一種測定總膽汁酸的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定總膽汁酸的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒：試劑R1：Good’s緩沖液、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、曲拉通X?100、EDTA、丁基羥基茴香醚、疊氮鈉，試劑R2：Good’s緩沖液、3?α羥基類固醇脫氫酶、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、丁基羥基茴香醚、疊氮鈉。制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的總膽汁酸的濃度。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定總膽汁酸的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定總膽汁酸的試劑盒及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽汁酸是膽汁的重要成分，在脂肪代謝中起著重要作用，膽汁酸主要存在于腸肝 循環(huán)系統(tǒng)并通過再循環(huán)起一定的保護(hù)作用，只有一少部分膽汁酸進(jìn)入外圍循環(huán)，促進(jìn)膽汁 酸腸肝循環(huán)的動(dòng)力是肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，吸收膽汁酸并將其分泌入膽汁、縮膽囊素誘導(dǎo)的 膽囊收縮、小腸的推進(jìn)蠕動(dòng)，回腸黏膜的主動(dòng)運(yùn)輸及血液向門靜脈的流入。
[0003] 膽汁酸有助于脂肪的乳化，增強(qiáng)胰腺的脂解作用，并通過形成混合膠粒提高脂類 的溶解度，促進(jìn)腸道對脂類物質(zhì)的吸收，膽汁酸對脂肪吸收的重要作用由脂肪痢以及引起 腸道膽汁鹽濃度降低的癥狀如膽汁陰塞、肝硬化以及服用膽汁酸結(jié)合藥物等得以證實(shí)。
[0004] 膽汁酸為膽固醇代謝提供了一條重要的排泄途徑，三分之一的膽固醇的分解代謝 是通過膽汁酸合成實(shí)現(xiàn)的，吸收的膽汁酸對膽汁酸自身合成起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，因而也對 膽固醇的分解起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，膽汁酸可促進(jìn)膽汁中膽固醇的分泌，對保持膽固醇的溶 解性具有重要作用；膽汁酸可為腸道膽固醇的吸收所必須，肝臟中膽固醇合成的調(diào)節(jié)與膽 汁酸的腸肝循環(huán)密切相關(guān)，膽汁酸可調(diào)節(jié)腸道膽固醇的合成。
[0005] 目前檢測膽汁酸的方法主要為酶循環(huán)法，但此法隨著檢測時(shí)間的增長，試劑的穩(wěn) 定性逐漸下降，測定的準(zhǔn)確度也就變差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)穩(wěn)定性差、測定準(zhǔn)確度低的缺 陷，而提供一種測定總膽汁酸的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明公開了一種測定總膽汁酸的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液 體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Good's緩沖液 5CK130 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1.0~3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5-3.5 mL/L EDTA 30~50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 60~150 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 1.0~4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.5~5.0 KU/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定總膽汁酸的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和 試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Good's緩沖液 90 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2.0 KU/L 曲拉通X-100 2 mL/L EDTA 40 mmol/L 丁基羥基茴香醚 1.5 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 100 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 2.5 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸3 KU/L 丁基羥基茴香醚 1.7 g/L 疊氮鈉 〇.8g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定總膽汁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，包括 以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Good's緩沖液 50~130 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1.0~3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5~3.5 mL/L EDTA 30~50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 60~150 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 1.0~4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.5~5.0 KU/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的總膽汁酸的濃度。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。
[0011] 作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:100之間。
[0012] 本發(fā)明的檢測原理是：樣本中的膽汁酸在3α_羥基類固醇脫氫酶及Thio_NAD+(二 核苷酸氧化型）的作用下，特異性地氧化，生成3-酮類固醇及Thio-NADH(二核苷酸還原型）， 此外，生成的3-酮類固醇在3α-羥基類固醇脫氫酶及還原性輔酶I存在下，生成膽汁酸和NAD +，如此循環(huán)往復(fù)從而放大微量的膽汁酸量，在405nm處測定生成的Thio-NADH的吸光度變 化，求得膽汁酸量。
式中：ΔΑυ/min待測樣品平均每分鐘的吸光度變化值 Δ AB/min校準(zhǔn)液平均每分鐘的吸光度變化值 Cs校準(zhǔn)液中TBA的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明在酶循環(huán)法的基礎(chǔ)上添加了丁基羥基茴香醚作為抗氧化劑，疊氮鈉作為防腐 劑，使得酶的穩(wěn)定性大大提升，保存時(shí)間更長，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0015] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中： 試劑R1: Good's緩沖液 90 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L 曲拉通X-100 2 mL/L EDTA 40 mmol/L 丁基羥基茴香醚 1.5 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 100 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 2.5 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L 丁基羥基茴香醚 1.7 g/L 疊氮鈉 〇.8g/L 其溶劑為純化水。
[0016] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中： 試劑R1: Good's緩沖液 50 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5 mL/L EDTA 50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5 g/L 疊氮鈉 1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's 緩沖液 BOmmol /], 3-α羥基類固醇脫氫酶 4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5 KU/L 丁基羥基茴香醚 3.0 g/L 疊氮鈉 0.2 g/L 其溶劑為純化水。
[0017] 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Good's緩沖液 90 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L 曲拉通X-100 2 mL/L EDTA 40 mmol/L 丁基羥基茴香醚 1.5 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 100 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 2.5 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L 丁基羥基茴香醚 1.7 g/L 疊氮鈉 〇.8g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長：主波長340nm、副波長405nm; (C)反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度Al， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：負(fù)方向； 3、檢測步驟 (a) 取225μ1試劑R1與3μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ； (d) 根據(jù)樣本中總膽汁酸(TBA)的活性>計(jì)算出樣 本中的總膽汁酸的濃度。
[0018] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Good's緩沖液 50 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5 mL/L EDTA 50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5 g/L 疊氮鈉 1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's 緩沖液 BOmmol /], 3-α羥基類固醇脫氫酶 4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5 KU/L 丁基羥基茴香醚 3.0 g/L 疊氮鈉 0.2 g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長：主波長340nm、副波長405nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度A1， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)方向； 3、 檢測步驟 (a) 取225μ1試劑R1與3μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入75μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = Α2-Α1 ； (d)根據(jù)樣本中總膽汁酸(ΤΒΑ)的活性
計(jì)算出樣 本中的總膽汁酸的濃度。
[0019] 表1為實(shí)施例1所制得的測定總膽汁酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定總膽汁 酸的試劑盒分別對質(zhì)控品1進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的總膽汁酸的濃度為24.9 umol/L，測定結(jié)果見表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定總膽汁酸的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差較小， 因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0020] 表2為實(shí)施例1所制得的測定總膽汁酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定總膽汁酸的 試劑盒分別對質(zhì)控品2進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的總膽汁酸的濃度為51.7 umol/ L，測定結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定總膽汁酸的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差較小， 因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0021] 表3為實(shí)施例3所制得的測定總膽汁酸的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù) 測定以及實(shí)施例4所制得的測定總膽汁酸的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測定， 對所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下：
由表3可知本發(fā)明所制得的測定總膽汁酸的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知， 實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0022] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定總膽汁酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體 組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Good's緩沖液 50~130 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5-3.5 mL/L EDTA 30~50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 60~150 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 1.0~4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定總膽汁酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Good's緩沖液 90 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L 曲拉通X-100 2 mL/L EDTA 40 mmol/L 丁基羥基茴香醚 1.5 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 100 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 2.5 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L 丁基羥基茴香醚 1.7 g/L 疊氮鈉 〇.8g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定總膽汁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Good's緩沖液 50~130 mmol/L 氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L 曲拉通X-100 0.5-3.5 mL/L EDTA 30~50 mmol/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Good's緩沖液 60~150 mmol/L 3-α羥基類固醇脫氫酶 1.0~4.0 KU/L 還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L 丁基羥基茴香醚 0.5~3.0 g/L 疊氮鈉 0.2~1.4 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的總膽汁酸的濃度。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定總膽汁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(b)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為3:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定總膽汁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于：步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:100之 間。
【文檔編號】G01N21/77GK106092923SQ201610376081
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司