一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，本發(fā)明對(duì)固相萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得固相萃取的時(shí)間縮短、效率變高，而高效液相色譜方法分析洛美沙星對(duì)映體的濃度精度高，速度快，操作簡(jiǎn)單、成本較低；檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)化合物的線性關(guān)系好，回收率高，相對(duì)偏差小，使用的試劑低毒，使用量少，對(duì)環(huán)境友好。
【專利說(shuō)明】
一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種快速高效檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]洛美沙星為喹諾酮類抗菌藥。對(duì)腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、志賀菌屬、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬等具有高度的抗菌活性;流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等對(duì)該品亦呈現(xiàn)高度敏感;對(duì)不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等假單胞菌屬、葡萄球菌屬和肺炎球菌、溶血性鏈球菌等亦有一定的抗菌作用。該品通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而起殺菌作用。目前已在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。
[0003]目前手性藥物對(duì)映體的常用分離方法有結(jié)晶法、動(dòng)力學(xué)方法、酶拆分法和色譜法等，這些方法應(yīng)用廣泛，促進(jìn)了手性藥物的研究和發(fā)展。然而，這些方法也存在一些不足之處，如結(jié)晶法操作繁瑣、分離時(shí)間長(zhǎng)、適用性窄，酶拆分法對(duì)酶的專一性有較高要求，分離成本較高，而色譜拆分法是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有結(jié)晶法檢測(cè)洛美沙星對(duì)映體成本高、分離時(shí)間長(zhǎng)，適用性窄，操作復(fù)雜，精度不高的缺陷而提供一種快速、精度高，操作簡(jiǎn)單、成本較低的檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動(dòng)相將洛美沙星溶解并稀釋配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的洛美沙星溶液，料液比為lg: 120-150mL，振蕩后加入無(wú)水硫酸銅及單乙醇胺，8000-12000rpm離心處理l〇-15min，取上清液，殘?jiān)脝我掖及啡芙獠㈦x心處理，合并上清液備用；3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2-3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層， 將剩余溶液過(guò)柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負(fù)壓抽干，分2-5次洗脫，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于30_35°C水浴中，氮?dú)獯蹈?，殘余物用乙醇?fù)溶，微孔納濾，濾液備用；4)采用高效液相色譜儀對(duì)步驟3)得到的濾液進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)時(shí)選用CHIRALCEL 0D-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯。在本技術(shù)方案中， 本發(fā)明所用的萃取方法效果好，時(shí)間短，降低了試劑的消耗量。
[0006]作為優(yōu)選，步驟3)中，依次用甲醇、二對(duì)甲苯甲酰-1-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
[0007]作為優(yōu)選，水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4-0.7%。
[0008]作為優(yōu)選，步驟3)洗脫液為含體積分?jǐn)?shù)15%的甲醇溶液，過(guò)柱的流速為6-9mL/min，洗脫液流速為1.2-1.5mL/min。
[0009]作為優(yōu)選，纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯的制備方法為:將纖維素纖維放入45-55 °C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25-30%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽(yáng)離子聚丙烯酰胺類化合物，55-85kw的功率下超聲處理20-30min，然后升溫至150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯，反應(yīng)2-4h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。
[0010]作為優(yōu)選，纖維素纖維為粘膠纖維或棉纖維。
[0011]作為優(yōu)選，無(wú)水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL。[〇〇12]作為優(yōu)選，高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL 0D-H;流動(dòng)相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙醇中含有體積比為0.4 %的冰乙酸和0.5 %的三乙胺)；流速:0.7mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng):294nm;進(jìn)樣量:20yL;柱溫:25 °C 〇
[0013]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對(duì)固相萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得固相萃取的時(shí)間縮短、效率變高，而高效液相色譜方法分析洛美沙星對(duì)映體的濃度精度高，速度快，操作簡(jiǎn)單、 成本較低;檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)化合物的線性關(guān)系好，回收率高，相對(duì)偏差小，使用的試劑低毒， 使用量少，對(duì)環(huán)境友好?！靖綀D說(shuō)明】
[0014]圖1為實(shí)施例1的色譜圖。
[0015]圖中，1為左洛美沙星;2為右洛美沙星?！揪唧w實(shí)施方式】
[0016]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0017]在本發(fā)明中，若非特指，所有設(shè)備和原料均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的，下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。
[0018]高效液相色譜儀Agilent 1200購(gòu)自安捷倫(中國(guó))科技有限公司；水浴氮吹儀WD-12購(gòu)自河南天馳儀器設(shè)備有限公司；固相萃取儀HSE-12B購(gòu)自天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；固相萃取柱Waters Oasis HLB購(gòu)自杭州伽鈦科學(xué)儀器有限公司；冰乙酸(分析純)、三乙胺(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;洛美沙星購(gòu)自大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司。[〇〇19] 高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL 0D-H;流動(dòng)相:正己烷-乙醇(20:80， v/v，乙醇中含有體積比為0.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng): 294nm;進(jìn)樣量:20yL;柱溫:25 °C 〇
[0020] 實(shí)施例1一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動(dòng)相將洛美沙星溶解并稀釋配置成50yg/mL的溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的洛美沙星溶液，料液比為lg: 150mL，振蕩后加入無(wú)水硫酸銅及單乙醇胺，12000rpm離心處理15min，取上清液，殘?jiān)脝我掖及啡芙獠㈦x心處理，合并上清液備用;無(wú)水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過(guò)柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負(fù)壓抽干，分5次洗脫，洗脫液為含體積分?jǐn)?shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.5mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于35°C水浴中，氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉靡掖紡?fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對(duì)甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7% ;過(guò)柱的流速為9mL/min;4)采用高效液相色譜儀對(duì)步驟3)得到的濾液進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)時(shí)選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯。
[0021]纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入55°C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽(yáng)離子聚丙烯酰胺類化合物，85kw的功率下超聲處理30min，然后升溫至 150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯，反應(yīng)4h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇22] 實(shí)施例2一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動(dòng)相將洛美沙星溶解并稀釋配置成40yg/mL的溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的洛美沙星溶液，料液比為lg: 120mL，振蕩后加入無(wú)水硫酸銅及單乙醇胺，8000rpm離心處理lOmin，取上清液，殘?jiān)脝我掖及啡芙獠㈦x心處理，合并上清液備用;無(wú)水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過(guò)柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負(fù)壓抽干，分2次洗脫，洗脫液為含體積分?jǐn)?shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.2mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于30°C水浴中，氮?dú)獯蹈?，殘余物用乙醇?fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對(duì)甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4% ;過(guò)柱的流速為6mL/min;4)采用高效液相色譜儀對(duì)步驟3)得到的濾液進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)時(shí)選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯。[〇〇23]纖維素_對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入45°C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽(yáng)離子聚丙烯酰胺類化合物，55kw的功率下超聲處理20min，然后升溫至 150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯，反應(yīng)2h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇24] 實(shí)施例3一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動(dòng)相將洛美沙星溶解并稀釋配置成45iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的洛美沙星溶液，料液比為lg: 130mL，振蕩后加入無(wú)水硫酸銅及單乙醇胺，9000rpm離心處理12min，取上清液，殘?jiān)脝我掖及啡芙獠㈦x心處理，合并上清液備用;無(wú)水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為lg水產(chǎn)品加入20mL;3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層，將剩余溶液過(guò)柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負(fù)壓抽干，分3次洗脫，洗脫液為含體積分?jǐn)?shù)15%的甲醇溶液，洗脫液流速為1.3mL/min，洗脫后的溶液在氮吹儀內(nèi)于33°C水浴中，氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉靡掖紡?fù)溶，微孔納濾，濾液備用；依次用甲醇、二對(duì)甲苯甲酰-L-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水楊酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5.4%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% ;過(guò)柱的流速為7mL/min;4)采用高效液相色譜儀對(duì)步驟3)得到的濾液進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)時(shí)選用CHIRALCEL OD-H手性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯。[〇〇25]纖維素_對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯的制備方法為:將粘膠纖維或棉纖維放入50°C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖維質(zhì)量5倍陽(yáng)離子聚丙烯酰胺類化合物，65kw的功率下超聲處理24min，然后升溫至 150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯，反應(yīng)3h，冷卻后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇26]分別稱取lmg左洛美沙星、右洛美沙星，置于100mL容量瓶中，用空白海水定容，超聲搖勻后，實(shí)施例1的步驟經(jīng)高效液相色譜儀檢測(cè)后，所得色譜圖示于圖1。[〇〇27]洛美沙星對(duì)映體濃度在0.04mg/L-10mg/L范圍內(nèi)與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。 以X表示濃度，Y表示洛美沙星對(duì)映體峰面積，左洛美沙星和右洛美沙星的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為7=113.93叉-7.2217、1?2 = 0.9994及7 = 117.71叉-9.9342、1?2 = 0.9998。在空白海水中添加0.lmg/L、5mg/L和15mg/L這3個(gè)濃度的洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)添加濃度平行操作3次，計(jì)算回收率和精密度，左洛美沙星及右洛美沙星的樣品平均回收率分別為88.53 %和89.26%，日間精密度分別為分別為5.71 %和4.25%，定量限均為0?04mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在于，包括以下步驟:1)用體積比90%:10%的異丙醇與正庚烷的混合物作為流動(dòng)相將洛美沙星溶解并稀釋 配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾；2)取勻漿后的水產(chǎn)品置于離心管中，加入步驟1)配置的洛美沙星溶液，料液比為lg: 120-150mL，振蕩后加入無(wú)水硫酸銅及單乙醇胺，8000-12000rpm離心處理l〇-15min，取上清 液，殘?jiān)脝我掖及啡芙獠㈦x心處理，合并上清液備用；3)在步驟2)的上清液中加入上清液體積2-3倍的正己烷溶液，靜置分層后棄正己烷層， 將剩余溶液過(guò)柱萃取，萃取完成后用去離子水淋洗，負(fù)壓抽干，分2-5次洗脫，洗脫后的溶液 在氮吹儀內(nèi)于30_35°C水浴中，氮?dú)獯蹈?，殘余物用乙醇?fù)溶，微孔納濾，濾液備用；4)采用高效液相色譜儀對(duì)步驟3)得到的濾液進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)時(shí)選用CHIRALCEL OD-H手 性柱，該手性柱的填料為5y硅膠表面涂布纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在于，步驟 3)中，依次用甲醇、二對(duì)甲苯甲酰-1-酒石酸，含檸檬酸鐵銨的水楊酸水溶液活化HLB固相萃 取柱。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在于，水楊 酸水溶液中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-6.5%，檸檬酸鐵銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4-0.7%。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在于， 步驟3)洗脫液為含體積分?jǐn)?shù)15 %的甲醇溶液，過(guò)柱的流速為6-9mL/min，洗脫液流速為1.2-1?5mL/min〇5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在 于，纖維素-對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯的制備方法為:將纖維素纖維放入45-55°C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 25-30%的氫氧化鉀溶液中，然后加入纖維素纖維質(zhì)量2倍的環(huán)氧季銨鹽化合物和纖維素纖 維質(zhì)量5倍陽(yáng)離子聚丙烯酰胺類化合物，55-85kw的功率下超聲處理20-30min，然后升溫至 150°C，加入纖維素纖維質(zhì)量10倍的對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯，反應(yīng)2-4h，冷卻后水洗，用醋酸中 和至中性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在于，纖維 素纖維為粘膠纖維或棉纖維。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在 于，無(wú)水硫酸銅的加入量為水產(chǎn)品的質(zhì)量的3倍，單乙醇胺的加入量為1 g水產(chǎn)品加入20mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種檢測(cè)水產(chǎn)品中洛美沙星對(duì)映體的方法，其特征在 于，高效液相色譜的條件為:色譜柱:CHIRALCEL OD-H;流動(dòng)相:正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙 醇中含有體積比為〇.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺)；流速:0.7mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):294nm; 進(jìn)樣量:20yL;柱溫:25°C。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK106093236SQ201610395557
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月5日 公開(kāi)號(hào)201610395557.9, CN 106093236 A, CN 106093236A, CN 201610395557, CN-A-106093236, CN106093236 A, CN106093236A, CN201610395557, CN201610395557.9
【發(fā)明人】楊立業(yè), 歐陽(yáng)小琨, 王陽(yáng)光, 金如娜, 王艷飛, 盧嬌
【申請(qǐng)人】浙江海洋大學(xué)