一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法。本試劑盒包括PVC底板、樣品墊、熒光結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述樣品墊、熒光結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按水平方向依次固定于PVC底板上。所述熒光結合墊上有包被的Vinculin抗原?納米熒光微球復合物、雞IgY?納米熒光微球復合物；所述的硝酸纖維素膜上有Vinculin抗原構成的檢測線和兔抗雞IgY抗體構成的質控線。本發(fā)明利用雙抗原夾心反應原理結合納米熒光微球來檢測Vinculin抗體，診斷腸易激綜合癥，相比一般的臨床癥狀積分診斷方法，結果更可靠科學，為腸易激綜合癥的診斷提供普查甚至初期預防提供了更明確的指標與方法，具有廣闊的推廣前景；且運用納米熒光微球技術檢測背景值低、檢測時間短、特異性和靈敏度較高、檢測結果可量化計算，可提供更科學的病情評價?！緦＠f明】一種腸易激綜合癥標志物Vinculiη抗體檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
[0001]本發(fā)明涉及一種腸易激綜合癥以Vinculin抗體為識別物的干式免疫熒光試劑盒及診斷方法，本發(fā)明屬于醫(yī)療產品領域?！?br>背景技術：
】[0002]腸易激綜合癥(Irritablebowelsyndrome，IBS)是一種常見的慢性胃腸道疾病，以腹痛、腹部不適和排便習慣改變?yōu)橹饕卣鳎３掷m(xù)存在或反復發(fā)作，經檢查可以排除引起這些癥狀的器質性疾病，目前認為本病是一種功能性腸道疾病。在西方國家IBS發(fā)病率為10%-15%，而在中國由于地域，人種不同，各地發(fā)病率有所不同，北京地區(qū)的發(fā)病率為0.82%，廣州地區(qū)則為5.6%ο根據大便的性狀將IBS分為便秘型IBS(IBS-C)，腹瀉型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之間可以相互轉換，以IBS-C和IBS-M型之間轉換為多見。[0003]IBS的發(fā)病機制至今尚不明確，情緒因素、飲食、藥物或激素均可引起胃腸道張力改變，促發(fā)或加重IBS。情緒焦慮、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS癥狀的發(fā)作和反復。近年來對IBS的發(fā)病機制作了進一步地探討，改變了多年來把IBS—直當成單純腸動力紊亂的看法，認識到本病具有內臟感覺異常，結腸對刺激的敏感性增高，從而產生腹痛以及腹瀉等排便異常的特點，而感覺異常所引起的動力紊亂是受中樞神經調控的。因此，證明中樞神經的狀態(tài)也能夠影響IBS病人的癥狀。進而有研究表明，給予小劑量選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑作用于神經中樞，可以減輕IBS病人的癥狀，及Ringel,Drossman等用150作PET腦掃描，發(fā)現直腸擴張后IBS病人腦血流的圖譜與健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像學檢查也觀察到IBS病人與健康人之間存在著腦圖的差異。這些都表明神經系統(tǒng)對腸功能具有影響。應激和腸道感染都是重要的發(fā)病誘因。Neal等報告對544例細菌性胃腸炎患者追隨半年的觀察，有25%的患者發(fā)生腸功能紊亂。在北京地區(qū)對IBS的流行病學調查中發(fā)現，痢疾史陽性導致發(fā)生本病的危險性上升2倍，其調查表明到有痢疾或腸炎史的IBS患者，其末端回腸、乙狀結腸與直腸交界處腸黏膜中炎性介質IL-1ftnRNA的表達增高。IL-1ftnRNA可抑制腸道水、鈉的吸收而產生腹瀉，還與遲發(fā)性疼痛和過敏有關，它在感染后IBS腸黏膜組織中含量的增高，表明炎癥及其隨后引起的免疫反應可能參與了IBS的發(fā)病機制。[0004]因此可證明神經因素和免疫因素在腸道中之間存在神經免疫機制。在腸黏膜內有著多種能夠釋放調節(jié)介質的免疫細胞，如分泌白細胞介素的單核細胞，分泌組胺、5-HT的肥大細胞和嗜鉻細胞等。其中，肥大細胞被認為很可能是在神經和免疫機制之間擔當溝通作用的重要免疫細胞。因為它們在腸道的炎癥反應中能夠分泌多種抗炎介質，又能釋放神經介質，而且許多肥大細胞是和神經纖維緊鄰的，刺激神經即可使肥大細胞活化。有實驗對對56例符合羅馬Π標準的IBS病人的腸黏膜活檢組織進行了檢測，發(fā)現IBS患者末端回腸黏膜內肥大細胞的數目(均值:10.98±2.96)比非IBS對照組的病人(6.05±0.51)明顯增多(P〈0.01)。在癥狀發(fā)作期間，其直腸黏膜內肥大細胞的活化比例(85%)較非IBS對照組(15%)明顯為尚。[0005]空腸彎曲桿菌C.jejuni是一種革蘭氏陰性菌，與小腸結腸炎有關，局部急性炎癥反應，參與腸組織的損傷和腹瀉。其毒素CjCDT可以調節(jié)宿主腸道上皮細胞炎癥反應，誘導腸上皮細胞釋放IL-8，而CDT的抗體具有中和并刺激IL-8的釋放能力。CDT感染人結腸上皮細胞致使NF-κB的激活和Toll樣受體(TLR)信號并且轉錄因子NF-κB激活大量的促炎細胞因子的基因，包括IL-li3、IL-6、IL_8和TNF-α。其中多數炎癥因子誘導急性炎癥過程中會促使細胞外基質成分的過度沉積，并使vinculin蛋白質的表達和mRNA相適應，S卩vinculin基因的轉錄和翻譯活性均有增強。加之CDT毒素性的作用使細胞脹破甚至凋亡，過度炎癥的狀況下機體易引發(fā)該蛋白的自身免疫產生vinculin抗體，因此vinculin抗體可作為腸易激綜合癥的一種檢測指標由于目前IBS缺乏特異性的體格檢查和生化異常的標志，患者臨床表現多樣性(癥狀的部位、發(fā)作類型以及嚴重性)，甚至同一患者不同時間也有差異。在過去30年中，為規(guī)范IBS的診斷，增強診斷的特異性，已提出幾種癥狀學診斷標準，常用的診斷標準是Manning標準和國際功能性胃腸病工作組制訂的羅馬標準。但都是根據臨床癥狀積分，并通過必要的檢查排除器質性病變后診斷的。在該領域急需一種生化標志物來區(qū)分腸易激綜合癥與其他一些炎癥性腸病等。[0006]熒光微球納米顆粒在標志物檢測領域具有巨大潛能。它具有以下特點:1、靈敏度高:不受外界的背景干擾;2、穩(wěn)定性高:避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現象;3、靈活性高:可以組合多樣化光譜;4、安全性高:對于檢測者、檢測樣品和環(huán)境都沒有危害;5、方便簡易:可對樣品直接進行檢測，無需特殊處理;6、以上特點決定其在生物標記物方面應用前景較廣闊，尤其是在床旁檢測領域。通過熒光微球納米顆粒標記人Vinculin抗原，建立一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法在臨床檢測領域具有重要的應用價值?！?br/>發(fā)明內容】[0007]腸易激綜合癥(Irritablebowelsyndrome，IBS)是一種常見的慢性胃腸道疾病，以腹痛、腹部不適和排便習慣改變?yōu)橹饕卣?，常持續(xù)存在或反復發(fā)作，經檢查可以排除引起這些癥狀的器質性疾病，目前認為本病是一種功能性腸道疾病。在西方國家IBS發(fā)病率為10%-15%，而在中國由于地域，人種不同，各地發(fā)病率有所不同，北京地區(qū)的發(fā)病率為0.82%，廣州地區(qū)則為5.6%ο根據大便的性狀將IBS分為便秘型IBS(IBS-C)，腹瀉型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之間可以相互轉換，以IBS-C和IBS-M型之間轉換為多見。[0008]IBS的發(fā)病機制至今尚不明確，情緒因素、飲食、藥物或激素均可引起胃腸道張力改變，促發(fā)或加重IBS。情緒焦慮、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS癥狀的發(fā)作和反復。近年來對IBS的發(fā)病機制作了進一步地探討，改變了多年來把IBS—直當成單純腸動力紊亂的看法，認識到本病具有內臟感覺異常，結腸對刺激的敏感性增高，從而產生腹痛以及腹瀉等排便異常的特點，而感覺異常所引起的動力紊亂是受中樞神經調控的。因此，證明中樞神經的狀態(tài)也能夠影響IBS病人的癥狀。進而有研究表明，給予小劑量選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑作用于神經中樞，可以減輕IBS病人的癥狀，及Ringel,Drossman等用150作PET腦掃描，發(fā)現直腸擴張后IBS病人腦血流的圖譜與健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像學檢查也觀察到IBS病人與健康人之間存在著腦圖的差異。這些都表明神經系統(tǒng)對腸功能具有影響。應激和腸道感染都是重要的發(fā)病誘因。Neal等報告對544例細菌性胃腸炎患者追隨半年的觀察，有25%的患者發(fā)生腸功能紊亂。在北京地區(qū)對IBS的流行病學調查中發(fā)現，痢疾史陽性導致發(fā)生本病的危險性上升2倍，其調查表明到有痢疾或腸炎史的IBS患者，其末端回腸、乙狀結腸與直腸交界處腸黏膜中炎性介質IL-1ftnRNA的表達增高。IL-1ftnRNA可抑制腸道水、鈉的吸收而產生腹瀉，還與遲發(fā)性疼痛和過敏有關，它在感染后IBS腸黏膜組織中含量的增高，表明炎癥及其隨后引起的免疫反應可能參與了IBS的發(fā)病機制。[0009]因此可證明神經因素和免疫因素在腸道中之間存在神經免疫機制。在腸黏膜內有著多種能夠釋放調節(jié)介質的免疫細胞，如分泌白細胞介素的單核細胞，分泌組胺、5-HT的肥大細胞和嗜鉻細胞等。其中，肥大細胞被認為很可能是在神經和免疫機制之間擔當溝通作用的重要免疫細胞。因為它們在腸道的炎癥反應中能夠分泌多種抗炎介質，又能釋放神經介質，而且許多肥大細胞是和神經纖維緊鄰的，刺激神經即可使肥大細胞活化。有實驗對對56例符合羅馬Π標準的IBS病人的腸黏膜活檢組織進行了檢測，發(fā)現IBS患者末端回腸黏膜內肥大細胞的數目(均值:10.98±2.96)比非IBS對照組的病人(6.05±0.51)明顯增多(P〈0.01)。在癥狀發(fā)作期間，其直腸黏膜內肥大細胞的活化比例(85%)較非IBS對照組(15%)明顯為尚。[00?0]空腸彎曲桿菌C.jejuni是一種革蘭氏陰性菌，與小腸結腸炎有關，局部急性炎癥反應，參與腸組織的損傷和腹瀉。其毒素CjCDT可以調節(jié)宿主腸道上皮細胞炎癥反應，誘導腸上皮細胞釋放IL-8，而CDT的抗體具有中和并刺激IL-8的釋放能力。CDT感染人結腸上皮細胞致使NF-κB的激活和Toll樣受體(TLR)信號并且轉錄因子NF-κB激活大量的促炎細胞因子的基因，包括IL-li3、IL-6、IL_8和TNF-α。其中多數炎癥因子誘導急性炎癥過程中會促使細胞外基質成分的過度沉積，并使vinculin蛋白質的表達和mRNA相適應，S卩vinculin基因的轉錄和翻譯活性均有增強。加之CDT毒素性的作用使細胞脹破甚至凋亡，過度炎癥的狀況下機體易引發(fā)該蛋白的自身免疫產生vinculin抗體，因此vinculin抗體可作為腸易激綜合癥的一種檢測指標由于目前IBS缺乏特異性的體格檢查和生化異常的標志，患者臨床表現多樣性(癥狀的部位、發(fā)作類型以及嚴重性)，甚至同一患者不同時間也有差異。在過去30年中，為規(guī)范IBS的診斷，增強診斷的特異性，已提出幾種癥狀學診斷標準，常用的診斷標準是Manning標準和國際功能性胃腸病工作組制訂的羅馬標準。但都是根據臨床癥狀積分，并通過必要的檢查排除器質性病變后診斷的。在該領域急需一種生化標志物來區(qū)分腸易激綜合癥與其他一些炎癥性腸病等。[0011]熒光微球納米顆粒在標志物檢測領域具有巨大潛能。它具有以下特點:1、靈敏度高:不受外界的背景干擾;2、穩(wěn)定性高:避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現象;3、靈活性高:可以組合多樣化光譜;4、安全性高:對于檢測者、檢測樣品和環(huán)境都沒有危害;5、方便簡易:可對樣品直接進行檢測，無需特殊處理;6、以上特點決定其在生物標記物方面應用前景較廣闊，尤其是在床旁檢測領域。通過熒光微球納米顆粒標記人Vinculin抗原，建立一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法在臨床檢測領域具有重要的應用價值?！靖綀D說明】:圖1干式免疫熒光檢測系統(tǒng)結構示意圖，其中I為樣品墊;2為熒光結合墊;3為硝酸纖維素膜；4為吸水墊；5為PVC底板；6為樣本中目標抗原；7為熒光微球標記的Vinculin抗原;8為焚光微球標記的雞IGY；9為檢測線:Vinculin抗原；10為質控線:兔抗雞IgY0【主權項】1.一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，本試劑盒包括PVC底板、熒光結合墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊。2.所述熒光結合墊上包被有Vinculin抗原-納米熒光微球復合物、雞IgY-納米熒光微球復合物;硝酸纖維素膜上有VincuIin抗原構成的檢測線和兔抗雞IgY抗體構成的質控線。3.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，所述的納米熒光微球為醛基化紅熒光微球，納米顆粒粒徑為100?200nm，激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為612土5nm，表面醛基基團含量為0.I?0.5mmol/g。4.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，通過醛基熒光微球與Vinculin抗原蛋白末端的氨基殘基在弱堿性環(huán)境下醛胺縮合制備得到Vinculin抗原-納米熒光微球復合物用于特異性結合受試者血清、血漿或全血中的Vinculin抗體。5.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物VincuIiη抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于焚光微球納米顆粒與Vinculin抗原蛋白或雞IgY按照一定比例(ul:ug)分別混合，25-37°C反應I?4小時，分別制備得到Vinculin抗原-納米熒光微球復合物及雞IgY-納米熒光微球復合物。6.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于熒光結合墊的制備:將熒光結合墊切成9mmX300mm細條，將Vinculin抗原-納米熒光微球復合物及雞IgY-納米熒光微球復合物按照一定比例混合均勻鋪在熒光結合墊上，25?37°C烤干或-20?-60°C凍干得到制備好的熒光結合墊。7.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，將硝酸纖維素膜貼于PVC底板上。8.將兔抗雞IgY用PBS稀釋到濃度為0.l-2mg/ml，作為C線包被液；將Vinculin蛋白用PBS稀釋到濃度為0.l-2mg/ml，作為T線。9.通過噴膜儀，將T線包被液和C線包被液在硝酸纖維素膜上均勻劃線得到檢測線和質控線，25-37°C烤干，依次組裝熒光結合墊、樣品墊和吸水墊并斬切切條后即可得到檢測試紙條。10.如權利要求1所述的一種腸易激綜合癥標志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于檢測樣品為血清、血漿或全血。【文檔編號】G01N33/68GK106053827SQ201610325264【公開日】2016年10月26日【申請日】2016年5月17日【發(fā)明人】羅朝領,陳瀟,董敏【申請人】上海凱璟生物科技有限公司