一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，金膠墊上含有膠體金與抗卵黃磷蛋白單抗結(jié)合形成的金標(biāo)抗卵黃磷蛋白抗體復(fù)合物，硝酸纖維膜層上設(shè)有抗卵黃磷蛋白多克隆抗體溶液印制的測(cè)試線及羊抗鼠IgG抗體溶液印制的質(zhì)控線。優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明的金標(biāo)試紙使用簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，靈敏度高，較目測(cè)及經(jīng)驗(yàn)推斷卵黃物質(zhì)消耗情況可靠度和工作效率均得到了極大地提高。2、本發(fā)明的金標(biāo)試紙用于快速檢測(cè)蟹類水產(chǎn)品卵黃磷蛋白含量，結(jié)果判斷直觀可靠，可用于蟹類育苗技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試，提高蟹類人工育苗的成功率，為經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及卵黃磷蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋 白含量的金標(biāo)試紙及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 經(jīng)濟(jì)蟹類是我國(guó)水產(chǎn)品的重要組成部分，經(jīng)中國(guó)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，至2014年，我國(guó)各 類經(jīng)濟(jì)蟹類市場(chǎng)消費(fèi)量達(dá)60萬噸，其中主要的經(jīng)濟(jì)蟹類包括中華絨螯蟹，三疣梭子蟹，擬穴 青蟹，遠(yuǎn)海梭子蟹等，為適應(yīng)市場(chǎng)的巨大需求，我國(guó)自上世紀(jì)八十年代起逐步開始各種經(jīng)濟(jì) 蟹類的人工養(yǎng)殖，隨著經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，制約養(yǎng)殖發(fā)展的主要問題是優(yōu)質(zhì)苗 種稀缺。由于蟹類和魚類不同，在孵化后要經(jīng)過數(shù)次蛻殼，變態(tài)才能變?yōu)檎嬲饬x上的"蟹 苗"，這一復(fù)雜特性導(dǎo)致目前蟹類育苗水平普遍偏低，親本性腺發(fā)育不良、抱卵量低、胚胎發(fā) 育死亡率高、幼體育成率低等都造成了優(yōu)質(zhì)苗種的供應(yīng)不足。此外，低效的育苗技術(shù)導(dǎo)致每 年需要從野生資源中捕獲大量的親本或者天然苗種才能滿足生產(chǎn)需求，這必然給經(jīng)濟(jì)蟹類 的自然資源保護(hù)帶來巨大的壓力，因此提高蟹類人工育苗的成功率，是經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè) 可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。
[0003] 甲殼類在胚胎發(fā)育過程中均形成卵黃囊結(jié)構(gòu)，卵黃囊中的卵黃物質(zhì)是整個(gè)胚胎發(fā) 育過程中唯一的營(yíng)養(yǎng)來源，在孵化后，卵黃囊中依然存有部分卵黃物質(zhì)，為初孵幼體提供能 量，待卵黃物質(zhì)消耗完畢，卵黃囊特化為肝胰腺，幼體才開始從外界攝食獲取營(yíng)養(yǎng)。由于甲 殼動(dòng)物這種孵化后依然靠自身卵黃物質(zhì)供能一段時(shí)間的特性，給育苗工作帶來很大的難 題，蚤狀幼體孵化后恰到時(shí)機(jī)的投餌，是保證育苗成功的重要因素之一。過早的投餌，幼體 并不攝食，餌料在水中影響水質(zhì)，過晚投餌，幼體已經(jīng)處于饑餓狀態(tài)，會(huì)對(duì)接下來的變態(tài)發(fā) 育造成不可逆的傷害，最佳的投餌時(shí)機(jī)是幼體體內(nèi)卵黃物質(zhì)剛好消耗完畢，開始開口攝食。 在目前的蟹類育苗生產(chǎn)中，在何時(shí)開始投餌一直靠經(jīng)驗(yàn)來判斷，不同甲殼動(dòng)物的初孵幼體 所攜帶的卵黃物質(zhì)并不相同，因此，不同的甲殼動(dòng)物幼體的最適宜投餌時(shí)機(jī)均不相同。即使 是同一物種，由于親本營(yíng)養(yǎng)情況不同，水溫水質(zhì)等環(huán)境因素的差異，均會(huì)影響最適投餌時(shí) 機(jī)。由此可見，目前靠人為經(jīng)驗(yàn)判斷最適投餌時(shí)機(jī)不僅準(zhǔn)確率低，而且無法量化，阻礙了育 苗技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化推廣，因此目前亟需一種能快速有效確定幼體體內(nèi)卵黃物質(zhì)含量的檢測(cè)手 段來突破此瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量 的金標(biāo)試紙。
[0005] 本發(fā)明的再一的目的是，提供如上所述金標(biāo)試紙的用途。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0007] -種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸 纖維膜層和吸水紙層，所述底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，所 述金膠墊上含有膠體金與抗卵黃磷蛋白單抗結(jié)合形成的金標(biāo)抗卵黃磷蛋白抗體復(fù)合物，所 述硝酸纖維膜層上設(shè)有抗卵黃磷蛋白多克隆抗體溶液印制的測(cè)試線(T線)及羊抗鼠IgG抗 體溶液印制的質(zhì)控線(C線）。
[0008] 進(jìn)一步，所述金標(biāo)抗卵黃磷蛋白抗體復(fù)合物制備方法如下：取膠體金溶液，加入 0.2mol/L K2C03溶液，K2C03加入量為7yL/mL，然后加入透析好的抗卵黃磷蛋白單抗，單抗的 加入量為1 〇y g/mL，過夜穩(wěn)定后加入終濃度為1 %的BSA混勻。
[0009] 進(jìn)一步，所述質(zhì)控線中抗體包被濃度為lmg/mL。
[0010]進(jìn)一步，所述測(cè)試線中抗體包被濃度為lmg/mL。
[0011] 進(jìn)一步，所述金標(biāo)試紙對(duì)于中華絨螯蟹卵黃磷蛋白的檢測(cè)限為lug/ml。
[0012] 進(jìn)一步，所述的金膠墊由玻璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成，所述的樣品墊為 吸水性玻璃纖維。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] 如上任一所述金標(biāo)試紙?jiān)诳焖贆z測(cè)蟹類水產(chǎn)品卵黃磷蛋白含量中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明基于膠體金抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合原理來判別樣品中是否含有卵黃磷蛋白。所述 抗體為通過蟹雌性親本卵巢中純化卵黃磷蛋白為抗原制備的鼠單克隆抗體，所述膠體金抗 體的載體為硝酸纖維素膜，所述載體上的質(zhì)控區(qū)和測(cè)試區(qū)分別包被兔抗鼠IgG。將待檢測(cè)的 幼體勻漿后滴于試紙上，如其體內(nèi)卵黃磷蛋白尚未消耗完畢，測(cè)在測(cè)試線C和質(zhì)控線T處均 出現(xiàn)紅色條帶，如果其體內(nèi)卵黃磷蛋白已經(jīng)消耗完畢，則在測(cè)試線處無條帶，僅質(zhì)控線處有 條帶。
[0016] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0017] 1、本發(fā)明的金標(biāo)試紙使用簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，靈敏度高，較目測(cè)及經(jīng)驗(yàn)推斷卵黃物質(zhì) 消耗情況可靠度和工作效率均得到了極大地提高。
[0018] 2、不同的甲殼動(dòng)物幼體的最適宜投餌時(shí)機(jī)均不相同，即使是同一物種，由于親本 營(yíng)養(yǎng)情況不同，水溫水質(zhì)等環(huán)境因素的差異，均會(huì)影響最適投餌時(shí)機(jī);本發(fā)明的金標(biāo)試紙檢 測(cè)用于快速檢測(cè)蟹類水產(chǎn)品卵黃磷蛋白含量，結(jié)果判斷直觀可靠，用于蟹類育苗技術(shù)的標(biāo) 準(zhǔn)化測(cè)試，提高蟹類人工育苗的成功率，為經(jīng)濟(jì)蟹類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 附圖1為兔多抗wb檢測(cè)結(jié)果。
[0020] 附圖2為兔多抗elisa檢測(cè)結(jié)果。
[0021] 附圖3為本發(fā)明的金標(biāo)試紙實(shí)際使用檢測(cè)結(jié)果。
[0022] 附圖4為本發(fā)明的金標(biāo)試紙結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0024]實(shí)施例1金標(biāo)試紙的制備及檢測(cè)
[0025] 1卵黃磷蛋白提取
[0026]取2.0g中華絨螯蟹的成熟卵巢，加入5ml預(yù)冷的勻漿緩沖液冰浴勻漿，然后將勻漿 液在4°C下離心（離心力=12000\8)30分鐘，取紫色上清液2-31111，并加入等體積的飽和硫 酸銨溶液，冰浴后在4°C下離心（離心力=12000 X g)30分鐘，棄上清液，向離心管中加入2ml 的PBS緩沖液溶解沉淀，然后重復(fù)三次，最后將沉淀物溶解于lml的PBS緩沖液中，待凝膠過 濾層析。采用伯樂全自動(dòng)蛋白質(zhì)和多肽的純化儀（型號(hào):BioLogic DouFlowTM，美國(guó)伯樂公 司生產(chǎn))對(duì)卵巢提取物進(jìn)行分離純化。其中凝膠柱體積為120ml(直徑X高度= 2crnX4〇Cm， 上海廈美生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)），裝入30ml凝膠（型號(hào)Sephaeryl S-300瑞典 Pharmacia公司生產(chǎn)），純化前首先采用PBS溶液平衡凝膠柱，流速3mL/min，平衡3小時(shí)。用注 射器上樣lml Vn提取液(蛋白濃度約為lmg/ml)，流速為0.6ml，在280nm和470nm條件下檢測(cè) 洗脫液的吸光度(0D)，當(dāng)出現(xiàn)蛋白組分時(shí)每lmL收集一次。洗脫液于-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 2蛋白純化
[0028] 丙烯酰胺單體貯液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'_甲叉雙丙烯酰胺，先用40mL 雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀至50mL，過濾。用棕色瓶4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 濃縮膠緩沖液貯液(0.5mol/L !>丨8-?：14116.8):3.0381>18溶解在4〇11^雙蒸水 中，用4mol/L鹽酸調(diào)pH6.8。再用雙蒸水稀至50mL。保存在4°C備用。
[0030] 分離膠緩沖液貯液（1 ? 5mol/L Tris-HCl，pH8 ? 9): 18 ? 16gTris溶解在80mL雙蒸水 中，用4mol/L鹽酸調(diào)pH8.9。再用雙蒸水稀至100mL，保存在4°C備用。
[0031] 10% (AP)過硫酸銨:0. lg過硫酸銨溶入1 .OmL雙蒸水，使用前新鮮配制。
[0032] 電極緩沖液（0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3):15.14gTrisWl72.07g 甘氨酸，用雙蒸水稀釋到5L?？稍谑覝乇４嬉粋€(gè)月。
[0033] 樣品緩沖液(0.1111〇1/11>18-11(：14冊(cè).8):21111濃縮膠緩沖液貯液加上11^87%甘 油、O.lmg溴酚藍(lán)，用雙蒸水稀釋至10mL，可在-20°C保存6個(gè)月。
[0034] 分離膠配方:雙蒸水:6? 6ml、30%丙稀酰胺溶液:8.0ml、1 ? 5mol/L Tris(pH8? 8): 5.0ml、10%AP(W/V):200ul、TEMED:15ul。
[0035] 濃縮膠配方：雙蒸水：6.81111、30%丙稀酰胺溶液：1.71111、1111〇1/1^148(口冊(cè).8): 1.251111、10%過硫酸銨(￥/^) :10〇111、丁￡]\^0:1〇111。
[0036] 將玻璃板、膠墊、梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制分 離膠（12 % )和濃縮膠(5 % )。過硫酸銨和TEMED最后加入，加入后聚合即開始，立即混勻倒入 兩塊玻璃板之間。分離膠倒入兩塊玻璃板間，留下適合的高度，使點(diǎn)樣孔前端離分離膠有 2.5cm左右的距離，在膠頂部緩緩加入約0.5cm高的雙蒸水，待分離膠聚合完全后，傾去上層 的雙蒸水，用雙蒸水清洗凝膠頂層，用吸水紙吸去殘余的水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層， 插上梳子，待濃縮膠聚合完全后，拔去梳子，立即用雙蒸水清洗點(diǎn)樣孔，加入電極緩沖液。 [0037]將中華絨螯蟹卵黃磷蛋白洗脫液經(jīng)PBS稀釋為濃度20ug/ul后與上樣緩沖液4:1混 合，用微量進(jìn)樣器點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部，200伏電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，電壓改為250伏，繼 續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。將凝膠剝下，浸泡在l〇〇ml的底物液中，染色1小時(shí)，待膠帶 顯色后立即照相。然后將凝膠進(jìn)行染色。中華絨螯蟹卵黃磷蛋白由兩個(gè)亞基構(gòu)成，對(duì)條帶進(jìn) 行割膠回收蛋白。
[0038] 3多克隆抗體的制備
[0039] 將回收蛋白溶液與等體積的弗氏佐劑、Y0UL0NG佐劑混合乳化均勻，成油包水狀 態(tài)，以備免疫兔子。免疫策略：免疫2只新西蘭大白兔，皮下免疫3次，間隔一個(gè)月，最后經(jīng) ELI SA檢測(cè)，抗血清滴度> 1: 50000。取血:耳緣靜脈加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫半個(gè)月后采集兔血 (全部采集）。多克隆抗體純化:兔血離心15min(4000rpm，室溫），取上層血清，在4°C攪拌下 逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌30min，離心30min( 13000rpm，4°C )，棄上清； 沉淀溶于適量PBS (0.01M，pH7.4);在4 °C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33 %，繼續(xù)攪拌 30111；[11，離心30111；[11(13000印111，4°0，棄上清；沉淀溶于適量？133(0.01]\14117.4)，4°(^透析過 夜，測(cè)定抗體含量，-20°C凍存?zhèn)溆谩Ａ蛩徜@沉淀后繼續(xù)采用Protein A小柱進(jìn)行純化，新柱 子先用5ml超純水過柱，再用5ml 0.4M PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;抗體過柱，過程中 要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合位點(diǎn)上;繼續(xù)10ml0.4M PB緩沖液(pH 7.0) 平衡純化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3.0)洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持為適合抗體保存的中性。
[0040] 4單克隆抗體的制備
[0041]將表達(dá)純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑混合乳化均勻，成油包水狀態(tài)，以備免疫 小鼠。免疫策略:將蛋白免疫4只小鼠，皮下免疫3次，間隔4周，最后經(jīng)ELISA檢測(cè)，抗血清滴 度>1:32000。細(xì)胞融合:最后一次免疫后兩周，腹腔注射抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后進(jìn)行細(xì) 胞融合。將小鼠斷頸處死，70%乙醇浸泡30min消毒，在超凈臺(tái)剪開腹腔，取出脾臟，磨碎，過 80目篩網(wǎng)，得到脾細(xì)胞，加入SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，在PEG4000的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合篩 選:將融合好的細(xì)胞鋪進(jìn)96孔板，用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，三天后換液，改用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。 10天后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)?？寺』c建株:使用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化， 10天后檢測(cè)，將陽性克隆繼續(xù)有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直到得到的克隆都為陽性，可建立陽 性細(xì)胞株，共獲取陽性細(xì)胞株27株。擴(kuò)大培養(yǎng):將建株的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行凍存。 [0042]腹水制備:提前一周在小鼠腹腔注射礦物油，將一定數(shù)量的細(xì)胞注射入小鼠腹腔， 10天左右收集腹水，4000rpm離心，得上清即為單克隆抗體腹水。單克隆抗體純化:腹水離心 15min(4000rpm，室溫），取上清，在4°C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌 30min，離心30min( 13000rpm，4°C)，棄上清；沉淀溶于適量PBS(0 ? 01M，pH7 ? 4);在4°C攪拌下 逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33 %，繼續(xù)攪拌30min，離心30min( 13000rpm，4°C )，棄上清;沉 淀溶于適量roS(0.01M，pH7.4)，4°C透析過夜，測(cè)定抗體含量，_20°C凍存?zhèn)溆?。硫酸銨沉淀 后繼續(xù)采用Protein G小柱進(jìn)行純化，新柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml 0.4M PB緩沖液 (pH 7.0)平衡純化小柱;抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合 位點(diǎn)上;繼續(xù)l〇ml 0.4M TO緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液 (pH2.7)洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并加入lMTriS-HCl(pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持為適 合抗體保存的中性。
[0043] 5多克隆抗體效價(jià)測(cè)定
[0044]采用樣品直接包被法ELISA檢驗(yàn)兔多克隆抗體的效價(jià)。首先將純化的Vn(卵黃磷蛋 白）用包被緩沖液溶解成lμg/ml，然后用100yl/孔進(jìn)行包被;將純化后的Vn抗血清按1:200、 1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000用 1 % 的BSA 進(jìn)行稀釋，每孔加樣 100y 1，最后在酶標(biāo)儀測(cè)定0D450讀數(shù)。采用棋盤滴定法確定抗體和抗原的最適工作濃度（圖1-2)，抗原711包被液的濃度梯度為8.05、16.09、32.19、64.38、128.75、257.5、515和10301^/ ml，每個(gè)濃度橫向加樣9個(gè)孔，同時(shí)設(shè)置一列作為陰性對(duì)照，添加不含Vn的包被緩沖液;Vn抗 體稀釋倍數(shù)分為 1:1000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、抗體稀釋 1 ? 6-6 ? 4萬 倍數(shù)時(shí)，OD450讀數(shù)僅相差0.19。當(dāng)抗體稀釋64000倍時(shí)，0D450讀數(shù)仍然高達(dá)1.54，這說明該 抗體具體較高的效價(jià)，在稀釋2萬倍以上仍然可用于中華絨螯蟹Vn含量的ELISA測(cè)定。
[0045] 6抗體配對(duì)篩選
[0046] 將27株純化后的鼠單抗用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(包被液，下同）按照1:100倍稀 釋，100yL/孔，4°C過夜。洗液清洗包被板3次，每次洗液用量300uL，時(shí)間為lmin，10 %小牛血 清封閉（用PH9.6的碳酸鹽緩沖液按照1:9倍稀釋），每孔150此，恒溫37°C封閉3小時(shí)。加入濃 度梯度為1000、100、10、(^祕(mì)勺％蛋白溶液，100此/孔，25°(：，溫育451^11。用稀釋液按1 :1000 比例稀釋酶標(biāo)抗體，充分混勻，每孔l〇〇yl，25°C，溫育45min。洗液清洗包被板3次，每次洗液 用量300yL，時(shí)間為 lmin，每孔加TMB 100yL，25 °C 反應(yīng) 15min。加入2M H2SO4，100此/孔，450nm 讀取0D(吸光度)值。27株單抗中，大部分單抗與兔多抗配對(duì)效果很好，靈敏度可以達(dá)到lppb 以上。
[0047] 7金標(biāo)抗體復(fù)合物的制備
[0048] (1)膠體金溶液的配置:取0.01 %氯金酸水溶液100ml加熱至沸騰，邊攪拌邊加入 1 %檸檬酸三鈉水溶液1.8ml，繼續(xù)煮沸10min至溶液呈鮮紅色后冷卻。冷卻后裝入透析袋中 對(duì)超純水（1:5000)透析三次，最后將透析好的膠體金轉(zhuǎn)移到干凈的帶旋蓋的玻璃瓶中，在4 °C避光的環(huán)境下保存。
[0049] (2)金標(biāo)抗體的配置
[0050]標(biāo)記pH的確定:取6個(gè)1.5mL的離心管，對(duì)其進(jìn)行1-6編號(hào)，并在每個(gè)離心管中準(zhǔn)確 加入1.〇11114交體金溶液。然后每個(gè)管中分別加入0此、1此、3此、5此、7此、9此的0.2111〇1/1 K2CO3，搖勾后，分別在每個(gè)管中加入15iig單抗，搖勾后靜置40min，最后每管分別加入lOOyL 10 %NaCl，靜置觀察每管內(nèi)膠體金外觀變化，若顏色發(fā)生明顯變藍(lán)，產(chǎn)生沉淀的管中為不合 適的pH，而顏色變化不明顯的為合適的pH。膠體金溶液離心10min，取上清測(cè)定520nm的0D 值，5號(hào)管的吸光度最高，說明0.2mol/L K2C03加入量為7yL/mL時(shí)為最適加入量。
[00511最佳標(biāo)記濃度的確定:取7個(gè)1.5mL的離心管，對(duì)其進(jìn)行1~9編號(hào)，并在每個(gè)離心管 中準(zhǔn)確加入1. OmL膠體金溶液。然后每個(gè)管中分別加入7. OyL的0.2mo 1 /L K2C03，搖勻后分別 在每個(gè)管中加入0辟、2邱、4辟、6邱、8邱、10辟、12辟、14辟、16邱單抗，搖勾后靜置40111；[11，最 后加入100此的10%的NaCl溶液在每個(gè)管中，靜置察看各組管內(nèi)膠體金外觀的改變。若顏色 發(fā)生明顯變化變藍(lán)，產(chǎn)生沉淀的管中為不合適的抗體加入量，而顏色依然能保持紅色變化 不明顯的為合適的抗體加入量，而最先不變色的為最小標(biāo)記量。膠體金溶液離心l0min，取 上清測(cè)定520nm的0D值，1 -5號(hào)管出現(xiàn)顏色變化，而6號(hào)管的吸光度最高，說明膠體金溶液中 抗體加入量為1 0yg/mL時(shí)為最適抗體加入量。
[0052] 金標(biāo)抗體的配置:取1L膠體金溶液，加入0.2mol/L K2C03溶液，K2C03溶液的加入量 為7yL/mL。然后加入透析好的抗卵黃磷蛋白單抗，單抗的加入量為10yg/mL，過夜穩(wěn)定后加 入終濃度為1 %的BSA混勻。
[0053] (3)膠體金蛋白的純化：將制備好的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物在900印111/1]1；[11離心 15min，仔細(xì)吸出上清，沉淀用含5%的蔗糖和0.05%TWeen-20的0.002M硼酸鹽緩沖溶液復(fù) 溶。離心洗滌兩次，最后將復(fù)合物濃縮至原體積的1/10,于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 8膠體金試紙條的制備
[0055] 請(qǐng)參照?qǐng)D4,圖4是測(cè)定卵黃磷蛋白含量金標(biāo)試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4中涉及的標(biāo)記 如下：1.底板，2.樣品墊，3.金膠墊，4.硝酸纖維膜層，5.吸水紙層。該試紙?jiān)O(shè)有地底板1，底 板上依次覆蓋樣品墊2、金膠墊3、硝酸纖維膜層4和吸水紙層5。所述底板1是PVC底板，樣品 墊2的材料是玻璃纖維。金膠墊的制作:將上述步驟7制備得到的金標(biāo)單抗體用點(diǎn)金標(biāo)膜機(jī) 均勻的噴在處理過的金標(biāo)墊上，點(diǎn)樣量為2yL/cm，于37°C烘干24小時(shí)，備用。劃膜:選取PALL 的NC膜170用點(diǎn)金標(biāo)(膜)機(jī)將濃度為1. Omg/mL的兔多抗劃以0.7yL/cm劃測(cè)試線(T線）；將濃 度為1 .Omg/mL的羊抗鼠二抗以0.7yL/cm劃質(zhì)控線(C線），于37°C烘干24小時(shí)，備用。
[0056] 9實(shí)際使用
[0057]純化卵黃磷蛋白測(cè)試，將純化好的中華絨螯蟹卵黃磷蛋白配置為0.5、l、10、20iig/ mL的溶液，放入1.5ml離心管中，并設(shè)無卵黃磷蛋白的溶液作為空白對(duì)照，將試紙條條按照 箭頭插離心管中，在10分鐘后讀取結(jié)果，檢測(cè)限為lug/ml(圖3)。
[0058]中華絨螯蟹蚤狀幼體卵黃磷蛋白快速檢測(cè)方法，收集中華絨螯蟹蚤狀幼體80-100 只左右，放入1.5ml離心管中，加入lml勻漿緩沖液（1M Tris HC1 10ml，NaCl 2.925g， EDTA0.0 5g，100mM PMSF 0.5ml，加蒸餾水定容至500ml)，用研磨棒在離心管中研磨5分鐘， 靜止15分鐘，隨后12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液。將試紙條插入上清液，10分鐘后讀取結(jié)果， 如出現(xiàn)兩條線，則表明蚤狀幼體中尚含有未消化完的卵黃磷蛋白。
[0059]實(shí)施例2T線和C線最佳包被的篩選
[0060]制作NC膜檢測(cè)層時(shí)，檢測(cè)線和質(zhì)控線的抗體包被濃度直接影響試紙條的顯色效 果。如質(zhì)控線抗體包被濃度過高，C線顏色過深，濃度過低顯色不清晰，起不到質(zhì)控線作用； 檢測(cè)線的抗體包被濃度過高不僅影響質(zhì)控線的顯色效果，而且容易出現(xiàn)假陽性，浪費(fèi)抗體； 濃度過低T線顯色過淺，影響結(jié)果的判讀。本發(fā)明對(duì)質(zhì)控線和檢測(cè)線的抗體包被濃度進(jìn)行篩 選，實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同，在NC膜上的T線及C線上分別包被0.1、0.5、1、2mg/mL抗體，形 成16個(gè)不同的組合，組裝成試紙條，選用中華絨螯蟹卵黃磷蛋白濃度為20iig/mL進(jìn)行測(cè)試， 觀察質(zhì)控線和檢測(cè)線的顯色，確定包被抗體的最適濃度。不同濃度的抗體包被NC膜檢測(cè)層 的結(jié)果如表1所示，當(dāng)檢測(cè)線包被抗體濃度為0. lmg/mL時(shí)，檢測(cè)線顏色較淺，肉眼剛能分辨； 當(dāng)檢測(cè)線包被抗體濃度為0.5mg/mL時(shí)，檢測(cè)線有顯色但相比質(zhì)控線顯色效果較弱；當(dāng)檢測(cè) 線包被抗體濃度為lmg/mL時(shí)，檢測(cè)線和質(zhì)控線顏色均清晰明顯；當(dāng)檢測(cè)線包被空提濃度為 3mg/mL時(shí)，由于檢測(cè)線濃度偏高截留較多的金標(biāo)抗體而使質(zhì)控線顯色減弱。從試紙成本和 檢測(cè)顯色結(jié)果兩方面考慮，最終選擇控線和檢測(cè)線的抗體包被濃度分別為lmg/mL和lmg/mL 為最適濃度。
[0061]表1 T線和C線最佳包被的濃度組合
[0063] 注:檢測(cè)線、質(zhì)控線:+++強(qiáng)陽性信號(hào);+++陽性信號(hào);+弱陽性型號(hào);-無陽性信號(hào)。
[0064] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖 維膜層和吸水紙層，所述底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層和吸水紙層，其特 征在于，所述金膠墊上含有膠體金與抗卵黃磷蛋白單抗結(jié)合形成的金標(biāo)抗卵黃磷蛋白抗體 復(fù)合物，所述硝酸纖維膜層上設(shè)有抗卵黃磷蛋白多克隆抗體溶液印制的測(cè)試線(T線)及羊 抗鼠 I gG抗體溶液印制的質(zhì)控線(C線）。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，其特征在于，所述金 標(biāo)抗卵黃磷蛋白抗體復(fù)合物制備方法如下:取膠體金溶液，加入0.2mol/L K2CO3溶液，K2CO3 加入量為7yL/mL，然后加入透析好的抗卵黃磷蛋白單抗，單抗的加入量為10yg/mL，過夜穩(wěn) 定后加入終濃度為1 %的BSA混勻。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，其特征在于，所述質(zhì) 控線中抗體包被濃度為lmg/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，其特征在于，所述測(cè) 試線中抗體包被濃度為lmg/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，其特征在于，所述金 標(biāo)試紙對(duì)于中華絨螯蟹卵黃磷蛋白的檢測(cè)限為lug/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述快速測(cè)定蟹類卵黃磷蛋白含量的金標(biāo)試紙，其特征在于，所述的 金膠墊由玻璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成，所述的樣品墊為吸水性玻璃纖維。7. 權(quán)利要求1-6任一所述的金標(biāo)試紙?jiān)诳焖贆z測(cè)蟹類水產(chǎn)品卵黃磷蛋白含量中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK106053799SQ201610629061
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日
【發(fā)明人】劉智俊, 李燕, 陸錦天, 李住, 張根玉, 史建華
【申請(qǐng)人】上海市水產(chǎn)研究所