肺癌診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測抗體的方法、用于診斷肺癌的方法以及用于肺癌診斷的試劑盒。本發(fā)明的方法是基于受試者的血液或血清樣品。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明使用包含BARD1、其短肽和/或較大片段的氨基酸段的不同肽的組合。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括測量所述樣品中結(jié)合各所述不同肽的自身免疫抗體的量并且應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)上確定的評估進(jìn)行所述診斷。
【專利說明】
肺癌診斷
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于診斷肺癌的方法、用于檢測肺癌的方法、用于檢測抗體的方法、其 它方法和檢測試劑盒以及診斷測試試劑盒。
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明的問題
[0003] 肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因。除手術(shù)以外的治療方法不是非常有效的并且 導(dǎo)致耐藥性。因此，迫切需要深入了解肺癌的病因?qū)W及其進(jìn)展。結(jié)腸直腸癌是全世界癌癥相 關(guān)死亡的另一個主要原因并且是第四最常見的癌癥。結(jié)腸直腸癌患者的存活和預(yù)后取決于 腫瘤在診斷時的階段。早期結(jié)腸直腸癌是可以治愈的。不幸的是，在診斷時超過57%的疾病 已局部或遠(yuǎn)距離擴(kuò)散。盡管在癌癥的控制上投入了大量資金并取得了顯著進(jìn)步，但晚期結(jié) 直腸癌患者的五年存活率僅為15%。
[0004] 最近，許多團(tuán)體通過將腫瘤的蛋白、RNA和微RNA與健康組織相比較來說明驅(qū)動肺 癌的機(jī)理。除了TP53(肺癌中最頻繁缺失或突變的基因），p53-ARF途徑的組分也不斷地缺 失、突變或表觀遺傳學(xué)修飾。關(guān)于結(jié)腸直腸癌，難題是理解分子基礎(chǔ)，并且確定啟動發(fā)展且 推動進(jìn)展的因素。涉及結(jié)腸直腸癌發(fā)作的分子事件和轉(zhuǎn)移性進(jìn)展僅部分得到了闡明。最近 的研究已顯示分子和生化標(biāo)記在結(jié)腸直腸癌中的潛在用途，以預(yù)測對于化療（如MLHl、 MSH2、β-連環(huán)蛋白和p53)的結(jié)果和反應(yīng)。
[0005] 分子譜作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的預(yù)測和預(yù)后參數(shù)而出現(xiàn)，包括參與DNA損傷 修復(fù)的基因，諸如ERCCI、RRMl和BRCA1。已提出將乳腺癌易感性基因BRCA1的上調(diào)表達(dá)作為 NSCLC中對治療的反應(yīng)的預(yù)后和預(yù)測標(biāo)記。關(guān)于結(jié)腸直腸癌，BRCAl的研究主要局限于結(jié)腸 直腸癌風(fēng)險和BRCAl突變。一些研究試圖將BRCAl突變與結(jié)腸直腸癌風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，但沒有得 到任何明確的結(jié)論?；诋?dāng)前有限可得的證據(jù)，BRCA突變攜帶者應(yīng)被視為處于結(jié)腸直腸癌 的高風(fēng)險。然而，BRCAl表達(dá)在結(jié)腸直腸癌中的具體作用是不清楚的。
[0006] BRCAl在許多增生組織中被表達(dá)并且在DNA修復(fù)途徑和細(xì)胞周期控制中作為腫瘤 抑制基因起作用。BRCAl蛋白穩(wěn)定性和功能取決于其與BARD1(BRCA1相關(guān)的RING結(jié)構(gòu)域蛋白 1)的相互作用。BRCA1-BARD1異二聚體具有E3泛素連接酶活性，因此通過泛素化來控制關(guān)鍵 靶蛋白的穩(wěn)定性。BARDl還參與大多數(shù)肺癌中缺乏的p53依賴性細(xì)胞凋亡。MRDl使p53穩(wěn)定 且促進(jìn)其磷酸化，并且MRDl的表達(dá)是p53在發(fā)出細(xì)胞凋亡的信號中適當(dāng)起作用所需要的。 因此，BARDl在腫瘤抑制中起雙重作用，作為BRCAl和p53兩者的結(jié)合搭配物。一些研究已顯 示，在有絲分裂期間BARDl通過E2F轉(zhuǎn)錄性上調(diào)且通過磷酸化翻譯后上調(diào)，并且重要地，這是 有絲分裂所必需的。根據(jù)其它研究，已顯示BRCAl和BARDl兩者均與hMSH2相互作用，hMSH2是 通常與遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)相關(guān)的基因，并且hMSH2的突變似乎占HNPCC的 大約SOIO^^BRCAl-hMSffi信號傳導(dǎo)過程的缺陷導(dǎo)致對腫瘤發(fā)生的易感性增加。
[0007] TO 98/12327(德克薩斯大學(xué)系統(tǒng)董事會(Board of Regents，the University of Texas System))公開了幾個基因，這些基因是在基于結(jié)合乳腺癌蛋白BRCAl的篩選測定中 鑒定出來的。這些基因中的一個稱為MRDl，它是與BRCAl相互作用的RING蛋白并且被設(shè)想 用于各種癌癥相關(guān)的診斷和治療方法，特別是與乳腺癌、卵巢癌和子宮癌相關(guān)的那些癌癥。
[0008] TO 2008/119802(日內(nèi)瓦大學(xué)（University de Gengve))公開，在婦科癌癥中， BARDl的具有缺失的同工型是過表達(dá)的且異常地定位至細(xì)胞質(zhì)，并且其表達(dá)與乳腺癌和卵 巢癌的不良預(yù)后相關(guān)。這些同工型的結(jié)構(gòu)分析表明它們?nèi)狈εcBRCAl相互作用或誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡的區(qū)域。這些同工型對婦科癌癥具有特異性并且稱為同工型α、β、η、γ以及Ω。
[0009] WO 2012/023112公開了 MRD1的新穎的同工型，所述新穎的同工型特定地在肺癌 和結(jié)腸癌中出現(xiàn)。公開了用于檢測這些同工型的方法。
[0010] 由于肺癌的嚴(yán)重性，存在提供用于診斷受試者中肺癌的有效方法的迫切需要。由 于處于晚期狀態(tài)中的受試者癌癥的不能治愈性，存在提供允許早期診斷肺癌的方法的迫切 需要。早期診斷顯著地改善患有肺癌的受試者的預(yù)后。
[0011] 本發(fā)明的一個目的是提供無創(chuàng)傷性或需要微創(chuàng)手術(shù)的診斷方法?？稍谘簶悠坊?礎(chǔ)上進(jìn)行的診斷測試將是有利的。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于診斷肺癌的快速、可靠、靈敏且特異性的測 試。
[0013]本發(fā)明解決了上述問題。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明提供適于診斷肺癌的方法、試劑盒和測定。
[0016] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于檢測和/或測量血液和/或血清樣品中的抗體水 平的方法，其中測量特異性結(jié)合不同肽的抗體的水平，其中所述肽包含人MRDI (SEQ ID Ν0:42)和/或其同工型（SEQ ID Ν0:43-51)的一段氨基酸序列。
[0017] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于檢測和/或測量哺乳動物受試者的循環(huán)抗體水 平的方法，其中檢測對許多不同肽具有特異性的抗體，其中所述肽與MRDl相關(guān)并且/或者 包含BARDl或其同工型中的任何一個的氨基酸序列的片段。
[0018] 人MRDl的氨基酸序列(全長）以SEQ ID Ν0:42提供于所附序列表中。BARDl的同工 型包括同工型 a(alpha)(SEQ ID N0:43);同工型 Ji(pi)(SEQ ID N0:44);同工型 0(beta) (SEQ ID N0:45);同工型 k(SEQ ID N0:46);同工型 y(SEQ ID N0:47);同工型 A(SEQ ID N0:48);同工型(P(phi)(SEQ ID N0:49);同工型 e(epsil〇n)(SEQ ID N0:50);以及同工型 n (eta)(SEQ ID N0:51)。
[0019] 在一個方面，本發(fā)明提供一種通過檢測哺乳動物受試者中循環(huán)抗體的水平來診斷 肺癌的方法，其中檢測對許多不同肽具有特異性的抗體，其中所述肽與MRDl相關(guān)并且/或 者包含BARDl或其同工型中的任何一個的氨基酸序列的片段。
[0020] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于測量和/或檢測哺乳動物受試者中循環(huán)抗體水 平的體外和/或離體方法，所述方法包括以下步驟:a)在取自受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ) 上，確定與特異性結(jié)合不同肽的循環(huán)血清抗體的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人MRDl (SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列。
[0021] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷哺乳動物受試者中肺癌的體外和/或離體 方法，所述方法包括以下步驟:a)在取自受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié) 合不同肽的循環(huán)血清抗體的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或 其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列;b)在前一步驟獲得的參數(shù)的基礎(chǔ)上，診斷 所述受試者是否患有肺癌。
[0022] 在一個方面，本發(fā)明提供一種檢測和/或測量與肺癌發(fā)生相關(guān)的抗體水平的體外 和/或離體方法，所述方法包括以下步驟:a)在取自受試者的所述血液或血清樣品基礎(chǔ)上， 確定與特異性結(jié)合不同肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO: 42)和/或其同工型(SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列。
[0023] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于評估受試者患肺癌的概率和/或風(fēng)險的方法，所 述方法包括以下步驟:a)在取自受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同 肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列；由在步驟a)中測量的參數(shù)評估所述受試者患肺癌的概率 和/或風(fēng)險。
[0024] 在一個方面，本發(fā)明提供包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID NO: 43-51)的一段氨基酸序列的不同肽的組合在本發(fā)明體外和/或離體方法中，例如在用于 肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、預(yù)后、預(yù)測、復(fù)發(fā)的方法中，和/或在用于提高肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、 預(yù)后、預(yù)測和復(fù)發(fā)的臨床效率的方法中的用途。
[0025] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于檢測和/或確定存在于血液和/或血清樣品中的 抗體水平的方法，所述方法包括以下步驟:提供來自哺乳動物受試者的血液或血清樣品;使 所述血液或血清樣品與結(jié)合不同肽的一個或多個表面和/或固體基質(zhì)接觸，所述肽包含人 BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列，其中所述接 觸是處在足以通過抗原-抗體相互作用將存在于所述樣品中的抗體與不同肽結(jié)合的條件 下;移除血液或血清樣品用于將任何未結(jié)合的抗體從一個或多個表面或固體基質(zhì)移除；確 定與所述表面和/或基質(zhì)結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物的水平。
[0026] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷哺乳動物受試者中肺癌的方法，所述方法 包括以下步驟:提供來自哺乳動物受試者的血液或血清樣品；使所述血液或血清樣品與結(jié) 合不同肽的一個和/或多個表面或固體基質(zhì)接觸，所述肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/ 或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列，其中所述接觸是處在足以通過抗原-抗 體相互作用將存在于所述樣品中的抗體與不同肽結(jié)合的條件下;移除血液或血清樣品用于 將任何未結(jié)合的抗體從表面和/或基質(zhì)移除；確定與所述表面和/或基質(zhì)結(jié)合的抗原-抗體 復(fù)合物的水平；以及在前一步驟獲得的水平的基礎(chǔ)上，診斷所述受試者是否患有肺癌。
[0027] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷女性人類受試者中肺癌的體外和/或離體 方法。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括以下步驟:在取自女性受試者的血液或血清樣品 基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合至少19種不同肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，其中所述肽是分別包 含氨基酸序列SEQIDN0 :1至SEQIDN0:6;SEQIDN0:11至SEQIDN0 :14;SEQIDN0:18 至SEQ ID N0:21;SEQ ID N0:26至SEQ ID N0:30的肽；以及，在前一步驟獲得的參數(shù)的基礎(chǔ) 上，診斷所述女性受試者是否患有肺癌。
[0028] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷男性人類受試者中肺癌的體外和/或離體 方法。在優(yōu)選的實施方案中，此方法包括以下步驟:在取自男性受試者的血液或血清樣品基 礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合至少22種不同肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，其中所述肽是分別包含 氨基酸序列SEQIDN0 :1至SEQIDN0:5;SEQIDN0:7;SEQIDN0 :8;SEQIDN0:11至SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:20;SEQ ID NO:22;SEQ ID NO:23; SEQ ID N0:26;SEQ ID N0:27;以及SEQ ID N0:31 至SEQ ID N0:34的肽；以及，在前一步驟 獲得的參數(shù)的基礎(chǔ)上，診斷所述男性受試者是否患有肺癌。
[0029] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷受試者中肺癌的體外和/或離體方法，所述 方法包括以下步驟：
[0030] a)_將不同肽的組合暴露于受試者的血液或血清樣品，其中所述肽選自包含人 BARD1(SEQ ID N0:42)或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列的肽，并且其中所 述肽獨立地具有4至300個氨基酸的長度；
[0031]-確定與所述樣品中結(jié)合每種所述肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)；
[0032] b)由前一步驟獲得的參數(shù)來確定所述受試者被診斷為肺癌陽性還是陰性。
[0033] 在一些方面中，本發(fā)明提供用于進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒包 括至少4種不同肽。
[0034]在一個方面，本發(fā)明提供一種用于診斷肺癌的診斷測試試劑盒，其中所述診斷測 試試劑盒包括至少11種不同肽的組合，每種肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型 (SEQ ID NO:43-51)的一段氨基酸序列。在一個實施方案中，所述不同肽選自由包含根據(jù) SEQ ID NO: 1至41中任一個的氨基酸序列的肽組成的組。
[0035] 本發(fā)明的其它方面和優(yōu)選實施方案在下文和所附權(quán)利要求中限定。本發(fā)明的其它 特征和優(yōu)點對于技術(shù)人員來說，將通過以下給出的優(yōu)選實施方案的描述而變得顯而易見。
[0036] 附圖簡述
[0037] 圖1示出擬合模型（此處是邏輯回歸模型）的偏差。所示模型是用于肺癌的診斷試 劑盒質(zhì)量（以區(qū)分力(discriminative power)的方式）的量度，并且用于依據(jù)本發(fā)明的實施 方案來比較不同模型。
[0038] 圖2A至圖2C示出根據(jù)本發(fā)明診斷測試模型實施方案的接受者操作特征(ROC)曲線 和曲線下面積(AUC)值(越高越好，最大值=Ih(A)表示最佳25-肽模型(min)，AUC = 0.966， 優(yōu)異的區(qū)分能力；（B) 17-肽模型（I se)，AUC = 0.927，良好的區(qū)分能力；（C) 10-肽模型(AUC< 0.828);較差的區(qū)分能力。
[0039]圖3A至圖3C示出支持向量機(jī)(SVM)分類器分別基于40、30和10種肽(變量)的性能。 每個圖A至C從左到右示出代表性ROC曲線;展示針對癌癥和對照樣品的相對信號值分布的 箱線圖；展示100個建模系列中AUC值分布(均值為~0.83)的箱線圖。
[0040] 優(yōu)選實施方案的詳述
[0041] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及診斷的方法和用途、檢測哺乳動物受試者的血液 和/或血清抗體的方法、用于檢測和/或測量與肺癌發(fā)生相關(guān)的抗體水平的方法、用于評估 受試者患肺癌的概率和/或風(fēng)險的方法。本發(fā)明還涉及用途和試劑盒。
[0042] 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測和/或測量血液和/或血清樣品中抗體 水平的步驟。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測和/或測量哺乳動物受試者的循環(huán) 抗體水平的步驟。所述抗體優(yōu)選地是自身免疫抗體。
[0043] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是離體和/或體外方法。本發(fā)明的方法優(yōu)選地不 直接在人類或動物身體中進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括提供血液樣品的步 驟。優(yōu)選地，例如通過使用例如采血針的毛細(xì)血管采血法來取得血液樣品，例如抽出幾滴血 液。還可通過靜脈血液取樣(靜脈穿刺術(shù))來提供血液樣品。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在先前通 過常規(guī)技術(shù)取自受試者的樣品基礎(chǔ)上進(jìn)行。在一些實施方案中，血液取樣步驟不是本發(fā)明 方法的一部分。
[0044] 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括提供血液或血清樣品的步驟。優(yōu)選 地，血液和/或血清樣品取自哺乳動物受試者。
[0045] 出于本發(fā)明的目的，受試者優(yōu)選地是哺乳動物或人。更優(yōu)選地，受試者是人。根據(jù) 一個實施方案，受試者是具有吸煙史的人。因此，診斷方法優(yōu)選地是針對現(xiàn)在是或一直以來 是吸煙者的人特別設(shè)計的。在優(yōu)選的實施方案中，診斷方法優(yōu)選地是針對具有嚴(yán)重的長期 吸煙史的人特別設(shè)計的。
[0046] 血液樣品中的抗體水平可被例如定量測量和/或半定量測量。在一些實施方案中， 本發(fā)明的方法包括確定與樣品中的抗體和/或循環(huán)抗體的量相關(guān)的參數(shù)的步驟。優(yōu)選地，所 述參數(shù)是與存在于樣品中的抗體量相關(guān)的數(shù)值。所述數(shù)值優(yōu)選地使用合適的讀取和數(shù)據(jù)處 理設(shè)備在自動化過程中產(chǎn)生，如將在本說明書中其它地方所例證。
[0047] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟:a)在取自受試者的血液或血清 樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同肽的循環(huán)血清抗體的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含 人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸序列。與血清抗 體的量相關(guān)的參數(shù)可表示和/或?qū)?yīng)于所述樣品中的抗體水平。
[0048] 本發(fā)明的肽優(yōu)選地是分離的和/或純化的肽。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述肽是重組 肽。根據(jù)一個實施方案，所述肽是合成肽。合成化學(xué)方法(諸如固相肽合成)可用于合成根據(jù) 本發(fā)明的多肽。可借助于蛋白質(zhì)/肽純化領(lǐng)域中的任何已知技術(shù)來進(jìn)行這些肽的純化。示例 性技術(shù)包括離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法和免疫親和法。
[0049] 在本發(fā)明的實施方案中，確定血液樣品中抗體水平的步驟和/或所述步驟a)包括 以下步驟：
[0050] 1)使所述血液或血清樣品與結(jié)合所述不同肽的一個或多個表面和/或固體基質(zhì)接 觸，其中所述接觸是處在足以通過抗原-抗體相互作用將存在于所述樣品中的抗體與不同 肽結(jié)合的條件下；
[0051] 2)移除血液或血清樣品用于將來自表面和/或基質(zhì)的任何未結(jié)合的抗體從一個或 多個表面或固體基質(zhì)移除；
[0052] 3)通過測量與所述表面和/或基質(zhì)結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物水平來確定與循環(huán)血 清抗體的量相關(guān)的所述參數(shù)。
[0053] 表達(dá)"固體基質(zhì)（solid matrix)"和"固體基質(zhì)（solid matrices)"包括適合用于 進(jìn)行免疫測定或根據(jù)本發(fā)明方法的任何固相載體。所述固體基質(zhì)包括珠粒、微粒、納米粒 子、管、織物或板、膜、切片、孔，由玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、硝化纖維素、石英、陶瓷、右旋糖 酐或其它材料形成或涂布。例如，固體基質(zhì)是微量滴定孔的形式，諸如96-孔或312-孔微量 滴定板。在一些實施方案中，"固體基質(zhì)"和/或表面是指碳材料或適合作為例如電化學(xué)發(fā)光 測定中的電極材料的其它材料。
[0054] 例如在本發(fā)明的方法和試劑盒中，可通過吸附或化學(xué)耦合至固相載體來進(jìn)行根據(jù) 本發(fā)明的肽到固體基質(zhì)的固定和/或結(jié)合。可使用本領(lǐng)域中用于將蛋白質(zhì)或肽固定至固體 載體的任何已知方式。根據(jù)本發(fā)明的肽可由諸如通過酰胺或酯鍵的共價結(jié)合或者吸附的技 術(shù)來共價或非共價結(jié)合至固體基質(zhì)。可使用諸如生物素和親和素或抗體和抗原的結(jié)合對來 結(jié)合肽。在肽附著于固體基質(zhì)之后，可用阻斷溶液(含有諸如牛血清白蛋白的阻斷蛋白）來 孵育固體基質(zhì)以減少測試樣品中抗體到載體表面的非特異性吸附。根據(jù)一個實施方案，根 據(jù)本發(fā)明的肽可例如在本發(fā)明試劑盒的固體基質(zhì)上直接合成。
[0055]出于本說明書的目的，表達(dá)"抗原-抗體復(fù)合物"是指通過將樣品中的抗體結(jié)合至 本發(fā)明的肽而形成的復(fù)合物，本發(fā)明的肽優(yōu)選地提供于表面和/或固體載體上。因此，出于 本說明書的目的，"抗原-抗體復(fù)合物"也可被稱為"肽-抗體復(fù)合物"。在所述步驟3)中，保留 在表面和/或基質(zhì)上的抗體優(yōu)選地是形成抗原-抗體復(fù)合物的那些抗體，其中所述肽用作針 對所述抗體的抗原。
[0056]優(yōu)選地通過例如用合適的洗滌緩沖液(諸如I3BS)來洗滌和/或沖洗一個或多個表 面和/或固體基質(zhì)，來進(jìn)行移除所述血液和/或血清樣品的步驟2)。優(yōu)選地，此步驟不破壞可 能已在步驟1)中出現(xiàn)的抗原-抗體。
[0057] 在一個實施方案中，步驟3)包括在步驟1)之后和/或在步驟2)之后向一個或多個 表面或固體基質(zhì)中添加標(biāo)記分子的步驟，所述標(biāo)記與血液或血清樣品的抗體(抗體形成了 與所述表面和/或基質(zhì)結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物)相互作用和/或與之結(jié)合。
[0058] 標(biāo)記分子優(yōu)選地是產(chǎn)生或可被誘導(dǎo)以產(chǎn)生可在信號讀取步驟中被讀取的信號的 實體。通常，標(biāo)記分子與抗體，特別是與抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合或以某種形式相結(jié)合。因 此，標(biāo)記的存在通常表明抗原-抗體復(fù)合物的存在，并且更確切地說，表明對所述肽具有特 異性的抗體的存在。
[0059] 標(biāo)記可包括共價連接至產(chǎn)生信號的化合物或分子(諸如染料等）的抗體或抗體片 段?；蛘?，標(biāo)記可以是可與抗體直接綴合的分子，所述抗體以抗原-抗體復(fù)合物的形式結(jié)合 到表面和/或固體基質(zhì)上。
[0060] 對于技術(shù)人員來說存在許多類型的可用標(biāo)記，諸如例如產(chǎn)生光信號的標(biāo)記（染 料）、產(chǎn)生磁信號的標(biāo)記(例如，磁珠)和產(chǎn)生放射性信號的標(biāo)記(例如，用于放射免疫測定的 放射性標(biāo)記）。
[0061] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法（例如，步驟a))包括產(chǎn)生和/或測量信號的步 驟，所述信號與所述樣品中分別結(jié)合至各肽的抗體的量相關(guān)。在一個實施方案中，所述方法 包括測量信號的步驟，所述信號取決于結(jié)合至所述表面和/或基質(zhì)的抗原-抗體復(fù)合物的存 在和/或數(shù)量。
[0062] 在優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記分子可被誘導(dǎo)以產(chǎn)生可用合適的讀取設(shè)備來讀取的信 號。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括生成和測量信號的步驟，所述信號取決于 結(jié)合至所述表面和/或基質(zhì)的抗原-抗體復(fù)合物的存在和/或數(shù)量和/或受其影響，其中所述 復(fù)合物的數(shù)量影響所述信號的性質(zhì)、強(qiáng)度和/或力度。
[0063] 取決于所使用的標(biāo)記分子，技術(shù)人員將選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ糜谏尚盘?，諸如例如， 在ELISA情況下選擇用于酶的底物，或例如在電化學(xué)發(fā)光的情況下應(yīng)用電力。
[0064] 信號讀取優(yōu)選地使用合適的讀取設(shè)備在自動化過程中進(jìn)行。優(yōu)選地，平板讀數(shù)器 被用于測量所述信號。例如，如果測量光信號，那么讀取設(shè)備可包括光傳感器，例如光電倍 增管和/或照相機(jī)。例如，可使用電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)。
[0065] 讀取設(shè)備通常由信號的測量值直接計算或確定與血液樣品中的抗體量相關(guān)的數(shù) 值參數(shù)。在電化學(xué)發(fā)光檢測（Meso Scale Discovery，USA)的情況下，SECTOR Imager 6000 和2400是可商購獲得的成像檢測系統(tǒng)。此類裝置運行由在測定板上讀取的信號直接計算數(shù) 值的合適的軟件。在ELISA情況下，例如，常規(guī)ELISA平板讀數(shù)器可用于確定與抗體的量相關(guān) 的數(shù)值參數(shù)。
[0066] -般來說，用于進(jìn)行步驟a)和/或用于測量血液樣品中抗體水平的方法包括光學(xué) 檢測方法(例如ELISA)、質(zhì)量變化檢測(例如表面等離子體共振、質(zhì)譜法)和電學(xué)檢測(例如， 阻抗、光譜學(xué)、電化學(xué))技術(shù)。
[0067] 在一個實施方案中，例如通過放射免疫測定、免疫熒光測定或通過酶聯(lián)免疫吸附 測定，以及例如基于抗體對蛋白質(zhì)的免疫測定來以免疫化學(xué)方法確定血液樣品中的抗體水 平。
[0068] 如技術(shù)人員將了解，以單數(shù)形式使用的詞語"肽"包括提及多個同樣的和/或相同 的肽，例如固定在微量滴定板的一個點上的多個相同肽(就序列和/或結(jié)構(gòu)而言）。
[0069] 表達(dá)"不同肽"通常是指具有不同結(jié)構(gòu)和/或氨基酸序列的肽。通常，表達(dá)"不同肽" 更確切地是指若干多個或組的肽（多個的多個），其中每個多個或組的特征在于所述多個 和/或組內(nèi)肽的氨基酸序列和/或結(jié)構(gòu)的本質(zhì)。另一方面，"不同肽"包含在不同的多個和/或 組中，不同之處在于它們所含有的肽具有不同結(jié)構(gòu)和/或不同序列。因此，出于本說明書的 目的，表達(dá)"不同肽"并不旨在意指"具有相同氨基酸序列的不同個體肽分子"。
[0070] 依據(jù)一個實施方案，針對每種肽分別地確定與抗體的量相關(guān)的參數(shù)，以便獲得多 個所述參數(shù)，其中每個單獨參數(shù)與結(jié)合至所述不同肽的一種特定肽的抗體的量相關(guān)。
[0071 ]在一個實施方案中，所述不同肽是不同肽的組合。
[0072] 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，針對所述不同肽中的每個分別地確定抗體的 量。具體地說，針對是本發(fā)明方法、試劑盒和/或測定的一部分的肽中的每個，產(chǎn)生與存在于 樣品中的抗體的量相關(guān)的值和/或參數(shù)。優(yōu)選地，針對不同肽中的每個，確定特異性結(jié)合至 肽的抗體水平。
[0073] 本發(fā)明的方法包括使用多個不同肽并且測量結(jié)合至各不同肽的抗體水平。
[0074] 在一個實施方案中，所述肽被提供在微量滴定板的一個或多個孔中。優(yōu)選地，在本 發(fā)明的方法中，將所述受試者的樣品添加到所述一個或多個孔。在一個實施方案中，每個孔 包括幾個區(qū)域，并且其中每個區(qū)域包括所述不同肽的組合中選擇的多個特定的、限定的肽。 [0075]在一個實施方案中，所述不同肽的所有肽獨立地具有4至300、優(yōu)選8至250個氨基 酸的長度。在優(yōu)選實施方案中，所述肽具有8至200、更優(yōu)選8至150、甚至更優(yōu)選8至100并且 最優(yōu)選8至50個氨基酸的長度。
[0076]在一些實施方案中，肽是例如約6至30個氨基酸長度的短片段，并且在其它實施方 案中，肽是具有例如100-300、優(yōu)選130-260個氨基酸長度的較長片段。在一些實施方案中， 用于本發(fā)明方法和試劑盒的肽包括較短和較長片段和長度介于以上范圍之間的可能片段， 例如30-100個氨基酸。
[0077] 在一個實施方案中，所述不同肽由5至35、優(yōu)選11至30,并且最優(yōu)選17至28種不同 肽組成。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述不同肽包括十一 (11)種或更多種不同肽。
[0078]在優(yōu)選的實施方案中，所述不同肽選自四十一種肽的組，其中所述四十一種肽的 組中的每種肽分別包含和/或基本上由包括SEQ ID NO: 1至41的組的四^^一種氨基酸序列 中的一種組成。優(yōu)選地，所述不同肽是不同肽的組合，其中所述組合分別由41種不同肽形 成，其中每種肽包含和/或基本上由包括SEQ ID NO: 1至41的組的四^^一種氨基酸序列中的 一種組成。
[0079] 出于本說明書的目的，表達(dá)"基本上由……組成"是指至少85%、優(yōu)選至少90%、甚 至更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選97%或更高的序列同一性。例如，"基本上由……組成"是指 98%、99%并且最優(yōu)選99.5%的序列同一性。出于本說明書的目的，通過使用因特網(wǎng) (http://blast .ncbi .nlm.nih.gov)上的基本蛋白blast與預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)和數(shù)據(jù)庫選擇來 確定序列同一性百分比。這種序列比較工具基于以下兩個出版物中詳述的算法= Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller ^David J.Lipman( 1997)/'Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs",Nucleic Acids Res·25:3389_3402〇Stephen F.Altschul，John C.Wootton,E.MichaeI Gertz,Richa Agarwala,Aleksandr Morgulis, Alejandro A.Schaifer，fPYi_Kuo Yu(2005)//Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices"，F(xiàn)EBS J.272:5101-5109〇
[0080] 標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)包括blastp選擇(蛋白-蛋白BLAST、針對短輸入序列的參數(shù)自動調(diào)節(jié);期 望閾值10、字號3、矩陣BL0SUM62的使用；空位罰分:存在空位：11，空位延伸：1;條件合成得 分矩陣調(diào)整（conditional compositional score matrix adjustment)，無過濾器并且無 掩蔽）。例如當(dāng)比較序列或原始序列中的任一個缺乏氨基酸殘基、具有另外的氨基酸殘基 和/或具有由另一個殘基取代的一個或多個氨基酸殘基時，比較序列相對于原始序列的序 列同一性減小。與如本文所定義的任何序列具有低至80%序列同一性的序列仍可提供功能 性，即，適合作為本發(fā)明試劑盒和方法中的肽。
[0081] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及選擇可用于本發(fā)明方法，特別是用于診斷肺癌的 肽。在一些實施方案中，依據(jù)本發(fā)明建立不同的肽組，其中所述不同肽可選自這些肽組中的 一個或多個。優(yōu)選地，將所述肽分成五(5)個組，它們是A-E組。
[0082]因此，在一個實施方案中，所述不同肽包括幾個肽組:A肽組、B肽組、C肽組、D肽組 以及E肽組。
[0083]在一個實施方案中，所述A組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨 基酸序列組成的肽：SEQ ID N0:1(#286);SEQ ID N0:2(#720);SEQ ID N0:3(#493);SEQ ID N0：4(#68/524)；SEQ ID NO：5(#140)；SEQ ID N0：6(#139)；SEQ ID NO：7(#349)；SEQ ID N0:8(#117);SEQ ID N0:9(#5);以及 SEQ ID N0:10(#-4)。
[0084] 在一個實施方案中，所述B組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨 基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID N0:11(#16);SEQ ID N0:12(#453);和SEQ ID NO: 13(EX4..2)、SEQ ID N0:14(BRCT.2.)、SEQ ID N0:15(#15)、SEQ ID N0:16(#523);以及 SEQ ID N0：17(#109)〇
[0085] 在一個實施方案中，所述C組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨 基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID N0:18(#117/635);SEQ ID N0:19(#368);SEQ ID N0:20(BRCT.1.)、SEQ ID N0:21(EX4..1);SEQ ID N0:22(#188)、SEQ ID N0:23(LINK)、SEQ ID N0:24(#A21/635);以及SEQ ID N0:25(RING)。
[0086] 在一個實施方案中，所述D組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨 基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID N0:26(Ank);和SEQ ID N0:27(#A20/122)、SEQ ID N0:28(#54);SEQ ID N0:29(#48/522)和SEQ ID N0:30(#149);SEQ ID N0:31(#73);SEQ ID N0:32(#A-4);SEQ ID N0:33(#30RF);以及SEQ ID N0:34(#557)。
[0087] 在一個實施方案中，所述E組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨 基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID N0:35(#319)、SEQ ID N0:36(#702);SEQ ID N0:37 (#175);SEQ ID N0:38(#84);SEQ ID N0:39(#A29)SEQ ID N0:40(#542)以及SEQ ID N0:41 (#309)。
[0088] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的一種或多種肽以及選自所述 B、C、D和/或E組中的所述任何一組的一種或多種肽。
[0089] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的一種或多種肽、選自所述B組 的一種或多種肽，以及選自所述C、D和/或E組的一種或多種肽。
[0090] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的一種或多種肽、選自所述B組 的一種或多種肽、選自所述C組的一種或多種肽，以及選自所述D和/或E組的一種或多種肽。
[0091] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的三種或更多種肽，以及選自所 述B、C、D和/或E組中的所述任何一組的三種或更多種肽。
[0092] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的三種或更多種肽、選自所述B 組的兩種或更多種肽，以及選自所述C、D和/或E組的兩種或更多種肽。
[0093] 在一個實施方案中，所述不同肽包括選自所述A組的三種或更多種肽、選自所述B 組的兩種或更多種肽、選自所述C組的兩種或更多種肽，以及選自所述D和/或E組的兩種或 更多種肽。
[0094] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合包括選自所述A組的五種或更多種肽;選自 B組的兩種或更多種肽，以及選自C組的兩種或更多種肽。
[0095] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合缺乏來自E組的任何肽。
[0096]在一個實施方案中，所述不同肽包括包含選自SEQ ID NO: 1-5的氨基酸序列的兩 種或更多種肽;選自肽SEQ ID N0:ll-13的一種或多種肽；和選自SEQ ID N0:18-20的一種 或多種肽。
[0097]在一個實施方案中，所述不同肽包括包含選自SEQ ID NO: 1-5的氨基酸序列的三 種或更多種肽;選自肽SEQ ID N0:ll-13的兩種或更多種肽;和選自SEQ ID N0:18-20的兩 種或更多種肽。
[0098]在一個實施方案中，所述不同肽包括包含選自SEQ ID NO: 1-5的氨基酸序列的四 種或更多種肽；選自肽SEQ ID N0:ll-13的三種或更多種肽；和選自SEQ ID N0:18-20的三 種或更多種肽。
[0099] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合包括十一（11)種或更多種不同肽，其中所 述肽分別包含SEQ ID NO 1-5; 11-13和18-20的氨基酸序列。
[0100] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合包括至少10種不同肽，其中所述10種肽中 的每個分別包含或基本上由選自由SEQ ID NO: 1至10組成的組的一種氨基酸序列組成。
[0101] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合包括至少17種不同肽，其中所述17種肽中 的每個分別包含或基本上由選自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17組成的組的一種氨基酸序 列組成。
[0102] 在一個實施方案中，所述不同肽的組合包括至少25種不同肽，其中所述25種肽中 的每個分別包含或基本上由選自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:25組成的組的一種氨基酸序 列組成。
[0103] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是一種用于診斷人類女性受試者中肺癌的方 法。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法是一種用于診斷人類男性受試者中肺癌的方法。
[0104] 如果所述方法特別針對人類女性受試者，那么不同肽優(yōu)選地包括十九（19)種不同 肽，其中所述不同肽分別包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:6;SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO:14;SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:30。
[0105] 如果所述方法特別針對人類男性受試者，那么不同肽優(yōu)選地包括二十二(22)種不 同肽，其中所述不同肽分別包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:5;SEQ ID NO:7;SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:11至SEQ ID N0:13;SEQ ID N0:15;SEQ ID N0:18至SEQ ID N0:20; SEQ ID N0:22;SEQ ID N0:23;SEQ ID N0:26;SEQ ID N0:27;以及SEQ ID N0:31 至SEQ ID NO:34。
[0106] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括診斷所述受試者是否患有肺癌的步驟。優(yōu) 選地在所述血清和/或血液樣品中的抗體水平的基礎(chǔ)上，和/或在與循環(huán)血清抗體的量相關(guān) 的參數(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行所述診斷。
[0107] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在所述參數(shù)和/或所述信號的基礎(chǔ)上并且 由對每種肽具有特異性的統(tǒng)計學(xué)上確定的系數(shù)來計算受試者的測試值的步驟。本發(fā)明的方 法可包括通過將所述測試值與閾值相比較來診斷所述受試者是否患有肺癌的步驟。
[0108] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過將所述測試值與一個或多個閾值相 比較來評估受試者患肺癌的概率和/或風(fēng)險的步驟。
[0109] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過將所述測試值與一個或多個閾值相 比較來提高肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、預(yù)后、預(yù)測和復(fù)發(fā)的臨床效率的步驟。于是，所述篩查、監(jiān) 測、診斷、預(yù)后、預(yù)測的結(jié)果(result)或結(jié)果(outcome)取決于測試值是高于還是低于閾值。 例如，超過閾值的測試值通常指示和/或提高診斷、預(yù)測和/或預(yù)后受試者患肺癌的臨床效 率。
[0110] 優(yōu)選地以統(tǒng)計學(xué)方法確定每種肽的系數(shù)。在一個實施方案中，使用"Lasso模型"來 確定每種肽的系數(shù)，所述模型公開于:Ribbing J，Nyberg J，Caster 0和Jonsson EN(2007) The lass〇-a novel method for predictive covariate model building in nonlinear mixed effects models?！?Pharmacokinet Pharmacodyn 34:485-517。優(yōu)選肽的特定系數(shù) 在下文實施例中公開。
[0111] 優(yōu)選地將抗體的水平和/或與各抗體的量相關(guān)的參數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)值。在針對測定的 每種肽的系數(shù)和針對每種肽分別確定的數(shù)值的基礎(chǔ)上來確定對給定受試者具有特異性的 測試值。
[0112] 通過將受試者的測試值與預(yù)定閾值相比較來完成診斷步驟。優(yōu)選地還使用例如 lasso模型來以統(tǒng)計學(xué)方法確定閾值。具體地說，可通過使用來自已知是否患有肺癌的多個 個體的血液和/或血清樣品來以統(tǒng)計學(xué)方法確定閾值。為了確定閾值，優(yōu)選地考慮用于測量 血液和/或血清樣品中抗體水平的方法。
[0113] 在一些方面，本發(fā)明涉及一種測試試劑盒。表達(dá)"試劑盒"包括如本文所述的待耦 合或已經(jīng)耦合至固體基質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的至少一種肽或其變體或其組合，和任選的說明性 材料。優(yōu)選地，試劑盒包括不同肽沉積和/或固定在其上的固體載體表面。例如，所述表面提 供于板、膜、切片和/或孔上。優(yōu)選地，用于試劑盒中所用的肽的載體適于執(zhí)行抗體結(jié)合測 定。具體地說，載體適于例如共價地結(jié)合肽，并且適于暴露于血液和/或血清樣品。優(yōu)選地， 試劑盒的載體表面和/或基質(zhì)優(yōu)選地適于被洗滌以用于移除未結(jié)合的抗體并且適于暴露于 標(biāo)記。包含肽的載體和/或基質(zhì)優(yōu)選地適于被合適的裝置讀取以用于檢測和測量通過非共 價相互作用形成的肽-抗體復(fù)合物的水平和/或量。
[0114] 試劑盒的肽優(yōu)選地與用于本發(fā)明方法的那些肽是一樣的。因此，特別是關(guān)于本發(fā) 明方法的實施方案和在本說明書其它地方限定的優(yōu)選實施方案也適用于本發(fā)明的試劑盒。 這尤其適用于選擇所使用的肽，但也適用于一般肽特征，諸如大小和數(shù)目。
[0115] 在一個實施方案中，試劑盒是用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的試劑盒。
[0116] 在一個實施方案中，本發(fā)明的測試試劑盒包括包含多個孔的微量滴定板，其中每 個孔包括多個區(qū)域，并且其中多個一種特定肽提供于所述孔的特定區(qū)域中，使得每個區(qū)域 是特定肽所特有的。例如，本發(fā)明的試劑盒包括多點和/或多陣列板，諸如從美國的Meso Scale Discovery公司可商購獲得的那些。例如，板的每個孔可包括若干點，其中每個點是 由或可由肽涂布。 實施例
[0117] 實施例1:肽的選擇與合成
[0118] 根據(jù)關(guān)于MRDl同工型（SEQ ID N0:42-51)表達(dá)的研究來限定和選擇包含SEQ ID NO: 1至41的四十一種不同肽。這些實驗涉及一個同工型基于SiRNA的特異性抑制和蛋白質(zhì) 印跡中潛在翻譯產(chǎn)物的抑制的確認(rèn)，以及所述同工型的過表達(dá)和正確大小的內(nèi)源性蛋白的 表達(dá)的確認(rèn)。
[0119] 例如關(guān)于同工型γ (SEQ ID N0:47)的研究確認(rèn)，這種同工型表達(dá)在外顯子1至3中 編碼的蛋白（由于外顯子5中的終止密碼子，外顯子4和外顯子5-11的缺失不表達(dá)）。基于這 些研究，限定四十一種肽（SEQ ID NO: 1至41)
[0120]通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)肽固相合成程序來合成SEQ ID NO: 1至41的四十 一種不同肽。肽的純度為至少80%。將肽溶解于在緩沖液中l(wèi)mg/mL的儲備溶液中并且按 200mL的等分試樣在-20°C儲存。將肽儲存在pH 9.6的碳酸鹽緩沖液中。
[0121] SEQ ID NO: 1至41中的大部分肽是8至約30個氨基酸長度的短片段。較長片段是 SEQ ID N0:13(EX4..2)、SEQ ID N0:14(BRCT.2.)、SEQ ID N0:20(BRCT.1.)、SEQ ID N0:21 (EX4..1)、SEQ ID N0:23(LINK)、SEQ ID N0:26(Ank)。
[0122] 實施例2:使用肽的測定的準(zhǔn)備
[0123] 使用Meso Scale MSD技術(shù)平臺（Mesoscale，MD 20850_3173，Rockeville，USA)將 實施例1的41種肽沉積到微量滴定孔中。具體地說，以確定的量將每種肽沉積到多點板的點 中。每個多點陣列包括肽沉積于其上的碳涂層工作電極。為了檢測抗體結(jié)合，電刺激通過帶 磺基標(biāo)簽的標(biāo)記分子(釕II三聯(lián)吡啶-(4-甲基磺酸鹽)NSH酯而產(chǎn)生光。通過Mesoscale執(zhí)行 肽的涂鋪。每個孔含有10個不同點，使得10種不同肽涂鋪于96-孔微量滴定板的一個孔中。
[0124] 實施例3:分析患者和對照受試者的血液樣品
[0125] 從肺(n= 178)、結(jié)腸(n = 80)、良性乳腺(n = 9)、惡性乳腺(η= 14)、良性卵巢(η = 50)、惡性卵巢(η = 43)以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤(η = 20)人類癌癥患者和健康對照者(η = 266)收 集血液樣品。大多數(shù)受試者的性別和年齡是已知的。
[0126] 使用實施例2中所述的肽涂布微量滴定板來分析血液樣品。使用Meso Scale SECTOR Imager 2400(SI2400)裝置和Discovery Workbench 3.0軟件，產(chǎn)生與血液樣品中 的抗體量相關(guān)的數(shù)值。
[0127] 數(shù)據(jù)分析表明，并不是所有患者的血清均包含針對BARDl相同表位的抗體，而是存 在癌癥患者中呈陽性的不同表位/肽組合的廣泛分布。從這些結(jié)果來確定最獨特和最不獨 特的肽。
[0128] 為了證實抗體特異性地與呈現(xiàn)在MRDl同工型上的肽反應(yīng)，以與較短肽片段相同 的方式來點樣較長片段。血清抗體與較長片段的反應(yīng)性確認(rèn)了關(guān)于肽所觀察到的結(jié)果。
[0129] 發(fā)現(xiàn)，短肽和BARD同工型較長片段的組合允許檢測出更多癌癥患者。
[0130] 實施例4:統(tǒng)計分析和模型建立
[0131]用統(tǒng)計學(xué)方法分析在實施例3中獲得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集由至少一組變量已被測量的 379個獨特樣品組成。對于一些樣品，進(jìn)行2或3次獨立測量并且取平均值。變量是在使血液 樣品暴露于40種肽中的一種時由測量的信號獲得的數(shù)值。換句話說，變量是與樣品中特異 性結(jié)合至肽中的一種的抗體的量相關(guān)的值?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)集含有40個變量的測量值，將這 些測量值分成各有10個變量的四個子集(10種不同肽在一個孔中被涂鋪成10個不同點）。每 個板含有來自一個此類子集的肽的測量值，并且已分析四個板的每個子集。當(dāng)被分析時，這 些板將通過日期被提及。對于一些樣品，僅測量一個變量子集，而對于其它樣品，測量幾個 子集。在不同板上，還有一些樣品的相同變量被測量若干次。大多數(shù)所研究樣品的有關(guān)性別 和年齡的信息是可得的。癌癥樣品更詳細(xì)的診斷信息也被提供。
[0132] 以下給出關(guān)注于測試系統(tǒng)在區(qū)分對照(健康)血液血清樣品與肺癌血液血清樣品 中的預(yù)測能力的分析結(jié)果概述。討論方法學(xué)與分析結(jié)果的差異。
[0133] 最近"Lasso"法用于使用不同肽選擇來建立模型并且然后比較這些模型的預(yù)測能 力（圖1)。當(dāng)分析小數(shù)據(jù)集逐步協(xié)變量建模過程（stepwise covariate modeling procedure(SCM))時可能產(chǎn)生具有選擇偏差和差預(yù)測性能的協(xié)變量模型。與SCM相比，lasso 在小數(shù)據(jù)集或小子組中獲得預(yù)測協(xié)變量模型的方面優(yōu)于SCM(Ribbing J，Nyberg J，Caster O^PJonsson EN(2007)The lass〇-a novel method for predictive covariate model building in nonlinear mixed effects models.J Pharmacokinet Pharmacodyn 34: 485-517)。使用交叉驗證，lasso提供協(xié)變量模型的驗證并且不需要使用者指定用于選擇的 P值。這種方法允許獲得寡肽和MRDl片段的最佳組合以用于區(qū)分癌癥與對照樣品。這最終 導(dǎo)致選擇允許區(qū)別癌癥與對照樣品的最好的肽組合。所述圖還表明，超過最佳的增加的肽 數(shù)目不產(chǎn)生更強(qiáng)的預(yù)測能力。使用最佳25個變量(短肽和較長片段)對90個肺癌樣品進(jìn)行的 建模相對94個對照樣品進(jìn)行的建模產(chǎn)生AUC = O. 966。
[0134] Lasso模型建立和特征選擇是使用R-package :glmnet進(jìn)行交叉驗證的。已使用25 (SEQIDN0:l-25)、17(SEQIDN0:l-17)或10(SEQIDN0 :l-10)種肽建立了三個模型。
[0135] 圖1示出擬合模型的二項式偏差。用于所述模型的肽的數(shù)目在頂部示出。最好的交 叉驗證模型是此曲線的最小值(第一條垂直虛線）（26種肽）。第二條虛線是其中模型關(guān)于對 模型的交叉驗證(在這種情況下，有11種肽)沒有明顯不同的值(標(biāo)準(zhǔn)誤差I(lǐng)(Ise)內(nèi)，顯示為 誤差棒）。因此，具有17種肽的模型是統(tǒng)計學(xué)上有意義的，但具有10種肽的模型沒有統(tǒng)計學(xué) 意義。
[0136] 使用25個變量(較短肽和較長片段）（SEQ IF NO: 1-25)對90個肺癌樣品進(jìn)行的建 模相對94個對照樣品進(jìn)行的建模產(chǎn)生AUC = O. 966(圖2A)。用于建模的這些樣品選自上述的 全部379個可得樣品。進(jìn)行所述建模的目的還在于找出足以區(qū)分癌癥與對照的最小肽集合， 其中p>0.05。對于圖2B中示出的AOC曲線，使用具有17種肽(SEQ IF NO: 1-17)的模型，并且 對于圖3C，使用具有10種肽(SEQ IF NO: 1-10)的模型。
[0137] 為了區(qū)分對照受試者與癌癥患者，使用Lasso法來建立協(xié)變量模型建立。結(jié)果在圖 3A至3C中示出，在100個建模系列（建模重復(fù)100次）中，在圖A、B和C中分別使用40、30和10種 肽。每個圖A至C從左到右示出代表性ROC曲線;展示癌癥和對照樣品的相對信號值分布的箱 線圖；展示100個建模系列中AUC值分布(AUC均值為~0.83)的箱線圖。
[0138] 實施例5:具有25種肽的模型的肽系數(shù)和截斷值
[0139] 此實施例說明，預(yù)測因子值的計算是基于歸因于如以下表1所示的每種肽的系數(shù)。
[0140] 預(yù)測因子=1.878155義1(^10(#16值）-49.10811(^10(#117值）-16.4289叉1〇810 (#286值）+24.1176711(^10(#493值）-3.74674叉1(^10(#523值）+39.8918111(^10(#720 值）+3.49733叉1(^10(#117/635值）-3.21744叉1(^10(#5值）-13.1504叉1(^10(#349值）-19·78χ logl0(#453值）+10.3537x loglO(A21/635值）+27.37549x logl0(#68/524值）-12·5612χ logl0(#15值）-7·82582χ logl0(#109值）+15·05732χ logl0(#139值）+11·3804χ logl0(#140值）+4·024697χ logl0(#188值）-8·8073χ logl0(#368值）+0·246625χ IoglO (RING值）-0·23952χ loglO(EX4.1值）-5·00989χ loglO(EX4.2值）-0·17352χ loglO(LINK 值）+0·726563χ loglO(BRCTl值）+1·645815χ loglO(BRCT2值）+3·05931χ logl0(#-4值）-15.0948
[0141] 所述值，例如"#16值"對應(yīng)于通過Meso Scale SECTOR Imager確定的參數(shù)的數(shù)值。 通過將數(shù)值插入以上"預(yù)測因子"公式，獲得與截斷值和/或閾值相比較的預(yù)測因子值。
[0142] 表1:25種肽的模型 - 25種肽的模型 肽鑒定(SEQ 肽鑒定(內(nèi)部） 系數(shù) ID NO)___ (截距) -15.0948 22 #16 .1,878155 8 #117 -49.108 1 #286 -16.4289 3 #493 24.11767 16 #523 -3.74674 2 #720 39.89181 18 #117/635 3.49733 9 #5 -3.2.1744 7 #349 -13.1504
[0143] 12 #453 -19.78 24 UMims 103537 4 #68/524 27.37549 15 #15 -12.5612 17 #109 -7.82582 6 #139 15.05732 5 #140 11.3804 22 #188 4.024697 19 #368 -8J073 25 RING 0.246625 21 EX4..1. -0.23952 13 EX4..2. -5.00989 23 LINK -0.17352 20 BRCT.l. 0.726563 14 BRCT.2. 1.645815 10 #-4 I 3,05931
[0144] 各種截斷值被估算并且可能用于區(qū)別陽性或陰性。各截斷值的選擇影響模型的特 異性和/或靈敏性。對于最大特異性和靈敏性，截斷值= 0.08131021。
[0145] 截斷值表示針對診斷測試結(jié)果的閾值。如果計算預(yù)測因子>0.08131021，那么受 試者被診斷為患有癌癥（陽性測試結(jié)果）。如果計算預(yù)測因子<0.08131021，那么測試結(jié)果 是陰性。
[0146] 實施例6:用于在女性中區(qū)分肺癌對比健康的模型
[0147] 使用在實施例4中所描述的Lasso法，開發(fā)用于特異性地診斷女性中肺癌的模型。 對于這種模型，發(fā)現(xiàn)需要19種肽以獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著并且產(chǎn)生優(yōu)異AUC值的模型。這19種不 同肽是具有以下序列的肽：SEQ ID N0:1 至SEQ ID N0:6;SEQ ID N0:11 至SEQ ID N0:14; SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:30。
[0148] 實施例7:用于在男性中區(qū)分肺癌對比健康的模型
[0149] 使用在實施例4中所描述的Lasso法，開發(fā)用于特異性地診斷男性中肺癌的模型。 對于這種模型，發(fā)現(xiàn)需要22種肽以獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著并且產(chǎn)生優(yōu)異AUC值的模型。這22種不 同肽是具有以下序列的肽：SEQ ID N0:1 至SEQ ID N0:5;SEQ ID N0:7;SEQ ID N0:8;SEQ IDN0:11至SEQIDN0:13;SEQIDN0 :15;SEQIDN0:18至SEQIDN0:20 ;SEQIDN0:22; SEQ ID NO:23;SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:27;以及SEQ ID NO:31 至SEQ ID NO:34。
[0150]
[0151] 我們已分析了 178個肺癌樣品和266個對照樣品。數(shù)據(jù)集由至少一組變量(肽或多 肽)已被測量的379個獨特樣品組成。總的來說，數(shù)據(jù)集含有40個變量的測量值，將這些測量 值分成各有10個變量的四個子集。
[0152] 從40種肽的原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行使用"Lasso"法的獨立分析來以統(tǒng)計學(xué)方法評估不同 肽選擇。發(fā)現(xiàn)，例如針對肺癌診斷，使用20種選定的肽獲得>95%的預(yù)測性能(0.97R0C)。
[0153] 這是高度結(jié)論性的結(jié)果，其給出了足以實現(xiàn)無癥狀個體中肺癌的預(yù)測至診斷水平 的準(zhǔn)確性（>95%)的所有指示。這尤其適用于具有嚴(yán)重的長期吸煙史的個體。
【主權(quán)項】
1. 一種用于診斷哺乳動物受試者中肺癌的體外和/或離體方法，所述方法包括以下步 驟： a) 在取自所述受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同肽的抗體的量 相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51) 的一段氨基酸序列； b) 在前一步驟獲得的所述參數(shù)的基礎(chǔ)上，診斷所述受試者是否患有肺癌。2. -種用于評估受試者患肺癌的概率和/或風(fēng)險的方法，所述方法包括以下步驟： a) 在取自所述受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同肽的抗體的量 相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51) 的一段氨基酸序列； b) 由在步驟a)中測量的所述參數(shù)評估所述受試者患肺癌的概率和/或風(fēng)險。3. 不同肽的組合在用于肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、預(yù)后、預(yù)測、復(fù)發(fā)的體外和/或離體方法 中，和/或在用于提高肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、預(yù)后、預(yù)測和復(fù)發(fā)的臨床效率的方法中的用途， 所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一段氨基酸 序列。4. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中針對每種肽分別地確定與抗體的量相關(guān) 的參數(shù)，以便獲得多個所述參數(shù)，其中每個單獨參數(shù)與結(jié)合至所述不同肽的一種特定肽的 抗體的量相關(guān)。5. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽是不同肽的組合。6. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟b)包括在所述參數(shù)基礎(chǔ)上并且由對 每種肽具有特異性的統(tǒng)計學(xué)上確定的系數(shù)來計算所述受試者的測試值的步驟。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其還包括通過將所述測試值與閾值相比較來診斷所述受 試者是否患有肺癌的步驟。8. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述肽獨立地具有4至300、優(yōu)選8至250 個氨基酸的長度。9. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽由5至35、優(yōu)選11至30,并且 最優(yōu)選17至28種不同肽組成。10. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中不同肽的組合選自四十一種肽的組，其 中所述四十一種肽的組中的每種肽分別包含和/或基本上由包括SEQ ID ΝΟ:1至41的組的 四十一種氨基酸序列中的一種組成。11. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽包括幾個肽組:A肽組、B肽 組、C肽組、D肽組以及E肽組。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述A組包括包含或基本上由選自由以下各項組成 的組的氨基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID NO:l(#286);SEQ ID N0:2(#720);SEQ ID NO：3(#493)；SEQ ID NO：4(#68/524)；SEQ ID NO：5(#140)；SEQ ID N0：6(#139)；SEQ ID N0:7(#349);以及SEQ ID N0:8(#117);SEQ ID N0:9(#5);和SEQ ID N0:10(#-4)，所述B組 包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨基酸序列組成的一種或多種肽:SEQ ID N0:11(#16);SEQ ID N0:12(#453);SEQ ID N0:13(EX4..2);SEQ ID N0:14(#BRCT2.2)以及 SEQ ID N0:15(#15);SEQ ID N0:16(#523);和SEQ ID N0:17(#109)，所述C組包括包含或基 本上由選自由以下各項組成的組的氨基酸序列組成的一種或多種肽:SEQ ID N0:18(#117/ 635)；SEQ ID NO：19(#368)；SEQ ID NO：20(BRCT.1.)；SEQ ID NO：21(EX4..1)；SEQ ID NO： 22(#188)以及SEQ ID N0:23(LINK);SEQ ID N0:24(#A21/635);和SEQ ID N0:25(RING)，所 述D組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組的氨基酸序列組成的一種或多種肽： SEQ ID N0：26(Ank)；SEQ ID N0：27(#A20/122)；SEQ ID NO：28(#54)；SEQ ID N0：29(#48/ 522)以及SEQ ID N0:30(#149);SEQ ID N0:31(#73);SEQ ID N0:32(#A-4);SEQ ID N0:33 (#30RF)以及SEQ ID N0:34(#557)，所述E組包括包含或基本上由選自由以下各項組成的組 的氨基酸序列組成的一種或多種肽：SEQ ID N0:35(#319);SEQ ID N0:36(#702);SEQ ID N0:37(#175);SEQ ID N0:38(#84);SEQ ID N0:39(#A29)SEQ ID N0:40(#542)以及SEQ ID N0:41(#309)，所述肽組合包括選自所述A組的一種或多種肽，和選自所述B、C、D和/或E組中 所述任一組的一種或多種肽。13. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽包括選自所述A組的五種或 更多種肽;選自B組的兩種或更多種肽，以及選自C組的兩種或更多種肽。14. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽包括至少10種不同肽，其中 所述10種不同肽中的每種分別包含或基本上由選自由SEQ ID N0:1至10組成的組的一種氨 基酸序列組成。15. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述不同肽包括包含選自由SEQ ID: ΙΑ; 11-13; 18-2 組成的組的氨基酸序列的肽。16. -種用于診斷女性人類受試者中肺癌的體外和/或離體方法，所述方法包括以下步 驟： -在取自所述女性受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合至少19種不同 肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，其中所述肽是分別包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 6;SEQIDN0:11至SEQIDN0:14 ;SEQIDN0:18至SEQIDN0:21;SEQIDN0 :26至SEQID NO :30的肽； -在前一步驟獲得的所述參數(shù)的基礎(chǔ)上，診斷所述女性受試者是否患有肺癌。17. -種用于診斷男性人類受試者中肺癌的體外和/或離體方法，所述方法包括以下步 驟： -在取自所述女性受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合至少22種不同 肽的抗體的量相關(guān)的參數(shù)，其中所述肽是分別包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 5;SEQ ID N0:7;SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:11至SEQ ID N0:13;SEQ ID N0:15;SEQ ID NO: 18至SEQ ID NO:20;SEQ ID NO:22;SEQ ID NO:23;SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:27;以及SEQ ID NO :31.至SEQ ID NO :34的肽； -在前一步驟獲得的所述參數(shù)的基礎(chǔ)上，診斷所述男性受試者是否患有肺癌。18. -種用于診斷肺癌的診斷測試試劑盒，其中所述診斷測試試劑盒包括至少11種不 同肽的組合，每種肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51)的一 段氨基酸序列。19. 一種用于提高肺癌篩查、監(jiān)測、診斷、預(yù)后、預(yù)測和復(fù)發(fā)的臨床效率的方法，所述方 法包括： a)在取自所述受試者的血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同肽的抗體的量 相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID N0:42)和/或其同工型（SEQ ID N0:43-51) 的一段氨基酸序列； b)在前一步驟獲得的所述參數(shù)的基礎(chǔ)上，確定所述受試者是否處于患肺癌的增加的風(fēng) 險和/或可能性之中。20.-種檢測和/或測量與肺癌發(fā)生相關(guān)的抗體水平的體外和/或離體方法，所述方法 包括以下步驟： a)在取自所述受試者的所述血液或血清樣品基礎(chǔ)上，確定與特異性結(jié)合不同肽的抗體 的量相關(guān)的參數(shù)，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO:42)和/或其同工型（SEQ ID NO:43-51)的一段氨基酸序列。
【文檔編號】C07K7/04GK106062562SQ201480071075
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年11月5日
【發(fā)明人】伊姆加德·艾爾明格-芬格, 馬克西姆·皮柳金, 皮埃爾-阿拉因·安德烈
【申請人】巴德1股份公司