專利名稱：一種a、c群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測定方法。
背景技術(shù)：
腦膜炎球菌感染是引起兒童細菌性腦膜炎的常見病因，病死率較高。由于腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗的使用，有效地控制了發(fā)病率。但是，莢膜多糖屬T細胞非依賴性抗原，再次免疫不能被加強，且不能誘導(dǎo)2歲以下兒童產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有一定的局限性。以化學(xué)方法將蛋白載體共價結(jié)合到莢膜多糖上，可以使之成為T細胞依賴型抗原，從而具有免疫記憶反應(yīng)，因此對5歲以下嬰幼兒提供免疫保護。
研究表明，A群腦膜炎球菌多糖一破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物、C群腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物在小鼠中具有很強的免疫原性，可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IgG，而單獨的莢膜多糖不能刺激小鼠產(chǎn)生抗體或僅有低水平抗體產(chǎn)生。可見結(jié)合物中真正起作用的是與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合的多糖。多糖結(jié)合疫苗中的游離多糖含量超過規(guī)定的限度會對疫苗臨床使用的效果產(chǎn)生不利的影響，因此多糖蛋白結(jié)合物中游離多糖含量測定是多糖結(jié)合疫苗質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是反映結(jié)合疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。
因為不同細菌莢膜多糖以及不同多糖結(jié)合物性質(zhì)差異較大，所以多糖結(jié)合疫苗中的游離多糖測定是一個技術(shù)難點，目前尚無多糖結(jié)合物中游離多糖含量測定的通用方法。國外文獻報道采用高效液相色譜法進行細菌多糖結(jié)合物中游離多糖測定，一種采用高效凝膠過濾，一種采用高效陰離子交換色譜。高效凝膠過濾法基于分子大小差異來區(qū)分結(jié)合多糖與游離多糖，易受到分子大小相近雜質(zhì)的影響，測定結(jié)果誤差較大；高效陰離子交換色譜基于分子帶電荷性質(zhì)的差異來區(qū)分結(jié)合多糖與游離多糖，也易受到與多糖帶電荷性質(zhì)相似的雜質(zhì)的影響。國內(nèi)朱為、李鳳祥在《A群腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物中游離多糖測定方法的建立》(微生物學(xué)免疫學(xué)進展，2002年，30卷第4期)上介紹了一種利用乙醇沉淀法測定A群腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物游離多糖的方法，但該方法步驟繁多，一個樣品需要5天才能獲得結(jié)果。但目前尚無利用冷酚溶液萃取方法測定A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有方法測定游離多糖含量的不足，該方法可以準確測定A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖的含量，并且方法簡便、快捷。
本發(fā)明的技術(shù)方案及步驟(1)取待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；(2)另取該腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中；向每離心管加入2～10ml冷酚溶液，振蕩混勻10～30分鐘，置冰浴5～20分鐘，5000～10000rpm離心10～30分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4；(3)A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定磷含量，計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度；C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定唾液酸含量，計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度；樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度分別為p1、p2、p3、p4；(4)根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率應(yīng)在80～120％；(5)根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>式中P為回收率。
其中所述的冷酚溶液可以是按照每100g苯酚加40ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液溶解的比例配制，然后預(yù)冷至4℃制備而成。
本發(fā)明的有益效果是利用苯酚極強的致蛋白質(zhì)變性的特點，在苯酚存在并經(jīng)高速離心后，結(jié)合多糖因偶聯(lián)的蛋白變性而不可逆沉降，游離多糖仍在上清液中，這樣結(jié)合多糖與游離多糖分開，分別測定離心上清液與原液的多糖含量，即可計算出游離多糖含量。本發(fā)明提供了一種準確、快速測定A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的方法，建立了評價腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗質(zhì)量的方法。
具體實施例方式實施例1500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3。另取該A群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中。向每離心管加入2ml冷酚溶液，振蕩混勻10分鐘，置冰浴5分鐘，5000rpm離心10分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的磷含量，按照公式“A群多糖濃度＝磷含量/0.08”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝140.0μg/ml，p2＝12.0μg/ml，p3＝88.9μg/ml，p4＝85.1μg/ml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為95.7％；根據(jù)公式計算游離多糖含量H
H=p2p1÷P×100%,]]>A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為9.0％。
實施例2500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；另取該A群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中；向每離心管加入10ml冷酚溶液，振蕩混勻30分鐘，置冰浴20分鐘，10000rpm離心30分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的磷含量，按照公式“A群多糖濃度＝磷含量/0.08”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝143.2μg/ml，p2＝14.1μg/ml，p3＝75.2μg/ml，p4＝72.4μg/ml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為96.3％；根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為10.2％。
實施例3
500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；另取該A群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中。向每離心管加入4ml冷酚溶液，振蕩混勻20分鐘，置冰浴15分鐘，7000rpm離心20分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的磷含量，按照公式“A群多糖濃度＝磷含量/0.08”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝94.7μg/ml，p2＝7.6μg/ml，p3＝114.9μg/ml，p4＝112.3μg/ml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為97.7％；根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為8.2％。
實施例4500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；另取該C群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中。向每離心管加入2ml冷酚溶液，振蕩混勻10分鐘，置冰浴5分鐘，5000rpm離心10分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖濃度＝唾液酸含量/0.8”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝68.5μg/ml，p2＝7.8μg/ml，p3＝57.2μg/ml，p4＝54.5μg/ml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為95.3％；根據(jù)公式計算游離多糖含量H=p2p1÷P×100%,]]>C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為11.9％。
實施例5500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；另取該C群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中。向每離心管加入10ml冷酚溶液，振蕩混勻30分鐘，置冰浴20分鐘，10000rpm離心30分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖濃度＝唾液酸含量/0.8”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝116.2μg/ml，p2＝6.6μg/ml，p3＝49.6μg/ml，p4＝47.2μg/ml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為95.2％；根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為6.0％。
實施例6500克分析純無水醋酸鈉在加熱下溶于800ml注射用水，趁熱用0.45微孔濾膜過濾，過濾后的醋酸鈉溶液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶，此時上清即為飽和醋酸鈉溶液。取此飽和醋酸鈉溶液100ml，加注射用水稀釋至1000ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.9～7.1，即為1/10飽和中性醋酸鈉溶液。取500克分析純苯酚一瓶，在60℃水浴下加熱使融化，趁熱將已融化的苯酚倒入裝有200ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液的容器中，迅速混勻，置4℃冰箱保存過夜，即為冷酚溶液。
取待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；另取該C群腦膜炎球菌結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中。向每離心管加入4ml冷酚溶液，振蕩混勻20分鐘，置冰浴15分鐘，7000rpm離心20分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4。
測定樣1、樣2、樣3、樣4的唾液酸含量，按照公式“C群多糖濃度＝唾液酸含量/0.8”計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，分別為p1＝50.2μg/ml，p2＝3.1μg/ml，p3＝50.5μg/ml，p4＝48.6μml根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%,]]>回收率為96.2％；根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%,]]>C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量為6.4％。
權(quán)利要求
1.一種A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測定方法，其步驟是(1)取待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml作為樣1，取該待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml作為樣3；(2)另取該腦膜炎球菌多糖結(jié)合物2ml置于15ml離心管中，取該待檢腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液2ml置于另一15ml離心管中；向每離心管加入2～10ml冷酚溶液，振蕩混勻10～30分鐘，置冰浴5～20分鐘，5000～10000rpm離心10～30分鐘，每離心管單獨收集上清液，結(jié)合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4；(3)A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定磷含量，計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度；C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定唾液酸含量，計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度；樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度分別為p1、p2、p3、p4；(4)根據(jù)公式計算回收率PP=p4p3×100%]]>，回收率應(yīng)在80～120％；(5)根據(jù)公式計算游離多糖含量HH=p2p1÷P×100%]]>，式中P為回收率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測定方法，其特征是所述冷酚溶液是按照每100g苯酚加40ml 1/10飽和中性醋酸鈉溶液溶解的比例配制，然后預(yù)冷至4℃制備而成。
全文摘要
本發(fā)明一種A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物中游離多糖含量的測定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其步驟為取A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物作為樣1；取A、C腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液為樣3；取一定量A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物，加入冷酚溶液，充分振蕩，離心收集上清液為樣2；取一定量A、C腦膜炎球菌多糖結(jié)合物對應(yīng)的衍生物溶液，加入冷酚溶液，充分振蕩，離心收集上清液為樣4。A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定磷含量、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物測定唾液酸含量，計算出樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，并利用公式計算游離多糖含量。本發(fā)明能準確、快速、簡便測定出結(jié)合物中游離多糖的含量，從而評價制品質(zhì)量。
文檔編號G06F19/00GK1971266SQ20061004887
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者黃鎮(zhèn), 吳凱 申請人:云南沃森生物技術(shù)有限公司