫原而制備的抗強力霉素單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記后而制備。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的強力霉素現(xiàn)場快速檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)單抗C的制 備方法如下： (1) 以公知的膠體金的制備工藝制備膠體金溶液，制得的膠體金的顆粒大小為18-20nm; (2) 將單克隆抗體C(3g/L抗體蛋白），按200yl-3ml加入到上述的100ml膠體金溶液中， 慢攪混勻； (3) 向混合溶液中加入PEG20000，使其終濃度為1-5 %，靜置過夜； (4) 離心8000-10000轉(zhuǎn)/分，1-1.5小時，棄上清； (5) 取離心沉淀，用含有0.05-0.25%吐溫-20、0.02%疊氮化鈉的0.01mol/L磷酸鹽緩 沖液懸起，制成金標(biāo)單抗C。4. 按照權(quán)利要求3所述的氟苯尼考現(xiàn)場快速檢測試紙，其特征在于步驟(1)中所述膠體 金溶液的制備方法為按一定的配比將氯金酸與檸檬酸三鈉混合并加熱制備成膠體金溶 液。5. 按照權(quán)利要求3所述的強力霉素現(xiàn)場快速檢測試紙，其特征在于步驟(2)中單克隆抗 體C與膠體金溶液慢攪混勻30-60min。6. 強力霉素快速檢測試紙條的使用方法，其特征在于包括以下步驟： 將該試紙的加樣端吸水層（1)插入或在其上滴加被檢測樣品，5-10min在位于檢測層 (6)下端檢測線(4)不顯色，檢驗層(6)上部質(zhì)控線（5)顯示紅色線，表示樣品有中殘有強力 霉素;檢驗層(6)下部檢測線(4)顯示紅色線，檢驗層(6)上部質(zhì)控線(5)顯色，表示樣品表示 檢測不到強力霉素或是強力霉素濃度低于0.2ug/ml，質(zhì)控線處不顯示紅色，表示該試紙無 效。
【文檔編號】G01N33/558GK106053798SQ201610596849
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610596849.9, CN 106053798 A, CN 106053798A, CN 201610596849, CN-A-106053798, CN106053798 A, CN106053798A, CN201610596849, CN201610596849.9
【發(fā)明人】王曉潔, 李楠
【申請人】魯東大學(xué)