用于富集cns來源的外泌體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從生物體液如血液、血清、血漿、或唾液富集CNS來源的外泌體的方法。上述方法包括：使含有CNS來源的外泌體的生物體液接觸抗L1CAM抗體以形成免疫復(fù)合物，通過免疫復(fù)合物將在生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相；以及從生物體液分離固相結(jié)合的外泌體以富集CNS來源的外泌體?？梢詼y量來自CNS來源的外泌體的生物標記物，用于檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病，區(qū)分不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，監(jiān)測疾病進展或客觀地評價現(xiàn)有的和未來的醫(yī)學治療方法。
【專利說明】
用于富集CNS來源的外泌體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及用于在生物體液如血液、血清、血漿、或唾液中富集CNS (中樞神經(jīng)系 統(tǒng))來源的外泌體(exosome)的方法。本發(fā)明進一步涉及用于通過測量在富集自生物體液的 CNS來源的外泌體(CNS衍生的外泌體）中的生物標記物水平來確定CNS來源的物質(zhì)（生物標 記物)的水平的方法。
[0002] 美國政府利益的聲明
[0003] 在NS057567和NS082137(NINDS部門）以及美國國立衛(wèi)生研究院（NIH)的AG033398 (NIA部門）的支持下進行本文描述的工作。因此，根據(jù)所述支持，關(guān)于本發(fā)明，美國政府可以 孚有一定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0004] 迫切需要客觀的生物標記物來幫助診斷、鑒別診斷和/或監(jiān)測CNS疾病的疾病進 展，例如，阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、和朊病毒病。到目前為止，表現(xiàn)最好的標記物 均基于腦脊液(CSF)，其直接接觸腦和脊髓，但獲得CSF是創(chuàng)傷性操作，其嚴重限制了它的常 規(guī)應(yīng)用。因此，迫切需要CNS疾病的外周生物標記物(例如在血液中）。然而，挑戰(zhàn)在于，由于 嚴格調(diào)節(jié)的各種障礙如血腦屏障，并不能在外周體液中檢測所有CNS來源的（derived)材 料。例如，在血漿中僅可以容易檢測小部分的在人腦/CSF中看到的蛋白質(zhì)（Pan et al， J.Proteome Res.，13:4535-4545，2014)。此外，其它器官系統(tǒng)也產(chǎn)生許多CNS來源的材料。 這確實是上述事實的根本的基礎(chǔ)原因之一:盡管幾十年的研究和幾百萬美元的花費，但針 對AD、Η)或朊病毒病，還沒有確立外周生物標記物。另外，tau和淀粉樣蛋白β(Αβ)、即涉及AD 的蛋白質(zhì)、和突觸核蛋白（α-syn)、即涉及Η)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，的目前的測定均不能區(qū)分CNS 來源的部分與那些由其它系統(tǒng)產(chǎn)生的部分。例如，血液成分(Barbour et al,Neurodegener Dis. ,5(2):55-9,2008)和肌肉（Nagao et al. ,Muscle&nerve. ,22:61-70,1999)，其具有比 CNS大得多的體積質(zhì)量。換句話說，當通過現(xiàn)有的技術(shù)加以測量時，外周輸入會顯著影響CNS 疾病的信號。
[0005] 因此，迫切需要提供一種方法來富集CNS來源的生物標記物，其是本發(fā)明的焦點。
【附圖說明】
[0006] 圖1示：（a)抗LlCAM(-種神經(jīng)系統(tǒng)標記物)捕獲的血漿外泌體(插圖：LlCAM的免疫 金標記）的電子顯微照片；（b)通過抗LlCAM捕獲、或正常小鼠 IgG捕獲，Alix(-般外泌體標 記物)和LlCAM的Western印跡；（c)相比于在正常小鼠 IgG捕獲(mlgG)或〃空〃(無珠〃捕獲〃） 樣品中的水平，在抗LI CAM-捕獲血漿外泌體中的a-Syn (syn)水平；（d)利用貧外泌體血漿 (exosome-poor pIasma)與全血衆(zhòng)獲得的a-syn(syn)水平。
[0007] 圖2示:在臨床樣品中a-syn濃度的評估。利用Luminex來測量a-Syn濃度并對在從 血漿中分離的含有LI CAM的外泌體中的a-syn (a )、或在血漿中的總a-Syn (b)進行比較。
[0008] 圖3A和313不：用于]3D診斷的a-syn的ROC(受試者工作特征（Receiver Operating Characteristics))分析。圖3A示出，在整個組群(267位PD患者和215位健康對照）中，針對 PD與對照，血漿外泌體α-syn提供〇. 654的AUC(曲線下面積）（敏感性(靈敏度）=70.1 %，特 異性= 52.9%)。圖3B示出，在可獲得CSF樣品的受試者的子集中（100位PD和100位對照）， CSF總a-Syn提供〇. 724的AUC(敏感性=76.8 %，特異性=53.5 % )，即，LlCAM富集的外泌體 標記物(a-syn)的性能和通過測量CSFa-syn所提供的性能一樣好。圖3C示出，在F 1D患者中觀 測到(r = 0.176, p = 0.004, Pearson相關(guān))在血衆(zhòng)外泌體a-syn和疾病嚴重性之間的顯著相 關(guān)性，其中上述疾病嚴重性以UPDRS(統(tǒng)一帕金森病評分量表)運動評分作為指標的。
[0009] 圖4A和413不：在將125I標記的tau注入腦室內(nèi)（intracerebroventricule)以后的2、 5、10、20和60分鐘時在腦中（圖4A)和血漿中（圖4B)的放射性的水平。
[00?0]圖4C示:在外泌體部分(exo)和在上清部分(sup)中的放射性Tau(cpm/yl血衆(zhòng)）。示 出的數(shù)據(jù)是來自5只小鼠的平均值土 SD。CPM:每分鐘計數(shù)。
【具體實施方式】
[0011] 定義
[0012] 如在本文中所使用的"結(jié)合對"是指被吸引到彼此和特異性地結(jié)合于彼此的兩種 分子。結(jié)合對的實例包括但不限于抗原和針對上述抗原的抗體、配體和其受體、核酸互補 鏈、生物素和抗生物素蛋白、生物素和鏈霉親和素、植物凝集素(凝集素，lectin)和碳水化 合物。優(yōu)選的結(jié)合對是生物素和鏈霉親和素、生物素和抗生物素蛋白、熒光素和抗熒光素、 異輕洋地黃毒苷元(digioxigenin)/抗異輕洋地黃毒苷元。
[0013]如在本文中所使用的"CNS來源的外泌體"是指源自CNS，即，腦和/或脊髓的含有外 泌體的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)和核酸）。
[0014]如在本文中所使用的"外泌體(exosome)"是40-100nm胞外囊泡，其釋放自眾多的 細胞類型，并且執(zhí)行不同的細胞功能，包括細胞間通訊、抗原呈遞、和蛋白質(zhì)以及核酸的轉(zhuǎn) 移，例如mRNA和miRNAo
[0015] 如在本文中所使用的，"固定"是指試劑被固定到固體表面。當試劑被固定到固體 表面時，它是非共價結(jié)合于或共價結(jié)合于表面。
[0016] 如在本文中所使用的"LI CAM"是指由神經(jīng)系統(tǒng)表達的細胞粘附分子。LI CAM是跨膜 蛋白質(zhì)，它是200_220kDa的神經(jīng)元細胞粘附分子，Ll蛋白家族的成員，并且參與除涉及治療 耐受性癌癥的細胞迀移(在這種情況下，癌細胞是不相關(guān)的)之外的軸突導(dǎo)向。LlCAM還被指 定為CD171(分化簇171)。
[0017] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過尚未確定的機制，CNS來源的外泌體可以跨越血腦屏障的 多個層。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以在血液和其它外周體液中體內(nèi)檢測CNS來源的外泌體，其 攜帶獨特的、疾病特異性的生物標記物。
[0018] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于在生物體液如血液、血清、血漿、唾液、或尿液中分離和富 集源自CNS的外泌體的方法。本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以由生物體液中的源自CNS的富集的 外泌體來檢測和/或量化CNS來源的神經(jīng)系統(tǒng)生物標記物，而上述結(jié)果可用于檢測神經(jīng)系統(tǒng) 疾病如AD、PD、和朊病毒病。還可以將這些基于外周體液的但是CNS特異性的標志物用于鑒 別診斷，監(jiān)測疾病進展和/或客觀地評價CNS疾病的治療效果。
[0019] 本發(fā)明涉及用于從受試者的生物體液富集CNS來源的外泌體的方法。上述方法包 括以下步驟：（a)使含有CNS來源的外泌體的生物體液接觸抗LlCAM抗體以形成免疫復(fù)合物； (b)通過免疫復(fù)合物，將在生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相；以及(c)從生物體液 中分離固相結(jié)合的外泌體以富集CNS來源的外泌體。在一種實施方式中，將在步驟(a)中的 抗LlCAM抗體固定在固相上。適用于本發(fā)明的生物體液包括血液、血清、血漿、唾液、和尿液。 優(yōu)選的生物體液是血液、血清、血漿、或唾液。
[0020]為了特異性地富集源自生物體液中的CNS的外泌體，本發(fā)明使用免疫親和捕獲方 法來從受試者的生物體液分離含有LI CAM的外泌體。LI CAM是在源自CNS的外泌體的表面上 的標記物（Simpson et al·，Journalof Extracellular Vesicles 1:18374,2012)。神經(jīng)系 統(tǒng)特異性地表達L1CAM;它在其它器官系統(tǒng)(到目前為止報告的），包括血細胞和血小板中不 表達。例如，抗LlCAM抗體是特異性的并且不結(jié)合于免疫系統(tǒng)的NK和NKT細胞，如同NCAM-樣 (Fiandaca et al. ,Alzheimer's Dementia,S1552-5260(14)02469_8,2014)，因而不會非 特異性地捕獲源自免疫細胞或其它器官系統(tǒng)的外泌體。
[0021 ]用來捕獲CNS來源的外泌體的抗LlCAM抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈 抗體、或含有LlCAM抗原結(jié)合域的抗體片段如Fab或F(ab'）2片段。
[0022] 抗LlCAM抗體可以被固定在固相上，或者當接觸生物體液中的CNS來源的外泌體以 形成免疫復(fù)合物時，它可以在液相中，然后將抗LlCAM結(jié)合的外泌體結(jié)合于固相，其是借助 于能夠捕獲抗LlCAM的試劑加以固定。
[0023] 在一種優(yōu)選實施方式中，當接觸生物體液時，將抗LlCAM結(jié)合于固相。用來將試劑 固定于固相的方法在免疫化學中是常見的并且涉及在固相和試劑之間共價、疏水性或靜電 鍵的形成?？梢詫⒖筁lCAM直接固定在固相上。或者，可以通過結(jié)合對將抗LlCAM間接固定在 固相上。例如，可以通過吸附到固體表面或通過共價結(jié)合于涂布在固體表面上的氨基丙基 硅烷來首先固定結(jié)合對的第一成員（例如，鏈霉親和素、抗熒光素等）。然后可以通過生物 素-鏈霉親和素或熒光素和抗熒光素(結(jié)合對）的結(jié)合，將用結(jié)合對的第二成員（例如，生物 素、熒光素等)標記的抗LI CAM結(jié)合于固體表面。
[0024] 在借助于固相并通過LlCAM和抗LlCAM免疫復(fù)合物來特異性地捕獲CNS來源的外泌 體以后，從生物體液分離外泌體以富集CNS來源的外泌體。可以直接使用固相結(jié)合的外泌體 或者可以將它們從固相洗脫，供進一步使用和/或測量。
[0025]如通過電子顯微鏡或其它測量所證明的，通過本發(fā)明的免疫捕獲方法產(chǎn)生的在生 物體液中的含有LlCAM的外泌體顯示具有與通過其它外泌體分離技術(shù)(包括目前的"金標 準"，超速離心加密度梯度)所獲得的類似的質(zhì)量。因為我們的步驟不涉及超速離心，所以本 發(fā)明的方法更加實用于常規(guī)臨床檢查(在進一步優(yōu)化以后）。此外，超速離心并不提供僅源 自CNS的外泌體的特異性。
[0026]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在生物體液中的CNS來源的外泌體中含有的生物標記物的測 量結(jié)果可用于檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病。生物標記物可以是蛋白質(zhì)或核酸如DNA或RNA。例如，在 CNS來源的外泌體中的α-syn或磷酸化α-syn(例如，絲氨酸129-a-Syn，在殘基絲氨酸-129或 ps 129處a-syn的磷酸化)是用于F1D的生物標記物。在CNS來源的外泌體中，tau或酸化tau，例 如，p-tau 181，是AD的生物標記物。在CNS來源的外泌體中的朊病毒蛋白或磷酸化朊病毒蛋 白是骯病毒病如克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)的生物標記物。
[0027] 在CNS來源的外泌體中含有的作為AD的生物標記物的RNA包括那些RNA，其與基因 UBAP2L、YBXI、SERF2、UBE2B、RPLIOA、H3F3AP4、PPP2CA、匪D3、RNF7、RPLPO、SPARC、WTAP、 HNRNPU、LINC00265、IMMT、SLC35E2、CT60、SYNCRIP、RGS2、SMC6、ARSA、SPDYE7P、SMIM17、 TRAF3IP2-AS1、KCNC2、SLC24A1、HLCS、G0SR1、MN1、MGAT5、NBPF14、FBX031、WDR52、TBC1D2B、 ZNF648、NBPF16、PAGR1、AQP2、PRKCI、SCN2B、DPYSL3、TMEM26、TSPAN11、ELL2、FAM186A、CD59、 THSD4、GOLGA6B、ARHGEF5、PKDI、BPTF、FLG、POMl21LIOP、NXPH3、H3F3A、SH3TC2、GGCX、和 GREBl關(guān)聯(lián)。
[0028] 在CNS來源的外泌體中含有的作為PD的生物標記物的RNA包括那些RNA，其與基因 BL0C1S1、UBE2L3、RNF149、FAM89B、LCE6A、NT5DC2、PPP1CC、CCL5、HDLBP、HNRNPAB、NXN、 SLC9A4、EIF2AKI、PAPOLA、TRM50、SIX4、RAB3 IP、VANGL2、DHRSX、F0XP4、SYNM、ZNF543、ATF6、 L0C100132832、和 BL0C1S1-RDH5 關(guān)聯(lián)。
[0029] 當被捕獲在固相上時，或在從固相洗脫以后，可以在富集的外泌體中測量蛋白質(zhì) 生物標記物。對于被暴露在外泌體的表面上的蛋白質(zhì)生物標記物，可以測量它而無需外泌 體裂解。對于包含在外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)生物標記物，可以在外泌體裂解以后測量它。可以通 過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來測量蛋白質(zhì)生物標記物。免疫測定如ELISA、Luminex、 和最近的Quant er ix是用于測量蛋白質(zhì)生物標記物的優(yōu)選方法。
[0030] 對于核酸生物標記物，在測量核酸生物標記物以前，需要裂解捕獲的外泌體?？梢?通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如，DNA或RNA探針，或任何已知的測序技術(shù)，來檢 測核酸。
[0031] 本發(fā)明還涉及用于在受試者中檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病或用于鑒別診斷的方法。上述方 法包括以下步驟：（a)使來自受試者的生物體液接觸抗LlCAM抗體以形成免疫復(fù)合物，其中 生物體液是血液、血清、血漿、唾液、或尿液；（b)通過免疫復(fù)合物，將在生物體液中的CNS來 源的外泌體結(jié)合于固相；（c)從生物體液分離固相結(jié)合的外泌體以富集CNS來源的外泌體； (d)確定來自富集的CNS來源的外泌體的生物標記物的水平，其中，與來自正常受試者(用于 診斷)或來自患有另一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的受試者（用于鑒別診斷）的對照水平比較，在受試 者中來自CNS來源的外泌體的生物標記物的水平升高表明受試者患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如， AD、H)或朊病毒病）。在一種實施方式中，生物標記物是α-syn或磷酸化α-syn以及神經(jīng)系統(tǒng) 疾病是H)。在另一種實施方式中，生物標記物是tau、磷酸化tau或Αβ物質(zhì)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病 是AD。在另一種實施方式中，生物標記物是朊病毒蛋白以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是朊病毒病。
[0032] 本發(fā)明進一步涉及用于在受試者中監(jiān)測神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展的方法。上述方法包 括以下步驟：（a)在不同時間點（例如，在時間零點、6個月、1年、或2年時)從受試者獲得生物 體液樣品，其中生物體液是血液、血清、血漿、唾液、或尿液；（b)使每個樣品接觸抗LI CAM抗 體以形成免疫復(fù)合物；（c)通過免疫復(fù)合物，使在每種生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合 于固相；（d)從每個樣品分離固相結(jié)合的外泌體以富集CNS來源的外泌體；（e)在來自每個樣 品的富集的CNS來源的外泌體中確定生物標記物的水平，其中在稍后時間點的樣品中的水 平進一步升高表明疾病是進行性的。在一種實施方式中，生物標記物是α-syn或磷酸化α-syn以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是Η)。在另一種實施方式中。生物標記物是tau或磷酸化tau或Αβ物質(zhì) 以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是AD。在另一種實施方式中，生物標記物是朊病毒蛋白或磷酸化朊病毒 蛋白以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是朊病毒病。
[0033] 本發(fā)明進一步涉及用于在受試者中監(jiān)測神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物治療的方法。上述方 法包括以下步驟：（a)在藥物治療前后，從受試者獲得生物體液樣品，其中生物體液是血液、 血清、血漿、唾液、或尿液；（b)使每個樣品接觸抗LI CAM抗體以形成免疫復(fù)合物；（c)通過免 疫復(fù)合物，將在每種生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相；（d)從每個樣品分離固相 結(jié)合的外泌體以富集CNS來源的外泌體；（e)在來自每個樣品的富集的CNS來源的外泌體中 確定生物標記物的水平，其中在藥物治療以后樣品中的水平降低表明藥物治療是有效的。 在一種實施方式中，生物標記物是α-syn或磷酸化α-syn以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是PD。在另一種 實施方式中，生物標記物是tau或磷酸化tau或Αβ物質(zhì)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是AD。在另一種實 施方式中，生物標記物是朊病毒蛋白或磷酸化朊病毒蛋白以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病是朊病毒病。 [0034]本發(fā)明的受試者是哺乳動物受試者如人、馬、和狗，其中人是優(yōu)選的受試者。
[0035]以下實施例進一步說明本發(fā)明。這些實施例僅旨在說明本發(fā)明而不應(yīng)被解釋為限 制性的。
[0036] 實施例
[0037] 實施例1.外泌體分離
[0038] 按照修改自Tauro et al(Methods 56:293-304,2012)的協(xié)議并利用抗體包被的 超順磁微珠，從小鼠或人血漿分離外泌體。簡要描述：將IOyg抗LICAM抗體（克隆UJ127， Abeam,Cambridge，MA,USA)、或抗CD63抗體（克隆H5C6，BD Biosciences，San Diego，CA, USA)、或正常小鼠 IgG(Santa Cruz Biotechnology ,Dallas，TX,USA)(作為陰性對照）涂布 在一組（lmg)M-270環(huán)氧珠上，其中根據(jù)制造商的說明，利用DYNABEADS^抗體偶聯(lián)試 劑盒(Life Technologies ,Grand Island,NY，USA)。在37°C下快速解凍（在2分鐘內(nèi)）以后， 在2，000 X g下離心血漿樣品（>300yL) 15分鐘，接著在12，000 X g下離心30分鐘，然后用磷酸 鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)1:3.稀釋上清。在4°C下，借助于溫和旋轉(zhuǎn)，溫育一組抗體包被的 珠和900yL稀釋血漿約24小時。然后用ImL的0.1%牛血清白蛋白（83厶)/^3(?!17.4)洗滌珠 四次并轉(zhuǎn)移到新管。
[0039] 借助于60yL的0.1%83六/1^(?!17.4)和固定緩沖液(4%多聚甲醛/5%戊二醛）的 1:1混合物，從珠洗脫外泌體，用于電子顯微鏡檢測?；蛘?，在室溫下，借助于輕輕搖動，通過 在0.1%85六/?85(口!17.4)中在11(^1^的1%1>4〇11父-100加 10%蛋白酶抑制劑混合物 (P2714, Sigma-Aldrich，St Louis ,MO,USA;在IOml的H2O中制備）中溫育珠 1小時來裂解外 泌體，用于Luminex測量和其它分析。
[0040] 分批提取在臨床血漿樣品中的外泌體，并將PD和對照樣品分配到每個批次。將匯 集自30個健康對照的兩個參比血漿樣品加入每一批次以有助于消除批次變化。
[0041] 為了質(zhì)量控制和測定發(fā)展，還在PBS中稀釋一些參比血漿樣品（匯集自健康年老對 照），然后經(jīng)受超速離心（100，〇〇〇 X g，3小時，在4°C下），然后再懸浮沉淀物(pellet)，加載 到OptiPrep?密度梯度，并在4°C于100,000 X g下離心18小時，以獲得外泌體，如在Tauro et al (上述）中描述的。在兩步超速離心（180,000 X g，3小時，在4°C下，X 2)以后，通過除去外 泌體來制備貧外泌體血漿樣品。
[0042] 實施例2.來自人血漿的抗LlCAM捕獲的外泌體的表征
[0043] Luminex 測定
[0044] 借助于已建立的Luminex協(xié)議(Brain 133:713-726,2010)，IOOyL的外泌體制備品 (提取自300yL血漿)用來量化α-syn。
[0045] 電子顯微鏡檢查
[0046] 將以1:1與4% (v/v)多聚甲醛和5% (v/v)戊二醛混合的分離的外泌體制備品分層 在福爾姆華膜(formvar)/碳涂布的300 目銅網(wǎng)格(Polysciences ,Warrington ,PA,USA)上， 并允許在室溫下干燥20分鐘。為了直接成像，然后用水洗滌網(wǎng)格兩次，時間為兩分鐘，接著 在室溫下用在水中的2 % (w/v)乙酸雙氧鈾（Electron Microscopy Sciences ,Hatf ieId， PA，USA)染色20分鐘。為了免疫金染色，在利用I %BSA/5 %正常山羊血清/PBS緩沖液封閉30 分鐘以前，用PBS洗滌網(wǎng)格。用I3BS再洗滌網(wǎng)格，在室溫下在封閉緩沖液中在有或沒有1:50稀 釋度的抗LI CAM抗體(abeam)的情況下溫育兩小時，然后在室溫下用18-nm金結(jié)合的山羊抗 小鼠 IgG抗體(abeam)溫育60分鐘。再次洗滌網(wǎng)格并放置在室溫下以在用乙酸雙氧鈾顯影 (contras t)以前干燥。用JE0L( Peabody，MA，USA) 1230透射電子顯微鏡進行成像。
[0047] We s tern 印跡分析
[0048 ] 遵循標準協(xié)議，進行We s t e r η印跡。用La emm I i樣品緩沖液來溶解外泌體樣品（~10 yg蛋白質(zhì)）并在轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜以前在ID SDS-PAGE凝膠上分離。借助于以下一抗:小 鼠抗人 LlCAM(Abcam, 1:500)和小鼠抗人 Alix(Cat#ABC40, Millipore ,Billerica, MA，USA; 1:1000)來探測上述膜。
[0049] 為了檢查LlCAM在人血細胞中的表達，使用來自紅細胞和血小板的細胞裂解液 (IOOyg蛋白質(zhì)），以及連同人大腦皮質(zhì)（IOOyg蛋白質(zhì)）勾漿液作為對照，用抗LlCAM抗體來探 測膜。
[0050] 結(jié)果
[0051] 圖1(a)示：抗LlCAM捕獲的血漿外泌體的電子顯微照片（插圖：L1CAM的免疫金標 記）。圖1(b)的Western印跡表明，Alix，一種常見的外泌體標記物，和L1CAM，借助于抗LlCAM 捕獲來富集，但借助于正常IgG捕獲則不能富集。
[0052]圖I(c)表明：在抗LlCAM捕獲的血漿外泌體中的α-syn水平高于在正常小鼠 IgG捕 獲(ml gG)的血漿外泌體或〃空捕獲〃(無珠)血漿外泌體中的水平。在抗LI CAM捕獲血漿外泌 體中的a-syn信號不大可能來自于游離的a-syn污染，這是因為來自正常小鼠 IgG捕獲的或〃 空捕獲"樣品的信號是最小的。
[0053]為了進一步證實a-syn信號是來自外泌體，利用超速離心來產(chǎn)生貧外泌體血漿。相 比于常規(guī)血漿，在此貧外泌體血漿中在含有LlCAM的外泌體中的a-syn信號被降低超過10倍 (圖 Id)。
[0054] 還檢查了在血細胞中的LlCAM表達，并且結(jié)果表明，在紅細胞和血小板中LlCAM是 不可檢測的。
[0055] 實施例3.在臨床樣品中血漿外泌體a-syn的評估
[0056]收集一大隊列的2 6 7位P D和215位年齡和性別匹配的健康對照血漿樣品并利用 Luminex測定(見實施例1)來測量在血漿含有LlCAM的外泌體中以及在全血漿中它們的a-syn濃度。結(jié)果示于圖2。圖2a表明，相比于健康對照，在患者中，在血漿含有LlCAM的外泌 體中α-syn濃度顯著較高(p<0.0001)。
[0057]圖2b示出，在與對照中，總血漿a-syn濃度沒有顯著差異(p = 〇. 134，t檢驗）。 [0058] 為了進一步評估在含有LlCAM的外泌體中血漿a-syn有助于PD診斷的潛力，在267 位ro患者和215位健康對照中生成用于分析物的ROC(受試者工作特征）曲線，以表征在區(qū)別 PD與健康對照受試者中它們的敏感性(靈敏度)和特異性。發(fā)現(xiàn)血漿外泌體α-syn的性能是 適度的(AUC = 0.654，敏感性=70.1 %，特異性=52.9 % )(圖3A)。在受試者的子集中還借助 于可獲得的CSF樣品（100位和100位對照)進行ROC分析；圖3B表明，CSF總α-syn提供〇. 724 的AUC(敏感性=76.8%，特異性=53.5% )。以上結(jié)果表明，比較血漿外泌體a-Syn與CSF總 a-syn(其是到目前為止描述的PD的最好的分子生物標記物(Mollenhauer et al. ,Exp Neurol 213(2): 315-325，2008))，已實現(xiàn)基本等效的診斷性能(敏感性和特異性）。
[0059] 另外，檢查了在血漿外泌體α-syn和Η)疾病嚴重性之間的相關(guān)性。觀測到在含有 1^10厶]\1的外泌體中的血楽_€[-8711(^ = 0.176，口 = 0.004，？6&18011相關(guān);見圖3(])或血楽_外泌體 (exo)/總α-syn比率(r = 〇. 130，p = 0.035)與UPDRS運動評分之間的顯著相關(guān)性。結(jié)果表明， 血漿外泌體a-syn顯示與疾病嚴重性(UPDRS運動）的顯著的、雖然微弱的、相關(guān)性，這表明血 漿外泌體a-syn可用于監(jiān)測或預(yù)測疾病進展。為此，應(yīng)當強調(diào)的是，幾個組沒有觀測到CSFa-syn與PD嚴重性的這種相關(guān)性（例如，Hong et al ,Brain，133:713-26，2010)。因此，在與 嚴重性關(guān)聯(lián)方面以及還可能在與進展關(guān)聯(lián)方面，血漿外泌體α-syn的性能優(yōu)于CSFa-syn。
[0060] 實施例4.在抗LlCAM富集的外泌體中tau的測量
[0061 ] 對小鼠腦室內(nèi)注射125I-標記tau2N4R(I-tau)。然后在注射后的2、5、10、20和60分 鐘時收集腦和血衆(zhòng)。利用γ計數(shù)器來確定在腦（圖4A)和血漿（圖4B)中放射性的水平。結(jié)果 表明，tau被從腦轉(zhuǎn)運到血液。
[0062]在注射后60分鐘時收集血液，接著，從無血小板血漿提取含有LlCAM的外泌體(見 實施例1)。在全血衆(zhòng)、外泌體部分(Exo)、和少外泌體(exosome-less)部分(在免疫親和捕獲 以后的上清）中測量放射性的水平。示出在外泌體部分中和在上清部分中（圖4C)放射性tau (CPmAiL血漿）的結(jié)果。結(jié)果表明，tau，用于AD的關(guān)鍵標記物，相對于對照外泌體(空外泌體 或小鼠 IgG抗體連接的外泌體），在通過抗LlCAM所富集的外泌體中可很好地檢測。在人血液 中tau物質(zhì)也是可容易檢測的(數(shù)據(jù)未示出）。
[0063] 實施例5.在人唾液中檢測的LlCAM
[0064]按照由Devic et al (Brain · 134(Pt 7): el78 · doi : 10 · 1093brain/awr015 · Epub 2011Feb 24)描述的程序來收集來自正常受試者的人唾液。簡要地，在9-11AM之間，從沒有 預(yù)先存在的健康擔憂的個體收集唾液樣品。為了除去不溶性物質(zhì)和碎片，在4°C和15，000g 下離心樣品15分鐘。將10% (v/v)蛋白酶抑制劑混合物立即加入上清，然后借助于20% (v/ v)的TCA在冰上沉淀蛋白質(zhì)1小時。在4°C和15，OOOg下離心混合物15分鐘。除去上清并用冰 冷的丙酮洗滌沉淀物兩次。借助于BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific Pierce)并采 用BSA作為標準來評估蛋白質(zhì)濃度，然后將樣品存儲在-20°C下直至分析。依據(jù)在實施例1中 描述的協(xié)議，借助于抗LlCAM抗體涂覆的珠或正常小鼠 IgG涂覆的珠（陰性對照）來溫育上 清。
[0065]依據(jù)在實施例2中描述的協(xié)議，裂解捕獲的外泌體，用于Western印跡分析。借助于 小鼠抗人Alix來探測膜。Alix(-種常見的外泌體標記物)在由抗LlCAM捕獲的外泌體中是 明顯可檢測的，并具有95千道爾頓(kDa)的預(yù)期分子量，但在由正常小鼠 IgG(陰性對照）捕 獲的外泌體中是不可檢測的。除分別具有50kDa和25kDa的適當分子量的人IgG的已知重鏈 和輕鏈以外，不存在其它非特異性帶。
[0066] 在抗LlCAM捕獲的外泌體中，通過如在實施例3描述的但針對在人唾液中的a-syn 測定所優(yōu)化的Luminex方法(Devic et al Brain 201 IJul ;134(Pt 7): el78.doi 10.1093/ brain/awr015.Epub 2011Feb 24)，a-syn也是可檢測的。
[0067] 實施例6.提取自LlCAM外泌體的核酸
[0068] 為了分離CNS來源的核酸，依據(jù)在實施例1中描述的方法，從總共72位受試者的血 漿（24位患有AD，24位患有PD以及24位是年齡匹配的健康對照）中富集LlCAM-外泌體。在 RNAseq分析以前，將每個類別(AD、H)和正常對照)分成三個小組(p〇〇l)(n = 8/組）。
[0069] 核酸提取自LlCAM外泌體。按照單細胞RNA seq協(xié)議（Tang et al，Nat.Protoc.5, 516-535,2010)，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。借助于通用引物，將這些cDNA預(yù)擴增到約50-80納克。
[0070] 在借助于Covaris S2系統(tǒng)的CDNA片段化以后，借助于DNA文庫構(gòu)建試劑盒(NEB# E7370L)，將片段化cDNA應(yīng)用于文庫構(gòu)建體。
[0071] 通過比較在3個小組中確定的基因，在AD樣品中，但不在ro或健康對照樣品中存在 58種唯一識別的基因。這58種基因是：UBAP2L、YBX1、SERF2、UBE2B、RPL10A、H3F3AP4、 PPP2CA、NMD3、RNF7、RPLP0、SPARC、WTAP、HNRNPU、LINC00265、INMT、SLC35E2、CT60、SYNCRIP、 RGS2、PSMC6、ARSA、SPDYE7P、SMIM17、TRAF3IP2-AS1、KCNC2、SLC24A1、HLCS、G0SR1、MN1、 MGAT5、NBPF14、FBX031、WDR52、TBC1D2B、ZNF648、NBPF16、PAGR1、AQP2、PRKCI、SCN2B、 DPYSL3、TMEM26、TSPANlI、ELL2、FAMl86A、CD59、THSD4、G0LGA6B、ARHGEF5、PKDI、BPTF、FLG、 POMl21LIOP、NXPH3、H3F3A、SH3TC2、GGCX、和GREBI。
[0072] 在PD樣品中，但不在AD或健康對照樣品中，存在唯一識別的25種基因。這25種基因 是：BLOCISI、UBE2L3、RNF149、FAM89B、LCE6A、NT5DC2、PPPICC、CCL5、HDLBP、HNRNPAB、NXN、 SLC9A4、EIF2AKI、PAPOLA、TRM50、SIX4、RAB3 IP、VANGL2、DHRSX、F0XP4、SYNM、ZNF543、ATF6、 L0C100132832、和BL0C1S1-RDH5。
[0073] 應(yīng)當理解的是，上述描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式并且可在其中進行修改而沒有 偏離如在權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于從生物體液中富集CNS來源的外泌體的方法，包括： (a) 使含有CNS來源的外泌體的生物體液接觸抗L1 CAM抗體以形成免疫復(fù)合物，其中所 述生物體液是血液、血清、血漿、或唾液； (b) 通過所述免疫復(fù)合物將在所述生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相；以及 (c) 從所述生物體液中分離所述固相結(jié)合的外泌體以富集所述CNS來源的外泌體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，將在步驟(a)中的所述抗L1CAM抗體固定在所述固 相上。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括從所述固相洗脫結(jié)合的所述外泌體的步驟4. 一種用于在體液中檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病的CNS來源的生物標記物的方法，包括： (a) 使生物體液接觸抗L1CAM抗體以形成免疫復(fù)合物，其中所述生物體液是血液、血清、 血漿、或唾液； (b) 通過所述免疫復(fù)合物將在所述生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相， (c) 從所述生物體液中分離結(jié)合的所述外泌體，以及 (d) 確定來自（c)的所述外泌體的所述CNS來源的生物標記物的水平，其中所述生物標 記物是核酸或蛋白質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是帕金森病，而所述生物標記 物是α-突觸核蛋白或磷酸化的α-突觸核蛋白。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是阿爾茨海默病，而所述生物 標記物是tau或磷酸化的tau。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是朊病毒病，而所述生物標記 物是朊病毒蛋白。8. -種用于在受試者中檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括以下步驟： (a) 使來自受試者的生物體液接觸抗L1CAM抗體以形成免疫復(fù)合物，其中所述生物體液 是血液、血清、血漿、或唾液； (b) 通過所述免疫復(fù)合物將在所述生物體液中的CNS來源的外泌體結(jié)合于固相； (c) 從所述生物體液中分離所述固相結(jié)合的外泌體以富集所述CNS來源的外泌體，以及 (d) 確定來自富集的所述CNS來源的外泌體的生物標記物的水平， 其中，與來自沒有所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病的受試者的對照水平比較，在所述受試者中來自 所述CNS來源的外泌體的所述生物標記物的水平升高表明所述受試者患有所述神經(jīng)系統(tǒng)疾 病。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是帕金森病，而所述生物標記 物是α-突觸核蛋白或磷酸化的α-突觸核蛋白。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是阿爾茨海默病，而所述生物 標記物是tau或磷酸化的tau。11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是朊病毒病，而所述生物標記 物是朊病毒蛋白。
【文檔編號】G01N33/53GK106062559SQ201580003884
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年6月26日
【發(fā)明人】章京
【申請人】北京新源長青生物科技有限公司