一種產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素Envision免疫組化的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，提供了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素Envision免疫組化的檢測(cè)方法，該方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了特異性高、重復(fù)性好、背景低，可直觀、簡(jiǎn)便檢測(cè)α毒素的Envision免疫組化方法。該方法可用于除鼠以外動(dòng)物組織中產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的檢測(cè)，也為該毒素在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的分布檢測(cè)提供了有效、可靠的手段。CGMCC No.887020140114
【專利說明】
一種產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素 Env i s i on免疫組化的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了 一種產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素 Envision 免疫組化的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生多種外毒素，根據(jù)其產(chǎn)生的主要4種致死性外毒素，產(chǎn)氣莢膜 梭菌分為4(€〇、8((1、0、6)、(：(€[、0)、0(€[、6)和￡(€[、0型，各型均產(chǎn)生€[毒素，該毒素具有卵磷 脂酶C和鞘磷脂酶兩種毒性，可同時(shí)水解細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂成分，破壞細(xì)胞膜 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞溶解，從而呈現(xiàn)細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等，在動(dòng)物壞死性腸 炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽等病癥中起關(guān)鍵作用，給養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成巨大的 損失。
[0003] 目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)方法主要有病原菌的分離鑒定、腸內(nèi)容物的毒素檢測(cè) (常用小鼠接種試驗(yàn)及毒素中和試驗(yàn)）。產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是腸源性感染，常形成腸源性 毒血癥，并不一定形成菌血癥及敗血癥，因此從內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官不一定能分離到細(xì)菌;而利用 小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做毒素接種實(shí)驗(yàn)和毒素中和實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要針對(duì)毒素的標(biāo)準(zhǔn)陽性高免血清， 耗時(shí)費(fèi)力，且由于動(dòng)物的個(gè)體差異，還能導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。
[0004] 免疫組織化學(xué)方法可用于研究抗原在組織器官和細(xì)胞中的定位與分布，可直觀地 檢測(cè)到抗原物質(zhì)；另外，Bacciarini指出：抗毒素抗體的免疫組化在那些細(xì)菌培養(yǎng)和PCR檢 測(cè)不可行的情況下，是一個(gè)可供選擇的檢測(cè)方法。α毒素是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的毒力 因子，因此，如何運(yùn)用Envision免疫組化方法檢測(cè)動(dòng)物組織中產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素成為亟待 解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述情況，本發(fā)明提供了提供了 一種產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素 Envi s ion免疫組化的檢測(cè)方法，該方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了特異性 高、重復(fù)性好、背景低，可直觀、簡(jiǎn)便檢測(cè)α毒素的Envi s ion免疫組化方法。該方法可用于除 鼠源外A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)，也為該毒素在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的分布檢測(cè)提供了有效、可靠的 手段。
[0006] 發(fā)明人在本發(fā)明中所采用的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌采用現(xiàn)有菌種，特別選自菌種 NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英國(guó)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào):NCTC528 )，可通過現(xiàn)有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現(xiàn)有技術(shù)中可直接獲得 的材料，不需進(jìn)行單獨(dú)的生物保藏。
[0007] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:具體步驟如下：
[0008] 1產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的制備：
[0009] Α型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37°C厭氧培養(yǎng)36h，選取 單個(gè)的菌落進(jìn)行液體硫乙醇厭氧增菌12小時(shí)，然后將增菌液按體積百分比5%接種于產(chǎn)毒 培養(yǎng)基Gordon湯中，45 °C培養(yǎng)5h產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離心后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除 菌后的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素；
[0010]其中所述的血平板培養(yǎng)基成分為：100毫升蒸餾水、3.8g豆粉瓊脂、lg葡萄糖和5ml 脫纖綿羊血。
[0011]所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為:每l〇〇mlPBS緩沖液溶解3g胰蛋白胨、1.2g糊精、2g酵母 浸膏和2.2g L-精氨酸，PBS為0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液。
[0012] 2人工感染家兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病
[0013] 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，3只/組，實(shí)驗(yàn)組肌肉 注射上述除菌α毒素3mL，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，72h內(nèi)觀察動(dòng)物發(fā)病狀況;實(shí)驗(yàn)組在 其死亡時(shí)，立即進(jìn)行臨床剖檢病變，并取病變組織，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續(xù) 的組織切片制備和免疫組化染色;對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行；
[0014] 所述的改良Bouin ' S液固定液成分為：750mL飽和苦味酸緩沖液（由ros緩沖液配 置），甲醛250mL，在使用前不加50mL冰乙酸；與常規(guī)Bouin'S液固定液相比，本發(fā)明所提供的 固定液在使用前不加冰醋酸，避免了組織固定時(shí)形態(tài)收縮明顯，且強(qiáng)酸對(duì)組織中抗原有損 害，因此改良的固定液利于固定組織的長(zhǎng)期保存。
[0015] 3組織切片的制備
[0016]組織于固定液48h后，將組織用刀片切成lcm3的組織塊，組織塊經(jīng)流水沖洗完固定 液后，再進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，切片于37°C溫箱烤干，放置4 °C備用后續(xù)免疫組化染色；陰性對(duì)照組組織同時(shí)進(jìn)行此操作；
[0017] 4Envision免疫組化檢測(cè)
[0018] ①陰性對(duì)照與陽性對(duì)照的組織切片于4°C冰箱拿出，在室溫放置無水霧后，放置37 °C溫箱30min，使組織粘的更牢固，再脫蠟；
[0019] ②上述切片依次經(jīng)二甲苯I、Π ，體積比1:1的二甲苯：100 %酒精混合物，各常規(guī)脫 蠟6min，再經(jīng)100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸餾水，各水化處理 4min;
[0020] ③上述切片在0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液90°C微波修復(fù)4次，5min/次，每次間 隔4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫，
[0021] 其中所述的0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液成分為：1L去離子水、檸檬酸0.378g、檸 檬酸三鈉2.412g;
[0022] ④上述切片經(jīng)roS緩沖液漂洗3次，5min/次，將H2〇2用roS緩沖液稀釋至10%，滴加 覆蓋在組織上，37 °C濕盒避光封閉lh;
[0023] ⑤上述切片經(jīng)roS緩沖液漂洗3次，5min/次，小牛血清經(jīng)roS緩沖液稀釋至10%，滴 加覆蓋在組織上，37°C濕盒孵育50min;
[0024] ⑥甩去組織上的血清，小鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12經(jīng)roS緩沖液按 體積比稀釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內(nèi)孵育，4°C過夜轉(zhuǎn)37°C濕盒孵育30min;
[0025] ⑦上述切片于經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標(biāo)二抗各 試劑，37°C濕盒孵育50min;
[0026] ⑧上述切片經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60s，切片再用去離 子水充分洗滌，終止顯色反應(yīng)；
[0027]⑨上述切片經(jīng)蘇木素復(fù)染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色；
[0028]⑩1 %鹽酸無水乙醇溶液進(jìn)行分化3s，之后切片在去離子水中沖洗返藍(lán)15min;
[0029] 0最后組織切片經(jīng)過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察；
[0030] 上述使用的PBS緩沖液成分為：1L去離子水、磷酸二氫鉀：0.27g、磷酸氫二鈉： 1 · 42g、氯化鈉:8g、氯化鉀0 · 2g;
[0031] 上述方法中其他未公開參數(shù)均可參考現(xiàn)有技術(shù)，如2013年發(fā)表于中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)的 《間接免疫酶組化檢測(cè)禽波氏桿菌在感染雞體內(nèi)的抗原定位》中記載的技術(shù)方案。
[0032] 其中步驟(4)中小鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的制備方法如下：
[0033] 將產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細(xì)胞株F12,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏中心，保 藏編號(hào):CGMCC No. 8870;進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng);選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式 不完全佐劑0.5mL/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細(xì)胞株F12，0.5-1 X 106個(gè)/只，7-10天后 收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12，腹水經(jīng)正辛酸-硫酸銨方法純化，SDS-PAGE檢測(cè)純 化效果。
[0034] 5結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0035]按照普通光學(xué)顯微鏡視野下觀察到的特定區(qū)域或細(xì)胞經(jīng)染色后棕黃色顯色的有 無、數(shù)量、種類及深淺來判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[0036] (1)沒有出現(xiàn)棕黃色區(qū)域或細(xì)胞的判為陰性；
[0037] (2)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞零星分布且少于5%的判為弱陽性；
[0038] (3)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞分布比例為5 %~50 %為陽性；
[0039] (4)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞在組織中分布比例大于50%為強(qiáng)陽性。
[0040]采用本發(fā)明上述公開的檢測(cè)方法，具有如下有益效果：
[0041 ] (1)特異性強(qiáng):本方法可檢測(cè)到陽性對(duì)照臟器中α毒素的分布，而陰性對(duì)照、替代試 驗(yàn)組及感染巴氏桿菌、沙門氏菌和球蟲等其他病原致死兔兔組織的免疫組化檢測(cè)為陰性； [0042] (2)敏感性高:本方法α毒素的免疫組化檢測(cè)陽性率高于常規(guī)的細(xì)菌分離技術(shù)，且 本方法第二抗體選用小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑，該二抗具有高敏感、低背景、快速 簡(jiǎn)便的特點(diǎn)；
[0043] (3)重復(fù)性好:本方法對(duì)人工感染的陽性組織、兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病病例、陰性對(duì)照 和其他病原感染組織的連續(xù)切片進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果均相一致。
[0044] 綜上所述，本發(fā)明提供的免疫組化檢測(cè)方法以小鼠抗α毒素單克隆抗體為基礎(chǔ)，建 立了特異性高、重復(fù)性好、背景低，可直觀、簡(jiǎn)便檢測(cè)α毒素的Envision免疫組化方法。該方 法可用于除鼠源外A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)，也為該毒素在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的分布檢測(cè)提供了 有效、可靠的手段。
[0045] 保藏信息
[0046] 保藏時(shí)間：2014年1月14日
[0047]保藏單位名稱：中國(guó)普通微生物保藏管理中心CGMCC
[0048] 保藏編號(hào)：CGMCC No .8870
[0049] 保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所
[0050] 分類命名:抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細(xì)胞株
【附圖說明】：
[0051 ]圖1為陽性對(duì)照組織免疫組化染色結(jié)果示意圖，
[0052]圖la為腎臟分布結(jié)果:棕黃色陽性著色主要分布在腎小管的上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，陽 性分布比例大于50%，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（X400);
[0053]圖lb為腎臟陰性對(duì)照結(jié)果:無陽性信號(hào)著色，檢測(cè)為陰性（X400);
[0054] 圖lc為胃分布結(jié)果：陽性顆粒主要分布在黏膜固有層的胃底腺細(xì)胞及黏膜頂端脫 落上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，陽性分布比例大于50%，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（X400);
[0055] 圖Id為胃陰性對(duì)照結(jié)果:無陽性信號(hào)著色，檢測(cè)為陰性（X400);
[0056] 圖le為小腸分布結(jié)果：陽性信號(hào)主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞及固有層中，陽性分 布比例大于50%，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（X400);
[0057]圖If為小腸陰性對(duì)照結(jié)果:無陽性信號(hào)著色，檢測(cè)為陰性（X400);
[0058]圖lg為脾臟分布結(jié)果：白髓紅髓中都有彌散性棕黃色陽性顆粒分布，陽性分布比 例大于50%，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（X400);
[0059]圖lh為脾臟陰性對(duì)照結(jié)果:無陽性信號(hào)著色，檢測(cè)為陰性（X400);
[0060] 圖2為圖1的彩色示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。在實(shí)施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)等技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。 [0062]實(shí)施例中所用的試劑及其來源:液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物;L-多 聚賴氨酸黏片劑購(gòu)自索萊寶公司;抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的雜交瘤細(xì)胞株保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏中心(保藏號(hào):CGMCCNo. 8870);小牛血清購(gòu)自浙江天杭生物公司； 小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑(PV-9002)購(gòu)自北京中杉金橋;增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色 試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司；其他試劑所用化學(xué)試劑均為分析純。
[0063] 實(shí)施例1
[0064]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的制備：
[0065] Α型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種(英國(guó)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心保藏保藏號(hào):NCTC528)接種 于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37°C厭氧培養(yǎng)36h，挑取單個(gè)的菌落到硫乙醇酸鹽增菌培養(yǎng)基 中，在氣體濃度為88%N2、7%H 2、5%C02的厭氧環(huán)境條件下38°C培養(yǎng)12h。將5mL A型產(chǎn)氣莢 膜梭菌增菌液接種到l〇〇ml pH7.5的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中（每100mL PBS緩沖液溶解3g蛋白胨、 1.2g糊精、2g酵母浸膏和2.2gL-精氨酸）中，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，43 °C培養(yǎng)5h高效產(chǎn)毒， 然后在4°C3800g離心15min，再用孔徑0.22μπι的蔡氏濾器中過濾除菌，即得到除菌后以α毒 素為主的外毒素。利用卵磷脂酶活性和LD 5Q實(shí)驗(yàn)測(cè)定所產(chǎn)α毒素的活性，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝 膠電泳（SDS-PAGE)驗(yàn)證Α型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)毒除菌后的純度，用于后續(xù)動(dòng)物的人工攻毒陽 性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0066] 實(shí)施例2
[0067] 人工感染家兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病
[0068] 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，3只/組，實(shí)驗(yàn)組肌肉 注射上述除菌測(cè)小鼠 LD50為24·25的α毒素3mL，且對(duì)照組注射等量的生理鹽水，72h內(nèi)觀察動(dòng) 物發(fā)病狀況。在其死亡時(shí)，立即進(jìn)行臨床剖檢病變，并取病變組織心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎 臟、胃、小腸和盲腸，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續(xù)陽性對(duì)照的組織切片制備及免 疫組化染色，陰性對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行；
[0069]其中所述的改良Bouin ' S液固定液成分為:750mL飽和苦味酸緩沖液（由roS緩沖液 配置），甲醛250mL，在使用前加入50mL冰乙酸。
[0070] 實(shí)施例3 [0071] 組織切片的制備
[0072] 組織于固定液48h后，將組織用刀片切成lcm3的組織塊，組織塊經(jīng)流水沖洗至無黃 色固定液時(shí)，再經(jīng)70%酒精(過夜）、80%酒精（lh)、85%酒精（lh)、90%酒精（lh)、95%酒精 (lh)、100 %酒精(45min)、二甲苯:酒精（1 Omin)梯度脫水、二甲苯透明組織10s、60 °C浸蠟 1.5h、石蠟包埋，經(jīng)切片機(jī)切成4um厚的切片，切片于37 °C溫箱烤干，放置4 °C備用后續(xù)免疫 組化染色，陰性對(duì)照組組織同時(shí)進(jìn)行此操作。
[0073] 實(shí)施例4
[0074] 小鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體F12的制備方法如下：
[0075] 將產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細(xì)胞株F12,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏中心保 藏，保藏編號(hào)：CGMCC No. 8870;進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng);選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注 射弗式不完全佐劑〇. 5mL/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細(xì)胞株F12，0.5-1 X 106個(gè)/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12,腹水經(jīng)正辛酸-硫酸銨方法純化，SDS-PAGE 檢測(cè)純化效果。
[0076] 實(shí)施例5
[0077] Envision免疫組化檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化
[0078]通過對(duì)易出現(xiàn)問題的抗原修復(fù)、封閉液、單抗稀釋度、酶標(biāo)二抗和DAB顯色等多個(gè) 工作條件進(jìn)行3次重復(fù)摸索和優(yōu)化，摸索過程如下：
[0079] (1)抗原修復(fù)時(shí)間的選擇
[0080]將0.01M pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液微波加熱煮沸，調(diào)至低火進(jìn)行微波修復(fù)，修復(fù)時(shí) 間分別為:連續(xù)修復(fù)5min，15min，間斷修復(fù)4次，5min/次，間隔4min。
[0081 ]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)間斷修復(fù)20min優(yōu)于連續(xù)修復(fù)的5min和15min，此修復(fù)時(shí)間利于增強(qiáng)陽性 信號(hào)，且不易脫片。
[0082] (2)過氧化物酶封閉時(shí)間的選擇
[0083] 將商品化H202溶液用roS緩沖液稀釋至10%，滴加覆蓋于組織上，在37°C濕盒中分 別孵育1 〇min、30min和lh，選擇最佳的作用時(shí)間。
[0084]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示封閉lh可有效封閉組織中血管及其他部位過氧化物酶的活性，非特 異性背景著色低。
[0085] (3)封閉液及其時(shí)間的選擇
[0086] 封閉液選5%834、10%小牛血清，分別在37°(：濕盒孵育1〇111丨11、3〇111丨11、5〇111丨11和 90min，選擇最佳封閉時(shí)間。
[0087] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10%小牛血清與5%BSA封閉效果相似，最佳封閉時(shí)間為50min，因此 選用價(jià)格適宜的小牛血清。
[0088] (4) 一抗最佳稀釋度和反應(yīng)時(shí)間的確定
[0089] 應(yīng)用抗α毒素單克隆抗體Al 1為一抗，用pH 7 · 0PBS緩沖液按1/50，1/100，1/200，1/ 400，1/800，1/1000稀釋抗體，每個(gè)稀釋度分別在37°(：濕盒孵育111和4°(：過夜轉(zhuǎn)37°(：孵育 30min，以確定一抗的最佳工作濃度和時(shí)間。
[0090] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一抗稀釋1/400進(jìn)行4°C過夜轉(zhuǎn)37 °C孵育30min為最佳工作條件。
[0091] (5)二抗孵育條件的選擇
[0092]根據(jù)試劑說明書，即用型超敏免疫組化試劑中各個(gè)成分在37°C分別孵育lOmin、 30min和50min，比較出二抗最佳孵育時(shí)間。
[0093]多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二抗孵育條件為37°C作用50min。
[0094] (6)顯色底物作用時(shí)間的選擇
[0095] 按試劑說明書，在顯微鏡下觀察DAB顯色，顯色時(shí)間分別為30s、lmin、2min和5min 后終止，篩選出最佳顯色時(shí)間。
[0096] 多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示最佳顯色時(shí)間為50-60s。
[0097] (7)蘇木素復(fù)染時(shí)間的選擇
[0098] 蘇木素分別對(duì)組織復(fù)染0.5min、lmin、1.5min和3min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞核著色 程度，確定最佳復(fù)染時(shí)間。
[0099]多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示最佳復(fù)染時(shí)間為1.5min。
[0100] 實(shí)施例6
[0101] Envision免疫組化檢測(cè)方法
[0102]除特殊說明外，本步驟所涉及的百分比均為體積百分比：
[0103]通過實(shí)施例5以上對(duì)Envision免疫組化各重要影響條件的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體 系如下：
[0104] ①待檢切片制備好后，依次經(jīng)二甲苯I、Π ，二甲苯：100%酒精（1:1)，各脫蠟6min， 再經(jīng)100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸餾水，各水化處理4min;同時(shí) 設(shè)置陰陽性對(duì)照，陽性對(duì)照為肌肉注射α毒素感染家兔的病變組織，陰性對(duì)照為注射等量生 理鹽水家兔的組織器官以及實(shí)驗(yàn)室確診保存的巴氏桿菌、沙門氏菌和球蟲感染致死的兔組 織器官；
[0105] ②切片在0.01Μ pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液90 °C微波修復(fù)4次，5min/次，每次間隔 4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫；
[0106] ③切片經(jīng)ros緩沖液漂洗3次，5min/次，H2〇2經(jīng)ros緩沖液稀釋至10%，滴加覆蓋在 組織上，37 °C濕盒避光封閉lh;
[0107] ④切片經(jīng)ros緩沖液漂洗3次，5min/次，10%小牛血清經(jīng)PBS緩沖液稀釋至10%，滴 加覆蓋在組織上，37°C濕盒孵育50min;
[0108] ⑤甩去組織上的血清，小鼠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體All經(jīng)roS緩沖液稀 釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內(nèi)孵育，4°C過夜轉(zhuǎn)37°C濕盒孵育30min;同時(shí)設(shè)置替代 實(shí)驗(yàn)，以非免疫小鼠血清和PBS代替一抗，其余步驟不變；
[0109] ⑥切片于經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標(biāo)二抗各試 劑，37°C濕盒孵育50min;
[0110] ⑦切片經(jīng)ros緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60S，切片再用去離子水 充分洗滌，終止顯色反應(yīng)；
[0111] ⑧切片經(jīng)蘇木素復(fù)染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色；
[0112] ⑨1 %鹽酸酒精進(jìn)行分化3s，切片在去離子水中沖洗返藍(lán)15min;
[0113] ⑩最后組織切片經(jīng)過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。
[0114] 結(jié)果判定：
[0115] 按照普通光學(xué)顯微鏡視野下觀察到的特定區(qū)域或細(xì)胞經(jīng)染色后棕黃色顯色的有 無、數(shù)量、種類及深淺來判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[0116] (1)沒有出現(xiàn)棕黃色區(qū)域或細(xì)胞的判為陰性；
[0117] (2)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞零星分布且少于5%的判為弱陽性；
[0118] (3)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞分布比例為5 %~50 %為陽性；
[0119] (4)組織中棕黃色區(qū)域或細(xì)胞在組織中分布比例大于50%為強(qiáng)陽性。
[0120] 根據(jù)上述方法和標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)明人對(duì)對(duì)人工肌肉感染病兔組織器官中α毒素的分布檢 測(cè)運(yùn)用建立好的Envision免疫組化方法，檢測(cè)人工肌肉感染病兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎 臟、胃、小腸和盲腸中的α毒素，其檢測(cè)結(jié)果為：腎臟：陽性著色主要分布在腎小管的上皮細(xì) 胞胞質(zhì)中，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性(圖la);胃：陽性顆粒主要分布在黏膜固有層的胃底腺細(xì)胞及 黏膜頂端脫落上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性(圖lc);小腸：陽性信號(hào)主要分布在腸 絨毛上皮細(xì)胞及固有層中，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（圖le);盲腸：陽性顆粒主要分布在粘膜上皮 細(xì)胞和腺體細(xì)胞的胞漿中，染色結(jié)果為陽性;脾臟：白髓紅髓中都有彌散性棕黃色陽性顆粒 分布，染色結(jié)果為強(qiáng)陽性（圖lg);肝臟:肝竇中及變性、壞死肝細(xì)胞胞質(zhì)中有陽性顆粒著色， 染色結(jié)果為陽性;肺臟:肺間質(zhì)、肺泡壁及支氣管受損的柱狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)有陽性顆粒分 布，染色結(jié)果為陽性;心臟：陽性顆粒主要分布在顆粒變性的心肌細(xì)胞胞質(zhì)，染色結(jié)果為陽 性。因此，本發(fā)明所提供的方法可以用于產(chǎn)氣莢膜梭菌病α毒素的檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)氣芙膜梭菌病α毒素化Vi Sion免疫組化的檢測(cè)方法，其特征在于:具體步驟如 下： (1) 產(chǎn)氣芙膜梭菌α毒素的制備： A型產(chǎn)氣芙膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37°C厭氧培養(yǎng)36h，選取單個(gè) 的菌落進(jìn)行液體硫乙醇厭氧增菌12小時(shí)，然后將增菌液按體積百分比5%接種于產(chǎn)毒培養(yǎng) 基中，45°C培養(yǎng)化產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離屯、后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除菌后的A型產(chǎn) 氣芙膜梭菌外毒素； (2) 人工感染家兔產(chǎn)氣芙膜梭菌病 選取1.0-1.5Kg剛斷奶后家兔6只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，3只/組，實(shí)驗(yàn)組肌肉注射 上述除菌α毒素3mL，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，7化內(nèi)觀察動(dòng)物發(fā)病狀況;實(shí)驗(yàn)組在其死 亡時(shí)，立即進(jìn)行臨床剖檢病變，并取病變組織，投入改良Bouin'S液固定液中，用于后續(xù)的組 織切片制備和免疫組化染色;對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行； (3) 組織切片的制備 組織于固定液4她后，將組織用刀片切成1cm3的組織塊，組織塊經(jīng)流水沖洗完固定液后， 再進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，切片于37°C溫箱烤干，放置4°C備 用后續(xù)免疫組化染色；陰性對(duì)照組組織同時(shí)進(jìn)行此方法操作； (4化nvision免疫組化檢測(cè) ① 陰性對(duì)照與陽性對(duì)照的組織切片于4 °C冰箱拿出，在室溫放置無水霧后，放置37°C溫 箱30min，使組織粘的更牢固，再脫蠟； ② 上述切片依次經(jīng)二甲苯Ι、Π ，體積比1:1的二甲苯：100%酒精混合物，各常規(guī)脫蠟 6min，再經(jīng)100 %酒精，95 %酒精，90 %酒精，80 %酒精，70 %酒精，蒸饋水，各水化處理4min; ③ 上述切片在0.01M pH 6.0巧樣酸鹽緩沖液90°C微波修復(fù)4次，5min/次，每次間隔 4min，暴露出抗原表位，自然冷卻至室溫， 其中所述的0.01M pH 6.0巧樣酸鹽緩沖液成分為：1L去離子水、巧樣酸0.378g、巧樣酸 Ξ鋼2.412g; ④ 上述切片經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，將此化用PBS緩沖液稀釋至10 %，滴加覆蓋 在組織上，37 °C濕盒避光封閉化； ⑤ 上述切片經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，小牛血清經(jīng)PBS緩沖液稀釋至10%，滴加覆 蓋在組織上，37°C濕盒解育50min; ⑥ 甩去組織上的血清，小鼠抗產(chǎn)氣芙膜梭菌α毒素單克隆抗體F12經(jīng)PBS緩沖液按體積 比稀釋至1/600，滴加覆蓋在組織上，濕盒內(nèi)解育，4 °C過夜轉(zhuǎn)37 °C濕盒解育30min; ⑦ 上述切片于經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶標(biāo)二抗各試 劑，37°C濕盒解育50min; ⑧ 上述切片經(jīng)PBS緩沖液漂洗3次，5min/次，DAB室溫下顯色50-60S，切片再用去離子水 充分洗涂，終止顯色反應(yīng)； ⑨ 上述切片經(jīng)蘇木素復(fù)染1.5min，去離子水沖洗至切片不脫色； ⑩ 1%鹽酸無水乙醇溶液進(jìn)行分化3s，之后切片在去離子水中沖洗返藍(lán)15min; 0最后組織切片經(jīng)過上行酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察； 上述使用的PBS緩沖液成分為：1L去離子水、憐酸二氨鐘:0.27g、憐酸氨二鋼：1.42g、氯 化鋼:8g、氯化鐘0.2g; 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定： 按照普通光學(xué)顯微鏡視野下觀察到的特定區(qū)域或細(xì)胞經(jīng)染色后棟黃色顯色的有無、數(shù) 量、種類及深淺來判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為： ① 沒有出現(xiàn)棟黃色區(qū)域或細(xì)胞的判為陰性； ② 組織中棟黃色區(qū)域或細(xì)胞零星分布且少于5%的判為弱陽性； ③ 組織中棟黃色區(qū)域或細(xì)胞分布比例為5 %~50 %為陽性； ④ 組織中棟黃色區(qū)域或細(xì)胞在組織中分布比例大于50%為強(qiáng)陽性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟（1)中所述的血平板培養(yǎng)基成分為： 100毫升蒸饋水、3.始豆粉瓊脂、Ig葡萄糖和5ml脫纖綿羊血； 所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為:每lOOmlPBS緩沖液溶解3g膜蛋白腺、1.?糊精、地酵母浸膏 和2.2g心精氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟(2)中的改良Bouin'S液固定液成分 為:750mL飽和苦味酸緩沖液，甲醒250mL，且在使用前不加50mL冰乙酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:所述步驟(4)中小鼠抗產(chǎn)氣芙膜梭菌α毒素單 克隆抗體F12的制備方法如下： 將產(chǎn)氣芙膜梭菌α毒素的雜交瘤細(xì)胞株F12,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏中屯、保藏，保 藏編號(hào):CGMCC No. 8870;進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng);選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式 不完全佐劑0.5血/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細(xì)胞株F12,0.5-1 X106個(gè)/只，7-10天后 收集小鼠腹水，得到大量單克隆抗體F12，腹水經(jīng)正辛酸-硫酸錠方法純化，SDS-PAGE檢測(cè)純 化效果。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK106093404SQ201610357015
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】王海榮, 秦貴平, 柴同杰, 陳長(zhǎng)俊
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)