專利名稱：一種檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的傳感器及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酚含量的檢測(cè)方法，具體涉及堆肥復(fù)雜系統(tǒng)中酚類物質(zhì)的生物傳感器測(cè)定。
背景技術(shù)：
酚類物質(zhì)是大規(guī)模有機(jī)化工工業(yè)非常重要的基本原料和副產(chǎn)物，在環(huán)境中廣泛存在，難以被生物或非生物降解，具有高毒性。作為公認(rèn)的有害物質(zhì)，酚對(duì)人體健康和環(huán)境有很大的影響。在城市生活垃圾堆肥系統(tǒng)中，存在有多種酚類污染物，堆肥中自然微生物菌群分泌出的木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和多酚氧化酶等多種酶均可以催化酚類物質(zhì)的解毒和氧化。因此，對(duì)堆肥過程中的酚類物質(zhì)的檢測(cè)，可實(shí)施對(duì)環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)控制。
目前，對(duì)于酚含量的測(cè)定采用較多的有分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法等方法進(jìn)行檢測(cè)。用分光光度法檢測(cè)，由于對(duì)底物濁度的要求和光干擾物質(zhì)的影響，限制了其精確性和使用范圍；采用液相和氣相色譜法檢測(cè)，檢測(cè)前需要對(duì)樣品分離，分離過程通常需要預(yù)處理，比較繁瑣和耗時(shí)，此外檢測(cè)儀器比較昂貴，且不便攜帶，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。因此研究一種適合在堆肥過程控制中的酚含量測(cè)定是亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在運(yùn)用電化學(xué)原理，提供一種測(cè)定酚含量的電流型生物傳感器，以提高酚類物質(zhì)測(cè)定的靈敏性和抗干擾能力，以便更好地應(yīng)用到城市生活垃圾堆肥處理中，解決堆肥過程控制系統(tǒng)中的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的。
一種檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的傳感器，是在距碳糊電極表面8mm處的碳糊1中埋入磁體2，電極經(jīng)拋光、清洗后，取足量的漆酶—磁性納米顆粒交聯(lián)體3滴涂在電極表面，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗掉未吸附的交聯(lián)體后制成漆酶?jìng)鞲衅鳌?br> 漆酶—磁性納米顆粒交聯(lián)體3是在制備Fe3O4膠狀沉淀后加入正硅酸乙酯和氨丙基三甲氧基硅烷完成氨基硅烷化，再懸浮于戊二醛中攪拌制得醛基化核/殼型磁性納米顆粒，然后將漆酶和磁性納米顆粒按1∶50的質(zhì)量比加入到pH7.0、1/15M的磷酸鹽緩沖溶液中攪拌12小時(shí)，再用磷酸鹽緩沖溶液清洗若干次抽濾干燥即成。
傳感器檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的方法是在接有三電極系統(tǒng)的電解池中，以飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極，以修飾了漆酶-Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體的碳糊電極為工作電極，用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定，先用1/15M的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)含酚的堆肥浸出液的pH值至5.5，測(cè)出傳感器在還原電位-0.232V下的響應(yīng)電流變化，按照對(duì)苯二酚和鄰苯二酚含量與電流變化建立的線性回歸方程計(jì)算堆肥浸出液中酚含量，對(duì)苯二酚含量與電流變化的線性回歸方程為y＝(0.2118±0.0045)x+(0.9834±0.2496)y是電流變化的值(μA)，x是加入對(duì)苯二酚濃度(μM)。對(duì)苯二酚的線性范圍為1×10-7～1.375×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到3×10-10M，r2為0.9933。
鄰苯二酚含量與電流變化的線性回歸方程為y＝(0.1581±0.0025)x+(0.7702±0.2764)y是電流變化的值(μA)，x是加入鄰苯二酚濃度(μM)。鄰苯二酚的線性范圍為5×10-8～2.75×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到5×10-8M，r2為0.9953。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明


圖1以漆酶—磁性納米顆粒交聯(lián)體修飾的碳糊電極結(jié)構(gòu)；1、碳糊 2、磁體3、漆酶—磁性納米顆粒交聯(lián)體 4、PVC管5、推進(jìn)塞6、電線圖2漆酶氧化還原酚的機(jī)制；其中QH2代表酚，Qox代表酚的氧化產(chǎn)物；圖3用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定堆肥浸出液中加入對(duì)苯二酚的階梯電流響應(yīng)；圖4對(duì)苯二酚含量與電流變化的線性回歸圖；圖5鄰苯二酚含量與電流變化的線性回歸圖；漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是含有銅離子的多酚氧化酶，每個(gè)漆酶蛋白分子中含有四個(gè)銅離子，包括一個(gè)I型銅原子，是單電子受體，和氨基酸殘基結(jié)合成為單核中心，一個(gè)II型銅原子，也是單電子受體，與兩個(gè)III型銅原子構(gòu)成三核中心；兩個(gè)III型銅原子是雙電子受體，形成偶合的離子對(duì)。銅離子是漆酶的催化活性中心，是漆酶表現(xiàn)催化活性的決定因素。漆酶是單電子氧化還原酶，可催化氧化250多種底物，其中酚及其衍生物占總數(shù)的一半以上，隨著酚類底物取代基的種類、數(shù)目和在芳環(huán)上的位置不同，漆酶的催化活性也有差異。催化氧化反應(yīng)主要表現(xiàn)在底物自由基的生成和漆酶分子中四個(gè)銅離子的協(xié)同作用。在漆酶催化酚類底物反應(yīng)中，酚將電子轉(zhuǎn)移給I型銅原子，通過氨基酸配體將電子傳遞給三核位點(diǎn)，還原態(tài)的酶分子再通過四電子轉(zhuǎn)移傳遞給O2，失去電子的酚變成醌自由基，再通過自由基反應(yīng)形成氧化產(chǎn)物，O2則還原為水。整個(gè)反應(yīng)過程需要連續(xù)的單電子氧化作用來滿足漆酶的充分還原。
漆酶主要由一些高等植物如漆樹以及白腐菌等真菌分泌產(chǎn)生，有些細(xì)菌也能產(chǎn)生漆酶。在堆肥系統(tǒng)中，也存在許多能夠分泌出漆酶的優(yōu)勢(shì)菌種，如黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、簡青霉(Penicillium simplicissimum)等。漆酶是胞外酶，對(duì)底物的氧化具有非特異性的特點(diǎn)，具有相當(dāng)廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，可以催化空氣中的氧氣直接氧化分解酚類、芳胺類和羧酸類等化合物以及它們的衍生物，此外還有甾體激素、生物色素、金屬有機(jī)物以及一些非酚類化合物。因此，利用漆酶對(duì)酚類物質(zhì)的催化作用可以制備出靈敏穩(wěn)定的酚傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)堆肥系統(tǒng)中酚類物質(zhì)的實(shí)時(shí)在線測(cè)定。
在制備漆酶和磁性納米顆粒交聯(lián)體的過程中，首先采用化學(xué)共沉淀的方法制備Fe3O4膠體，其粒徑為10nm左右。然后用正硅酸乙酯和聚乙二醇等試劑在Fe3O4表面包被一層SiO2殼，形成核/殼型的磁性納米粒子，其形狀為球形，粒徑在120nm左右。再用氨丙基三甲氧基硅烷將納米粒子表面氨基硅烷化，接著用戊二醛與粒子表面的氨基反應(yīng)，形成席夫堿結(jié)構(gòu)，從而使漆酶交聯(lián)固定在磁性粒子表面。磁性納米粒子比表面積很大，吸附酶量比較高，并使固定化的酶在溶液中與底物充分接觸反應(yīng)，電化學(xué)響應(yīng)非常靈敏。
在PVC管中填充碳糊，并埋入高能釹鐵硼磁鋼，該種磁體具有磁力大，體積小等特點(diǎn)。制成帶磁性的碳糊電極后，取足量的漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體滴涂在電極表面，形成磁性吸附，從而制備出漆酶?jìng)鞲衅?，其?gòu)造見圖1。將漆酶與Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)，達(dá)到固定化酶的效果，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，延長酶電極使用壽命，20天內(nèi)，響應(yīng)電流基本保持不變；40天左右，降到初始響應(yīng)電流的70％。利用順磁性，將漆酶—磁性納米顆粒吸附到碳糊電極表面上，便于分離和再生，而且操作簡單。當(dāng)酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)信號(hào)顯著降低時(shí)，可以通過更新電極表面，重新吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體達(dá)到再生的目的。即將電極的后端的推進(jìn)塞往前推進(jìn)，擠出失活的漆酶-磁性顆粒交聯(lián)體和碳糊的混合層，用0.5μm Al2O3粉末進(jìn)行拋光至電極表面光潔，形成新的電極表面，然后用水沖洗電極表面，再依次用38％HNO3、丙酮、水在超聲波中清洗，最后再用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)沖洗，自然晾干備用。經(jīng)重新處理的電極吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體，完成再生。也可以使用裝有蒸餾水的洗瓶吹洗傳感器表面，將磁場(chǎng)吸附的顆粒吹洗干凈，自然晾干后再重新吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體達(dá)到再生的目的。后一種方法更簡便易行。
酚類物質(zhì)在傳感器表面的氧化還原機(jī)制見圖2，漆酶以O(shè)2和酚為底物，將酚催化氧化。酚的氧化物在電極上還原成為酚，并產(chǎn)生電流信號(hào)，從而可以特異性地檢測(cè)出樣品中酚的濃度。
以對(duì)苯二酚為底物，催化反應(yīng)方程式為 以鄰苯二酚為底物，催化反應(yīng)方程式為 本發(fā)明的電化學(xué)測(cè)定采用上海上海辰華儀器公司生產(chǎn)的CHI660B電化學(xué)系統(tǒng)與50ml電解池中的三電極系統(tǒng)相連接，進(jìn)行控制與監(jiān)測(cè)。該三電極系統(tǒng)以修飾了漆酶-Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體的碳糊電極(直徑8mm)作為工作電極(即基底電極)，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑片電極作為對(duì)電極，進(jìn)行穩(wěn)定的測(cè)量。所有工作均在室溫(25℃)下完成。
本發(fā)明以對(duì)苯二酚、鄰苯二酚為底物，測(cè)試了堆肥浸出液中酚類物質(zhì)的含量，建立了電流變化與對(duì)苯二酚、鄰苯二酚含量之間的線性關(guān)系。圖3以對(duì)苯二酚為例，表示在堆肥浸出液中，還原電位-0.232V條件下，每次加入10μM對(duì)苯二酚所得到的電流變化曲線。
考察了對(duì)苯二酚、鄰苯二酚的測(cè)定反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)在還原電位-0.232V下，在磷酸鹽緩沖溶液pH值范圍為5～6，對(duì)苯二酚濃度為1×10-7～1.375×10-4M，鄰苯二酚濃度為5×10-8～2.75×10-4M時(shí)，電流對(duì)對(duì)苯二酚、鄰苯二酚的響應(yīng)比較顯著。最佳條件是在磷酸鹽緩沖溶液(pH5.5)中，通過電流變化分別測(cè)定對(duì)苯二酚、鄰苯二酚的含量。對(duì)苯二酚的線性回歸方程為y＝(0.2118±0.0045)x+(0.9834±0.2496)y是電流變化的值(μA)，x是加入對(duì)苯二酚濃度(μM)。對(duì)苯二酚的線性范圍為1×10-7～1.375×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到3×10-10M。線性回歸曲線見圖4。
鄰苯二酚的線性回歸方程為y＝(0.1581±0.0025)x+(0.7702±0.2764)y是電流變化的值(μA)，x是加入鄰苯二酚濃度(μM)。鄰苯二酚的線性范圍為5×10-8～2.75×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到5×10-8M。線性回歸曲線見圖5。
分別用對(duì)苯二酚和鄰苯二酚做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。將3組含酚的堆肥浸出液樣品分別用高效液相色譜法和漆酶生物傳感器測(cè)定。在最佳條件下，經(jīng)傳感器采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定得到的酚濃度值，與用高效液相色譜法測(cè)得的相應(yīng)的值很接近。
將本測(cè)定方法運(yùn)用到堆肥處理當(dāng)中，不僅測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法非常相近而且操作快速、簡便，靈敏度高，選擇性好，再生方法簡便易行，而且還能克服分光光度法所不能克服的復(fù)雜系統(tǒng)中濁度和光干擾物質(zhì)的干擾問題，為城市生活垃圾堆肥控制系統(tǒng)中快速、低成本的酚含量在線檢測(cè)提供了技術(shù)支持。
具體實(shí)施例方式
1、漆酶-Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體的制備氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將一定量按Fe2+∶Fe3+＝1∶2配比的FeCl2、FeCl3投加入38mL 0.4M鹽酸中溶解后，倒入375mL 0.7M氨水中，強(qiáng)烈攪拌生成Fe3O4膠狀沉淀。然后取0.232g沉淀，加入到200mL正丙醇中，超聲后再依次加入5.36g PEG(聚乙二醇)、20mL H2O、10mL氨水和1.2mL TEOS(正硅酸乙酯)，攪拌24h，分離、清洗、冷凍干燥后，取0.5g懸浮于10mL甲醇中，加入0.5mL APTMS(氨丙基三甲氧基硅烷)，室溫?cái)嚢?2h完成硅烷化，之后懸浮于5mL 2.5％戊二醛中攪拌，即得到醛基化核/殼型磁性納米顆粒。然后在4℃，將0.01g漆酶和0.5g磁性納米顆粒加入到5mL由1/15M Na2HPO4和1/15MKH2PO4配成的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中攪拌12h，完成交聯(lián)，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)清洗3次后抽濾干燥，懸浮于1mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中。
2、漆酶?jìng)鞲衅鞯闹苽涫紫仍赑VC管中填充碳糊，其組分為質(zhì)量比為1.25∶1的石墨與石蠟，距表面8mm處，放入6.5mm×1.5mm的高能釹鐵硼磁鋼，形成磁性區(qū)域，并繼續(xù)填充碳糊，使電極表面具有良好的導(dǎo)電性能，并留有更新再生用的碳糊層。用0.5μm Al2O3粉末進(jìn)行拋光至電極表面光潔，然后用水沖洗電極表面，再依次用38％HNO3、丙酮、水在超聲波中清洗，最后再用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)沖洗，自然晾干備用。取60μL的漆酶—磁性顆粒交聯(lián)體懸浮液滴涂在電極表面，空氣中干燥1小時(shí)，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)沖洗，去掉未固定的漆酶—磁性顆粒交聯(lián)體，置于4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 3、堆肥條件具體堆料組成見如下土壤218g，取樣于為岳麓山東側(cè)表層以下1m處，稻草2600g，食堂殘余物988g，麩皮52g，含水率51％。對(duì)堆料混合后進(jìn)行好氧堆肥，環(huán)境溫度保持在30℃(水浴恒溫)，通風(fēng)量為0.033m3/h。
4、堆肥浸出液制備取堆肥樣10g置于錐形瓶中，加入200mL蒸餾水，在37℃下振蕩120min，速度200r/min，過濾后將濾液離心5min，10000r/min，上清液過濾即得到堆肥浸出液。
5、酚的標(biāo)定對(duì)苯二酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線是在最佳條件下標(biāo)定。最佳條件是磷酸鹽緩沖溶液(1/15M，pH5.5)，還原電位-0.232V，分別加入一定濃度的對(duì)苯二酚，根據(jù)響應(yīng)電流變化即可計(jì)算出測(cè)定池中對(duì)苯二酚的濃度。
鄰苯二酚的標(biāo)定步驟同上，在最佳條件下，分別加入一定濃度的鄰苯二酚，根據(jù)響應(yīng)電流變化即可計(jì)算出測(cè)定池中鄰苯二酚的濃度。
6、堆肥浸出液中酚的測(cè)定采用計(jì)時(shí)電流的方法，以修飾了漆酶-Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體的碳糊電極為基底電極，用磷酸鹽緩沖溶液(1/15M)調(diào)節(jié)含酚的堆肥浸出液的pH值至pH5.5，以傳感器在還原電位-0.232V下的響應(yīng)電流變化測(cè)定堆肥浸出液中酚含量。將相同的樣品用Agilent 1100高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，采用H2O、乙腈和乙酸(88∶10∶2)作為流動(dòng)相，流速為0.7mL/min，紫外分光光度計(jì)在波長280nm處進(jìn)行檢測(cè)。將得到的酚含量結(jié)果與傳感器結(jié)果相比較，見下表。

7、酶?jìng)鞲衅髟偕?dāng)酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)信號(hào)顯著降低時(shí)，將電極的后端的推進(jìn)塞往前推進(jìn)，擠出失活的漆酶-磁性顆粒交聯(lián)體和碳糊的混合層，用0.5μm Al2O3粉末進(jìn)行拋光至電極表面光潔，形成新的電極表面，然后同步驟2的方法將電極重新處理、吸附具有活性的漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體，完成再生。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的傳感器，其特征在于在距碳糊電極表面8mm處的碳糊(1)中埋入磁體(2)，電極經(jīng)拋光、清洗后，取足量的漆酶-磁性納米顆粒交聯(lián)體(3)滴涂在電極表面，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗掉未吸附的交聯(lián)體后制成漆酶?jìng)鞲衅鳌?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的傳感器，漆酶-磁性納米顆粒交聯(lián)體(3)是在制備Fe3O4膠狀沉淀后加入正硅酸乙酯和氨丙基三甲氧基硅烷完成氨基硅烷化，再懸浮于戊二醛中攪拌制得醛基化核/殼型磁性納米顆粒，其特征在于將漆酶和Fe3O4磁性納米顆粒按1∶50的質(zhì)量比加入到pH7.0、1/15M的磷酸鹽緩沖溶液中攪拌12小時(shí)，再用磷酸鹽緩沖溶液清洗若干次，抽濾干燥即成。
3.一種如權(quán)利要求1所述的傳感器檢測(cè)堆肥中酚類物質(zhì)的方法是在接有三電極系統(tǒng)的電解池中，以飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極，以修飾了漆酶-Fe3O4磁性納米顆粒交聯(lián)體的碳糊電極為工作電極，用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定，其特征在于用1/15M的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)含酚類物質(zhì)的堆肥浸出液的pH值至5.5，測(cè)出傳感器在還原電位-0.232V下的響應(yīng)電流變化，按照對(duì)苯二酚和鄰苯二酚含量與電流變化建立的線性回歸方程計(jì)算堆肥浸出液中酚含量，對(duì)苯二酚含量與電流變化的線性回歸方程為y＝(0.2118±0.0045)x+(0.9834±0.2496)y是電流變化的值(μA)，x是加入對(duì)苯二酚濃度(μM)，對(duì)苯二酚的線性范圍為1×10-7～1.375×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到3×10-10M，r2為0.9933，鄰苯二酚含量與電流變化的線性回歸方程為y＝(0.1581±0.0025)x+(0.7702±0.2764)y是電流變化的值(μA)，x是加入鄰苯二酚濃度(μM)，鄰苯二酚的線性范圍為5×10-8～2.75×10-4M，檢測(cè)下限達(dá)到5×10-8M，r2為0.9953。
全文摘要
本發(fā)明涉及堆肥系統(tǒng)中酚含量的生物傳感器檢測(cè)。本發(fā)明以修飾了漆酶—Fe
文檔編號(hào)G06F19/00GK1837809SQ20061003150
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者曾光明, 湯琳, 章毅, 牛承崗, 沈國勵(lì), 黃丹蓮 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)