檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法，該方法包括：(1)將所述待測樣品與蒸餾水接觸，并進(jìn)行超聲和第一離心處理，獲得上清；(2)將所述上清進(jìn)行稀釋處理，所述稀釋后的上清中待測樣品的濃度為0.1mg/ml～4mg/ml；(3)將稀釋后的上清與脫氧膽酸鈉、TCA進(jìn)行接觸，并進(jìn)行第二離心處理，以便沉淀蛋白；(4)將沉淀后的蛋白與第一溶液和福林酚溶液接觸，并進(jìn)行孵育處理；(5)將孵育處理后的溶液進(jìn)行吸光度檢測；以及(6)基于吸光度檢測結(jié)果，確定待測樣品中蛋白含量。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測方法，能夠針對性地實(shí)現(xiàn)對廣金錢草中微量蛋白的準(zhǔn)確測定，檢測方法簡便、快速。
【專利說明】
檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣金錢草是一種藥用植物，具有利濕退黃、利尿通淋的功效。廣金錢草中含有豐富 的黃酮類物質(zhì)，另外，廣金錢草中還含有豐富的多糖、酚類以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
[0003] 如何對廣金錢草中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量分析，將為中藥廣金錢草的安全生產(chǎn)提供 重要的質(zhì)控證據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是基于發(fā)明人對以下問題和事實(shí)的發(fā)現(xiàn)而提出的：
[0005] 發(fā)明人經(jīng)過大量的研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的檢測蛋白質(zhì)含量的方法，如雙縮脲法、 BCA(Bicinchoninic acid)法和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)均無法實(shí)現(xiàn)對中藥廣金錢草中 的蛋白含量的檢測。雙縮脲法易受干擾物質(zhì)如硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等的影響， 無法滿足廣金錢草中的微量蛋白含量的檢測;BCA法靈敏度較低(80~400ug)，中藥成分中 的總黃酮、多糖、生物堿類和總酚類嚴(yán)重影響廣金錢草中蛋白含量的測定，造成假陽性結(jié) 果;Bradford法易受干擾物質(zhì)如去污劑、TritonX-100、SDS等影響，無法用于具有復(fù)雜成分 的廣金錢草中的蛋白含量的測定。
[0006] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提出了一種具有能夠快速、準(zhǔn)確測定中藥廣金錢草中蛋白含量的方法。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括:（1)將所述待測樣品與蒸餾水接觸，并進(jìn)行超聲和第一離心 處理，獲得上清;（2)將所述上清進(jìn)行稀釋處理，稀釋后的上清中待測樣品的濃度為0. lmg/ml~ 4mg/ml; (3)將稀釋后的上清與脫氧膽酸鈉、TCA進(jìn)行接觸，并進(jìn)行第二離心處理，以便沉淀獲得 蛋白；⑷將所述蛋白與第一溶液和福林酚溶液接觸，并進(jìn)行孵育處理;（5)將孵育處理后的溶液 進(jìn)行吸光度檢測;以及(6)基于吸光度檢測結(jié)果，確定待測樣品中蛋白含量。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí) 施例的檢測方法，能夠針對性地實(shí)現(xiàn)對廣金錢草中微量蛋白的準(zhǔn)確測定，檢測方法簡便、快速。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法還可以進(jìn)一步包括 如下附加技術(shù)特征至少之一：
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基于吸光度檢測結(jié)果，確定待測樣品中蛋白含量是通 過如下方式實(shí)現(xiàn)的:利用BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃 度是 280μg/ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10yg/ ml;將待測樣品的吸光度檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對應(yīng)，確定待測樣品中蛋白含量。發(fā) 明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在上述梯度條件下，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線更加適用于廣金 錢草樣品中微量蛋白含量的確定，能夠保證用于吸光度檢測的樣品濃度如果在lOμg/ml~ 280μg/ml范圍內(nèi)，則測出的結(jié)果的準(zhǔn)確度更高。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟⑴中，所述超聲是在功率為400W，頻率為40kHz的條 件下進(jìn)行的。發(fā)明人經(jīng)過超聲條件的篩選，發(fā)現(xiàn)超聲功率和頻率在上述條件下，可充分打碎 待測廣金錢草，使其中的可溶于水的物質(zhì)充分溶解于蒸餾水中，進(jìn)而保證后續(xù)對中藥廣金 錢草中蛋白含量的測定更加真實(shí)和準(zhǔn)確。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟（1)中，所述第一離心是在轉(zhuǎn)速為5000rpm的條件下 離心5min。發(fā)明人對第一離心條件進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在上述離心條件下，既可保證廣金錢草 中不溶于水的物質(zhì)被充分沉淀，又可保證溶于水中的蛋白成分不被沉淀出來。在本發(fā)明實(shí) 施例的上述離心條件下，最大限度地排除了廣金錢草中不溶于水的物質(zhì)對蛋白含量檢測的 干擾，進(jìn)一步提高了對中藥廣金錢草中蛋白含量測定的準(zhǔn)確性。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(2)中，所述稀釋后的上清中待測樣品的濃度為2mg/ml 或lmg/ml。發(fā)明人經(jīng)過大量的上清稀釋濃度的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上清中待測樣品的濃度稀釋到 2mg/ml或lmg/ml，可顯著稀釋待測樣品廣金錢草中影響蛋白含量測定的干擾物質(zhì)，將干擾物 質(zhì)的影響降到最低，在上述稀釋濃度下，測得的廣金錢草中蛋白含量更加真實(shí)、有效、準(zhǔn)確。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(3)中，所述第二離心是在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下 進(jìn)行30min。在步驟(3)中，稀釋后的上清與脫氧膽酸鈉、TCA進(jìn)行接觸，可將上清中的蛋白充 分沉淀。發(fā)明人經(jīng)過第二離心條件的篩選，發(fā)現(xiàn)在上述離心條件下，上清中的沉淀蛋白更加 高效、完全地沉淀到試管底部，同時(shí)又不會(huì)導(dǎo)致蛋白沉淀過緊而不易于后續(xù)的蛋白復(fù)溶。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一溶液含有試劑A和試劑B，所述試劑A和試劑B的體 積比為50:1，其中，試劑A為氫氧化鈉、碳酸鈉和水的混合溶液，所述氫氧化鈉在所述試劑A 中的含量為0.4% (質(zhì)量體積比，即每100ml溶劑A中含有0.4克氫氧化鈉），所述碳酸鈉在所 述試劑A中的的含量為2.0% (質(zhì)量體積比，即每100ml溶劑A中含有2.0克碳酸鈉），試劑B為 二水合酒石酸二鈉、五水硫酸銅和水的混合溶液，所述二水合酒石酸二鈉在所述試劑B中的 含量為1.192% (質(zhì)量體積比，即每100ml溶劑B中含有1.192克二水合酒石酸二鈉），所述五 水硫酸銅在所述試劑B中的含量為0.5% (質(zhì)量體積比，即每100ml溶劑B中含有0.5克五水硫 酸銅）。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述第一溶液，可將獲得的蛋白沉淀充分復(fù)溶，測得的廣 金錢草中的蛋白含量更加真實(shí)、準(zhǔn)確。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述吸光度檢測的檢測波長為700~800nm，優(yōu)選750nm。在 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的吸光度檢測波長下，測得的吸光度能更加真實(shí)地反映蛋白的含量。
[0016] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：（1)將400mg待測樣品溶于10蒸餾水，并在功率為400W， 頻率為40kHz的條件下進(jìn)行超聲處理，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的條件下進(jìn)行第一離心處理5min， 獲得上清，所述上清中待測樣品的濃度為40mg/ml; (2)將所述上清進(jìn)行稀釋處理，稀釋后的 上清中待測樣品的濃度為2mg/ml或lmg/ml; (3)將稀釋后的上清與1.5mg/ml的脫氧膽酸鈉、 72%的TCA進(jìn)行接觸，并在轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下進(jìn)行第二離心處理30min，以便沉淀蛋 白；（4)將沉淀后的蛋白與第一溶液和福林酚溶液接觸，并進(jìn)行孵育處理30min，其中，所述 第一溶液含有試劑A和試劑B，所述試劑A和試劑B的體積比為50:1，試劑A為氫氧化鈉、碳酸 鈉和水的混合溶液，所述氫氧化鈉在所述試劑A中的含量為0.4%，所述碳酸鈉在所述試劑A 中的的含量為2.0%，試劑B為二水合酒石酸二鈉、五水硫酸銅和水的混合溶液，所述二水合 酒石酸二鈉在所述試劑B中的含量為1.192%，所述五水硫酸銅在所述試劑B中的含量為 0.5%; (5)將孵育處理后的溶液進(jìn)行吸光度檢測，所述吸光度檢測的檢測波長為750nm;以 及（6)利用BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是280yg/ ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml;將待測 樣品的吸光度檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對應(yīng)，確定待測樣品中蛋白含量。利用根據(jù)本 發(fā)明實(shí)施例的上述檢測方法，可特異性實(shí)現(xiàn)對廣金錢草中蛋白含量的準(zhǔn)確測定。
【附圖說明】
[0017] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測廣金錢草中蛋白含量的方法流程圖；
[0018] 圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0019] 圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用本發(fā)明實(shí)施例的方法檢測多批次廣金錢草蛋白中 蛋白含量的統(tǒng)計(jì)圖；
[0020] 圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的采用Lowry法檢測廣金錢草中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； [0021 ]圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的采用雙縮脲法檢測廣金錢草中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； [0022]圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的采用BCA法檢測廣金錢草中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； [0023]圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的采用Bradford法檢測廣金錢草中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖；以及
[0024] 圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例8的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文 獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均 為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026] 在以下實(shí)施例中，所用試劑、樣品及儀器如表1~表3所示：
[0027] 表1:
[0029] 備注:試劑①配制方法為:取1 %氫氧化鈉溶液100ml與5 %碳酸鈉溶液100ml混合， 定容至250ml(其中，1%氫氧化鈉的配制方法為:稱取lg NaOH，溶于80ml純化水中，攪拌溶 解，定容至l〇〇ml; 5 %碳酸鈉的配制方法為:稱取5g NaOH，溶于80ml純化水中，攪拌溶解，定 容至 100ml)。
[0030] 試劑②配制方法為：取2.98 %二水合酒石酸二鈉溶液100ml與1.25 %五水硫酸銅 溶液l〇〇ml混合，定容至250ml (其中，2.98 %二水合酒石酸二鈉的配制方法為:稱取2.98g二 水合酒石酸二鈉，溶于80ml純化水中，攪拌溶解，定容至100ml。1.25%五水硫酸銅的配制方 法為:稱取1.25g五水硫酸銅，溶于80ml純化水中，攪拌溶解，定容至100ml)。
[0031 ]試劑③的配制方法為:試劑①:試劑②=50:1 (體積比），臨用新制，以防沉淀析出， 影響定量分析。
[0036] 實(shí)施例1檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法
[0037] 在本實(shí)施例中，詳細(xì)介紹了實(shí)驗(yàn)過程中所用標(biāo)準(zhǔn)品、溶液的制備過程以及檢測樣 品中蛋白含量的過程：
[0038] 1.1BSA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0039] 1)量取100μΙ 5mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品，加注射用水(純化水或蒸餾水)稀釋至500μ1，制 成濃度為lmg/ml BSA溶液，加適量注射用水依次稀釋到280μg/ml、140μg/ml、120μg/ml、100 μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml，每個(gè)梯度濃度用移液器吹打混勾三 次并短暫離心，再進(jìn)行下一梯度濃度的稀釋，每個(gè)梯度濃度平行2個(gè)復(fù)孔。
[0040] 2)陰性對照組為注射用水，測試時(shí)平行2個(gè)復(fù)孔。
[00411 1.2溶液的制備
[0042] 1)供試品（廣金錢草原料藥)溶液的制備:精密量取400mg供試品，加10ml注射用水 溶解，充分渦旋振蕩，超聲處理（功率400W，頻率40kHz)，終濃度為40mg/ml，5000rpm離心 5min，取上清。將上清用適量注射用水稀釋，使終濃度為0. lmg/ml~4mg/ml。其中2mg/ml用 于在以下實(shí)施例中用于混標(biāo)溶液的制備。
[0043] 2)混標(biāo)溶液制備：吸取50μ1步驟1)中的2mg/ml供試品，分別加入50μ1 80μg/ml和 280μg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吹打混勻，即制備為終濃度含lmg/ml+40μg/ml和lmg/ml+140yg/ ml的混標(biāo)溶液，以用于考察方法的準(zhǔn)確度(方法準(zhǔn)確度的可接受標(biāo)準(zhǔn)為：回收率應(yīng)在80 %~ 120%范圍內(nèi)）。
[0044] 3)空白對照為注射用水。
[0045] 1.3空白對照的制備
[0046] 為考察該方法的專屬性，即考察方法實(shí)施過程中，TCA沉淀是否會(huì)引入外源雜質(zhì)， 干擾目標(biāo)蛋白分子的檢測，在實(shí)驗(yàn)過程中將溶解供試品的空白溶劑(注射用水)設(shè)置兩組對 照分別進(jìn)行測定。
[0047] 兩組對照為：
[0048] 經(jīng)TCA沉淀處理(處理過程與供試品處理過程完全一致)的空白對照;未經(jīng)TCA
[0049] 沉淀處理(注射用水加入96孔板中，直接進(jìn)行0D750nm測定)的空白對照。
[0050] 進(jìn)而比較TCA處理組與未處理組檢測結(jié)果的差異。
[0051] 1.4樣品中蛋白含量的測定
[0052]以下，發(fā)明人以稀釋后的濃度為lmg/ml上清液為供試品，介紹蛋白含量的測定過程： [0053] 1)精密量取100μΙ上述lmg/ml供試品、各濃度梯度BSA標(biāo)準(zhǔn)品或各濃度混標(biāo)溶液， 分別加入1〇μ1 1.5mg/ml脫氧膽酸鈉，禍旋混勾，室溫放置10min。
[0054] 2)向步驟1)中樣品分別加入10μ1 72 %三氯醋酸，渦旋混勻，12000rpm30min離心 30min。輕輕吸去上清，加入100μΙ試液③復(fù)溶管底蛋白沉淀，再加入500μ1試液③，混勻，室 溫放置l〇min。
[0055] 3)上述復(fù)溶后樣品分別加入50μ1福林酚，立即混勻，室溫孵育30min。孵育完畢后， 轉(zhuǎn)移100~200μ1樣品至96孔板中。
[0056] 4)酶標(biāo)儀開機(jī)預(yù)熱30min后，將96孔板置于酶標(biāo)儀，并在750nm處讀取吸光值。
[0057] 5)根據(jù)各濃度梯度BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而將測得的供試品或各濃度混標(biāo) 溶液的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得供試品或各濃度混標(biāo)溶液中蛋白含量。
[0058] 為方便理解，發(fā)明人將上述檢測廣金錢草中蛋白含量的方法繪成流程圖，如圖1所示。
[0059] 實(shí)施例2專屬性研究
[0060] 為驗(yàn)證本發(fā)明實(shí)施例的測定廣金錢草中蛋白含量方法的專屬性，發(fā)明人設(shè)置兩組 對照(如實(shí)施例1所述)分別進(jìn)行了測定。測定結(jié)果如表4所示：
[0061] 表4:
[0063] 空白對照(注射用水)經(jīng)TCA沉淀和未經(jīng)TCA沉淀操作過程所測得的0D750nm吸光值 無差異，表明該方法專屬性良好，說明TCA沉淀過程中未引入外源雜質(zhì)(對目標(biāo)蛋白檢測無 干擾），該法可良好檢測目標(biāo)蛋白的含量。
[0064] 實(shí)施例3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0065]分別測定8個(gè)濃度梯度下的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液(如實(shí)施例1所述)的0D750nm吸光值，計(jì) 算平均值，扣除陰性對照零點(diǎn)，以扣除零點(diǎn)后的8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的吸光值如 表5所示，BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度對0D750nm的吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。
[0066] 表5: BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值
[0068] 表5和圖2結(jié)果表明，該方法線性相關(guān)性良好，可用于目標(biāo)蛋白含量檢測。
[0069] 實(shí)施例4供試品和混標(biāo)溶液蛋白含量測定
[0070] 將稀釋至lmg/ml供試品廣金錢草溶液按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行測定蛋白含量， 平行三個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果如下表6所示。
[0071] 表6供試品蛋白含量測定
[0073] 將終濃度含lmg/ml+40μg/ml和lmg/ml + 140μg/ml的混標(biāo)溶液按照實(shí)施例1所述測 定蛋白含量的方法進(jìn)行測定，平行三個(gè)重復(fù)，測定結(jié)果如下表7所示。
[0074] 表7 :混標(biāo)溶液蛋白含量測定
[0076] 由表7可以看出，低濃度點(diǎn)和高濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收率分別為100.18%和100.83%， 結(jié)果表明實(shí)施例1所述的方法的準(zhǔn)確度高，可對中藥組分中的蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0077] 實(shí)施例5應(yīng)用（多批次蛋白含量測定）
[0078] 發(fā)明人采用該方法進(jìn)行了多批次廣金錢草蛋白含量的測定，結(jié)果如下表8所示。 [0079]表8:多批次供試品蛋白含量測定
[0081 ]以不同批次供試品的批次為橫坐標(biāo)，蛋白含量為縱坐標(biāo)作圖，如圖3所示。
[0082]表8和圖3表明，采用該方法能夠應(yīng)用于測定多批次廣金錢草蛋白含量，測得結(jié)果 準(zhǔn)確、可靠，本發(fā)明的方法可用于成分復(fù)雜的中藥廣金錢草蛋白含量的測定。
[0083]實(shí)施例6供試品上清稀釋濃度的篩選 [0084]條件 1:
[0085]將供試品上清稀釋至0.1mg/ml，按照本發(fā)明所述方法進(jìn)行測定，平行三個(gè)重復(fù)，試 驗(yàn)結(jié)果如表9所示。
[0086] 表9:0. lmg/ml供試品蛋白含量測定結(jié)果
[0088]采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行供試品蛋白含量測定，測得供試品0D750nm吸光值與陰 性對照吸光值無明顯差別，表明供試品在0. lmg/ml稀釋濃度，供試品響應(yīng)信號已低于方法 的最低檢測限，無法對供試品中蛋白含量進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品上清須至少稀 釋至0. lmg/ml以上，才能保證供試品測定結(jié)果產(chǎn)生陽性信號。
[0089]條件 2:
[0090]將供試品上清稀釋至4mg/ml，按照本發(fā)明所述方法進(jìn)行測定，平行三個(gè)重復(fù)，試驗(yàn) 結(jié)果如下表10所示。
[0091 ] 表10:4mg/ml供試品蛋白含量測定結(jié)果
[0093] 采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行供試品蛋白含量測定，供試品在4mg/ml稀釋濃度下，測 得供試品〇D750nm吸光值在標(biāo)準(zhǔn)定量點(diǎn)的上限以內(nèi)，測得的蛋白含量的較準(zhǔn)確。但供試品在 4mg/ml稀釋濃度下，接近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)定量上限(280μg/ml) 0D750nm吸光值(0.4616)，若上清稀釋濃 度高于4mg/ml則供試品0D750值不在線性范圍內(nèi)，則無法對供試品中蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0094] 發(fā)明人結(jié)合本實(shí)施例條件1和條件2的結(jié)果，最終確定供試品上清稀釋濃度應(yīng)為 0.1~4mg/ml范圍內(nèi)，即應(yīng)大于0. lmg/ml，并且不大于4mg/ml，對廣金錢草樣品中蛋白含量 的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0095] 實(shí)施例7
[0096] 發(fā)明人前期在對廣金錢草中蛋白含量的測定方法進(jìn)行了大量篩選工作，篩選過程 中，發(fā)明人在不同的方法下對本底的稀釋濃度也進(jìn)行了篩選(如以下方法1~方法4所述）， 篩選結(jié)果表明，廣金錢草基質(zhì)效應(yīng)明顯，干擾物質(zhì)太多，利用現(xiàn)有的方法均無法對蛋白含量 進(jìn)行準(zhǔn)確定量，呈現(xiàn)明顯的假陽性結(jié)果。
[0097] 方法lLowry法檢測廣金錢草中蛋白含量
[0098] 試劑堿性銅試液取Na0H5g，NaC03 25g加水200ml溶解，作為甲液；取酒石酸鉀 0.25g加水25ml溶解，另取CuS04 0.125g，加水15ml使溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前合 并甲乙液，并加水250ml，即得。
[0099] (l)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0100] 5mg/ml BSA母液加水稀釋10倍，濃度為500ug/ml，再加水依次稀釋到終濃度為 140/120/100/80/60/40/20/10ug/ml〇
[0101] (2)供試品溶液的制備
[0102] 稱取100mg供試品加入100ml水，混勾，濃度為Ιπ^/ηιυΟΟΟΓρηι離心5min，取上清。lmg/ ml供試品加水稀釋10倍，濃度為100ug/ml，加水依次稀釋到終濃度為80/60/40/20/10ug/ml。 [0103] (3)混標(biāo)溶液的制備
[0104] lmg/ml供試品加水稀釋成終濃度為20/40/80/120/160/200ug/ml的樣品。20/40/ 80/120/160/200ug/ml供試品分別加入等體積的80ug/mlBSA，混勻，制成終濃度為10/20/ 40/60/80/100ug/ml 供試品加 40ug/mlBSA 的混標(biāo)溶液。
[0105] (4)蛋白含量測定
[0106] a. lOOul BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和供試品加標(biāo)溶液加入lOOul堿性銅試液， 混勻，室溫靜置l〇min。
[0107] b.加入50ml福林酚立即混勻，室溫靜置30min。
[0108] c.用酶標(biāo)儀在600nm處測定吸光度;同時(shí)以稀釋用水作為空白。
[0109] d.以對照品溶液濃度與其對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。從線性回歸方程計(jì)算 供試品和供試品加標(biāo)溶液中蛋白的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)即得供試品中蛋白濃度，并同計(jì) 算其回收率。
[0110] (5)試驗(yàn)結(jié)果
[0111] a.標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光值見表11.
[0112] 表11:標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光值
[0115] 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。
[0116] b.供試品溶液吸光值如表12所示
[0117] 表12:供試品溶液吸光值
[0119] c.混標(biāo)溶液吸光值及回收率如表13所示 [0120] 表13:混標(biāo)溶液吸光值及回收率
[0122] 表12和表13的試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然回收率結(jié)果符合可接受標(biāo)準(zhǔn)(80 %~120 % )，但 供試品溶液蛋白測定結(jié)果高于或略低于稀釋本底樣品濃度(如表12所示），呈現(xiàn)明顯假陽性 結(jié)果（即廣金錢草成分中不可能100%全部為蛋白質(zhì)），說明廣金錢草中存在某種"偽蛋白"， 對加標(biāo)回收混標(biāo)溶液的測定結(jié)果無影響，但嚴(yán)重干擾了供試品本底的測定。
[0123] 本條件表明，該方法不適宜作為廣金錢草中蛋白含量的測定。
[0124] 方法2雙縮脲法檢測廣金錢草中蛋白含量
[0125] 試劑雙縮脲試劑取CuS04 0.75g、酒石酸鉀鈉3.0g和碘化鉀2.5g加水250ml使溶 解，邊攪拌邊加入10%NaOH溶液150ml，用水稀釋至500ml，混勻，即得。
[0126] (l)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0127] 5mg/ml BSA母液加水稀釋，依次稀釋至終濃度為1.4/1.2/1.0/0.8/0.6/0.4/0.2/ 0·lmg/ml〇
[0128] (2)供試品溶液的制備
[0129] 10mg/ml供試品溶液5000rpm離心5min，取上清。加水稀釋10倍（10*)和20倍（20*)， 即終濃度分別為lmg/ml和0.5mg/ml。
[0130] (3)混標(biāo)溶液的制備
[0?31 ] 取lmg/ml供試品與0.8mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合，制成終濃度為0.5mg/ml供試 品加0.4mg/ml BSA的混標(biāo)溶液，用于考察方法的準(zhǔn)確度。
[0132] (4)蛋白含量測定
[0133] a.吸取1.0ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和混標(biāo)標(biāo)溶液加入雙縮脲試液4.0ml， 立即混勻，室溫靜置30min。
[0134] b.用酶標(biāo)儀在540nm處測定吸光度;同時(shí)以稀釋用水作為空白。
[0135] c.以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與其對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。從線性回歸方程計(jì)算供 試品和混標(biāo)溶液中蛋白的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)即得供試品中蛋白濃度，并同時(shí)計(jì)算其回收率。
[0136] (5)試驗(yàn)結(jié)果
[0137] a.標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度測定結(jié)果如表14所示。
[0138] 表14標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度0D540nm
[0141] 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。
[0142] b.供試品溶液、混標(biāo)溶液吸光值如表15所示
[0143] 表15:供試品溶液、混標(biāo)溶液吸光值及回收率
[0145] 表15的試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然回收率結(jié)果符合可接受標(biāo)準(zhǔn)(80%~120%)，但不同濃 度供試品溶液蛋白測定結(jié)果都高于稀釋本底供試品濃度，呈現(xiàn)明顯假陽性結(jié)果，說明廣金 錢草中存在某種"偽蛋白"，對加標(biāo)回收混標(biāo)溶液的測定結(jié)果無影響，但嚴(yán)重干擾了供試品 本底的測定。
[0146] 本條件表明，該方法不適宜作為廣金錢草中蛋白含量的測定。
[0147] 方法3BCA法檢測廣金錢草中蛋白含量
[0148] (l)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0149] 5mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品母液加水稀釋，依次稀釋至終濃度為25/50/100/200/300/400/ 500μg/ml〇
[0150] (2)供試品溶液的制備
[0151 ] 10mg/ml供試品溶液5000rpm離心5min，取上清。加水稀釋至終濃度分別為lmg/ml、0 · 8mg/ ml、0 · 4mg/ml、0 · 2mg/ml、0 · lmg/ml、0 · 08mg/ml、0 · 06mg/ml、0 · 04mg/ml、0 · 02mg/ml 和0 · 0 lmg/ml。
[0152] (3)混標(biāo)溶液的制備
[0153] 分別取0.08mg/ml和0· 16mg/ml供試品與200μg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合，分別制 成終濃度為0.04mg/ml供試品加100μg/ml BSA的混標(biāo)溶液和終濃度為0.08mg/ml供試品加 lOOμg/ml BSA的混標(biāo)溶液，用于考察方法的準(zhǔn)確度。
[0154] (4)蛋白含量測定
[0155] a.按照試劑盒說明書(BCA蛋白濃度測定試劑盒P0012,碧云天）要求加適量(一般 為20~25μ1)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品到96孔板中，每個(gè)樣品2個(gè)平行。
[0156] b.加入200μ1工作液，混勻，在試劑盒說明書要求下37°C孵育30min。（BCA法測定蛋 白濃度時(shí)，吸光度會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃 度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時(shí)間），放冷。
[0157] c.用酶標(biāo)儀在562nm測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品蛋白濃度。
[0158] (5)試驗(yàn)結(jié)果
[0159] a.標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度測定結(jié)果如表16所示。
[0160] 表16:標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度0D562nm
[0162] 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。
[0163] b.供試品溶液、混標(biāo)溶液吸光值如表17所示
[0164] 表17:供試品溶液、混標(biāo)溶液吸光值及回收率
[0167] 表17的試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然回收率結(jié)果符合可接受標(biāo)準(zhǔn)(80%~120%)，但不同濃 度供試品溶液蛋白測定結(jié)果高于或略低于稀釋本底供試品濃度，呈現(xiàn)明顯假陽性結(jié)果，說 明廣金錢草中存在某種"偽蛋白"，對加標(biāo)回收混標(biāo)溶液的測定結(jié)果無影響，但嚴(yán)重干擾了 供試品本底的測定。
[0168] 本條件表明，該方法不適宜作為廣金錢草中蛋白含量的測定。
[0169] 方法4Bradford法檢測廣金錢草中蛋白含量
[0170] 試劑酸性染色液取考馬斯亮藍(lán)G250 0.Olg加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀釋 至100ml，混勻。過濾，取濾液即得。本試劑應(yīng)置棕色瓶內(nèi)，如有沉淀產(chǎn)生，使用前需經(jīng)過濾。
[0171] (l)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0172] 5mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品母液加水稀釋10倍，濃度為500μg/ml，再加水依次稀釋至終濃 度為 140/120/100/80/60/40/20/10μg/ml。
[0173] (2)供試品溶液的制備
[0174] 10mg/ml供試品溶液5000rpm離心5min，取上清。加水稀釋至終濃度分別為lmg/ml、 0·lmg/ml和0·01mg/ml。
[0175] (3)蛋白含量測定
[0176] a. lOOul BSA對照品溶液、供試品溶液加入5.Oml酸性染色液，立即混勻。
[0177] b.立即用酶標(biāo)儀在595nm處測定吸光度；同時(shí)以稀釋用水作為空白。
[0178] c.以對照品溶液濃度與其對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。從線性回歸方程計(jì)算 供試品和供試品加標(biāo)溶液中蛋白的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)即得供試品中蛋白濃度。
[0179] (5)試驗(yàn)結(jié)果
[0180] a.標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度測定結(jié)果如表18所示。
[0181] 表18標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度0D562nm
[0184] 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。
[0185] b.供試品溶液溶液吸光值
[0186] 表19不同濃度供試品溶液吸光值
[0188]表19的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度供試品溶液蛋白測定結(jié)果高于或略低于稀釋本底 供試品濃度，呈現(xiàn)明顯假陽性結(jié)果。
[0189] 本條件表明，該方法不適宜作為廣金錢草中蛋白含量的測定。
[0190] 方法1、2、3、4的試驗(yàn)結(jié)果表明，利用方法1~方法4的方法，雖然發(fā)明人對樣品的稀 釋濃度進(jìn)行了篩選，但均無法實(shí)現(xiàn)對廣金錢草中蛋白含量的檢測。
[0191 ]實(shí)施例8檢測其它物質(zhì)蛋白含量
[0192]發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例1所描述的方法對某種中藥E2進(jìn)行了蛋白含量檢測。 [0193] 發(fā)明人將供試品稀釋至0· lmg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，并同時(shí)制備混標(biāo)溶 液，混標(biāo)溶液為lmg/ml供試品加1 Oug/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)品、2mg/ml供試品加1 Oug/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn) 品以及4mg/ml供試品加1 Oug/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，檢測步驟同實(shí)施例1所述，檢測結(jié)果如表20、 表21和表22所示。其中，表20為標(biāo)準(zhǔn)品BSA在0D750nm吸光度，表21為供試品0D750nm測定結(jié) 果，表22為混標(biāo)溶液吸光值及回收率。
[0194] 表20:不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品0D750nm吸光值
[0196] 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖8所示。
[0197] 表20和圖8結(jié)果表明，該方法線性相關(guān)性良好，系統(tǒng)適應(yīng)性合格。
[0198] 表21:不同濃度供試品溶液0D750吸光值
[0200] 表22:混標(biāo)溶液0D750吸光值及回收率
[0202] 由表21和表22結(jié)果可知，供試品稀釋至0.1~4.Omg/ml，采用實(shí)施例1所述的方法 測得某種中藥E2中蛋白的0D750nm吸光值已接近該法的檢測下限lOug/ml，對檢測下限值 l〇Ug/ml進(jìn)行加標(biāo)回收，回收率不符合可接受標(biāo)準(zhǔn)80%~120%，進(jìn)而利用實(shí)施例1所述的方 法無法對供試品中蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因此，利用本發(fā)明實(shí)施例1所述的方法無法實(shí)現(xiàn)中藥 E2中的蛋白含量進(jìn)行定量分析。
[0203] 綜合實(shí)施例7和實(shí)施例8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，本發(fā)明所提出的檢測廣金錢草中蛋 白含量的方法可專屬性地、準(zhǔn)確地檢測廣金錢草中的蛋白含量。
[0204] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不 必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任 一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié) 合和組合。
[0205] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述 實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法，其特征在于，包括： (1) 將所述待測樣品與蒸餾水接觸，并進(jìn)行超聲和第一離心處理，獲得上清； (2) 將所述上清進(jìn)行稀釋處理，稀釋后的上清中待測樣品的濃度為0. lmg/ml~4mg/ml; (3) 將稀釋后的上清與脫氧膽酸鈉、TCA進(jìn)行接觸，并進(jìn)行第二離心處理，以便沉淀獲得 蛋白； (4) 將所述蛋白與第一溶液和福林酚溶液接觸，并進(jìn)行孵育處理； (5) 將孵育處理后的溶液進(jìn)行吸光度檢測；以及 (6) 基于吸光度檢測結(jié)果，確定待測樣品中蛋白含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于吸光度檢測結(jié)果，確定待測樣品 中蛋白含量是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的： 利用BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是280μg/ml、 140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml; 將待測樣品的吸光度檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對應(yīng)，確定待測樣品中蛋白含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（1)中，所述超聲是在功率為400W， 頻率為40kHz的條件下進(jìn)行的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（1)中，所述第一離心是在轉(zhuǎn)速為 5000rpm的條件下離心5min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述稀釋后的上清中待測樣 品的濃度為2mg/ml或lmg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，所述第二離心是在轉(zhuǎn)速為 12000rpm的條件下進(jìn)行30min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶液含有試劑A和試劑B，所述試 劑A和試劑B的體積比為50:1， 其中，試劑A為氫氧化鈉、碳酸鈉和水的混合溶液，所述氫氧化鈉在所述試劑A中的含量 為0.4 %，所述碳酸鈉在所述試劑A中的的含量為2.0 %， 試劑B為二水合酒石酸二鈉、五水硫酸銅和水的混合溶液，所述二水合酒石酸二鈉在所 述試劑B中的含量為1.192%，所述五水硫酸銅在所述試劑B中的含量為0.5%。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸光度檢測的檢測波長為700~ 800nm，優(yōu)選750nm。9. 一種檢測中藥廣金錢草蛋白含量的方法，其特征在于，包括： (1) 將400mg待測樣品溶于10毫升蒸餾水，并在功率為400W，頻率為40kHz的條件下進(jìn)行 超聲處理，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的條件下進(jìn)行第一離心處理5min，獲得上清，所述上清中待測 樣品的濃度為40mg/m 1; (2) 將所述上清進(jìn)行稀釋處理，稀釋后的上清中待測樣品的濃度為2mg/ml或lmg/ml; (3) 將稀釋后的上清與1.5mg/ml的脫氧膽酸鈉、72%的TCA進(jìn)行接觸，并在轉(zhuǎn)速為 12000rpm的條件下進(jìn)行第二離心處理30min，以便沉淀蛋白； (4) 將沉淀后的蛋白與第一溶液和福林酚溶液接觸，并進(jìn)行孵育處理30min，其中，所述 第一溶液含有試劑A和試劑B，所述試劑A和試劑B的體積比為50:1，試劑A為氫氧化鈉、碳酸 鈉和水的混合溶液，所述氫氧化鈉在所述試劑A中的含量為0.4%，所述碳酸鈉在所述試劑A 中的的含量為2.0%，試劑B為二水合酒石酸二鈉、五水硫酸銅和水的混合溶液，所述二水合 酒石酸二鈉在所述試劑B中的含量為1.192%，所述五水硫酸銅在所述試劑B中的含量為 0.5% ； (5) 將孵育處理后的溶液進(jìn)行吸光度檢測，所述吸光度檢測的檢測波長為750nm;以及 (6) 利用BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是280yg/ ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml; 將待測樣品的吸光度檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對應(yīng)，確定待測樣品中蛋白含量。
【文檔編號】G01N21/31GK106092926SQ201610383266
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日 公開號201610383266.8, CN 106092926 A, CN 106092926A, CN 201610383266, CN-A-106092926, CN106092926 A, CN106092926A, CN201610383266, CN201610383266.8
【發(fā)明人】王學(xué)海, 周昌茂, 馮蕓, 尹海龍, 許勇, 趙格寧, 黃璐, 肖強(qiáng), 劉哲
【申請人】武漢光谷人福生物醫(yī)藥有限公司, 武漢珂美立德生物醫(yī)藥有限公司, 湖北生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司, 人福醫(yī)藥集團(tuán)股份公司