一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒，所述測(cè)試棒具有兩個(gè)通道。其特征在于，其包含基板和平行設(shè)置且互不接觸的第一吸收性條帶和第二吸收性條帶。其中所述第一吸收性條帶的T線包被有抗人ACRV1蛋白的抗體。C線包被有抗鼠二抗或葡萄球菌表面A蛋白SPA，第二吸收性條帶的T線包含人ACRV1蛋白，C線包被有抗鼠二抗或葡萄球菌表面A蛋白SPA。
【專利說明】
一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于一種體外診斷的生物技術(shù)，具體涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)評(píng)估男性精子密度的雙通道測(cè)試棒。
【背景技術(shù)】
[0002]中國是人口大國，隨著生活水平的提高和二胎政策的逐漸放開，我國有超過2億個(gè)有生育需求的適齡家庭。另一方面，由于食品安全、環(huán)境污染、不良生活習(xí)慣等因素的影響，越來越多的家庭面臨生育困難的問題:根據(jù)中國人口協(xié)會(huì)的調(diào)查結(jié)果，我國不孕不育患者超過4000萬，占育齡人口的12.5%，這個(gè)比率相比于20年前升高了 4倍，并仍在增加。
[0003]在受到不孕不育困擾的家庭中，男性因素導(dǎo)致的不育占40%，而精子密度異常是導(dǎo)致男性不育的重要原因。如果每毫升精液中精子數(shù)量少于1500萬，稱為精子密度偏低或少精，會(huì)直接影響受孕率;另一方面，如果精子密度高于25000萬每毫升，由于單位體積內(nèi)的精子密度過大，精子在游動(dòng)的過程中相互碰撞增多、速度下降，難以獲得精卵結(jié)合時(shí)所需的能量，也會(huì)減少受孕的幾率。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)精子濃度的方法，主要有經(jīng)典的顯微計(jì)數(shù)法和比色法。利用顯微計(jì)數(shù)法的檢測(cè)儀器主要有血細(xì)胞計(jì)數(shù)池、Makler計(jì)數(shù)池和Cell-VU計(jì)數(shù)池以及CASA系統(tǒng)隨機(jī)配置的Macro精子計(jì)數(shù)池。但國內(nèi)外專家發(fā)現(xiàn)，這種精子計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果可比性較差，其原因不僅包括來自精液標(biāo)本本身的影響因素，如標(biāo)本完整性、精液粘稠度等，還包括來自精子計(jì)數(shù)操作過程中的技術(shù)誤差，如計(jì)數(shù)池的差異、樣本混勻、加樣、技術(shù)人員的熟練程度等。
[0005]檢測(cè)精子密度的經(jīng)典方法是進(jìn)行精液常規(guī)檢查，這種方法需要到醫(yī)院去取樣，不但受到環(huán)境、方法、時(shí)間的限制，還會(huì)增加被檢男性的心理負(fù)擔(dān)，主觀和客觀因素的限制導(dǎo)致很多人不愿意到醫(yī)院做檢查，而更傾向于在家庭等私密環(huán)境中自檢。目前，中國市場(chǎng)上存在的精子密度自檢工具是基于比色法設(shè)計(jì)的試劑盒，該方法通過化學(xué)染料碘化丙啶對(duì)精液中的核酸成分進(jìn)行染色，根據(jù)顯色深淺判斷精子密度。這種方法雖然具有一定的可行性，但也存在多個(gè)弊端:首先，碘化丙啶作為有一定致癌性的核酸染料，家庭使用存在風(fēng)險(xiǎn);其次，該方法步驟繁瑣，結(jié)果判讀受到主觀因素的影響，準(zhǔn)確性較低;更重要的是，比色法不能區(qū)另IJ精液中非精子細(xì)胞成分，容易受到白細(xì)胞等其他細(xì)胞的影響。比色法本身的這些問題使其無法推廣，市場(chǎng)迫切需要一種更方便、更安全、更準(zhǔn)確的家用精子密度檢測(cè)工具。
[0006]精子頂體蛋白(Acrosomalvesicle protein I，簡稱ACRVl)是研究較多的一種精子特異性蛋白。一方面，ACRVl的基因位于人的11號(hào)染色體上，是單拷貝基因，成熟精子中ACRVl的蛋白含量非常穩(wěn)定;另一方面，ACRVl蛋白集中在精子頂體區(qū)的基質(zhì)中，在精子細(xì)胞裂解時(shí)易于釋放，能夠方便地檢測(cè)。這兩個(gè)特點(diǎn)決定了 ACRVl的蛋白量能夠作為推斷精子密度的可靠指標(biāo)。
[0007]膠體納米金免疫層析法是一種對(duì)復(fù)雜樣品中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)的固相膜免疫分析方法，該方法將膠體金免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合，其原理是將特異的抗原或抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品(如尿液、血液、精液裂解液、唾液等)后，由于毛細(xì)管作用，樣品便會(huì)帶著膠體金墊上的金標(biāo)抗體或抗原沿著硝酸纖維素膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，體系中發(fā)生抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，這一反應(yīng)使膠體金在這一條帶聚集而顯示出紫紅色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。由這一技術(shù)開發(fā)出的膠體金檢測(cè)試紙已成功應(yīng)用于多種臨床診斷及藥物監(jiān)測(cè)。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)精子密度的方法，僅能定性地測(cè)定精子密度較高或者半定量的測(cè)定精子密度高于某一值，而不能準(zhǔn)確地測(cè)定精子密度的范圍。此外，現(xiàn)有技術(shù)中還公開了一種通過比較檢測(cè)線(T線)與對(duì)照線(C線)的顏色差異來判斷精子密度的方法。這種方法的缺點(diǎn)在于，其需要主觀地比較判斷C線與T線的顏色深淺，在家用中受到使用者個(gè)人主觀的判斷誤差的影響，很難獲得準(zhǔn)確的誤差較小的結(jié)果。
[0009]針對(duì)這一技術(shù)問題，本實(shí)用新型提供了一種檢測(cè)精子密度的方法，所述方法為雙通道膠體金免疫層析法來檢測(cè)精子標(biāo)志蛋白ACRVl的濃度，所述兩個(gè)通道分別標(biāo)志性檢測(cè)正常精子密度范圍的上限和下限，從而用來評(píng)估男性精液樣品中的精子密度是否處于適于受孕的范圍。本實(shí)用新型僅通過肉眼觀察兩個(gè)通道的T線是否顯色，就可以判斷精子密度處于何種范圍內(nèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本實(shí)用新型的目的是提供一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒，此測(cè)試棒可以家用評(píng)估精液中精子密度是否處于健康范圍以內(nèi)，以克服現(xiàn)有家用精子密度檢測(cè)產(chǎn)品不安全、不準(zhǔn)確、非特異的缺點(diǎn)，同時(shí)幫助患者避免到醫(yī)院進(jìn)行精液檢查時(shí)受到的環(huán)境、方法、時(shí)間、以及心理上的限制。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案，提供一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒，其包含基板和平行設(shè)置且互不接觸的第一吸收性條帶和第二吸收性條帶，所述基板的兩端分別定義為S端和E端，所述第一吸收性條帶和第二吸收性條帶分別包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，所述樣品墊的一端位于所述基板的S端，另一端位于所述金標(biāo)墊的近S端上，所述金標(biāo)墊的近E端位于所述硝酸纖維素膜的近S端表面上，所述硝酸纖維素膜的近E端位于吸水墊的近S端下面，所述吸水墊的近E端位于所述基板的E端，所述硝酸纖維素膜上分別包被T線和C線，所述T線靠近S端，所述C線靠近E端，其中所述第一吸收性條帶的T線包被有抗人ACRVl蛋白的抗體，C線包被有抗鼠二抗，第二吸收性條帶的T線包含人ACRVl蛋白，C線包被有抗鼠二抗，所述金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人ACRVl單克隆抗體。
[0012]技術(shù)方案中提供的測(cè)試棒，進(jìn)一步包含殼體，其分別在第一吸收性條帶和第二吸收性條帶的樣品墊的上端具有開口，并且在第一吸收性條帶和第二吸收性條帶的T線和C線上端具有開口。
[0013]技術(shù)方案中提供的測(cè)試棒，進(jìn)一步的包含第一吸收條帶的T線，第一吸收條帶的C線;第二吸收條帶的T線，第二吸收條帶的C線。第一吸收性條帶的T線上包含的抗人ACRVl蛋白抗體的含量為0.2-1 yL/cm，濃度為0.5-2 mg/mL，第一吸收性條帶的C線包含的抗鼠二抗的含量為0.5-2.0 mg/mL;第二吸收性條帶的T線包含的人ACRVl蛋白的含量為0.5-2.0 mg/mL，包被量為0.2-1 yL/cm，第二吸收性條帶的C線包含的抗鼠二抗的含量為0.5-2.0 mg/mL，包被量為 0.2-1 yL/cm。
[0014]技術(shù)方案中提供的測(cè)試棒，進(jìn)一步的包含第一和第二吸收條帶的金標(biāo)墊，包含的膠體金標(biāo)記的鼠抗人ACRVl單克隆抗體的含量為3-6 yL/cm。
[0015]本實(shí)用新型根據(jù)上述技術(shù)方案，設(shè)計(jì)開發(fā)了一種用于評(píng)估男性精液中精子濃度是否處于健康范圍之內(nèi)的雙通道測(cè)試棒。通道一用于測(cè)定男性精液中的精子密度是否低于生育所需精子密度的下限，通道二用于判斷精子密度是否顯著高于正常至孕的上限。其中通道一的硝酸纖維素膜上有一條兔抗人ACRVl蛋白多克隆抗體的T線和一條抗鼠二抗的C線，T線的報(bào)告設(shè)定值為高于1500萬個(gè)精子/毫升精液;通道二的硝酸纖維素膜上帶有重組人ACRVl蛋白的T線和抗鼠二抗的C線，T線的報(bào)告設(shè)定值為低于25000萬個(gè)精子/毫升精液。該方法不僅具有使用安全、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，更具有方便快捷、無需任何儀器設(shè)備、結(jié)果判讀直觀可靠的優(yōu)點(diǎn)。使用該測(cè)試棒，受試者可以隨時(shí)在家中自我檢測(cè)。
【附圖說明】
[0016]圖1是一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖2是一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒各通道上檢測(cè)線的包埋成分。
[0018]圖3是測(cè)試棒對(duì)精子密度的測(cè)試結(jié)果判讀示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1.利用基因重組技術(shù)獲得人源ACRVl蛋白
[0020]將編碼人ACRVl基因的DNA片段克隆到可誘導(dǎo)的T7噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子控制的表達(dá)載體上，其C端帶有His6-標(biāo)簽。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，并用IPTG誘導(dǎo)ACRVl-His6的高表達(dá)。裂解細(xì)胞后，ACRVl蛋白處于不溶的包涵體中；采用6M的鹽酸胍溶解包涵體，低鹽透析后，離心去除不溶蛋白，采用鎳柱親和純化獲得人ACRVl重組蛋白。
[0021]實(shí)施例2.鼠抗人ACRVl單克隆抗體的制備
[0022]用純化的人源ACRVl蛋白免疫Balb/c小鼠，初次免疫后每隔2周用相同抗原再次加強(qiáng)免疫，取血測(cè)定血清抗ACRVl效價(jià)，以確定免疫效果。末次免疫后3天處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液(10~8細(xì)胞/毫升)。脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按10:1混合，在500mg/mL的PEG4000作用下按常規(guī)方法融合。細(xì)胞置于37 0C,5%CO2條件下用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。用有限稀釋法克隆化，所獲陽性單克隆再克隆化培養(yǎng)2次。制備腹水型鼠源單抗時(shí)，取約10~6個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的陽性克隆細(xì)胞株注入預(yù)注射石蠟油的雌性Balb/c小鼠腹腔內(nèi)。產(chǎn)生腹水后用大號(hào)針頭將腹水吸入離心管，過濾去除細(xì)胞及其他固體雜質(zhì)，經(jīng)蛋白A微球親和柱純化獲得抗體。
[0023]實(shí)施例3.兔抗人ACRVl多克隆抗體的制備
[0024]初次免疫取重組得人源ACRVl蛋白(0.2 mg/mL) 2 mL，加等量福氏完全佐劑，充分乳化后給家兔背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，間隔2周后用福氏不完全佐劑乳化相同肽段，肌內(nèi)注射，以后每隔2周用不含佐劑的抗原肌內(nèi)注射，共加強(qiáng)免疫4次后采血。免疫血清效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法，抗體純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化。
[0025]實(shí)施例4.金標(biāo)鼠抗人ACRVl抗體的制備
[0026]將100 !1^0.01%的氯金酸(說11(:14)水溶液加熱至沸騰，迅速加入2.5 mL新配制的I %檸檬酸溶液，邊加邊攪拌，溶液由淡黃色變?yōu)樯詈稚訜嶂令伾€(wěn)定變?yōu)樽霞t色后，自然冷卻至室溫，獲得膠體金溶液。用0.2 mol/L的碳酸鉀水溶液將膠體金溶液調(diào)至pH為8.5，磁力攪拌下加入2.5-10 mL 0.5mg/mL的鼠抗人ACRVl單克隆抗體，繼續(xù)攪拌30-60分鐘，加入牛血清白蛋白(BSA)至終質(zhì)量百分比濃度為I %，再攪拌30-60分鐘，4000 rpm離心20分鐘，棄沉淀;上清以10000 rpm離心60分鐘，棄上清，沉淀用0.01 M的含有I %BSA的磷酸鹽緩沖液重新懸浮洗滌2次，將沉淀用0.01 M的含有I %BSA的磷酸鹽緩沖液懸浮，加疊氮化鈉至
0.02%，得到穩(wěn)定的金標(biāo)抗體探針，4 °C保存。
[0027]實(shí)施例5.金標(biāo)墊的制備
[0028]金標(biāo)墊由玻璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成，將含有金標(biāo)抗體以及BSA、蔗糖的溶液噴于玻璃纖維上(BSA和蔗糖可以增加金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性和水溶性)作為測(cè)試棒的金標(biāo)墊，噴量為5 yL/cm。將玻璃纖維置于42°C真空干燥箱中烘干2小時(shí)以上，待完全烘干后，密封保存待用。
[0029]實(shí)施例6.樣品墊的制備
[0030]樣品墊為吸水性玻璃纖維層，為了增加保濕性和粘接性，將含吐溫-20、PEG20000的溶液噴在玻璃纖維上(PEG20000無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，并具有優(yōu)良的保濕性、粘接劑、抗靜電等特點(diǎn))，置于42 °C熱空氣消毒箱中烘干，密封備用。
[0031]實(shí)施例7.硝酸纖維素膜上T線和C線的包被
[0032]通道一用于檢測(cè)樣品中精子濃度是否低于正常受孕的下限，S卩1500萬/毫升，經(jīng)過優(yōu)化，選用濃度為0.5 mg/mL的兔抗人ACRVl多克隆抗體包被T線，選用0.8 mg/mL的抗鼠二抗包被C線;通道二用于檢測(cè)樣品中精子濃度是否高于一般受孕所需的上限，S卩25000萬/毫升，經(jīng)過優(yōu)化，選用濃度為1.2 mg/mL的重組人ACRVl蛋白包被T線，選用0.8 mg/mL的抗鼠二抗包被C線。上述包被量均為I yL/cm。包被后的硝酸纖維素膜經(jīng)真空干燥后，用1%BSA、
0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液封閉2小時(shí)，以0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌，真空干燥，密封待用。
[0033]實(shí)施例8.檢測(cè)棒的組裝
[0034]將已經(jīng)包被T線和C線的硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體墊、玻璃纖維樣品墊、吸水紙板按順序如圖1粘貼于底板上，按所需寬度切割后，通道一和通道二成對(duì)安放于雙通道塑料封裝盒中，密封保存?zhèn)溆谩?br>[0035]實(shí)施例9.精液樣品的量取與裂解
[0036]取新鮮精液放置40 min后，取150 yL加入2850 yL精子裂解液(1mM的磷酸緩沖溶液，含1%曲拉通114)，顛倒混勻后，取100此分別滴加在兩條檢測(cè)通道的上樣孔中，水平放置5-15分鐘，判讀結(jié)果。
[0037]實(shí)施例10.雙通道檢測(cè)棒的判讀
[0038]對(duì)于通道一，待精液裂解液滴加后，若T線顯色，C線顯色，表明測(cè)試者精子密度高于正常下限的1500萬/毫升;若T線不顯色，C線顯色，表明測(cè)試者精子密度低于正常范圍，屬于少精;若C線不顯色，表明試紙失效。對(duì)于通道二，待精液裂解液滴加后，若T線顯色，C線顯色，表明測(cè)試者精子密度沒有超出受孕上限的2500萬/毫升;若T線不顯色，對(duì)C線顯色，表明測(cè)試者精子密度高于正常范圍的上限，精子獲能及受孕可能受到影響；若C線不顯色，表明試紙失效。該精子密度檢測(cè)棒的結(jié)果判讀如圖3所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種評(píng)估精子密度的膠體金雙通道測(cè)試棒，其特征在于包含基板和平行設(shè)置且互不接觸的第一吸收性條帶和第二吸收性條帶，所述基板的兩端分別定義為S端和E端，所述第一吸收性條帶和第二吸收性條帶分別包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，所述樣品墊的一端位于所述基板的S端，另一端位于所述金標(biāo)墊的近S端上，所述金標(biāo)墊的近E端位于所述硝酸纖維素膜的近S端表面上，所述硝酸纖維素膜的近E端位于吸水墊的近S端下面，所述吸水墊的近E端位于所述基板的E端，所述硝酸纖維素膜上分別包被T線和C線，所述T線靠近S端，所述C線靠近E端，其中所述第一吸收性條帶的T線包被有抗人ACRVl蛋白的抗體，C線包被有抗鼠二抗，第二吸收性條帶的T線包含人ACRVl蛋白，C線包被有抗鼠二抗，所述金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人ACRVl單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是進(jìn)一步包括:殼體，其分別在第一吸收性條帶和第二吸收性條帶的樣品墊的上端具有開口，并且在第一吸收性條帶和第二吸收性條帶的T線和C線上端具有開口。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是第一吸收性條帶的T線上包含的抗人ACRVl蛋白抗體的含量為0.2-1 417011，濃度為0.5-2 mg/mLo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是第一吸收性條帶的C線包含的抗鼠二抗的含量為0.5-2.0 mg/mLo5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是第二吸收性條帶的T線包含的人ACRVl蛋白的含量為 0.5-2.0 11^/1^，包被量為0.2-1 yL/cm。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是第二吸收性條帶的C線包含的抗鼠二抗的含量為 0.5-2.0 11^/1^，包被量為0.2-1 yL/cm。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試棒，其特征是第一和第二吸收性條帶的所述金標(biāo)墊包含的膠體金標(biāo)記的鼠抗人ACRVl單克隆抗體的含量為3-6 yL/cm。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK205538989SQ201620049166
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年1月18日
【發(fā)明人】郝睿, 陳明慧
【申請(qǐng)人】南京沐美生物科技有限公司