一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。該試紙條由樣品墊、金標墊、包被膜和吸水膜依次粘貼組合到PVC底板上，所述金標墊上涂覆有樹枝狀聚合物?金?適配體復(fù)合物增敏探針，包被膜上具有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上包被有抗沙門氏菌單克隆抗體，質(zhì)控線上包被有鏈霉親和素。該試紙條的制備方法包括樹枝狀聚合物?金?適配體復(fù)合物增敏探針的制備、金標墊的制備、包被膜的制備以及試紙條的組裝等。該試紙條利用樹枝狀聚合物?金?適配體復(fù)合物增敏探針進行信號放大，極大提高檢測靈敏度，且操作簡單、檢測速度快，無需專用儀器設(shè)備，成本低廉，適合于大批量樣品中沙門氏菌的高靈敏快速檢測。
【專利說明】
一種用于檢測沙門氏菌的増敏型核酸適配體試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種腸道桿菌致病菌，在自然界中廣泛存在，極易污染水源、肉類(尤其是禽類)、蛋類及蛋制品等，人或動物食用被污染的食品即會引發(fā)食物中毒。目前，在全世界范圍內(nèi)，特別是發(fā)展中國家沙門氏菌感染事件逐年增多，我國70?80%的細菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的，可見沙門氏菌污染已經(jīng)嚴重威脅到人類健康和公共食品衛(wèi)生安全。因此，建立準確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測技術(shù)對于保障食品安全和國民健康具有重要意義。
[0003]目前沙門氏菌檢測方法主要有傳統(tǒng)的微生物檢驗技術(shù)、儀器分析法、分子生物學(xué)技術(shù)和免疫檢測方法等。其中，傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)存在操作復(fù)雜，檢測時間長，靈敏度和特異性不高等缺點；儀器分析法簡單快速，但儀器設(shè)備價格昂貴，不適合現(xiàn)場快速檢測；分子生物學(xué)方法能縮短檢驗時間，靈敏度和特異性好，但費用昂貴，易污染，假陽性偏高；ELISA方法靈敏、快速、特異性好，已廣泛的應(yīng)用于食品中微生物的檢測，但其結(jié)果解讀或者配套儀器較復(fù)雜，需要一定的專業(yè)知識。
[0004]而金標層析試紙條正好可以避免這些弊端，不需要專用儀器，只需要插入、比對即可，具有快速、低成本，操作簡單易行，能滿足絕大部分食品樣品的檢測，非常適用于大量樣品的初篩。但是，常規(guī)的金標試紙條靈敏度較低，難以實現(xiàn)痕量目標物的快速分析。同時，隨著政府監(jiān)管體系的完善和檢測力度的加強，食品中目標檢測物的濃度會越來越少，這對金標試紙條的靈敏度提出了更高的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有金標試紙條的靈敏度難以滿足沙門氏菌高靈敏檢測的研究現(xiàn)狀，利用樹枝狀聚合物做為信號放大載體，將樹枝狀聚合物、金納米粒子、核酸適配體(Aptamer)進行組裝，制備樹枝狀聚合物-金-核酸適配體納米復(fù)合物，將其作為信號增敏探針應(yīng)用于金標試紙條中，進行金標試紙條檢測信號增強研究，提供一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法，實現(xiàn)對食品中沙門氏菌的高靈敏快速檢測。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條包括PVC底板，在所述PVC底板上依次粘貼有樣品膜，信號增敏探針-金標結(jié)合墊，硝酸纖維素膜和吸水膜四種粘貼物;所述相鄰粘貼物之間相互連接疊放;所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線。
[0008]所述信號增敏探針-金標結(jié)合墊上包被有樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體納米復(fù)合物;所述樹枝狀聚合物為端巰基的樹枝狀聚合物;所述核酸適配體的5 ’端被巰基標記，3’端被生物素標記。
[0009]所述檢測線上包被有抗沙門氏菌單克隆抗體。
[0010]所述質(zhì)控線上包被有鏈霉親和素。
[0011]所述用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法，其具體制備步驟如下:
[0012](I)樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物的制備
[0013]稱取0.l-0.4mg的樹枝狀聚合物溶解到5mL丙酮中，取新合成的粒徑為10-20nm的膠體金溶液ImL膠體金溶液分散到5mL純水中，在氮氣保護和快速攪拌下，將膠體金溶液逐滴滴加到樹枝狀聚合物溶液中，磁力攪拌下室溫反應(yīng)12h后，1000rpm 4°C離心30min，棄上清，用純水洗滌沉淀物，離心洗滌并重復(fù)3次后將沉淀用重懸液(2OmM Na3P04，5 % BSA，
0.25% Tween-20，10 %蔗糖)重懸，得到10倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物溶液。
[0014](2)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物的制備
[0015]取1uL IuM的核酸適配體加入到2uL醋酸緩沖液(0.5M，pH5.0)和3uL ImM三羧甲基磷酸溶液中，室溫避光放置lh，得到活化的核酸適配體溶液。
[0016]取10倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物溶液200uL，逐滴加入到活化的核酸適配體溶液中，室溫下攪拌60min;取170uL 10uM的dATP加入到上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)攪拌30min;逐步將0.1M的NaCl溶液加入到反應(yīng)液中，使NaCl的終濃度達到30mM，室溫下反應(yīng)Ih后放置與4°C冰箱過夜孵育;9400g離心1min后沉淀用重懸液重懸至200uL，得到樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物。
[0017]沙門氏菌核酸適配體序列為:5’-SH-TATGGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTTGAC ATT ATG ACA G-b1tin-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0018](3)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結(jié)合墊的制備
[0019]用三維平面點膜噴金儀將上述制備的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物均勻的噴涂到玻璃纖維膜上，噴液量為0.7uL/cm，置于37°C烘干后封裝備用。
[0020](4)包被膜的制備
[0021 ]用三維平面點膜噴金儀將濃度為0.5-lmg/mL的抗沙門氏菌單克隆抗體溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到檢測線(T線)；將濃度為0.5-2mg/mL的鏈霉親和素溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線(C線)。
[0022](5)增敏型沙門氏菌核酸適配體層析試紙條的制備
[0023]將樣品膜、樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結(jié)合墊、具有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼組合到PVC底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2_，用切割機切成3_寬的試紙條，得到基于增敏探針的增敏型沙門氏菌適配體試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?br>[0024]本發(fā)明試紙條采用膠體金層析試紙技術(shù)，以樹枝狀聚合物做為載體，利用其外圍大量的巰基，通過金硫鍵自組裝可偶聯(lián)大量金納米粒子。當待測樣品中存在沙門氏菌時，沙門氏菌先和金標結(jié)合墊上的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物特異結(jié)合，隨著毛細管作用繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，再與檢測線上包被的抗沙門氏菌的抗體發(fā)生免疫識別反應(yīng)，在檢測線上顯現(xiàn)出一定顏色的沉淀線；多余的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物繼續(xù)向前，核酸適配體上標記的生物素和質(zhì)控線上包被的鏈霉親和素發(fā)生結(jié)合，金納米粒子富集使得質(zhì)控線顯色；如果待測樣品中不存在沙門氏菌時，樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物在檢測線上不產(chǎn)生富集，繼續(xù)層析迀移和質(zhì)控線上的鏈霉親和素發(fā)生結(jié)合，試紙條檢測線不顯色，而質(zhì)控線顯色。
[0025]試紙條的檢測線和質(zhì)控線均是由金納米粒子聚集而顯色，與常規(guī)試紙條相比，當沙門氏菌濃度極低時，檢測線上也可富集更多的金納米粒子，其沉淀線顯色也會更深，因此，可實現(xiàn)比常規(guī)試紙條更低濃度目標物的超靈敏檢測，顯著提高試紙條檢測方法的靈敏度。
[0026]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明針對現(xiàn)有金標試紙條的靈敏度難以滿足沙門氏菌高靈敏檢測的要求，提供一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法，借助于樹枝狀聚合物的端巰基來偶聯(lián)大量的金納米粒子，進一步與特異性識別沙門氏菌的核酸適配體組裝制備樹枝狀聚合物-金-核酸探針，并做為信號增敏探針代替常規(guī)的金-核酸適配體探針，能夠顯著提高傳統(tǒng)試紙條檢測方法的靈敏度，實現(xiàn)對沙門氏菌的高靈敏檢測，同時具有簡單、快速、結(jié)果容易判讀等特點。
【附圖說明】
[0027]圖1本發(fā)明試紙條的組成結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖2本發(fā)明試紙條的檢測原理示意圖。
[0029]圖3本發(fā)明試紙條的檢測結(jié)果判定圖。
[0030]附圖中序號說明:1:PVC底板；2:樣品墊；3:增敏探針金標結(jié)合墊;4:硝酸纖維素膜;5:吸水墊;6:檢測線;7:質(zhì)控線。
【具體實施方式】
[0031]為更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0032]實施例1
[0033]如圖1所示，一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，其中序號I為PVC底板，其兩端分別設(shè)有樣品墊2和吸水墊5;在PVC底板的中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測層4，其上有檢測線6和質(zhì)控線7;在硝酸纖維素膜檢測層4和樣品墊2之間設(shè)置有金標結(jié)合墊3。
[0034]所述金標結(jié)合墊3上包被有樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物增敏探針；所述樹枝狀聚合物為端巰基的樹枝狀聚合物;所述核酸適配體的5 ’端被巰基標記，3，端被生物素標記。
[0035]所述檢測線6上包被有抗沙門氏菌單克隆抗體。
[0036]所述質(zhì)控線7上包被有鏈霉親和素。
[0037]實施例2
[0038]—種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條及其制備方法，具體操作步驟如下:
[0039](I)樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物的制備
[0040]稱取0.2mg的樹枝狀聚合物溶解到5mL丙酮中，取新合成的粒徑為1nm的膠體金溶液ImL膠體金溶液分散到5mL純水中，在氮氣保護和快速攪拌下，將膠體金溶液逐滴滴加到樹枝狀聚合物溶液中，磁力攪拌下室溫反應(yīng)12h后，10000rpm4°C離心30min，棄上清，用純水洗滌沉淀物，離心洗滌并重復(fù)3次后將沉淀用重懸液(20mM Na3PO4，5 %BSA，0.25 % Tween-20,10%蔗糖)重懸，得到1倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物溶液。
[0041 ] (2)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物的制備
[0042]取1uL IuM的沙門氏菌核酸適配體加入到2uL醋酸緩沖液(0.5M，pH5.0)和3uLImM三羧甲基磷酸溶液中，室溫避光放置lh，得到活化的沙門氏菌核酸適配體溶液，沙門氏菌核酸適配體DNA序列為:5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATGACA G-b1tin-3，0
[0043]取10倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物溶液200uL，逐滴加入到活化的沙門氏菌核酸適配體溶液中，室溫下攪拌60min;取170uL 10uM的dATP加入到上述反應(yīng)液中，室溫下繼續(xù)攪拌30min;逐步將0.1M的NaCl溶液加入到反應(yīng)液中，使NaCl的終濃度達到30mM，室溫下反應(yīng)Ih后放置與4 °C冰箱過夜孵育;6500rpm離心15min后沉淀用重懸液重懸至200uL，得到樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物。
[0044](3)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結(jié)合墊的制備
[0045]用三維平面點膜噴金儀將上述制備的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復(fù)合物均勻的噴涂到玻璃纖維膜上，噴液量為0.7uL/cm，置于37°C烘干后封裝備用。
[0046](4)包被膜的制備
[0047]用三維平面點膜噴金儀將濃度為lmg/mL的抗沙門氏菌單克隆抗體溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到檢測線(T線)；將濃度為1.5mg/mL的鏈霉親和素溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線(C線)。
[0048](5)增敏型沙門氏菌核酸適配體試紙條的制備
[0049]將樣品膜、樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結(jié)合墊、具有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼組合到PVC底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2mm，用切割機切成3mm寬的試紙條，得到基于樹枝狀核酸增敏探針的增敏型沙門氏菌核酸適配體試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩?br>[0050]具體使用時，將制備好的金標試紙條取出，其樣品玻璃纖維膜端插入到待測樣品溶液中，等待1min后取出用肉眼進行觀察。如果質(zhì)控線7不顯色，則試紙條出現(xiàn)質(zhì)量問題，檢測結(jié)果無效;如果質(zhì)控線7和檢測線6均顯色時，說明待測樣品中含有目標物沙門氏菌，檢測線6顯色越深則檢測溶液中沙門氏菌濃度越高，待測樣品為陽性;如果檢測線6不顯色，只有質(zhì)控線7顯色時，說明待測樣品中不含有沙門氏菌，待測樣品為陰性。
【主權(quán)項】
1.一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，包括PVC底板(I)，在所述PVC底板(I)上依次粘貼有樣品膜(2)，增敏探針金標結(jié)合墊(3)，硝酸纖維素膜(4)和吸水膜(5)四種粘貼物;所述相鄰粘貼物之間相互連接疊放;所述硝酸纖維素膜(4)上依次設(shè)置有檢測線(6)和質(zhì)控線(7);其特征在于，所述金標結(jié)合墊(3)上包被有樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體納米復(fù)合物;所述樹枝狀聚合物為端巰基樹枝狀聚合物;所述核酸適配體為能特異性識別沙門氏菌的核酸適配體，其DNA序列的5 ’端被巰基標記，3 ’端被生物素標記;所述檢測線(6)上包被有抗沙門氏菌單克隆抗體;所述質(zhì)控線(7)上包被有鏈霉親和素。2.制備權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于包括如下操作步驟: (1)制備樹枝狀聚合物-金納米粒子復(fù)合物 (2)制備樹枝狀聚合物-金粒子-適配體復(fù)合物 (3)將步驟(2)制備的樹枝狀聚合物-金粒子-適配體復(fù)合物噴涂到玻璃纖維膜上，噴液量為0.7uL/cm，制備金標結(jié)合墊，烘干備用。 (4)在硝酸纖維素膜上的檢測線位置噴涂抗沙門氏菌單克隆抗體溶液，在質(zhì)控線位置噴涂鏈霉親和素，烘干備用。 (5)將樣品膜、金標結(jié)合墊、具有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼組合到PVC底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2mm，切成3mm寬的試紙條，與干燥劑一起封裝于鋁箔袋中保存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中所用膠體金的粒徑為1nm;步驟(4)中所述噴涂于檢測線位置的抗沙門氏菌單克隆抗體是濃度為lmg/mL的抗沙門氏菌單克隆抗體溶液;步驟(4)中所述噴涂于質(zhì)控線位置的鏈霉親和素是濃度為1.5mg/mL的鏈霉親和素溶液。
【文檔編號】G01N33/543GK106053805SQ201610582015
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月21日 公開號201610582015.2, CN 106053805 A, CN 106053805A, CN 201610582015, CN-A-106053805, CN106053805 A, CN106053805A, CN201610582015, CN201610582015.2
【發(fā)明人】孫鳳霞, 康立超, 彭夏雨, 楊井泉, 羅小玲, 李紅敏, 黨富民, 向曉黎, 王東健, 羅瑞峰
【申請人】新疆農(nóng)墾科學(xué)院, 孫鳳霞