一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯熒光納米材料、NaYF4:Yb,Tm納米顆?；騈aGd(WO4)2：Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。本發(fā)明的試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性高、安全性好、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，在便攜式熒光讀數(shù)儀下可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)，能滿足不同層次人員的需要。
【專利說(shuō)明】
-種檢測(cè)玉米赤霉稀酬的黃光免疫層析試紙
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種免疫層析試紙，特別是設(shè)及一種檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層 析試紙。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉締酬(Zearalenone，稱ZEN)又稱F-2毒素，主要是由粉紅鑲刀菌及禾谷鑲 刀菌產(chǎn)生的一種非醬體霉菌毒素。廣泛存在于霉變的玉米、高梁、小麥、燕麥、大麥等谷類作 物W及奶中，是世界上污染范圍最廣的一種鑲刀菌毒素，全國(guó)的飼料原料及飼料中ZEN檢出 率高達(dá)100% dZEN是一種特殊毒性的生物毒素，具有類雌激素樣作用，能引起動(dòng)物流產(chǎn)、死 胎、返情等生殖機(jī)能異常，還可W導(dǎo)致生長(zhǎng)下降、免疫抑制、不育、崎形等，ZEN還可通過(guò)食物 鏈在人體中造成蓄積，進(jìn)而每年給食品工業(yè)、飼料產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給 人類健康造成極大的危害，因此針對(duì)ZEN開展有效的快速檢測(cè)很有意義。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 13078規(guī)定，在飼料及玉米中ZEN最高殘留限量《50化g/kg，目前用于ZEN的檢測(cè)方法主要有 生物鑒定法、化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫分析法4大類。生物鑒定法的優(yōu)點(diǎn)是待檢樣品 不需很純，缺點(diǎn)是靈敏度低、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)?；瘜W(xué)分析法的有點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但不能準(zhǔn)確定 量，且分析結(jié)果的可重復(fù)性和再現(xiàn)性差。儀器分析法具有高分離、高檢測(cè)效能及快速分析能 力等優(yōu)勢(shì)，但對(duì)樣品的前處理要求高，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，且儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，不適 于快速檢測(cè)。免疫分析法操作簡(jiǎn)單，成本低，而且具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏性，同時(shí)能進(jìn)行 定性和半定量或一定定量的檢測(cè)，適合于對(duì)大量樣品的篩查，是目前優(yōu)先發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)。
[0003] 未修飾的氧化石墨締表現(xiàn)出很弱的巧光，在紫外光照射下用肉眼基本上觀察不到 巧光。運(yùn)是由于氧化石墨締納米片表面有很多含氧基團(tuán)，例如納米片表面上的環(huán)氧鍵和徑 基，納米片側(cè)面的簇基，運(yùn)些基團(tuán)通常能誘導(dǎo)電子-空穴對(duì)的非福射復(fù)合，從而導(dǎo)致氧化石 墨締的巧光很弱。經(jīng)過(guò)正下胺修飾W后，氧化石墨締納米片表面的環(huán)氧鍵和簇基都被反應(yīng) 掉，運(yùn)將極大地降低其非福射復(fù)合能力。因此修飾后，氧化石墨締表現(xiàn)出很強(qiáng)的巧光可作為 新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。雖然膠體金試紙?jiān)诖朔矫鎽?yīng)用較廣，但其不能做到定量 檢測(cè)，作為更敏感、穩(wěn)定、靈活、安全的氧化石墨締巧光層析試紙的研究，是膠體金免疫檢測(cè) 技術(shù)的有力補(bǔ)充。
[0004] 上轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒經(jīng)過(guò)表面修飾與活化后，作為新型標(biāo)記物在生物檢測(cè)等領(lǐng)域 進(jìn)行應(yīng)用。因其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，使上轉(zhuǎn)換巧光免疫試紙法與理化檢測(cè)與微生 物檢測(cè)技術(shù)相比，具有靈敏度高，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低及能進(jìn)行大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的特點(diǎn)； 與膠體金試紙相比，具備定量檢測(cè)的特色，作為更敏感、穩(wěn)定、靈活、安全的UPT-LF的研究， 是膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的有力補(bǔ)充。但是目前上轉(zhuǎn)換巧光材料的制備和試紙的研究仍存在 發(fā)光效率不夠，巧光材料種類少等缺陷，丞待加強(qiáng)該方面的研究和探討。
[0005] 下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒具有高靈敏度，是一種完全惰性的無(wú)機(jī)發(fā)光材料，具有獨(dú)特 物理結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，可作為新型標(biāo)記物應(yīng)用在生物檢測(cè)領(lǐng)域。將其與生物學(xué)、免疫學(xué)、材 料學(xué)相結(jié)合而開發(fā)的用于ZEN快速檢測(cè)的下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒標(biāo)記免疫層析方法，在靈敏、 穩(wěn)定、靈活方面顯示了優(yōu)異的特性，是膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的有利補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙， 該試紙具有特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，能定量檢測(cè)食品、飼料、中草藥中的玉米赤霉締 酬。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 一種檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸 附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料 層，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡和用羊抗小 鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡;所述的巧光抗體纖維層采 用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為氧化石墨締巧光納米材料、化YF4:化，Tm納 米顆?；騈aGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0009] 所述的支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層和設(shè)置在吸附層頂面的面層。
[0010] 所述的支撐體包括透明的中空管體，吸附層填充在中空管體內(nèi)部，吸附層從測(cè)試 端開始依次為吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。
[0011] 所述的中空管體的上端裝有連接頭，連接頭上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的輔 助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊，氣囊 的出氣口依次經(jīng)連接套上部的進(jìn)氣通道、連接頭的內(nèi)腔與中空管體的上口部相連通，進(jìn)氣 通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無(wú)法向內(nèi)吸氣的單向出氣裝置。
[0012] 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔，換氣腔內(nèi) 設(shè)置有圓球形的密封球，換氣腔的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一出氣口，第一出氣口 經(jīng)出氣通道與進(jìn)氣通道相連通，換氣腔側(cè)面設(shè)置有與外界大氣相連通的第二出氣口，構(gòu)成 只能向外排氣、無(wú)法向進(jìn)氣通道吸氣的單向出氣結(jié)構(gòu)。
[0013] 所述的第一出氣口為圓形，其直徑小于密封球的直徑。
[0014] 所述的連接頭為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體的上端呈密封連接，連 接頭上部的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)的盲孔，盲孔內(nèi)壁 上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過(guò)外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套下部的盲孔 內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈。
[0015] 所述的隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡呈相間設(shè)置在纖維素膜層的表面，間距為6- 10mm〇
[0016] 所述的中空管體的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。
[0017] 所述的氧化石墨締巧光納米材料是一種W氧化石墨締為基質(zhì)通過(guò)酷氯化反應(yīng)和 烷基胺來(lái)修飾后，用銀納米顆粒進(jìn)行表征后得到的巧光納米材料。
[0018] 所述的氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0019] (1)氧化石墨締巧光材料修飾：
[0020] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5血DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞諷，80°C下 加熱回流48h后離屯、，得到中間體酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂?jī)纱魏螅稍?再在抽 真空氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反應(yīng)72h，冷卻至室 溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨締，分散于20mL雙蒸水中，80(K)r/min離屯、，除去未反應(yīng)的正 下胺，將剩余的反應(yīng)液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙蒸水中，配制成 濃度為Img/mL的修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0021 ] (2)表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0022] (a)將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入lOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的巧 樣酸鋼溶液，80°C加熱回流比后攬拌0.化，4°C條件下過(guò)夜;取ImL過(guò)夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，攬拌2地后離屯、，除去未反應(yīng)的琉基乙酸，超純水洗涂3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸 干，加超純水配制成濃度為Img/mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0023] (b)取O.lmM的邸C 10化和O.lmM的畑S 1化L，逐步加入到ImL琉基乙酸包覆的銀納 米顆粒溶液中，反應(yīng)化，得到簇基活化的銀納米顆粒溶液；
[0024] (C)取O.lmM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12化，加入到簇基活化的銀納米顆粒 溶液中，4°C反應(yīng)過(guò)夜，得到表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液；
[0025] (3)氧化石墨締巧光納米材料ZEN抗體的標(biāo)記：
[00%]取修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反應(yīng)化，離屯、，除 去未反應(yīng)的戊二醒，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)化，經(jīng)離屯、，收集氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗涂，保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 所述船￥。4:￥6，時(shí)1納米顆粒是^化￥&為基質(zhì)、￥護(hù)為敏化劑，由化和時(shí)1共滲雜形成 的直徑為60~80nm的發(fā)藍(lán)色巧光的納米顆粒。
[00%]所述的化YF4:化，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括W下步驟：
[0029] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0030] 分別取濃度均為0.5mo 1 /L的 Y ( N03 ) 3溶液5.5mL、化(N03 ) 3溶液0.5mL和Tm ( N03 ) 3溶 液0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的巧樣酸鋼溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應(yīng)化；加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7血，25 °C條件下避光攬拌0.化，用HN03調(diào)節(jié)抑值至7.4，靜置0.化，加 雙蒸水稀釋至30ιΛ;再在220°C下反應(yīng)2地，冷卻到室溫，經(jīng)過(guò)濾、雙蒸水洗涂、干燥，得到發(fā) 藍(lán)色光的NaYF4:孔，化巧光納米顆粒；
[0031] (2)巧光納米顆粒的表面娃化：
[0032] 將化YF4: Yb，Tm巧光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度 為Img/血的化YF4: Yb，化巧光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光納米 顆粒溶液中，充分?jǐn)埌璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 60(K)r/min離屯、lOmin，得到表面娃化的巧光納米顆粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為lOmg/mL的巧光納米顆粒甲醇溶液；
[0033] (3)巧光納米顆粒的表面氨基化：
[0034] 取3mL巧光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力攬拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入化L的APTSA，密封后在40 °C反應(yīng)30min，再在70 °C水浴反應(yīng)化，600化/min 離屯、5min，得到表面氨基化的巧光納米顆粒，用乙醇反復(fù)洗涂4次，真空干燥后，4°C密封保 存；
[0035] (4)ZEN抗體的標(biāo)記：
[0036] 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的巧光納米顆粒溶解，配制成濃 度為lOmg/mL的表面氨基化的巧光納米顆粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)化，6000r/min離屯、5min，取上清液；將Img/mL 的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:1〇〇,4°(：避光反應(yīng)地，離屯、，雙蒸水洗涂后分散在?85緩沖溶液中，4°(：條件下 透析3d，離屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0037] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒是W氧化禮(Gd2〇3)、鶴酸鋼(化2W〇4 · 2此0)為基 質(zhì)，館離子化U3+)為敏化劑，在條件反應(yīng)下形成100~200nm的納米顆粒。
[0038] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0039] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒
[0040] 稱取7g Gcb化和7g化2〇3,分別加入至50血的HN03中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結(jié)晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;將化2W〇4 · 2此0溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 化2W〇4溶液;將制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N03)3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2WO4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反應(yīng)蓋中，用稀硝酸、氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑=5,攬拌均勻，封閉 反應(yīng)蓋，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)蓋中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸饋水洗涂粉體3次，每次靜置化;將洗好的粉體加熱至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[0041] (2)ZEN抗體的標(biāo)記
[0042] 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液1000化/min離屯、30min，除去雜質(zhì)；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至抑8.2;
[0043] 取lOmL化Gd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攬拌狀態(tài)下，加入ZEN單克隆抗體或多 克隆抗體溶液10化1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度Img/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min離屯、30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀釋至10血，lOOOOr/ min離屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 所述的吸附纖維層由玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜制成。
[0045] 所述的吸水材料層由吸水濾紙制成。
[0046] 所述的纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜或簇化纖維素膜制成。
[0047] 所述的偶聯(lián)ZEN的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
[004引所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡還可W為"十十"字型排列印跡、"π"字型排 列印跡、《丄丄"字型排列印跡、"hi·"字型排列印跡或叫?，，字型排列印跡。
[0049] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、巧光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與巧光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的面層上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維層 一偵帕.3~0.7畑1。
[0050] 本發(fā)明的試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性高、安全性好、簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果 顯示形象、直觀、適用范圍廣、攜帶方便的特點(diǎn)。在便攜式巧光讀數(shù)儀下可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)定量檢 巧。。能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加 工、養(yǎng)殖戶W及消費(fèi)者個(gè)人等。本發(fā)明在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要 的意義，將具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[0051] 圖1為實(shí)施例4的試紙的主視圖，圖中，2為吸附纖維層，3為巧光抗體纖維層，4為纖 維素膜層，7為吸水材料層，14為面層，15為底層。
[0052] 圖2為實(shí)施例4的試紙的俯視圖，圖中，4為纖維素膜層，5為隱形檢測(cè)印跡，6為隱形 對(duì)照印跡，14為面層，15為底層，16為樣品標(biāo)記線。
[0053] 圖3為實(shí)施例5的試紙的主視圖，圖中，1為中空管體，2為吸附纖維層，3為巧光抗體 纖維層，4為纖維素膜層，5為隱形檢測(cè)印跡，6為隱形對(duì)照印跡，7為吸水材料層，8為連接頭， 9為連接頭的內(nèi)腔，10為密封圈，11為單向出氣裝置，12為氣囊，13為連接套。
[0054] 圖4為圖3的A-A向剖視圖，圖中，1為中空管體，4為纖維素膜層，6為隱形對(duì)照印跡。
[0055] 圖5為圖3中的連接頭的主視圖，圖中，1為中空管體，8為連接頭。
[0056] 圖6為圖3中的連接頭的俯視圖，圖中，8為連接頭，9為連接頭的內(nèi)腔。
[0057] 圖7為圖3中的連接套的剖視圖，圖中，10為密封圈，12為氣囊，13為連接套，111為 換氣腔，112為第二出氣口，113為密封球，114為第一出氣口，115為出氣通道，131為盲孔， 132為進(jìn)氣通道。
【具體實(shí)施方式】
[0058] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0化9]實(shí)施例1
[0060]檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙的制備，主要包括:ZEN人工抗原的制備、 ZEN單克隆抗體或多克隆抗體的制備、氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記ZEN抗體的制備、纖維 素膜層的制備W及免疫層析試紙的組裝等步驟。
[0061 ] 1、偶聯(lián)ZEN載體蛋白的制備
[0062] 將ZEN與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備人工合成抗原。
[0063] 稱取lOmg的ZEN溶于5mL化晚，避光攬拌反應(yīng)12h，將所得溶液用氮?dú)獯蹈?，加?mL 雙蒸水，用等體積乙酸乙醋萃取3次，棄去水相，用氮?dú)獯蹈?，得到油狀物A。稱取N-徑基班巧 酷亞胺（NHS)2.3mg、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)4. Img與3.18mg A充分混合后室溫過(guò)夜，產(chǎn)生 白色沉淀，離屯、后棄去沉淀，取上清得到B溶液。稱取BSA 5mg，溶于ImL的碳酸鹽緩沖液(pH 為9.6)中得C溶液，將B溶于緩慢加入C溶液中，避光室溫?cái)埌璺磻?yīng)過(guò)夜。反應(yīng)產(chǎn)物在4 °C攬拌 下用PBS透析3d，每天換液3~6次，透析后得到純化的ZEN-BSA。
[0064] 2、抗ZEN抗體的制備
[0065] (1)單克隆抗體的制備
[0066] 動(dòng)物免疫：用制備的ZEN載體蛋白偶聯(lián)物W30yg~50yg/只的用量免疫6~8周齡 Ba化/C小鼠3~4次，每次免疫間隔時(shí)間3~5周，確定抗體效價(jià)符合要求后進(jìn)行超強(qiáng)免疫，并 在融合之前檢測(cè)其抑制價(jià)。
[0067] 細(xì)胞融合:超強(qiáng)免疫后3~4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽(yáng)性血清;脫頸致死， 用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin消毒體表，無(wú)菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼 龍紗布過(guò)濾，l〇(K)r/min離屯、lOmin，收集脾細(xì)胞。將1X108的脾細(xì)胞與N&)骨髓瘤細(xì)胞按10:1 的比例混合，100化/min離屯、lOmin棄上清，將細(xì)胞沉淀物于37 °C水浴中緩緩加入0.7~ 1.0血的50 %陽(yáng)G4000，Imin內(nèi)加完，前30s加0.1~0.3mL，中間15s加0.2~0.4mL，最后15s加 完;然后緩緩加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15mL，W終止陽(yáng)G的作用，37°C水浴5~10min，1000r/ min離屯、lOmin棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（8 ~10塊），！00化~200μLν孔，置于37°C、5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0068] 單克隆抗體的篩選:培養(yǎng)10~14天，用間接化ISA法進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、 抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3~6次有限稀釋克隆化(直到細(xì)胞克隆為單克隆，檢測(cè)各 個(gè)克隆孔效價(jià)、抑制價(jià)基本一致），而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞 分泌的單克隆抗體可特異地與ZEN反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)到l〇w~1〇12,輕鏈亞型為K或λ，重鏈 亞型為1肖61、1肖623、1肖626、1肖63，針對(duì)26卿寺異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備氧化石墨 締巧光納米材料標(biāo)記抗體的玻璃纖維棉。
[0069] (2)多克隆抗體的制備
[0070] 用ΖΕΝ載體蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭白兔，免疫劑量為20化g~50化g/次，背部皮下 分4~6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌PBS溶解制備的ZEN載體蛋白偶聯(lián)物，與等量弗氏完全佐劑 (FCA)混合，充分乳化;加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解ZEN載體蛋白偶聯(lián)物，與等量弗氏不完全佐 劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2~3周進(jìn)行，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔2~3周，最后一次 免疫后10~15天，W化ISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到105W上時(shí)，采血并分離收集高免血清。
[0071] W飽和硫酸錠鹽析法提取IgG抗體，即取1份高免血清加2份PBS(抑7.2)混勻，加等 體積飽和硫酸錠溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、250化/min離屯、15min，棄上清，再W適量PBS (PH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸錠溶液至終濃度33%，置4°C冰箱化，4°C、2500r/min離屯、 15min，棄上清，W適量PBS (抑7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱內(nèi)用PBS (pH7.2)透析48~72h，中間 換液數(shù)次，4°C、12000r/min離屯、15min，收集上清，得純化的抗ZEN多克隆抗體，-20°C凍存， 用于制備氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記抗體玻璃纖維棉。
[0072] 3、氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備
[0073] (1)氧化石墨締巧光材料修飾：
[0074] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL二甲基甲酯胺(DMF)中，超聲混勻后，加入20血二 氯亞諷，80°C下加熱回流4她后離屯、，得到中間體酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂?jī)纱?后，干燥;再在抽真空氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反應(yīng) 72h，冷卻至室溫，得到烷基胺修飾的氧化石墨締，分散于20血雙蒸水中，800化/min離屯、，除 去未反應(yīng)的正下胺，將剩余的反應(yīng)液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙 蒸水中，配制成濃度為Img/mL的修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0075] (2)表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備：
[0076] (a)將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入lOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的巧 樣酸鋼溶液，80°C加熱回流比后攬拌0.化，4°C條件下過(guò)夜;取ImL過(guò)夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，攬拌2地后離屯、，除去未反應(yīng)的琉基乙酸，超純水洗涂3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸 干，加超純水配制成濃度為Img/mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液；
[0077] (b)取O.lmM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺化0〇10化和O.lmM的N服10μ L，逐步加入到1 mL琉基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液中，反應(yīng)化，得到簇基活化的銀納米顆粒 溶液；
[0078] (C)取O.lmM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12化，加入到簇基活化的銀納米顆粒 溶液中，4°C反應(yīng)過(guò)夜，得到表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液；
[0079] (3)氧化石墨締巧光納米材料ZEN抗體的標(biāo)記：
[0080] 取修飾的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反應(yīng)化，離屯、，除 去未反應(yīng)的戊二醒，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液中，加入表面 標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)化，經(jīng)離屯、，收集氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體，0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗涂，保存?zhèn)溆谩?br>[0081] 4、巧光抗體纖維層的制備
[0082] 將1:100~1:500稀釋的氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的ZEN抗體吸附于精制玻璃 纖維棉中，4Γ低溫真空干燥，制備氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記抗體的玻璃纖維棉。
[0083] 5、吸附纖維素膜層的制備：
[0084] 纖維素膜層由硝酸纖維素制成，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜層的不同位置分別噴點(diǎn)ZEN 人工抗原檢測(cè)印跡和兔抗鼠 IgG抗體(或羊抗鼠 IgG抗體、羊抗兔IgG抗體)對(duì)照印跡，于37Γ 烘干備用。
[0085] 6、免疫層析試紙的組裝
[0086] 將吸附纖維層、巧光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從測(cè)試端開始依次貼在 帶有粘合劑的底層上，再在覆蓋上面層，并切成3-4cm寬的試紙即可。
[0087] 7、檢測(cè)反應(yīng)原理
[0088] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，在虹吸作用帶動(dòng)下，待測(cè)溶液中ZEN和巧光抗 體纖維層中的巧光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，直至到吸水材料層。
[0089] 在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)ZEN可與吸附在氧化石墨締上的ZEN抗體-銀納米顆粒相結(jié)合， 因抗原-抗體作用和靜電吸引作用，導(dǎo)致ZEN抗體-銀納米顆粒從氧化石墨締上剝離出來(lái)，進(jìn) 而釋放氧化石墨締所散發(fā)的巧光，并和偶聯(lián)ZEN的載體蛋白結(jié)合。而羊抗鼠抗體則能與ZEN 抗原結(jié)合，在35化m紫外線激發(fā)下隱形檢測(cè)印跡線(T線）和隱形對(duì)照印跡線(C線)都會(huì)出現(xiàn) 吸收峰，通過(guò)巧光讀條儀讀取T線峰值定量檢測(cè)待測(cè)樣品中ZEN中的含量。反之，樣品中無(wú) ZEN時(shí)，則T線和C線不會(huì)出現(xiàn)紫外吸收峰。
[0090] 實(shí)施例2
[0091] 實(shí)施例2中免疫層析試紙的制備和實(shí)施例1基本相同，主要不同之處在于：巧光抗 體為NaYF4:孔，化納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0092] 所述的化YF4:化，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法， 包括W下步驟：
[0093] (1)采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒：
[0094] 分別取濃度均為 0.5mol/L 的 Y(N03)3 溶液 5.5mL、Yb(N〇3)3 溶液 0.5mL 和 Tm(N〇3)3 溶 液0.5mL，混合均勻，再緩慢加入0.4mol/L的巧樣酸鋼溶液2mL，25°C條件下避光充分反應(yīng) 化;加入1.5mol/L NH4F溶液7mL，同條件下攬拌0.5h，用HN03調(diào)節(jié)抑值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30ιΛ;再在220°C下反應(yīng)2地，冷卻到室溫，經(jīng)過(guò)濾、雙蒸水洗涂、干燥，得到發(fā)藍(lán) 色光的NaYF4:孔，化巧光納米顆粒；
[00M] (2)巧光納米顆粒的表面娃化：
[0096] 將化YF4: Yb，Tm巧光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度 為Img/血的化YF4: Yb，化巧光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光納米 顆粒溶液中，充分?jǐn)埌璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 60(K)r/min離屯、lOmin，得到表面娃化的巧光納米顆粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成濃度為lOmg/mL的巧光納米顆粒甲醇溶液；
[0097] (3)巧光納米顆粒的表面氨基化：
[009引取3mL巧光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力攬拌20min，再用超聲 波均勻分散，加入化L的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基Ξ甲氧基硅烷(APTSA)，密封后在40°C反應(yīng) 30min，再在70 °C水浴反應(yīng)化，600化/min離屯、5min，得到表面氨基化的巧光納米顆粒，用乙 醇反復(fù)洗涂4次，真空干燥后，4 °C密封保存；
[0099] (4)ZEN抗體的標(biāo)記：
[0100] 用〇.〇lmol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的巧光納米顆粒溶解，配制成濃 度為lOmg/mL的表面氨基化的巧光納米顆粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光納米顆粒溶液 與5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)化，6000r/min離屯、5min，取上清液；將Img/mL 的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液 的體積比為1:1〇〇,4°(：避光反應(yīng)地，離屯、，雙蒸水洗涂后分散在?85緩沖溶液中，4°(：條件下 透析3d，離屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體， 置于PBS緩沖溶液中，4°C保存。
[0101] 檢測(cè)反應(yīng)原理
[0102] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，在虹吸作用帶動(dòng)下，待測(cè)溶液中ZEN和巧光抗 體纖維層中的巧光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，直至到吸水材料層。
[0103] 在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)ZEN可與巧光抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉巧光抗體上ZEN的抗原結(jié) 合點(diǎn)，阻止巧光抗體與纖維素膜上的ZEN人工抗原的檢測(cè)印跡結(jié)合，不能顯示檢測(cè)印跡，而 羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與巧光抗體結(jié)合，在紅外線激發(fā)下通過(guò)巧光讀條 儀T線處就不會(huì)出現(xiàn)吸收峰，C線處會(huì)出現(xiàn)吸收峰。反之樣品溶液中無(wú) ZEN時(shí)，則不能阻止巧 光抗體與纖維素膜上偶聯(lián)ZEN載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，通過(guò)巧光讀條儀T線處就會(huì)出現(xiàn)吸 收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與巧光標(biāo)記抗體結(jié)合，通過(guò)巧光讀 條儀C線處也會(huì)出現(xiàn)吸收峰。如果纖維素膜上沒(méi)有T線和C線吸收峰，則表明試紙條已失效。 實(shí)施例3
[0104] 實(shí)施例3中免疫層析試紙的制備和實(shí)施例1基本相同，主要不同之處在于：巧光抗 體為NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0105] 所述的化Gd(W〇4)2:化納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方 法，包括W下步驟：
[0106] (1)采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2: Eu3+納米顆粒
[0107] 稱取7g Gcb化和7g化2〇3,分別加入至50血的HN03中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部 結(jié)晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;將化2W〇4 · 2此0溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 化2W〇4溶液;將制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N03)3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2W〇4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反應(yīng)蓋中，用稀硝酸、氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑=5,攬拌均勻，封閉 反應(yīng)蓋，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)蓋中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉 淀后，去除上清液，用蒸饋水洗涂粉體3次，每次靜置化;將洗好的粉體加熱至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒；
[010引（2)ZEN抗體的標(biāo)記
[0109] 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液1000化/min離屯、30min，除去雜質(zhì)；用去離子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至抑8.2;
[0110] 取lOmL化Gd(W化)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攬拌狀態(tài)下，加入ZEN單克隆抗體或多 克隆抗體溶液10化1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度Img/mL，混勻，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min離屯、30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀釋至10血，lOOOOr/ min離屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[011。 檢測(cè)反應(yīng)原理
[0112] 當(dāng)試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)ZEN及巧光 納米顆粒標(biāo)記抗體玻璃纖維棉中的下轉(zhuǎn)換巧光納米顆?；疓d(W化)2: Eu3+標(biāo)記抗體一起向 纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)ZEN可與巧光納米 顆粒標(biāo)記抗體纖維層中的下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒標(biāo)記抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉下轉(zhuǎn)換巧光納米 顆粒標(biāo)記抗體上ZEN的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒標(biāo)記抗體與纖維素膜上偶聯(lián) ZEN載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，試紙上無(wú)法顯示檢測(cè)印跡，而羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔 IgG)抗體則可與下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒標(biāo)記抗體結(jié)合，在紅外線激發(fā)下通過(guò)巧光讀條儀T線 處就不會(huì)出現(xiàn)吸收峰，C線處會(huì)出現(xiàn)吸收峰。反之樣品溶液中若無(wú) ZEN，則不能阻止下轉(zhuǎn)換巧 光納米顆粒標(biāo)記抗體與纖維素膜上偶聯(lián)ZEN載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，通過(guò)巧光讀條儀T線 處就會(huì)出現(xiàn)吸收峰，同樣羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗體也能與下轉(zhuǎn)換巧光納米顆 粒標(biāo)記抗體結(jié)合，通過(guò)巧光讀條儀C線處也會(huì)出現(xiàn)吸收峰。如果纖維素膜上沒(méi)有T線和C線吸 收峰，則表明試紙條已失效。
[0113] W下結(jié)合其他實(shí)施例具體說(shuō)明免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法
[0114] 實(shí)施例4
[0115] 本實(shí)施例的檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，參照?qǐng)D1-2,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層2、巧光抗體纖維層3、纖維 素膜層4及吸水材料層7,所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形 檢測(cè)印跡5和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡6;所 述的巧光抗體纖維層采用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為氧化石墨締巧光納 米材料標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體。
[0116] 所述的支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層15和設(shè)置在吸附層頂面的面層14。
[0117] 所述的面層覆蓋在吸附纖維層、巧光抗體纖維層及吸水材料層上，在吸附纖維層 與巧光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的面層上印制有樣品標(biāo)記線16,該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維 層一偵 1|0.3 ~0.7cm。
[0118] 為了更好的技術(shù)效果，所述的隱形檢測(cè)印跡5和隱形對(duì)照印跡6呈相間設(shè)置在纖維 素膜層4的表面，即兩條印跡帶平行排列成V/"，間距為6~10mm。
[0119] 覆蓋在吸附纖維層和巧光抗體纖維層上面的面層為白色，覆蓋在吸水材料層上面 的面層為其它顏色(如黃色），測(cè)試樣品標(biāo)記線位于吸附纖維層與巧光抗體纖維層交界處對(duì) 應(yīng)的白色面層偏向吸附纖維層一側(cè)約0.5cm處，在標(biāo)記線右側(cè)面層上印有箭頭及max字樣。
[0120] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[0121] 檢測(cè)玉米樣:將樣品粉碎，用無(wú)水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0122] 操作方法:將ZEN試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線，約10~20 秒鐘取出試紙，5min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0123] 結(jié)果判定：
[0124] (a)陽(yáng)性判定:通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性， 說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有ZEN;
[0125] (b)陰性判定：通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰 性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含ZEN;
[0126] (C)失效判定:通過(guò)巧光讀條儀T線不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，或T線處出現(xiàn) 吸收峰，C線處不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0127] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[01%]靈敏性的檢測(cè)：用憐酸鹽緩沖液PBS(抑7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、 5、10、20、30、50ng/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例的免疫層析試紙上上樣80~1 OOyL，反應(yīng) 5min后，通過(guò)讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對(duì)光密度值（relative optical (161131*7，1?00)。^不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)光密度值的百分率為縱坐標(biāo)，^不同 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)ZEN 的ICso和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙ZEN對(duì)的曲線回歸方程為:y = -0.3164X+0.984，相關(guān)系 數(shù)為R2 = 0.996，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)ZEN的IC50為33.86ng/mL，該試紙的最低檢測(cè) 限為4.87ng/mL，表明免疫層析試紙對(duì)ZEN具有較高的靈敏度。
[0129] 特異性的檢測(cè)其他真菌毒素作為競(jìng)爭(zhēng)物，配制上述標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測(cè)其抑制率，W該試紙對(duì)ZEN的與IC50各競(jìng)爭(zhēng)物IC50的百分比作為其交叉反應(yīng)率。 測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無(wú)交叉反 應(yīng)。
[0130] 表1免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)
[0131]
[0132]
[0133] 本實(shí)施例的試紙條具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0134] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例的試紙條W氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的 ZEN抗體為基礎(chǔ)制成，由于經(jīng)修飾過(guò)的氧化石墨締巧光材料具有非凡光學(xué)特性和良好的生 物相容性，同時(shí)氧化石墨締電子傳遞效率高，使得運(yùn)種新型免疫方法靈敏度高，檢測(cè)極限 低，最低僅為4.87ng/mL。
[0135] (2)穩(wěn)定性高，安全性好。本實(shí)施例的試紙條氧化石墨締巧光納米材料標(biāo)記的ZEN 抗體為基礎(chǔ)制成，納米銀顆粒表面與蛋白質(zhì)帶有相反的電荷基團(tuán)，因靜電吸附而牢固結(jié)合； 石墨締比表面積大，能與多種蛋白質(zhì)生物分子通過(guò)化學(xué)反應(yīng)結(jié)合，而對(duì)其生物活性影響很 小，穩(wěn)定性高，靈活性好。
[0136] (3)本實(shí)施例的氧化石墨締巧光免疫層析試紙可對(duì)玉米、DDGS、飼料等進(jìn)行檢測(cè)。 通過(guò)銀納米和氧化石墨締共同作用，檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)，降低抗體用量，節(jié)省抗體成本。
[0137] 實(shí)施例5
[0138] 本實(shí)施例的檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙，參照?qǐng)D3-7,包括支撐體和固 定在支撐體上的吸附層，所述的支撐體包括透明的中空管體1，吸附層填充在中空管體內(nèi) 部，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層2、巧光抗體纖維層3、纖維素膜層4及吸水材料 層7,所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)ZEN的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡5和用羊抗 小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡6;所述的巧光抗體纖維 層采用吸附巧光抗體的玻璃纖維棉制成，巧光抗體為化YF4:化，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克 隆抗體或者多克隆抗體。
[0139] 所述的中空管體1的上端裝有連接頭8,連接頭8上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的 輔助吸附裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套13和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊 12,氣囊12的出氣口依次經(jīng)連接套13上部的進(jìn)氣通道132、連接頭8的內(nèi)腔9與中空管體1的 上口部相連通，進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無(wú)法向內(nèi)吸氣的單向出 氣裝置11。
[0140] 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔111，換氣 腔111內(nèi)設(shè)置有圓球形的密封球113，換氣腔111的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一出氣 口 114,第一出氣口經(jīng)出氣通道115與進(jìn)氣通道132相連通，換氣腔111側(cè)面設(shè)置有與外界大 氣相連通的第二出氣口 112,構(gòu)成只能向外排氣、無(wú)法向進(jìn)氣通道吸氣的單向出氣結(jié)構(gòu)。
[0141] 為了更好的技術(shù)效果，所述的第一出氣口 114為圓形，其直徑小于密封球的直徑。 運(yùn)樣的設(shè)置能夠使第一出氣口與圓球形的密封球更加緊密的結(jié)合，保證空間的密封性。
[0142] 所述的連接頭8為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體1的上端呈密封連接， 連接頭上部的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套13的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)得盲孔131，盲 孔131內(nèi)壁上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過(guò)外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔131內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈10。
[0143] 所述的隱形檢測(cè)印跡5和隱形對(duì)照印跡6呈相間設(shè)置在纖維素膜層4的表面，間距 為6~10mm。
[0144] 所述的中空管體1的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。
[0145] 測(cè)試樣品標(biāo)記線位于吸附纖維層與巧光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的透明中空管體 上偏向吸附纖維層一側(cè)約0.5cm處，在標(biāo)記線右側(cè)的透明中空管體上印有箭頭及max字樣。
[0146] 使用時(shí)，將連接套和連接頭通過(guò)內(nèi)外螺紋連接在一起，輕輕擠壓氣囊，氣囊中的氣 體通過(guò)進(jìn)氣通道、連接頭的內(nèi)腔和連接套側(cè)壁的換氣腔向外排出，此時(shí)換氣腔內(nèi)的圓球形 密封球被從氣囊中擠壓出的氣體抬起，氣囊中的氣體通過(guò)第一出氣口順利向外排出；將試 紙插入待測(cè)樣品溶液中，然后松開氣囊，此時(shí)，中空管體的內(nèi)腔、連接頭的內(nèi)腔和進(jìn)氣通道 內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，在負(fù)壓的吸引下，密封球緊緊吸附在換氣腔的底面上的第一出氣口上，將其封 閉，從而幫助樣品溶液更加快速的浸潤(rùn)試紙，從而減少樣品溶液浸潤(rùn)試紙條的時(shí)間，提高檢 測(cè)效率。
[0147] 由上述情況可W清楚的看出，本實(shí)施例結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，簡(jiǎn)單合理，通過(guò)將支撐體整 體修改為密閉結(jié)構(gòu)，同時(shí)在支撐體的頂部增加氣囊，使吸收更加迅速，從而有效提高檢測(cè)的 速度和準(zhǔn)確度，同時(shí)氣囊部分和支撐體部分為密封拆裝式連接，檢測(cè)完畢后只需更換支撐 體部分即可，拆裝方便，易操作，使用效果好，是檢測(cè)試紙上的創(chuàng)新。
[0148] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[0149] 檢測(cè)DDGS樣:將樣品粉碎，用無(wú)水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0150] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內(nèi)的氣體排出，將ZEN試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插 入深度不超過(guò)標(biāo)記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0151] 結(jié)果判定：
[0152] (a)陽(yáng)性判定:通過(guò)巧光讀條儀T線處不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè) 結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有玉米赤霉締酬；
[0153] (b)陰性判定:通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性， 說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含玉米赤霉締酬；
[0154] (C)失效判定:通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0155] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[0156] 用憐酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例的免疫層析試紙上上樣80~10化L，反應(yīng)4min后，通過(guò)讀 條儀讀取T線掃描面積光密度的相對(duì)光密度值(relative optical density, ROD)。W不同 濃度標(biāo)準(zhǔn)品與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)光密度值的百分率為縱坐標(biāo)，W不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對(duì)數(shù) 值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)ZEN的IC50和最低檢測(cè)限。經(jīng) 測(cè)定，該試紙ZEN對(duì)的曲線回歸方程為:y = -0.4134X+0.8893，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.996，根據(jù) 回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)ZEN的IC50為44.86ng/mL，該試紙的最低檢測(cè)限為5.78ng/mL，表明 免疫層析試紙對(duì)ZEN具有較高的靈敏度。
[0157] 特異性的檢測(cè)其他真菌毒素作為競(jìng)爭(zhēng)物，配制上述標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測(cè)其抑制率，W該試紙對(duì)ZEN的與IC50各競(jìng)爭(zhēng)物IC50的百分比作為其交叉反應(yīng)率。 測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無(wú)交叉反 應(yīng)。
[0158] 表2免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)
[0159] _
[0160] 本實(shí)施例的試紙條具有W下優(yōu)點(diǎn):
' '
[0161] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例上轉(zhuǎn)換巧光免疫層析試紙W發(fā)藍(lán)色光譜的上轉(zhuǎn) 換巧光納米材料化YF4: Yb，化標(biāo)記的ZEN抗體為基礎(chǔ)制成，由于NaYF4: Yb，Tm納米顆粒發(fā)光效 率高，能有效消除樣品檢測(cè)背景光，靈敏度大幅提高。
[0162] (2)穩(wěn)定性高，安全性好。本實(shí)施例的試紙中上轉(zhuǎn)換巧光納米材料化YF4:化，Tm能 有效發(fā)射藍(lán)色光譜，完全避免了其他條件引起的發(fā)光澤滅。NaYF4:Yb，Tm材料具有無(wú)機(jī)惰 性、紅外光激發(fā)、可見光發(fā)射的特點(diǎn)，使用該試紙進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于周圍人員與環(huán)境無(wú)任何危 害。
[0163] (3)簡(jiǎn)便、快速。利用巧光讀條儀，該試紙可直接讀值，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)。只 要將試紙插入被檢樣品3~5秒鐘，4分鐘后即可讀取結(jié)果，在T線處無(wú)吸收峰表示被檢樣品 中含有ZEN;反之，不含ZEN。結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，最大限度的避免了人為誤判。
[0164] (4)本實(shí)施例的試紙制備時(shí)，巧光抗體采用化YF4:Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克 隆抗體或多克隆抗體，即將氨基化的化YF4:化，Tm納米顆粒直接與抗體相連，標(biāo)記過(guò)程簡(jiǎn) 單，偶聯(lián)率高，從而有效提高基于NaYF4:孔，Tm材料的免疫試紙的靈敏度。
[01化]實(shí)施例6
[0166] 本實(shí)施例的檢測(cè)玉米赤霉締酬的巧光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)同實(shí)施例4,不同之處 在，本實(shí)施例的巧光抗體為化Gd(W化)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗 體。
[0167] (1)待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)步驟：
[016引檢測(cè)孤GS樣:將樣品粉碎，用無(wú)水乙醇稀釋制成l:10(m/v)的樣品懸液。
[0169] 操作方法:擠壓氣囊，將氣囊內(nèi)的氣體排出，將ZEN試紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品中，插 入深度不超過(guò)標(biāo)記線，松開氣囊，約3-5秒鐘取出試紙，4min后放入巧光讀條儀直接讀值。
[0170] 結(jié)果判定：
[0171] (a)陽(yáng)性判定:通過(guò)巧光讀條儀T線處不出現(xiàn)吸收峰，C線處出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè) 結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有玉米赤霉締酬；
[0172] (b)陰性判定:通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都出現(xiàn)吸收峰，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性， 說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含玉米赤霉締酬；
[0173] (C)失效判定:通過(guò)巧光讀條儀T線和C線處都不出現(xiàn)吸收峰，則表明試紙已失效。
[0174] (2)本實(shí)施例免疫層析試紙的靈敏性、特異性檢測(cè)
[01巧]用憐酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)或雙蒸水分別配制濃度為1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，在本實(shí)施例的免疫層析試紙上上樣80~10化L，反應(yīng)4min后，通過(guò)讀 條儀讀取τ線掃描面積光密度的相對(duì)光密度值(relative optical density, ROD)。w不同 濃度標(biāo)準(zhǔn)品與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)光密度值的百分率為縱坐標(biāo)，W不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對(duì)數(shù) 值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算該試紙對(duì)ZEN的IC50和最低檢測(cè)限。經(jīng) 測(cè)定，該試紙ZEN對(duì)的曲線回歸方程為:y = -0.3467X+0.8841，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.987，根據(jù) 回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)ZEN的1C日日為45.8ng/mL，該試紙的最低檢測(cè)限為5.36ng/mL，表明 免疫層析試紙對(duì)ZEN具有較高的靈敏度。
[0176] 特異性的檢測(cè)其他真菌毒素作為競(jìng)爭(zhēng)物，配制上述標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度，用免疫層 析試紙檢測(cè)其抑制率，W該試紙對(duì)ZEN的與IC50各競(jìng)爭(zhēng)物IC50的百分比作為其交叉反應(yīng)率。 測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可看出，該免疫層析試紙的特異性較好，與其他真菌毒素均無(wú)交叉反 應(yīng)。
[0177] 表3免疫層析試紙與其他真菌毒素的交叉反應(yīng) [017 引
[0179] 本實(shí)施例的試紙條具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0180] (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本實(shí)施例下轉(zhuǎn)換巧光納米顆粒標(biāo)記免疫層析試紙是W氧 化禮(Gcb化）、鶴酸鋼(化2W〇4 · 2此0)為基質(zhì)，館離子巧u3+)為敏化劑形成的100~200nm納米 顆粒，具有良好的光學(xué)特性，使ZEN的檢測(cè)消除了背景光的干擾，靈明度大大提高，最低可檢 測(cè)到 5.36ng/mL。
[0181] (2)穩(wěn)定性高。NaGd(W化)2:Eu3+納米顆粒屬于完全惰性的無(wú)機(jī)發(fā)光材料，運(yùn)些性質(zhì) 使得其具有非常好的光穩(wěn)定性，在紫外燈的照射下不發(fā)生光漂白，使得讀值穩(wěn)定。
[0182] (3)簡(jiǎn)便、快速。使用本實(shí)施例試紙可與巧光讀條儀結(jié)合使用，直接讀值，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng) 定量檢測(cè)，只需將試紙條插入被檢樣品中3-5秒鐘，取出后4分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0183] (4)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本實(shí)施例巧光納米顆粒標(biāo)記免疫層析試紙是WT線 是否出現(xiàn)吸收峰作為檢測(cè)陽(yáng)性和陰性的標(biāo)準(zhǔn)。若T線處無(wú)吸收峰則表示被檢樣品中含有 ZEN，反之則表示被檢樣品中不含ZEN。結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤 判。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，包括支撐體和固定在支撐體上的吸附 層，吸附層從測(cè)試端開始依次為吸附纖維層(2)、熒光抗體纖維層(3)、纖維素膜層(4)及吸 水材料層(7)，其特征在于，所述的纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)ZEN的載體蛋白溶液印制的隱 形檢測(cè)印跡(5)和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡 (6);所述的熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體為氧化石墨烯 熒光納米材料、NaYF4:Yb，Tm納米顆粒或NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或 者多克隆抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括設(shè)置在吸附層底面的底層(15)和設(shè)置在吸附層頂面的面層(14)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 支撐體包括透明的中空管體(1)，吸附層填充在中空管體內(nèi)部，吸附層從測(cè)試端開始依次為 吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 中空管體(1)的上端裝有連接頭(8)，連接頭(8)上端設(shè)置有輔助吸附裝置，所述的輔助吸附 裝置包括與所述連接頭呈密封連接的連接套（13)和設(shè)置在所述連接套上部的氣囊（12)，氣 囊（12)的出氣口依次經(jīng)連接套（13)上部的進(jìn)氣通道（132)、連接頭(8)的內(nèi)腔(9)與中空管 體（1)的上口部相連通，進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁上設(shè)置有只能向外排氣無(wú)法向內(nèi)吸氣 的單向出氣裝置(11); 所述的單向出氣裝置包括設(shè)置在進(jìn)氣通道所在的連接套側(cè)壁的換氣腔（111)，換氣腔 (111)內(nèi)設(shè)置有圓球形的密封球（113)，換氣腔（111)的底面上開有與密封球相對(duì)應(yīng)的第一 出氣口（114)，第一出氣口經(jīng)出氣通道（115)與進(jìn)氣通道（132)相連通，換氣腔（111)側(cè)面設(shè) 置有與外界大氣相連通的第二出氣口（112)，構(gòu)成只能向外排氣、無(wú)法向進(jìn)氣通道吸氣的單 向出氣結(jié)構(gòu)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 第一出氣口（114)為圓形，其直徑小于密封球的直徑。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 連接頭(8)為上下開口的中空結(jié)構(gòu)，其下端與中空管體（1)的上端呈密封連接，連接頭上部 的外壁上設(shè)置有外螺紋，連接套（13)的下部設(shè)置有與連接頭相對(duì)應(yīng)的盲孔（131)，盲孔 (131)內(nèi)壁上設(shè)置有與外螺紋相對(duì)應(yīng)的內(nèi)螺紋，連接頭通過(guò)外螺紋和內(nèi)螺紋旋裝在連接套 下部的盲孔（131)內(nèi)，連接頭的頂部與盲孔頂部之間在連接套上設(shè)置有防止漏氣的密封圈 (10) 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 隱形檢測(cè)印跡(5)和隱形對(duì)照印跡(6)呈相間設(shè)置在纖維素膜層(4)的表面，間距為6-10mm; 所述的中空管體(1)的內(nèi)腔為長(zhǎng)方形。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 氧化石墨烯熒光納米材料標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步 驟： (1)氧化石墨烯熒光材料修飾： 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超聲混勻后，加入20mL二氯亞砜，80°C下加熱 回流48h后離心，得到中間體酰氯化氧化石墨烯，用四氫呋喃洗滌兩次后，干燥;再在抽真空 氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，將酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反應(yīng)72h，冷卻至室溫，得 到烷基胺修飾的氧化石墨烯，分散于20mL雙蒸水中，8000r/min離心，除去未反應(yīng)的正丁胺， 將剩余的反應(yīng)液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，蒸干后的干物質(zhì)重新分散在雙蒸水中，配制成濃度 為lmg/mL的修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液； (2) 表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液的制備： (a) 將lOOmg硝酸銀溶解于250mL超純水中，加熱沸騰，加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸 鈉溶液，80 °C加熱回流1 h后攪拌0.5h，4°C條件下過(guò)夜;取lmL過(guò)夜后的溶液，加入ImM的巰基 乙酸l〇yL，攪拌24h后離心，除去未反應(yīng)的巰基乙酸，超純水洗滌3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加 超純水配制成濃度為lmg/mL疏基乙酸包覆的銀納米顆粒溶液； (b) 取0.1 mM的EDC 10yL和0.1 mM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巰基乙酸包覆的銀納米顆 粒溶液中，反應(yīng)lh，得到羧基活化的銀納米顆粒溶液； (c) 取0.1 mM的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體12yL，加入到羧基活化的銀納米顆粒溶液 中，4°C反應(yīng)過(guò)夜，得到表面標(biāo)記ZEN抗體銀納米顆粒溶液； (3) 氧化石墨稀焚光納米材料ZEN抗體的標(biāo)記： 取修飾的氧化石墨稀焚光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室溫反應(yīng)3h，離心，除去未 反應(yīng)的戊二醛，將剩余的反應(yīng)液分散在0.01mol/L、pH7.4的roS緩沖溶液中，加入表面標(biāo)記 ZEN抗體銀納米顆粒溶液，4°C反應(yīng)3h，經(jīng)離心，收集氧化石墨稀焚光納米材料標(biāo)記的ZEN單 克隆抗體或者多克隆抗體，〇. 01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液洗滌，保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述的 NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaYF4: Yb，Tm納米顆粒： 分別取濃度均為0.5111〇1/1的￥(觀3)3溶液5.511^、￥13(^)3) 3溶液0.511^和1'111(^)3)3溶液 0.5mL，混合均勻，再加入0.4mol/L的檸檬酸鈉溶液2mL，25 °C條件下避光充分反應(yīng)lh;加入 1.5mol/L NH4F溶液7mL，25°C條件下避光攪拌0.5h，用HN〇3調(diào)節(jié)pH值至7.4，靜置0.5h，加雙 蒸水稀釋至30mL;再在220°C下反應(yīng)24h，冷卻到室溫，經(jīng)過(guò)濾、雙蒸水洗滌、干燥，得到發(fā)藍(lán) 色光的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒； (2) 熒光納米顆粒的表面硅化： 將NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液中，配制成濃度為lmg/ mL的NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶液，再將5mL濃氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm熒光納米顆粒溶 液中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)20min，再加入2.5mL正娃酸四乙酯，4°C避光條件下反應(yīng)4h; 6000r/min 離心10min，得到表面硅化的熒光納米顆粒，用乙醇洗滌4次，分散在甲醇中，配制成濃度為 1 Omg/mL的焚光納米顆粒甲醇溶液； (3) 熒光納米顆粒的表面氨基化： 取3mL熒光納米顆粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力攪拌20min，再用超聲波均 勻分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反應(yīng)30min，再在70 °C水浴反應(yīng)lh，6000r/min離心 5min，得到表面氨基化的熒光納米顆粒，用乙醇反復(fù)洗滌4次，真空干燥后，4°C密封保存； (4) ZEN抗體的標(biāo)記： 用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖溶液將表面氨基化的熒光納米顆粒溶解，配制成濃度為 lOmg/mL的表面氨基化的熒光納米顆粒溶液；取lOmL表面氨基化的熒光納米顆粒溶液與 5 · 6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反應(yīng)3h，6000r/min離心5min，取上清液；將lmg/mL的 ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體加入上清液中，ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體和上清液的 體積比為1:100，4°C避光反應(yīng)4h，離心，雙蒸水洗滌后分散在PBS緩沖溶液中，4°C條件下透 析3d，離心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或多克隆抗體，置 于PBS緩沖溶液中，4°C保存。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的熒光免疫層析試紙，其特征在于，所述 的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒標(biāo)記的ZEN單克隆抗體或者多克隆抗體的制備方法，包括以下 步驟： (1) 采用水熱合成法制備NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒 稱取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分別加入至50mL的HN〇3中，加熱至80°C，保溫濃縮至全部結(jié) 晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;將Na 2W〇4 · 2H20溶于去離子水中，配制成濃度為0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；將制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去離子水溶解，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %的Gd (N〇3) 3溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %的Eu (N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd (N〇3) 3溶液、1 OmLNa2W〇4溶 液和5mL Eu (N〇3)3溶液，加入到反應(yīng)爸中，用稀硝酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=5，攪拌均勾，封閉反 應(yīng)釜，200°C恒溫加熱24h后，自然降至室溫;將反應(yīng)釜中溶液倒出靜置，待溶液中粉體沉淀 后，去除上清液，用蒸餾水洗滌粉體3次，每次靜置3h;將洗好的粉體加熱至80°C干燥12h，得 到 NaGd(W〇4)2 :Eu3+納米顆粒； (2) ZEN抗體的標(biāo)記 將ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液10000r/min離心30min，除去雜質(zhì)；用去離子水溶 解NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒，配制成濃度為0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，然后 用O.lmol/L K2C03溶液調(diào)節(jié)NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液至pH 8.2; 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+納米顆粒溶液，在攪拌狀態(tài)下，加入ZEN單克隆抗體或多克隆抗 體溶液1 〇〇μ 1，ZEN單克隆抗體或多克隆抗體溶液濃度lmg/mL，混勻，室溫溫育30miη，4 °C、 10000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀釋至 10mL，10000r/min 離心30min，沉淀用0.02mo 1/L Na2B4〇7溶液稀釋至lmL，4°C保存?zhèn)溆谩?br>【文檔編號(hào)】G01N33/558GK106066400SQ201610424509
【公開日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日 公開號(hào)201610424509.8, CN 106066400 A, CN 106066400A, CN 201610424509, CN-A-106066400, CN106066400 A, CN106066400A, CN201610424509, CN201610424509.8
【發(fā)明人】職愛民, 賈國(guó)超, 李鎂娟, 張培蕾, 周志友, 趙強(qiáng), 王自良, 宋蓮軍, 邱國(guó)慶
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