專利名稱：轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法。

背景技術(shù)：
通過生物技術(shù)將克隆的外源基因人為地整合到昆蟲基因組內(nèi)、并穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)，這樣的昆蟲叫做轉(zhuǎn)基因昆蟲。轉(zhuǎn)基因昆蟲能夠形成一個(gè)具有相應(yīng)外源基因的新的品種，其利用價(jià)值在于 (1)開展基礎(chǔ)理論研究； (2)生產(chǎn)外源蛋白； (3)開展經(jīng)濟(jì)昆蟲的分子育種； (4)開展害蟲的生物防治。
在轉(zhuǎn)基因昆蟲研究中，多采用紅色熒光基因、綠色熒光基因等作為標(biāo)志基因(也稱報(bào)告基因)，確定及選擇轉(zhuǎn)基因昆蟲，熒光蛋白的含量是標(biāo)志基因表達(dá)量的體現(xiàn)，也是很多外源基因與標(biāo)志基因結(jié)合構(gòu)成的融合蛋白表達(dá)量的體現(xiàn)。當(dāng)前對(duì)轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)主要是處在肉眼觀測(cè)的定性階段，對(duì)融合蛋白表達(dá)量的檢測(cè)主要是解剖昆蟲，通過分子生物學(xué)或分析化學(xué)的分析檢測(cè)方法得到。本發(fā)明可以在不損傷昆蟲、不需分子生物學(xué)或生物化學(xué)分析測(cè)試的情況下，只需通過熒光觀察和數(shù)碼照像，就可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量的觀察值，達(dá)到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量外源基因與標(biāo)志基因結(jié)合構(gòu)成的融合蛋白表達(dá)量的目的。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法 1)是利用熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲的個(gè)體，用數(shù)碼相機(jī)或數(shù)碼CCD攝影設(shè)備，在暗室中按1/60秒-20秒曝光時(shí)間攝取表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像； 2)運(yùn)用圖像處理技術(shù)，首先將所得昆蟲圖像進(jìn)行預(yù)處理，明確圖像中昆蟲部分和黑色背景界限，再將所攝取的表現(xiàn)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應(yīng)顏色分量的灰度圖像，按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，根據(jù)該直方圖，按照選擇能夠清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值的要求，確定二值化分割圖像的閾值，然后利用該閾值進(jìn)行二值化分割圖像，得到一張與原圖像素大小一樣，但昆蟲部分像素值為1、即為白色，背景部分像素值為0、即為黑色的二值圖像，最后，利用中值濾波消除圖像斑點(diǎn)，確定中值濾波的鄰域大??； 3)根據(jù)所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，累加灰度圖像中分離所得昆蟲部分像素值，除以所取的像素點(diǎn)數(shù)，所得平均值作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)數(shù)值。
所述的圖像處理技術(shù)，使用photoshop圖像處理軟件、開源圖像處理軟件Gimp、或者matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，或者采用c、python編程語(yǔ)言編程實(shí)現(xiàn)。
所述的相應(yīng)顏色分量是根據(jù)轉(zhuǎn)基因昆蟲表達(dá)的熒光蛋白顏色確定，Red熒光基因是轉(zhuǎn)化為紅色顏色分量的灰度圖像，GFP、EGFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為綠色顏色分量的灰度圖像，CFP和ECFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為藍(lán)色顏色分量的灰度圖像。
所述的利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，是利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件的圖像處理工具箱，建立了一個(gè)可供調(diào)用的函數(shù)meanRGB，程序代碼如下 function r=meanRGB(filename,rgb,threshold,neighborhood)f=imread(filename);g=f(:,:,rgb);b=im2bw(g,threshold/256);if neighborhood　　m=medfilt2(b,[2*neighborhood+1,2*neighborhood+1]);else　　m=bendr=0;n=0;h=size(f,1);w=size(f,2);for x=1:1:h　　for y=1:1:w<!-- SIPO <DP n="2"> --><dp n="d2"/>　　 if m(x,y)　　 n=n+1;　　 r=r+double(g(x,y));　　endendendr=r/n;r=int16(r); 這個(gè)函數(shù)調(diào)用的接口是 輸入的參數(shù)filename為所攝取表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像的文件名。rgb表明測(cè)量是紅、綠、藍(lán)哪種顏色的熒光紅色熒光則該參數(shù)值為1，綠色熒光則該參數(shù)值為2，藍(lán)色熒光則該參數(shù)值為3。threshold為本技術(shù)方案第二步所確定的閾值。neighborhood為本技術(shù)方案第二步所確定中值濾波鄰域大小。
該函數(shù)調(diào)用后返回取得的結(jié)果即為圖像中昆蟲部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)量的數(shù)值。
本發(fā)明具有的有益的效果是本發(fā)明可以在不損傷昆蟲、不需分子生物學(xué)或生物化學(xué)分析測(cè)試的情況下，只需通過熒光觀察和數(shù)碼照像，就可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量的觀察值，達(dá)到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量融合蛋白表達(dá)量的目的。



圖1是紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖2是分割圖1得到的位于圖1上面的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖3是分割圖1得到的位于圖1下面的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖4是經(jīng)過預(yù)處理的圖2； 圖5是經(jīng)過預(yù)處理的圖3； 圖6是圖4紅色顏色分量的灰度圖象； 圖7是圖5紅色顏色分量的灰度圖象； 圖8是圖6的直方圖； 圖9是圖7的直方圖； 圖10是對(duì)圖6應(yīng)用閾值10進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖11是對(duì)圖6應(yīng)用閾值11進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖12是對(duì)圖6應(yīng)用閾值12進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖13是對(duì)圖6應(yīng)用閾值13進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖14是對(duì)圖6應(yīng)用閾值14進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖15是對(duì)圖6應(yīng)用閾值15進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖16是對(duì)圖6應(yīng)用閾值16進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖17是對(duì)圖6應(yīng)用閾值17進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖18是對(duì)圖6應(yīng)用閾值18進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖19是對(duì)圖6應(yīng)用閾值19進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖20是對(duì)圖6應(yīng)用閾值20進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖21是對(duì)圖16進(jìn)行鄰域的大小為10的中值濾波后所得的圖； 圖22是對(duì)圖7應(yīng)用閾值10進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖23是對(duì)圖7應(yīng)用閾值11進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖24是對(duì)圖7應(yīng)用閾值12進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖25是對(duì)圖7應(yīng)用閾值13進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖26是對(duì)圖7應(yīng)用閾值14進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖27是對(duì)圖7應(yīng)用閾值15進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖28是對(duì)圖7應(yīng)用閾值16進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖29是對(duì)圖7應(yīng)用閾值17進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖30是對(duì)圖7應(yīng)用閾值18進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖31是對(duì)圖7應(yīng)用閾值19進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖32是對(duì)圖7應(yīng)用閾值20進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖33是對(duì)圖7應(yīng)用閾值21進(jìn)行二值化所得的二值圖； 圖34是對(duì)圖7應(yīng)用閾值22進(jìn)行二值化所得的二值圖像； 圖35是GFP轉(zhuǎn)基因家蠶RGB彩色圖像； 圖36是圖35綠色顏色分量的灰度圖象； 圖37是圖36的直方圖； 圖38是應(yīng)用閾值10進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖39是應(yīng)用閾值11進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖40是應(yīng)用閾值12進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖41是應(yīng)用閾值13進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖42是應(yīng)用閾值14進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖43是應(yīng)用閾值15進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖44是應(yīng)用閾值16進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖45是應(yīng)用閾值17進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖46是應(yīng)用閾值18進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖47是應(yīng)用閾值19進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖48是應(yīng)用閾值20進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖49是應(yīng)用閾值21進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖50是應(yīng)用閾值22進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖51是GFP轉(zhuǎn)基因家蠶； 圖52是圖51綠色顏色分量的灰度圖象； 圖53是圖52的直方圖； 圖54是應(yīng)用閾值2進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖55是應(yīng)用閾值3進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖56是應(yīng)用閾值4進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖57是應(yīng)用閾值5進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖58是應(yīng)用閾值3進(jìn)行二值化分割后再經(jīng)過中值濾波所得的二值圖； 圖59是Red轉(zhuǎn)基因昆蟲； 圖60是Red轉(zhuǎn)基因昆蟲紅色顏色分量的灰度圖像； 圖61是圖60的直方圖； 圖62是應(yīng)用閾值10進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖63是應(yīng)用閾值11進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖64是應(yīng)用閾值12進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖65是應(yīng)用閾值13進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖66是應(yīng)用閾值14進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖67是應(yīng)用閾值15進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖68是應(yīng)用閾值16進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖69是應(yīng)用閾值17進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖70是應(yīng)用閾值18進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖71是應(yīng)用閾值19進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖72是應(yīng)用閾值20進(jìn)行二值化分割所得的二值圖； 圖73是應(yīng)用閾值18進(jìn)行二值化分割后再經(jīng)過中值濾波所得的二值圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測(cè)，激發(fā)光濾光片波長(zhǎng)為545-580nm，發(fā)射光濾光片波長(zhǎng)為610-的熒光裝置，用NiKon公司的COOLPIX4500數(shù)碼照相機(jī)觀察轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，在暗室中按1/2秒曝光攝取表達(dá)紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖1)。
圖1中有兩條轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，將圖1分割成圖2，圖3。
2、利用photoshop軟件分別對(duì)圖2、圖3進(jìn)行預(yù)處理。
2.1利用photoshop工具箱中的畫筆工具進(jìn)行預(yù)處理，得到圖4，圖5，使得圖像中昆蟲部分和黑色背景界限分明。
2.2因?yàn)楸緦?shí)施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)的熒光基因?yàn)榧t色熒光(Red)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換為紅色顏色分量的灰度圖象，得到圖6，圖7。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“通道”的紅色選項(xiàng)。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖8，圖9。在photoshop中操作即為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“直方圖”。
仔細(xì)觀察以上兩幅直方圖，發(fā)現(xiàn)它們都有兩個(gè)峰。因?yàn)閳D片是在黑暗環(huán)境中攝取，背景為黑色并且像素值大小越低，該像素值所代表的顏色就越黑。所以可以認(rèn)為第一個(gè)峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個(gè)峰代表圖像中的家蠶部分。選擇第一個(gè)峰和第二個(gè)峰之間的谷底靠近第一峰的一個(gè)像素?cái)?shù)值開始，以1為梯度，不斷增大該值，直到能將圖像中背景部分和家蠶部分清晰的分開為止，選擇該值作為進(jìn)行圖像二值化的閾值。
對(duì)于圖6，我們選擇像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應(yīng)用閾值10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20對(duì)圖6進(jìn)行二值化的二值圖圖10，圖11，圖12，圖13，圖14，圖15，圖16，圖17，圖18，圖19，圖20。在photoshop中操作為選擇“菜單欄→圖像→調(diào)整→閾值”，在跳出的對(duì)話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應(yīng)的二值圖像。
比較觀察二值圖10至圖20，當(dāng)用閾值10-15進(jìn)行二值化圖像分割時(shí)(圖10～圖15)，所得的二值圖家蠶形體周圍有比較多的小白色斑點(diǎn)，家蠶部分的輪廓不清晰，說明這些值不是好的閾值。當(dāng)閾值為16時(shí)(圖16)，所得的二值圖家蠶形體周圍的小的白色斑點(diǎn)減少，昆蟲部分的輪廓比較清晰。但是當(dāng)閾值為17-20時(shí)(圖17～圖20)，雖然家蠶形體周圍小的白色斑點(diǎn)消失，但是家蠶部分出現(xiàn)較大的黑色斑點(diǎn)(家蠶尾部)，也即在當(dāng)閾值為17-20時(shí)圖像的家蠶部分有較大部分像素點(diǎn)會(huì)被誤認(rèn)為背景。所以，選擇16作為圖6的閾值。為了清除圖16中的白色斑點(diǎn)，需要對(duì)圖16進(jìn)行中值濾波，取能夠?qū)唿c(diǎn)去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在photoshop中選擇“菜單欄→濾鏡→雜色→中間值”，在跳出的對(duì)話框中輸入所用的濾波鄰域的大小，從1開始不斷增大該值，直到能夠?qū)唿c(diǎn)完全去掉為止。記取此時(shí)所用的鄰域的大小。對(duì)于圖片11，選擇的鄰域的大小為10，得到圖21。
也就是說對(duì)于圖4(即圖6的原圖)，按照技術(shù)方案第二步對(duì)其進(jìn)行處理，確定它二值化分割的閾值為16，中值濾波的鄰域大小為10。
同理對(duì)于圖7，我們同樣選擇像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應(yīng)用閾值10-22對(duì)圖7進(jìn)行二值化的二值圖(圖22～圖34)。
同樣地，比較觀察二值圖22至圖34，當(dāng)閾值大于20后，即圖32、圖33、圖34，圖片中家蠶部分和黑色背景部分能夠清晰地分開。在這種情況下，為遵循“選擇能夠清晰分割圖像背景和家蠶部分的最小閾值”的要求，所以選擇20作為閾值。
因?yàn)橛瞄撝?0進(jìn)行二值化圖像分割得到的圖32，沒有小的白色斑點(diǎn)，所以沒有必要進(jìn)行中值濾波，也就是中值濾波的鄰域的大小為0。
也就是說對(duì)于圖5(即圖7的原圖)，按照技術(shù)方案第二步對(duì)其進(jìn)行處理，確定它二值化分割的閾值為20，中值濾波的鄰域大小為0。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計(jì)算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)量的數(shù)值。
對(duì)于圖4(文件名為“ph4.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph4.jpg’，1，16，10)，調(diào)用所得的結(jié)果為132。
對(duì)于圖5(文件名為“ph5.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph5.jpg’，1，20，0)，調(diào)用所得的結(jié)果為148。
本實(shí)施例在同樣條件下對(duì)2個(gè)轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體進(jìn)行攝影，獲得2個(gè)轉(zhuǎn)基因家蠶熒光基因表達(dá)量的相對(duì)數(shù)值，圖4的結(jié)果為132，圖5的結(jié)果為148，說明圖5對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)的紅色熒光蛋白含量高于圖4，也即圖5對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因家蠶熒光基因表達(dá)的效率較高。
實(shí)施例2 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測(cè)，熒光裝置的激發(fā)光濾光片波長(zhǎng)為460-490nm，發(fā)射光濾光片波長(zhǎng)為510-550，用NiKon公司的COOLPIX 4500數(shù)碼照相機(jī)觀察轉(zhuǎn)基因家蠶2齡幼蟲，在暗室中按1秒曝光時(shí)間攝取表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖35)。
2、利用photoshop軟件對(duì)圖35按上面說明的技術(shù)方案步驟二進(jìn)行處理。
2.1因?yàn)樵搱D像中昆蟲部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無(wú)需再作圖像預(yù)處理。
2.2因?yàn)楸緦?shí)施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)的熒光基因?yàn)榫G色熒光(GFP)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換綠色顏色分量的灰度圖象，得到圖36。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“通道”的綠色選項(xiàng)。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖37。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“直方圖”。
直方圖37有兩個(gè)峰，其中第一個(gè)峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個(gè)峰代表圖像中的家蠶部分。所以，選擇第一個(gè)峰和第二個(gè)峰的谷底靠近第一峰的一個(gè)值，10，為開始嘗試的閾值，得到應(yīng)用閾值10-22對(duì)圖36進(jìn)行二值化的二值圖，得到圖38至圖50。在photoshop中操為選擇“菜單欄→圖像→調(diào)整→閾值”，在跳出的對(duì)話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應(yīng)的二值圖像。
比較觀察二值圖38至圖50，當(dāng)閾值大于20后，即圖48、圖49、圖50，圖片中家蠶部分和黑色背景部分能夠清晰地分開。在這種情況下，為了減少人為原因造成的誤差，遵循“選擇能夠清晰分割圖像背景和家蠶部分的最小閾值”的要求，所以選擇20作為閾值。
因?yàn)橛瞄撝?0進(jìn)行二值化圖像分割得到的圖48，沒有小的白色斑點(diǎn)，所以沒有必要進(jìn)行中值濾波，也就是中值濾波的鄰域的大小為0。
也就是說對(duì)于圖35(即圖36的原圖)，按照技術(shù)方案第二步對(duì)其進(jìn)行處理，確定它二值化分割的閾值為20，中值濾波的鄰域大小為0。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計(jì)算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)量的數(shù)值。
對(duì)于圖35(文件名為“ph35.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph35.jpg’，2，20，0)，計(jì)算所得的結(jié)果為140。
實(shí)施例3 1、利用OLYMPUS SZX12體視顯微鏡(解剖鏡)觀測(cè)，激發(fā)光濾光片波長(zhǎng)為460-490nm，發(fā)射光濾光片波長(zhǎng)為510-550的熒光裝置，用數(shù)碼CCD攝影設(shè)備，按8秒曝光攝取轉(zhuǎn)基因家蠶3齡幼蟲，在暗室中攝取表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖51)，該圖比實(shí)施例2中的圖像暗，說明GFP基因的表達(dá)比實(shí)施例2弱。
2、利用photoshop軟件對(duì)圖51按上面說明的技術(shù)方案步驟二進(jìn)行處理。
2.1因?yàn)樵搱D像中家蠶部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無(wú)需再作圖像預(yù)處理。
2.2因?yàn)楸緦?shí)施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)的熒光基因?yàn)榫G色熒光(GFP)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換綠色顏色分量的灰度圖象，得到圖51。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“通道”的綠色選項(xiàng)。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖53。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動(dòng)面板的“直方圖”。
直方圖52有兩個(gè)峰，其中第一個(gè)峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個(gè)峰代表圖像中的家蠶部分。但是，由于本圖中轉(zhuǎn)基因家蠶gfp基因表達(dá)量較少，家蠶部分較為暗淡，所以兩個(gè)峰之間間隔較小，我們選擇第一個(gè)峰和第二個(gè)峰的谷底靠近第一峰的一個(gè)值，2，為開始嘗試的閾值，按應(yīng)用閾值2、3、4和5對(duì)圖52進(jìn)行二值化，得到圖54至圖57。在photoshop中操為選擇“菜單欄、圖像、調(diào)整、閾值”，在跳出的對(duì)話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應(yīng)的二值圖像。
比較觀察以上的二值圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用閾值2進(jìn)行二值化圖像分割(圖54)，所得的二值圖家蠶形體周圍有比較多的小白色斑點(diǎn)，家蠶部分的輪廓不太清晰，說明該值不是好的閾值。當(dāng)閾值為3時(shí)(圖55)，所得的二值圖家蠶形體周圍的小的白色斑點(diǎn)減少，昆蟲部分的輪廓比較清晰。但是當(dāng)閾值為4、5時(shí)(圖56、圖57)，雖然家蠶形體周圍小的白色斑點(diǎn)消失，但是家蠶部分出現(xiàn)較大的黑色斑點(diǎn)(家蠶胸部)，也即在當(dāng)閾值大于3時(shí)圖像的家蠶部分有較大部分像素點(diǎn)會(huì)被誤認(rèn)為背景。所以，選擇3作為圖52的閾值。
為了清除圖55中的黑色背景中白色斑點(diǎn)和家蠶部分黑色斑點(diǎn)，需要對(duì)圖55進(jìn)行中值濾波，取能夠?qū)唿c(diǎn)去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在photoshop中選擇“菜單欄→濾鏡→雜色→中間值”，在跳出的對(duì)話框中輸入所用的濾波鄰域的大小，從1開始不斷增大該值，直到能夠?qū)唿c(diǎn)完全去掉為止。記取此時(shí)所用的鄰域的大小。對(duì)于圖片55，選擇的鄰域的大小為4，得到圖58。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計(jì)算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)量的數(shù)值。
對(duì)于圖51(文件名為“ph51.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph51.jpg’，2，3，4)，計(jì)算所得的結(jié)果為25。
實(shí)施例4 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測(cè)，激發(fā)光濾光片波長(zhǎng)為545-580nm，發(fā)射光濾光片波長(zhǎng)為610-的熒光裝置，用NiKon公司的COOLPIX4500數(shù)碼照相機(jī)觀察轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，在暗室中按1/2秒曝光攝取表達(dá)紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖59)。
2、上面說明的技術(shù)方案步驟二所描述的圖片處理方法不僅可以在photoshop軟件中的交互界面中實(shí)現(xiàn)，還可以用matlab數(shù)學(xué)軟件編程實(shí)現(xiàn)。下面我們就利用matlab按照技術(shù)方案步驟二對(duì)圖59進(jìn)行處理。
2.1因?yàn)樵搱D像中昆蟲部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無(wú)需再作圖像預(yù)處理。
2.2在matlab軟件環(huán)境中，讀入圖像，因?yàn)槭莇sRed轉(zhuǎn)基因昆蟲轉(zhuǎn)入表達(dá)的是紅色熒光蛋白，故將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為R(red)值的灰度圖像(圖60)。Matlab代碼image＝imread(‘Red.jpg’)； Red.jpg為圖59的文件名 red_image＝image(:，:，1) 2.3生成直方圖(圖61)，直方圖中存在明顯的兩個(gè)峰，其中第一個(gè)峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個(gè)峰代表圖像中的家蠶部分。選擇第一個(gè)峰和第二個(gè)峰之間的谷底靠近第一峰的區(qū)的像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應(yīng)用閾值10-20對(duì)圖60進(jìn)行二值化的二值圖圖62-圖72。
同樣地，選用能夠較為清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值18。
2.4對(duì)圖70進(jìn)行中值濾波去噪聲(即二值中的小斑點(diǎn))，選擇能夠?qū)唿c(diǎn)去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在matlab中，調(diào)用medfilt2函數(shù)，從中值濾波鄰域最小值1開始，以1為梯度，逐步增大中值濾波鄰域值，選擇能夠?qū)唿c(diǎn)去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小，得數(shù)值5。Matlab代碼 生成圖像直方圖imhist(red_image) 根據(jù)閾值二值化binary_image＝im2bw(red_image，18/255) 中值濾波medfilted_image＝medfilt2(binary_image，[5，5]) 也就是說對(duì)于圖59(即圖60的原圖)，按照技術(shù)方案第二步對(duì)其進(jìn)行處理，確定它二值化分割的閾值為18，中值濾波的鄰域大小為5(圖73)。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計(jì)算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)量的數(shù)值。
對(duì)于圖59(文件名為“ph59.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph59.jpg’，1，18，5)，所得的結(jié)果為185。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法，其特征在于
1)是利用熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲的個(gè)體，用數(shù)碼相機(jī)或數(shù)碼CCD攝影設(shè)備，在暗室中按1/60秒-20秒曝光時(shí)間攝取表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像；
2)運(yùn)用圖像處理技術(shù)，首先將所得昆蟲圖像進(jìn)行預(yù)處理，明確圖像中昆蟲部分和黑色背景界限，再將所攝取的表現(xiàn)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應(yīng)顏色分量的灰度圖像，按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，根據(jù)該直方圖，按照選擇能夠清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值的要求，確定二值化分割圖像的閾值，然后利用該閾值進(jìn)行二值化分割圖像，得到一張與原圖像素大小一樣，但昆蟲部分像素值為1、即為白色，背景部分像素值為0、即為黑色的二值圖像，最后，利用中值濾波消除圖像斑點(diǎn)，確定中值濾波的鄰域大小；
3)根據(jù)所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，累加灰度圖像中分離所得昆蟲部分像素值，除以所取的像素點(diǎn)數(shù)，所得平均值作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)數(shù)值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法，其特征在于所述的圖像處理技術(shù)，使用photoshop圖像處理軟件、開源圖像處理軟件Gimp、或者matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，或者采用c、python編程語(yǔ)言編程實(shí)現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法，其特征在于所述的相應(yīng)顏色分量是根據(jù)轉(zhuǎn)基因昆蟲表達(dá)的熒光蛋白顏色確定，Red熒光基因是轉(zhuǎn)化為紅色顏色分量的灰度圖像，GFP、EGFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為綠色顏色分量的灰度圖像，CFP和ECFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為藍(lán)色顏色分量的灰度圖像。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法，其特征在于所述的利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件，是利用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件的圖像處理工具箱，建立了一個(gè)可供調(diào)用的函數(shù)meanRGB，程序代碼如下
function r＝meanRGB(filename，rgb，threshold，neighborhood)
f＝imread(filename)；
g＝f(，，rgb)；
b＝im2bw(g，threshold/256)；
if neighborhood
m＝medfilt2(b，[2*neighborhood+1，2*neighborhood+1])；
else
m＝b
end
r＝0；
n＝0；
h＝size(f，1)；
w＝size(f，2)；
for x＝1:1:h
for y＝1:1:w
if m(x，y)
n＝n+1；
r＝r+double(g(x，y))；
end
end
end
r＝r/n；
r＝int16(r)；
這個(gè)函數(shù)的調(diào)用接口是
輸入的參數(shù)filename為所攝取表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像的文件名；rgb表明測(cè)量是紅、綠、藍(lán)哪種顏色的熒光。紅色熒光則該參數(shù)值為1，綠色熒光則該參數(shù)值為2，藍(lán)色熒光則該參數(shù)值為3；threshold為本權(quán)利要求書特征(2)所確定的閾值。neighborhood為本權(quán)利要求書特征(2)所確定的中值濾波鄰域大??；
該函數(shù)調(diào)用后取得的結(jié)果即為圖像中昆蟲部分像素值平均值，也即用來(lái)衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)的相對(duì)量的數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無(wú)損傷測(cè)定方法。是通過熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲個(gè)體，用數(shù)碼相機(jī)或數(shù)碼CCD攝影設(shè)備攝取圖像，利用圖像處理軟件，將所得圖像進(jìn)行預(yù)處理，再將所攝取的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應(yīng)顏色分量的灰度圖像，確定二值化分割圖像的閾值和用于消除圖像二值化后斑點(diǎn)的中值濾波的鄰域大小，用matlab應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件計(jì)算所得昆蟲形體部分熒光值的平均值，作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)量的相對(duì)數(shù)值。它可在不損傷昆蟲、不需分子生物學(xué)或生化測(cè)試的情況下，通過熒光觀察和數(shù)碼照像，可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量，達(dá)到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量外源基因與標(biāo)志基因結(jié)合構(gòu)成的融合蛋白表達(dá)量的目的。
文檔編號(hào)G06T7/60GK1912140SQ20061005282
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月7日
發(fā)明者楊元杰, 鐘伯雄, 魯華云, 丁農(nóng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)