一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法。該方法，以玄參配方顆粒為檢測對象，建立了針對該藥物制劑的指紋圖譜的方法，獲得了較為全面的圖譜信息，確認了共有特征峰S峰哈巴俄苷、1號峰哈巴苷、2號峰和3號峰肉桂酸，選擇S峰哈巴俄苷，確定了玄參配方顆粒的共有特征峰的相對保留時間，且結合該指紋圖譜中多個色譜峰的信息，能夠全面地、快速地檢測其質量，有利于其全面質量檢測和整體質量控制，從而有助于提高該藥物使用的安全性和穩(wěn)定性。同時，該方法具有穩(wěn)定性高、精密度高、重復性好等優(yōu)點。
【專利說明】
一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領域，具體涉及一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方 法。
【背景技術】
[0002] 玄參配方顆粒是通過對中藥玄參進行提取、濃縮、制粒所得。玄參為玄參科植物 Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，始載于《神農本草經》，玄參主要分布于東 北、華北與華東地區(qū)；具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主要用于熱病傷陰、舌絳煩渴、溫毒 發(fā)斑、津傷便秘、骨蒸勞嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉、癰腫瘡毒等的治療。玄參主要含環(huán)烯醚 萜苷類、苯丙素苷類、芳香糖苷類等，其中環(huán)烯迷萜苷類主要含哈巴苷和哈巴俄苷等活性指 標成分。
[0003] 《中國藥典》2015年版對玄參的質量控制包括原植物品種、藥材性狀、理化鑒別、含 量測定等項目，文獻也對玄參中化學成分進行闡述，包括含有哈巴苷和哈巴俄苷等環(huán)烯迷 萜苷類和苯丙素苷類、芳香糖苷類等成分，但是對于玄參配方顆粒這樣有效成分類型多、組 分復雜的中藥制劑，僅測定某類成分的含量，難以客觀、有效地評價或控制藥材的質量。
[0004] 然而，一方面，通過上述單一成分的含量測定或鑒別玄參配方顆粒，不能從整體上 檢測和控制其質量；另一方面，通過單一成分的含量測定聯合其他成分的鑒別玄參配方顆 粒，費時、費力，難以廣泛地應用于生產實踐。
[0005] 因此，建立一種能夠全面地、快速地檢測玄參配方顆粒的方法，對于其全面質量檢 測和整體質量控制具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 為此，本發(fā)明所要解決的是現有的玄參配方顆粒的檢測方法單一檢測指標不能從 整體上檢測和控制其質量、多個檢測指標聯合檢測費時、費力，難以廣泛地應用于生產實踐 的技術問題，從而提出一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案來實現的：
[0008] 本發(fā)明提供一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，該方法包括如下步驟：
[0009] (1)取待測玄參的藥物制劑0.4-0.6重量份，精密稱定，精密加入40~60%甲醇水 溶液40-60體積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取20-40分鐘，放冷，再稱定重量，取40 ~60%甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0010] (2)精密稱取哈巴苷對照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00004-0.00008重量份的溶液，搖勻，作為對照品A溶液；
[0011] 精密稱取哈巴俄苷對照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00001-0.00003重量份的溶液，搖勻，作為對照品B溶液；
[0012] 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00001 -0.00003重量份的溶液，搖勻，作為對照品C溶液；
[0013] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、以0.05%的 磷酸溶液為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫:0-10min，A:B為5% : 95% : 92% ; 10-20min，A:B為8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B為27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱溫為25°C，流速為lmL/min;
[0014] (4)分別精密吸取供試品溶液供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對照品 C溶液0.010-0.020體積份，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液 和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜；
[0015] (5)利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照 品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹 配，即得指紋圖譜；
[0016] 所述重量份與所述體積份的關系為g/mL。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，該方法包括如下步 驟：
[0018] (1)取待測玄參的藥物制劑0.5重量份，精密稱定，精密加入50%甲醇水溶液50體 積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50%甲醇水溶液補 足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0019] (2)精密稱取哈巴苷對照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00006重量份 的溶液，搖勻，作為對照品A溶液；
[0020] 精密稱取哈巴俄苷對照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002重量份的 溶液，搖勻，作為對照品B溶液；
[0021] 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002重量份 的溶液，搖勻，作為對照品C溶液；
[0022] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、以0.05%的 磷酸溶液為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫:0-10min，A:B為5% : 95% : 92% ; 10-20min，A:B為8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B為27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B為35%:65% - 100%:0%;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm (18~45min); 柱溫為25°C，流速為lmL/min;
[0023] (4)分別精密吸取供試品溶液供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對照品 C溶液0.015體積份，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液和、對照 品B溶液和對照品C溶液的液相色譜；
[0024] (5)利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照 品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹 配，即得指紋圖譜。
[0025] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，以4.6mm X 250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18、4·6mmX250mm、5ym的Diamonsil C18或4.6mmX 250mm、5μπι的Shim-pack VP-0DS為色譜柱。
[0026] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述藥物制 劑為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑 或注射制劑。
[0027] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述玄參的 藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0028] 取玄參，加熱回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，過 濾，合并濾液，濾液濃縮至60 °C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成 臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口 服液體制劑或注射制劑。
[0029] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述玄參的 藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0030] 取玄參，加熱回流提取1~5次，每次加入4~10重量倍量的水提取0.5~3 . Oh，過 濾，合并濾液，濾液濃縮至60 °C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成 臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口 服液體制劑或注射制劑。
[0031] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述玄參的 藥物制劑通過以下方法制備而成：
[0032] 取玄參，加熱回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量 倍量的水提取1.5h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對密度為1.10~1.15,加入常規(guī)輔 料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、 速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射制劑。
[0033] 所述藥學上可接受的輔料為:填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯 味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括:淀粉、預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、 蔗糖等;崩解劑包括:淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素納等;潤滑劑包括:硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石 粉、二氧化硅等;助懸劑包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素 等;粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等;甜味劑包括:糖精鈉、阿斯 帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矯味劑包括:甜味劑及各種香精;防腐劑包括:尼泊金類、 苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等;基質包括:PEG6000、 PEG4000、蟲蠟等。
[0034] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述玄參的 藥物制劑的指紋圖譜中，共有特征峰為:S峰哈巴俄苷、1號峰哈巴苷、2號峰和3號峰肉桂酸， 以S峰哈巴俄苷為內參考峰，各峰號相對保留時間分別為：1號峰0.22~0.26、2號峰0.75~ 0.89、S峰 1.00 和 3號峰 1.06~1.24。
[0035] 進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，所述玄參的 藥物制劑的指紋圖譜中，各峰號相對保留時間分別為：1號峰〇.24、2號峰0.82、5峰1.00和3 號峰1.15。
[0036] 本發(fā)明還提供上述方法在玄參的藥物制劑的質量檢測和質量控制中的應用。
[0037] 與現有技術相比，本發(fā)明的上述技術方案具有以下優(yōu)點：
[0038] 本發(fā)明所述玄參的藥物制劑的指紋圖譜的檢測方法，以玄參配方顆粒為檢測對 象，建立了針對該藥物制劑的指紋圖譜的方法，獲得了較為全面的圖譜信息，確認了共有特 征峰S峰哈巴俄苷、1號峰哈巴苷、2號峰和3號峰肉桂酸，選擇S峰哈巴俄苷，確定了玄參配方 顆粒的共有特征峰的相對保留時間，且結合該指紋圖譜中多個色譜峰的信息，能夠全面地、 快速地檢測其質量，有利于其全面質量檢測和整體質量控制，從而有助于提高該藥物使用 的安全性和穩(wěn)定性。同時，該方法具有穩(wěn)定性高、精密度高、重復性好等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0039] 為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發(fā)明的具體實施例并結合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中：
[0040] 圖1是本發(fā)明實驗例1中不同的檢測波長的色譜圖，峰1是哈巴苷，S峰是哈巴俄苷， 色譜圖1、2的檢測波長為210nm+280nm，色譜圖3、4的檢測波長為為210nm+278nm;
[00411圖2是本發(fā)明實驗例1中不同流動相的色譜圖，A:乙腈-0.03 %磷酸溶液;B:乙腈-0.04 %磷酸溶液；C:乙腈-0.05 %磷酸溶液；D:乙腈-0.06 %磷酸溶液；
[0042 ]圖3是本發(fā)明實驗例1中不同梯度洗脫程序的色譜圖，A:梯度1; B:梯度2; C:梯度3;
[0043] 圖4是本發(fā)明實驗例1中不同色譜柱的色譜圖，I :Agilent Zorbax SB-C18 5μηι， 4.6mmX250mm PN: 880975-902 ; Π : Diamonsi 1 (鉆石）C18 (2 )5μηι 4.6mmX250mm Ser# 201042495 ;m: Shim-pack VP-ODS 5μπι4· 6mm X 250mm S/N 07111129484;
[0044] 圖5是本發(fā)明實驗例1中不同流速的色譜圖，A: 0.8mL/min; B: 1. OmL/min; C: 1.2mL/ min；
[0045] 圖6是本發(fā)明實驗例1中不同柱溫的色譜圖，A: 25 °C ; B: 30 °C ; C: 35 °C ;
[0046] 圖7是本發(fā)明實驗例3中18批玄參配方顆粒的特征指紋圖譜；
[0047] 圖8是本發(fā)明實驗例3中玄參配方顆粒的對照特征指紋圖譜；
[0048] 圖9是本發(fā)明實驗例4中重復性實驗結果；
[0049] 圖10是本發(fā)明實驗例4中精密度實驗結果；
[0050] 圖11是本發(fā)明實驗例4中專屬性實驗結果，A:供試品;B:陰性對照品；
[0051 ]圖12是本發(fā)明實驗例4中溶液穩(wěn)定性實驗結果。
【具體實施方式】
[0052] 實施例1
[0053] 以下實施例和實驗例中，玄參配方顆粒的制備方法為:取玄參，加熱回流提取2次， 第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量倍量的水提取1.5h，過濾，合并濾液， 濾液濃縮至60°C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成顆粒劑。
[0054] 實施例2
[0055] 本實施例建立玄參配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0056] (1)取待測玄參的藥物制劑0.5g，精密稱定，精密加入50%甲醇水溶液50mL，稱定 重量，超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50 %甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，過濾， 取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0057] (2)精密稱取哈巴苷對照品，加50%甲醇水溶液制成每lmL含0.00006g的溶液，搖 勻，作為對照品A溶液；
[0058] 精密稱取哈巴俄苷對照品，加50%甲醇水溶液制成每111^含0.000028的溶液，搖 勻，作為對照品B溶液；
[0059] 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002重量份 的溶液，搖勻，作為對照品C溶液；
[0060] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動相A、以0.05%的磷酸溶液為流動相財安照 如下程序進行梯度洗脫:〇-l〇min，A:B為5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B為8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B為27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱溫為25°C，流速為lmL/ min；
[0061 ] (4)分別精密吸取供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液0.015 體積份，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對 照品C溶液的液相色譜；
[0062] (5)利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照 品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹 配，即得指紋圖譜。
[0063] 實施例3
[0064] 本實施例建立玄參配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0065] (1)取待測玄參的藥物制劑0.4g，精密稱定，精密加入40%甲醇水溶液60mL，稱定 重量，超聲提取20分鐘，放冷，再稱定重量，取40 %甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，過濾， 取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0066] (2)精密稱取哈巴苷對照品，加40%甲醇水溶液制成每lmL含0.00004g的溶液，搖 勻，作為對照品A溶液；
[0067] 精密稱取哈巴俄苷對照品，加40 %甲醇水溶液制成每lmL含0 . OOOOlg的溶液，搖 勻，作為對照品B溶液；
[0068] 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00001重量份 的溶液，搖勻，作為對照品C溶液；
[0069] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動相A、以0.05%的磷酸溶液為流動相財安照 如下程序進行梯度洗脫:〇-l〇min，A:B為5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B為8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B為27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱溫為25°C，流速為lmL/ min；
[0070] (4)分別精密吸取供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液 0.010mL，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和 對照品C溶液的液相色譜；
[0071] (5)利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照 品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹 配，即得指紋圖譜。
[0072] 實施例4
[0073] 本實施例建立玄參配方顆粒的指紋圖譜的方法，包括如下步驟：
[0074] (1)取待測玄參的藥物制劑0.6g，精密稱定，精密加入60%甲醇水溶液40mL，稱定 重量，超聲提取40分鐘，放冷，再稱定重量，取60 %甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，過濾， 取續(xù)濾液，作為供試品溶液；
[0075] (2)精密稱取哈巴苷對照品，加60%甲醇水溶液制成每lmL含0.00008g的溶液，搖 勻，作為對照品A溶液；
[0076] 精密稱取哈巴俄苷對照品，加60%甲醇水溶液制成每111^含0.000038的溶液，搖 勻，作為對照品B溶液；
[0077] 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00003重量份 的溶液，搖勻，作為對照品C溶液；
[0078] (3)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以4.6mmX 250mm、5ym的 Agilent Zorbax SB-C18為色譜柱，以乙腈為流動相A、以0.05%的磷酸溶液為流動相財安照 如下程序進行梯度洗脫:〇-l〇min，A:B為5% :95%-8% :92% ;10-20min，A:B為8% :92% - 22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25-30min，A:B為27.5% :72.5% - 28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40-45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min);柱溫為25°C，流速為lmL/ min；
[0079] (4)分別精密吸取供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液 0.020mL，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液和、對照品B溶液和 對照品C溶液的液相色譜；
[0080] (5)利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照 品A溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹 配，即得指紋圖譜。
[0081 ] 實驗例
[0082] 1、儀器與試藥
[0083] 儀器包括:U11iMate 3000色譜系統(tǒng)，包括LPG-3400A四元栗、WPS-3000TSL自動進 樣器、PDA二極管陣列檢測器、色譜工作站；
[0084] 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 5μπι 4.6mmX250mm PN:880975-902;天平：十萬 分之一天平（METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒）XS-205)，十萬分之一天平(METTLER TOLEDO (瑞士梅特勒)XP-56);超聲波發(fā)生器：（SK5200H上?？茖С晝x器有限公司）；超純水系統(tǒng)： 美國Millipore(密理博)公司。
[0085]試劑和試藥包括：乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技（中國）有限公司），水為超純水 (電阻率18.2πιΩ .cm)，其他試劑均為分析純；玄參配方顆粒(序號1-18)由華潤三九醫(yī)藥股 份有限公司提供，按照實施例1的制備方法制備而成。
[0086]實驗例1色譜分析條件的確定
[0087] (1)檢測波長的選擇
[0088] 分別選用雙波長(210+278nm)和雙波長(210+280nm)對玄參配方顆粒進行檢測，不 同的檢測波長的色譜圖如圖1所示，其保留時間如表1所示。
[0089]表1不同檢測波長下各峰的保留時間
[0091] 由表1和圖1可知，結合文獻報道，峰3為肉桂酸色譜峰，故玄參配方顆粒特征圖譜 檢測波長選用雙波長(210+278nm) 〇
[0092] (2)流動相的選擇
[0093] 考察乙腈-0.03 %磷酸溶液、乙腈-0.04 %磷酸溶液、乙腈-0.05 %磷酸溶液、乙腈-0.06%磷酸溶液等不同流動相系統(tǒng)，不同流動相的色譜圖如圖2所示。由圖2可知，乙腈_ 0.05%磷酸溶液對玄參配方顆粒的各成分分離效果較好，故流動相系統(tǒng)確定采用乙腈-0.05 %磷酸溶液。
[0094] (3)梯度的選擇
[0095]配方顆粒所含成分復雜，等度洗脫很難分離，故采用梯度洗脫方式。在實驗過程中 采用了多個不同的洗脫梯度對同一份玄參配方顆粒提取樣品進行測定，通過比較不同洗脫 程序所測定的樣品色譜圖，從中優(yōu)選色譜信息較豐富，主要色譜峰分離度高，基線較平穩(wěn)且 分析時間較為合理的梯度，不同的梯度洗脫程序如表2~4所示，不同梯度洗脫程序的色譜 圖如圖3所示。
[0096] 表2梯度1(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脫程序
[0098] 表3梯度2(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脫程序
[0100] 表4梯度3(A:乙腈;B:0.05%磷酸溶液)的洗脫程序
[0102 ]由表2~4和圖3可知，梯度3比梯度1、2分離效果好，梯度3得到的色譜圖峰形良好， 分離度高，分析時間較為合適，故確定梯度3為最終的流動相梯度。
[0103] (4)不同色譜柱的考察
[0104] 取同一份玄參配方顆粒樣品的供試品溶液，分別以色譜柱I:Agilent Zorbax SB-C18 5ym 4.6mmX250mm批號：880975_902; Π :Diamonsil(鉆石）C18(2)5ym 4.6mmX250mm 批號：Ser#201042495;m : Shim-pack VP-0DS5ym 4.6mm X 250mm批號：S/N 07111129484，
[0105] 按l.OmL/min的流速進行梯度洗脫分析，不同色譜柱的色譜圖如圖4所示，不同色 譜柱測定的共有峰的相對保留時間結果如表5所示。
[0106] 表5不同色譜柱測定的共有色譜峰系統(tǒng)適應性參數
[0108] 由圖4和表5可知，Agilent Zorbax SB-C18色譜柱對各個峰的分離度較好，且分析 時間較短，故選定色譜柱I作為色譜柱。
[0109] (5)不同流速的考察
[ΟΙ10] 取同一份玄參配方顆粒樣品的供試品溶液，分別以0.8mL/min、1. OmL/min，1.2mL/ min等不同流速測定，不同流速的色譜圖如圖5所示，不同流速測定的共有峰的相對保留時 間結果如表6所不。
[0111]表6不同流速測定的共有色譜峰系統(tǒng)適應性參數
[0114] 由圖5和表6可知，流速發(fā)生微小變化時各個共有峰的測定結果影響不大，從系統(tǒng) 適應性參數中可看出，流速為1 .OmL/min流速的色譜效果相對較好。
[0115] (6)不同柱溫的選擇
[0116] 取同一份玄參配方顆粒樣品的供試品溶液，考察不同柱溫25°C、30°C、35°C對本品 的分離效果，不同柱溫的色譜圖如圖6所示，不同柱溫測定的共有峰的相對保留時間結果如 表7所示。
[0117] 表7不同柱溫測定的共有峰的系統(tǒng)適應性參數
[0119]由圖6和表7可知，柱溫發(fā)生變化時各色譜峰分離效果相近，表明柱溫發(fā)生變化對 測定結果影響較小?？紤]到固定柱溫能使測定環(huán)境更加穩(wěn)定，因此選定接近常溫的柱溫25 °C作為本方法的測定溫度。
[0120] (7)最終色譜條件
[0121] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸溶液為流動相 B，按表8進行梯度洗脫;流速1. OmL/min，柱溫25°C ;檢測波長:前18min為210nm，之后換為 278nm。理論塔板數按哈巴俄苷計算應不低于5000。
[0122] 表8梯度洗脫程序
[0124] 實驗例2供試品溶液的制備
[0125] 精密稱取玄參配方顆粒(批號1306001S)5組，每組平行2份，每份0.5g，分別精密加 入50mL的水、30 %甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、100 %甲醇，超聲提取30min。放冷后補足減失 的溶劑至原重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液以〇. 45μπι微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。分別 吸取各供試液l〇yL，注入液相色譜儀，測定哈巴苷與哈巴俄苷的峰面積積分值。玄參配方顆 粒不同提取條件下哈巴苷與哈巴俄苷峰面積積分值如表9所示。
[0126] 表9玄參配方顆粒不同提取條件下哈巴苷與哈巴俄苷峰面積積分值
[0128] 由表9可知，以出0、30%]\^0!1、50%]\^0!1、70%]\^0!1為提取溶劑，哈巴苷、哈巴俄苷 峰面積相差不大，其中以50 %MeOH為提取溶劑峰面積相對較高，故選擇50 %MeOH為提取溶 劑。結合《中國藥典》2010年版一部玄參【含量測定】供試品的制備條件，因配方顆粒經提取 后的物質較藥材更易溶解，提取方式為超聲提取，時間為30min。
[0129] 實驗例3玄參配方顆粒特征指紋圖譜的建立
[0130]參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術指南(試行)》，利用中國藥典委員會推薦的 "中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版"軟件，通過對所得指紋圖譜的進行相似度比 較(以平均數建立參照特征指紋圖譜），并進行方法學考察。
[0131]根據實驗例1和2,確定玄參配方顆粒HPLC特征圖譜按如下方法建立：
[0132] (1)取玄參配方顆粒適量，研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 50 %甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500W，頻率40kHz) 30min，放冷，再稱定重量， 用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0133] (2)高效液相色譜條件：以Agi lent Zorbax SB-C18 5μηι、4 · 6mm X 250mm(PN: 880975-902)為色譜柱；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸溶液為流動相B，按表8進行梯度洗 脫;流速1.0mL/min，柱溫25°C;檢測波長:前18min為210nm，之后換為278nm。理論塔板數按 哈巴俄苷計算應不低于5000。進樣量:10yL。
[0134]表8梯度洗脫程序
[0136] 按上述方法進行玄參配方顆粒特征圖譜的共有模式的建立。
[0137] 取18個批次的玄參配方顆粒樣品作為供試品溶液，通過高效液相色譜得到玄參配 方顆粒特征圖譜，18批玄參配方顆粒的特征圖譜(S1~S18依次為批號A1301044、A1301045、 A1300816、1305369、1305370、1305371、G1306007、G1306008、G1306009、130701、130702、 130703、1303100、1303112、1303124、1306001S、1306002S、1306003S 的玄參配方顆粒的圖 譜)如圖7所示，采用藥典委員會編制的指紋圖譜相似度評價軟件"中藥色譜指紋圖譜相似 度評價系統(tǒng)2012版"，生成的對照特征指紋圖譜如圖8所示，對配方顆粒特征圖的檢測結果 進行分析、比較，選取其中的哈巴俄苷作為參照峰(S峰），計算各特征峰與S峰的相對保留時 間規(guī)定值，所得結果如表1 〇~12所示。
[0138] 表10玄參配方顆粒對照特征指紋圖譜相對保留時間
[0140]表12 18批玄參配方顆粒相似度結果
[0142] 由表10~12和圖7~8所示，各批與對照特征指紋圖譜的相似度均在0.90以上。
[0143] 實驗例4玄參配方顆粒特征指紋圖譜方法學驗證
[0144] 4.1精密度
[0145] 4丄1重復性實驗
[0146] 取同一批號供試品（批號1306001S)6份，按實驗例3的條件分別測定4個共有峰的 相對保留時間，相對保留時間結果如表13所示，相似度結果如表14所示，色譜圖如圖10所 不。
[0147] 由表13~14和圖10可知，1~3號峰與參照物S峰的相對保留時間的RSD分別為 0.12%、0.04%、0.04%，相似度分別為1.00;這表明本方法的重復性較好。
[0148] 表13重復性實驗結果
[0151]表14重復性實驗相似度結果
[0153] 4.1.2精密度實驗
[0154] 取同一份供試品溶液(批號1306001S)，按實驗例3的色譜條件，重復進樣6次，測定 4個共有峰的相對保留時間，相對保留時間結果如表15所示，相似度結果如見表16所示，色 譜圖如圖10所示。
[0155] 表15精密度實驗結果
[0157]表16精密度實驗相似度結果
[0159] 由表15~16和圖10可知，1~3號峰與參照物S峰的相對保留時間的RSD分別為 0.12%、0.03%、0.03%，相似度分別為1.00,這表明精密度較好。
[0160] 4.2專屬性
[0161] 本品為玄參飲片的單方顆粒，供試品的提取溶劑為50%甲醇，故精密吸取供試品 溶液、陰性對照溶液各10yL，分別注入高效液相色譜儀，按實驗例3的色譜條件測定，結果如 圖11所不。由圖11可知，結果陰性無干擾。
[0162] 4.3耐用性
[0163] 溶液穩(wěn)定性實驗
[0164] 取同一批號供試品(批號1306001S)，自制備后，按實驗例3的色譜條件分別在0、2、 4、6、12、14、16、18、20、22、24小時進樣，測定4個共有峰的相對保留時間，相對保留時間結果 如表17所示，相似度結果如表18所示，色譜圖如圖12所示。
[0165] 表17溶液穩(wěn)定性實驗結果
[0168] 表18穩(wěn)定性實驗相似度結果
[0169]
[0170] 由表17~18和圖12可知，1~3號峰與參照物S峰的相對保留時間的RSD分別為 0.21 %、0.02%、0.05%，相似度分別為1.00;這表明本發(fā)明的供試品制備方法所制得的供 試品溶液在24小時內穩(wěn)定，相似度較好。
[0171]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 取待測玄參的藥物制劑0.4-0.6重量份，精密稱定，精密加入40~60%甲醇水溶液 40-60體積份，稱定重量，加熱回流提取或超聲提取20-40分鐘，放冷，再稱定重量，取40~ 60%甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液； (2) 精密稱取哈巴苷對照品，加4 0~6 0 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.0 0 0 0 4 - 0.00008重量份的溶液，搖勻，作為對照品A溶液； 精密稱取哈巴俄苷對照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00001-0.00003 重量份的溶液，搖勻，作為對照品B溶液； 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00001 -0.00003重 量份的溶液，搖勻，作為對照品C溶液； (3) 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、以0.05%的磷酸 溶液為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫：0-10min，A:B為5% :95%-8% :92% ; 10-20min，A:B為8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B為27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱溫為25°C，流速為lmL/min; (4) 分別精密吸取供試品溶液供試品溶液、對照品A溶液、對照品B溶液和對照品C溶液 0.010-0.020體積份，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液和、對照 品B溶液和對照品C溶液的液相色譜； (5) 利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照品A 溶液、對照品B溶液對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹配，即得 指紋圖譜； 所述重量份與所述體積份的關系為g/mL。2. 根據權利要求1所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于， 該方法包括如下步驟： (1) 取待測玄參的藥物制劑0.5重量份，精密稱定，精密加入50 %甲醇水溶液50體積份， 稱定重量，加熱回流提取或超聲提取30分鐘，放冷，再稱定重量，取50 %甲醇水溶液補足減 失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液； (2) 精密稱取哈巴苷對照品，加50%甲醇水溶液制成每1體積份含0.00006重量份的溶 液，搖勻，作為對照品A溶液； 精密稱取哈巴俄苷對照品，加50 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002重量份的溶 液，搖勻，作為對照品B溶液； 精密稱取肉桂酸對照品，加40~60 %甲醇水溶液制成每1體積份含0.00002重量份的溶 液，搖勻，作為對照品C溶液； (3) 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、以0.05%的磷酸 溶液為流動相B按照如下程序進行梯度洗脫：0-10min，A:B為5% :95%-8% :92% ; 10-20min，A:B為8% :92%-22% :78% ;20-25min，A:B為22% :78%-27.5% :72.5% ;25_ 30min，A:B為27.5% :72.5%-28% :72% ;30-40min，A:B為28% :72% - 35% :65% ;40_ 45min，A:B為35% :65% - 100% :0% ;檢測波長為210nm(0~18min)和278nm(18~45min); 柱溫為25°C，流速為lmL/min; (4) 分別精密吸取供試品溶液供試品溶液、對照品A溶液、對照品B溶液和對照品C溶液 〇. 〇 15體積份，注入高效液相色譜儀，測定，分別得供試品溶液、對照品A溶液、對照品B溶液 和對照品C溶液的液相色譜； (5) 利用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對供試品溶液、對照品A 溶液和、對照品B溶液和對照品C溶液的液相色譜分別經過數據導入，多點校正和數據匹配， 即得指紋圖譜。3. 根據權利要求1或2所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，以 4.6mmX250mm、5ym的Agilent Zorbax SB-C18、4·6mmX250mm、5ym的Diamonsil C18或 4 · 6mm X 250mm、5μηι的Shim-pack VP-ODS為色譜柱。4. 根據權利要求1-3任一項所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在 于，所述藥物制劑為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、 口服液體制劑或注射制劑。5. 根據權利要求1-4任一項所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在 于，所述玄參的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取玄參，加熱回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少0.5h，過濾，合 并濾液，濾液濃縮至60 °C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床 上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液 體制劑或注射制劑。6. 根據權利要求5所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，所述玄 參的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取玄參，加熱回流提取1~5次，每次加入4~10重量倍量的水提取0.5~3. Oh，過濾，合 并濾液，濾液濃縮至60 °C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床 上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液 體制劑或注射制劑。7. 根據權利要求6所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在于，所述玄 參的藥物制劑通過以下方法制備而成： 取玄參，加熱回流提取2次，第1次加入8重量倍量的水提取2. Oh，第2次加入6重量倍量 的水提取1.5h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至60°C相對密度為1.10~1.15，加入常規(guī)輔料，按 照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、蜜煉丸劑、緩釋制劑、速釋制 劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射制劑。8. 根據權利要求1-7任一項所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在 于，所述玄參的藥物制劑的指紋圖譜中，共有特征峰為：S峰哈巴俄苷、1號峰哈巴苷、2號峰 和3號峰肉桂酸，以S峰哈巴俄苷為內參考峰，各峰號相對保留時間分別為：1號峰0.22~ 0.26、2號峰0.75~0.89、5峰1.00和3號峰1.06~1.24。9. 根據權利要求1-8任一項所述的建立玄參的藥物制劑的指紋圖譜的方法，其特征在 于，所述玄參的藥物制劑的指紋圖譜中，各峰號相對保留時間分別為：1號峰〇.24、2號峰 0.82、S峰 1.00 和 3 號峰 1.15。10. 權利要求1-9任一項所述的方法在玄參的藥物制劑的質量檢測和質量控制中的應
【文檔編號】G01N30/88GK106093262SQ201610423663
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610423663.3, CN 106093262 A, CN 106093262A, CN 201610423663, CN-A-106093262, CN106093262 A, CN106093262A, CN201610423663, CN201610423663.3
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