專利名稱：：一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及計算機(jī)科學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及微流控芯片技術(shù)。特別提供了一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
：癌癥是一種基因性疾病，在基因水平進(jìn)行診斷和治療是最基本和最準(zhǔn)確的方法。細(xì)胞癌變是一個以多種原癌基因的激活和抑癌基因的失活為基礎(chǔ)的過程，因此，在進(jìn)行基因診斷時，往往需要對多種基因的表達(dá)水平進(jìn)行綜合的判斷。目前，癌癥的診斷往往是在體外進(jìn)行，通過對血液和組織檢驗結(jié)果等進(jìn)行判斷，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到單細(xì)胞水平。并且，體外診斷和體內(nèi)治療是兩個相對獨(dú)立的環(huán)節(jié)，抗癌藥物對正常細(xì)胞往往也造成較大的損傷。如何將抗癌藥物特異性的釋放到腫瘤細(xì)胞，提高治療的靶向性，是生物醫(yī)學(xué)工作者們致力解決的難題。迄今為止，有多種方法和技術(shù)被應(yīng)用于藥物的靶向釋放中，如利用病毒(文獻(xiàn)CancerGeneTher即y，2008，15，667-675)、納米顆粒(文獻(xiàn)GeneTher即y，2000，7，1896-1905)以及微流控芯片(文獻(xiàn)LabOnAChip,2006，6，1384-1386)等攜帶藥物，但由于這些體系缺少了"診斷"這一環(huán)節(jié)，因此還不能做到最為準(zhǔn)確的靶向"治療"。2004年，Sh即iro小組報道了一種可控制基因表達(dá)的生物分子計算機(jī)(文獻(xiàn)Nature,2004，429，423-429)，在試管內(nèi)模擬了微小的DNA計算機(jī)進(jìn)入細(xì)胞后，通過多次的雜交、酶連、酶切反應(yīng)，對前列腺癌和肺癌多種相關(guān)基因的表達(dá)情況依次進(jìn)行計算，并在診斷成立時，釋放一條較短的單鏈核酸分子作為藥物進(jìn)行治療。該計算機(jī)首次將診斷和治療兩個相對獨(dú)立的環(huán)節(jié)聯(lián)系起來，并將診斷和治療定位在單細(xì)胞水平，提高了藥物釋放的靶向性，為解決癌癥的靶向治療提供了新的研究方向。但這種DNA計算機(jī)如要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗尚存在以下幾點(diǎn)不足1、該計算機(jī)所有的生化反應(yīng)是在試管中進(jìn)行的，DNA計算機(jī)要進(jìn)入體內(nèi)行使功能，必然需要一種有效的載體攜帶著DNA分子和酶將其傳遞到相應(yīng)的靶點(diǎn)，防止DNA分子在計算前就被降解掉，顯然試管不能成為這種有效的載體；2、對多種癌癥相關(guān)基因表達(dá)情況采用依次進(jìn)行(串聯(lián))的計算方式，并且每計算一種基因需要引入多種高濃度的外源性分子，有可能會影響到細(xì)胞的正常生理功能；3、該計算機(jī)必須要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能行使功能，增強(qiáng)了操作難度；4、最為重要的一點(diǎn)，該計算機(jī)采用限制性內(nèi)切酶(FokI酶)進(jìn)行酶切反應(yīng)，限制性內(nèi)切酶僅存于低等生物內(nèi)(如細(xì)菌、病毒等)，可在特定位點(diǎn)可將雙鏈DNA分子切斷，因此有可能對高等生物的基因組產(chǎn)生影響。綜上所述，若要將DNA計算機(jī)應(yīng)用于基因診斷和治療中，必須要有更為合理的計算方法和更為理想的平臺。另外，上述體系中所釋放的為預(yù)先已經(jīng)存在的藥物，一種更為靈活的方法為根據(jù)需要合成治療藥物然后釋放(文獻(xiàn)NatureBiotechnology，2003，21，1184-1191)。人們期望獲得一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容針對本發(fā)明的所述技術(shù)背景，我們設(shè)計了一種能自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物及其制備方法，(其具體實施可以是基于DNA計算機(jī)而進(jìn)行，優(yōu)選以微流控芯片為載體)，對癌癥相關(guān)的多種基因表達(dá)情況同時進(jìn)行計算，并于診斷成立時，自動合成完整的自殺基因作為有效的抗癌藥物釋放，而在診斷不成立時，釋放的僅為無效的片段化的藥物。我們以乳腺癌為例，在一塊幾平方厘米的微流控芯片上，在體外驗證了該DNA計算機(jī)原理的可行性。模擬了更為微型化的微流控芯片DNA計算機(jī)進(jìn)入體內(nèi)后，無需進(jìn)入細(xì)胞，可以通過微量的細(xì)胞質(zhì)，即可進(jìn)行基因診斷并治療的過程。計算中采用的分子種類和數(shù)量均較少，使用的酶為高等生物體內(nèi)存在的DNA連接酶。隨著納米材料和微加工技術(shù)的發(fā)展，有望開展進(jìn)一步的體內(nèi)試驗。DNA計算機(jī)是基于DNA分子生化反應(yīng)的新型生物計算機(jī)。具體地說，就是代表一定信息的DNA分子作為"輸入"，經(jīng)過雜交、變性、酶連、酶解等可控的生化反應(yīng)進(jìn)行"計算"，反應(yīng)后生成的新的或符合某種要求的DNA分子作為"輸出"。計算過程中往往需要酶的參與，如限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、外切核酸酶等。按照DNA計算機(jī)的實現(xiàn)方式，DNA計算機(jī)經(jīng)歷了試管(文獻(xiàn)Science,1994,266，1021-1024)、表面(文獻(xiàn)Nature,2000，403，175-179)和芯片(文獻(xiàn)LabOnAChip,2005，5,1033-1040)三個階段。將DNA分子固定在表面上的計算方式，可以克服試管中DNA分子易丟失和操作難、檢測難的特點(diǎn)，但多個計算步驟仍須在人工干預(yù)下間斷進(jìn)行。微流控芯片具有比表面更為明顯的優(yōu)勢，不僅可將計算用的某種DNA分子以三維立體的方式固定在芯片的局部，并且具有高度集成化、自動化、小型化、微型化的特點(diǎn)，DNA計算所需的多個生化反應(yīng)，均可在一塊微小的芯片上連續(xù)完成。因此芯片有可能取代試管和表面，成為DNA計算機(jī)一種理想的平臺。與傳統(tǒng)的電子計算機(jī)相比，DNA計算機(jī)具有并行性高、運(yùn)算速度快、信息存儲量大等優(yōu)點(diǎn)，被用于研究解決復(fù)雜的數(shù)學(xué)難題(文獻(xiàn)ProceedingsOfTheNationalAcademyOfSciencesOfTheUnitedStatedStatesOfAmerica，2004，101，9960-9965)。此夕卜，由于其具有生物相容性，科學(xué)家們力圖將其應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域中，用于癌癥的診斷和治療(文獻(xiàn)ScientificAmerican，2006，294，44-51)。本發(fā)明的目的是提供一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法是使用作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子，通過雜交、變性、酶連等生化反應(yīng)，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達(dá)情況進(jìn)行計算，并在計算結(jié)果符合要求時，自動合成并靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；在其所述的計算過程中，所述作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子具體是DNA分子和/或酶。所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中，作為運(yùn)算介質(zhì)的DNA分子具體為與每種癌癥相關(guān)基因相對應(yīng)的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個缺口的不完整的自殺基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數(shù)量與藥物片段分子的序列和數(shù)量相對應(yīng)。所述作為運(yùn)算介質(zhì)的DNA分子中，與每種癌癥相關(guān)基因相對應(yīng)的計算分子和藥物片段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中，當(dāng)被檢測對象中對應(yīng)的癌癥相關(guān)基因表達(dá)超出正常范圍(升高或降低都會超出正常范圍)時，超出部分的癌癥相關(guān)基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與計算分子的匹配關(guān)系中置換取代下來，使原有的計算分子與癌癥相關(guān)基因雜交的結(jié)構(gòu)變?yōu)樾碌母鼮榉€(wěn)定的結(jié)構(gòu)；5當(dāng)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部沒有從其與計算分子的匹配關(guān)系中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺基因分子結(jié)合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中所述作為運(yùn)算介質(zhì)的酶為T4DNA連接酶；所述藥物片段分子與計算分子在結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)，其二者能夠?qū)崿F(xiàn)雜交；具體而言，所述藥物片段分子與不完整的自殺基因分子上的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接酶的作用下能夠?qū)⒉煌暾淖詺⒒蛏系娜笨谔钛a(bǔ)，使其形成完整的自殺基因；相對于藥物片段分子而言，癌癥相關(guān)基因與計算分子互補(bǔ)序列較長，癌癥相關(guān)基因更易于與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。當(dāng)癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳?yīng)的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應(yīng)關(guān)系中取代下來后，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應(yīng)的目的區(qū)域(其后的輸出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。當(dāng)癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳?yīng)的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應(yīng)關(guān)系中取代下來后，從計算單元傳遞來的藥物片段分子被輸送到特定的目標(biāo)區(qū)域和不完整的自殺基因雜交并在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行酶連反應(yīng)，將相應(yīng)的缺口填補(bǔ)；所述的特定目標(biāo)區(qū)域中包含有不完整的自殺基因；當(dāng)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)符合要求(即原癌基因表達(dá)升高高于正常限制值并且抑癌基因表達(dá)降低低于正常限制值)時，相應(yīng)的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補(bǔ)，此時即有完整的自殺基因被合成并作為抗癌藥物釋放；只要有一種基因表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，缺口就不會被完全填補(bǔ)，對應(yīng)地就不能有完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法依據(jù)載體實施，所述載體是微流控芯片，其在結(jié)構(gòu)上具體分為三個功能單元輸入單元、計算單元和輸出單元；其中，計算單元布置在輸入單元和輸出單元之間，這三個單元之間液體流路順序聯(lián)接，并在電場作用下可以形成藥物片段分子的定向移動控制(如附圖2所示)；作為載體的微流控芯片，材料可為石英、玻璃、P匿A、PC聚合物等；所述自動合成并可靶向釋放抗癌藥物的方法中，計算分子固定在作為載體的微流控芯片的計算單元上；藥物片段分子預(yù)先雜交在計算分子上；不完整的自殺基因和T4DNA連接酶體系預(yù)先放置在輸出單元中。當(dāng)原癌基因分子或抑癌基因分子這兩類癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳?yīng)的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應(yīng)關(guān)系中取代下來時，被取代下來的藥物片段分子在電場的作用下靶向釋放到對應(yīng)的目的區(qū)域(其后的輸出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物(當(dāng)然前提是所有的被取代下來的藥物片段分子能填補(bǔ)不完整的自殺基因的所有缺口使其能形成真正具有抗癌作用的完整藥物)。在微流控芯片的輸出單元，從計算單元傳遞來的藥物片段分子和不完整的自殺基因雜交并在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行酶連反應(yīng)，將相應(yīng)的缺口填補(bǔ)；當(dāng)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)符合要求(即原癌基因表達(dá)升高并且抑癌基因表達(dá)降低)時，相應(yīng)的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補(bǔ)，此時即有完整的自殺基因被6合成并作為抗癌藥物釋放；只要有一種基因表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，缺口就不會被完全填補(bǔ)，對應(yīng)地就不能有完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。藥物片段分子與不完整的自殺基因上的缺口序列相同，可在T4DNA連接酶的作用下將缺口填補(bǔ)。分子之間的關(guān)系詳見圖l。所述自動合成并可靶向釋放抗癌藥物的過程控制方法中，將計算分子固定在作為載體的微流控芯片的計算單元的具體過程是將末端修飾有丙烯酰胺基團(tuán)或氨基基團(tuán)的計算分子溶解于丙烯酰胺溶液中，終濃度為520iim;經(jīng)紫外曝光后，固定在丙烯酰胺水凝膠中。(固定在水凝膠中的計算分子可保持活性，可進(jìn)行雜交、變性等反應(yīng)。丙烯酰胺水凝膠為一種透明的基質(zhì)，在沒有電場作用下，可起到閥的作用；在低壓電場作用下，可允許DNA分子通過。)所述作為載體的微流控芯片中，輸入單元含有多個(根據(jù)實際需要確定可用范圍，通常的可用范圍是1300)樣品池，樣品池的數(shù)目依據(jù)診斷的需要而定，不同的癌癥相關(guān)基因通常分別由不同的樣品池輸入。所述微流控芯片中的計算單元具體為分別與各個樣品池相連的同等數(shù)量的并行通道；每個通道里含有與癌癥相關(guān)基因相對應(yīng)的計算分子和藥物片段分子，分別對不同基因的表達(dá)情況進(jìn)行計算并傳遞相應(yīng)藥物片段，不同通道的計算是同時獨(dú)立進(jìn)行的，互不干擾；所述微流控芯片中的輸出單元含有一條通道和一個酶連池，酶連池中含有不完整的自殺基因分子和T4DNA連接酶反應(yīng)體系；從計算單元不同通道傳遞來的藥物片段分子通過輸出單元的通道匯集到酶連池中進(jìn)行酶連反應(yīng)；在輸出單元的通道中固定了一段空白水凝膠，它不僅可以起到閥的作用，并且由于水凝膠有濃縮DNA分子的作用，從計算單元傳遞來的藥物片段分子在此處檢測要比在酶連池中檢測更為靈敏，參見圖2。所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法滿足下述兩種要求之一其一，在計算原癌基因表達(dá)是否升高并在其升高時能以對應(yīng)的量取代相應(yīng)藥物片段的微流控芯片的計算單元的通道中，固定有兩段水凝膠；第一段水凝膠中僅固定相應(yīng)的計算分子；第二段水凝膠中所固定的計算分子上，還預(yù)先雜交有相應(yīng)的藥物片段分子；當(dāng)原癌基因分子(即含有癌癥相關(guān)基因的待檢測分子中的一類，另一類待檢測分子是抑癌基因)在低壓電場作用下，進(jìn)入第一段水凝膠，和相應(yīng)的計算分子雜交而被其捕獲；捕獲的速度與原癌基因分子的濃度呈相關(guān)性；當(dāng)基因表達(dá)在正常范圍的上限時，經(jīng)過一定時間的電泳，原癌基因恰好走到第一段水凝膠的另一側(cè)邊緣；而當(dāng)基因表達(dá)升高時，由于雜交的速度更快，經(jīng)過相同時間的電泳，升高部分的原癌基因可穿過第一段水凝膠，到達(dá)其下游，并在電場作用下，進(jìn)入第二段水凝膠和計算分子雜交，而將相應(yīng)的藥物片段分子取代下來，取代的量與基因表達(dá)升高的量相對應(yīng)，取代下來的藥物片段分子在電場的作用下進(jìn)一步傳遞到輸出單元。其二，在計算抑癌基因表達(dá)是否降低并取代相應(yīng)藥物片段的微流控芯片的計算單元的通道中，固定有兩段水凝膠第一段水凝膠中固定相應(yīng)的計算分子，并預(yù)先雜交有相應(yīng)的藥物片段分子；第二段水凝膠為空白水凝膠，僅起到閥的作用，不參與計算；7抑癌基因分子在低壓電場作用下，首先進(jìn)入第一段水凝膠，將相應(yīng)的藥物片段分子取代下來(取代的速度與抑癌基因分子的濃度呈相關(guān)性)；當(dāng)抑癌基因表達(dá)在正常范圍下限時，經(jīng)過一定時間的電泳，抑癌基因恰好走到第一段水凝膠的另一側(cè)邊緣，將所有的藥物片段分子全部取代下來，被取代下來的藥物片段分子隨后被棄除；當(dāng)抑癌基因表達(dá)降低時，由于取代速度變慢，經(jīng)過相同時間的電泳，仍有一部分藥物片段不會被取代下來而保留在水凝膠中，取代下來的部分被棄除。保留在水凝膠中的部分在改變電泳條件時被沖洗下來，這部分的量和基因表達(dá)降低的量相對應(yīng)，在電場的作用下進(jìn)一步傳遞到輸出單元。在作為載體的微流控芯片的輸出單元中，當(dāng)原癌基因表達(dá)升高，抑癌基因表達(dá)降低時被傳遞來的相應(yīng)的藥物片段，可在不完整的自殺基因分子相應(yīng)的缺口的位置與之雜交，并在T4DNA連接酶的作用下將藥物片段分子與不完整的自殺基因之間的縫隙連接上，將相應(yīng)的缺口填補(bǔ)。當(dāng)所有的缺口都被填補(bǔ)時，沒有抗癌活性的不完整的自殺基因分子就成為完整的自殺基因分子，具有了抗癌活性?？傊?，本發(fā)明首次采用微流控芯片作為載體將DNA計算機(jī)應(yīng)用于癌癥的基因診斷和治療當(dāng)中，利用微流控芯片高通量的特點(diǎn)，同時計算多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)情況(原癌基因是否升高、抑癌基因是否降低)，在診斷成立時合成并釋放功能性的藥物——完整的自殺基因，在診斷不成立時，釋放的僅為無功能的藥物片段。該方法與納米技術(shù)和微加工技術(shù)相結(jié)合，有助于提高癌癥的靶向治療。下面結(jié)合附圖及實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖1為該DNA計算機(jī)的分子之間關(guān)系示意圖；圖2為該DNA計算機(jī)的載體——微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖(含一條計算原癌基因表達(dá)是否升高的通道和一條計算抑癌基因表達(dá)是否降低的通道)；圖3為計算原癌基因表達(dá)是否升高的原理示意圖之一；圖4為計算原癌基因表達(dá)是否升高的原理示意圖之二；圖5為計算原癌基因表達(dá)是否升高的原理示意圖之三；圖6為計算抑癌基因表達(dá)是否降低的原理示意圖之一；圖7為計算抑癌基因表達(dá)是否降低的原理示意圖之二；圖8為計算抑癌基因表達(dá)是否降低的原理示意圖之三；圖9為功能性藥物連接示意圖；圖10為正常范圍上限的原癌基因C-erbB-2在第一段水凝膠中的電泳熒光圖；圖11為五種不同濃度的原癌基因C-erbB-2的計算結(jié)果圖；圖12改變電泳條件時藥物片段B被洗脫的電泳熒光圖；圖13為五種不同濃度的抑癌基因nm23的計算結(jié)果圖；圖14為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之一；圖15為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之二；圖16為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖制三；圖17為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之四；圖18為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之五。具體實施方式實施例1我們以乳腺癌為例，說明自動合成并靶向釋放抗癌藥物的制備方法的可行性。我們計算了與乳腺癌關(guān)系最為密切的兩種基因，即原癌基因C-erbB-2和抑癌基因nm23，表達(dá)升高和降低的情況，并在兩者表達(dá)均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)時，合成完整的自殺基因HSV-tk作為抗癌藥物并將其釋放。在體外實驗中，我們采用合成的較短的DNA分子來代替較長的原癌基因和抑癌基因。與原癌基因相對應(yīng)的為計算分子1和藥物片段A，與抑癌基因相對應(yīng)的為計算分子2和藥物片段B。用與藥物片段A和B互補(bǔ)的模板鏈來代替不完整的自殺基因分子。藥物片段A和B可與模板鏈相結(jié)合，形成雜交雙鏈，并在T4DNA連接酶的作用下連接成完整的雙鏈，這個完整的雙鏈表示功能性的藥物，如圖9所示。為了便于檢測，在基因分子和藥物片段分子的末端用熒光基團(tuán)標(biāo)記，F(xiàn)AM基團(tuán)在494nm波長激發(fā)，522nm波長檢測時發(fā)出綠色熒光，TAMRA基團(tuán)在560nm波長激發(fā)，582nm波長檢測時發(fā)出紅色熒光。藥物片段A和B連接時需要有磷酸根基團(tuán)(P04-)的參與。計算分子標(biāo)記有丙烯酰胺基團(tuán)(acrylamide-)，可通過共價鍵固定在丙烯酰胺水凝膠中。分子的序列和修飾的情況詳見表1。表1為DNA計算機(jī)所需分子的核苷酸序列及標(biāo)記<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本實施例所用載體為微流控芯片，具體如圖2所示是含有兩條并行通道的玻璃芯片，通道寬200iim，深80iim，全長(從樣品池1或6到酶連池13)約50mrn，通道中固定的每段水凝膠長度均為lmm，液池的直徑為2mm。將含有10m計算分子的丙烯酰胺溶液注入通道中，待通道中充滿該溶液時，用黑色不透明膠布將芯片的其他部分遮蓋住，僅將需要形成水凝膠的通道部分露出，在紫外燈下曝光5分鐘，暴露的部分就形成了固定有計算分子的水凝膠。將其他部位未形成水凝膠的丙烯酰胺溶液，通過真空泵從水凝膠兩側(cè)的液池吸走。通過此方法，可在計算原癌基因是否升高的通道中形成兩段含有計算分子1的水凝膠，在計算抑癌基因是否降低的通道中形成一段含有計算分子2的水凝膠和一段空白水凝膠(不含任何計算分子)，在輸出單元的通道內(nèi)形成一段空白水凝膠(不含任何計算分子)。將藥物片段A加入液池4中，在液池4和5之間施加48v電壓，藥物片段A進(jìn)入水凝膠中和計算分子1雜交，經(jīng)5分鐘電泳后，雜交達(dá)到飽和，將液池4和5中的剩余液體棄除，同樣可將藥物片段B預(yù)先雜交在計算分子2上，各個緩沖液池中均充入高鹽的緩沖液IXTE和O.5MNaCl。計算的過程在熒光顯微鏡下檢測。我們設(shè)定l2ym為基因表達(dá)的正常范圍。在計算原癌基因是否升高的通道中，首先考察正常范圍上限即2ym的原癌基因C-erbB-2到達(dá)第一段水凝膠右側(cè)邊緣的時間，實驗證明為3分鐘，結(jié)果如圖IO所示。因此我們將第一步電泳的時間定為3分鐘?？疾?種不同濃度的C-erbB-2的計算結(jié)果。不同濃度的C-erbB-2分別從液池1中輸入，在液池1和3之間施加48v的電壓，電泳時間為3分鐘，然后在液池3和5之間施加48v電壓4分鐘，再在液池5和13之間施加48v電壓5分鐘，結(jié)果如圖11所示經(jīng)3分鐘電泳，C-erbB-2表達(dá)升高時(5和lOiim)，穿過第一段水凝膠，經(jīng)第二步電泳，進(jìn)入第二塊水凝膠，取代了藥物片段A，被取代下來的藥物片段A經(jīng)第三步電泳，經(jīng)過空白水凝膠到達(dá)液池13。當(dāng)C-erbB-2表達(dá)不升高時(l和O.2iim)，經(jīng)第一步電泳尚未到達(dá)第一段水凝膠的右側(cè)邊緣，液池5中不會出現(xiàn)C-erbB-2，應(yīng)此不能取代藥物片段A。以上結(jié)果驗證了，只有原癌基因表達(dá)升高時才會有相應(yīng)的藥物片段被傳遞到輸出單元。如圖12所示，改變電泳條件時，將電壓方向切換，緩沖液由高鹽(IXTE和O.5MNaCl)改為低鹽(1XTE)后，經(jīng)6分鐘電泳，藥物片段B可全部被沖洗下來。在計算抑癌基因是否降低的通道中，首先考察正常范圍下限即1ym的抑癌基因nm23到達(dá)第一段水凝膠右側(cè)邊緣的時間，也就是將藥物片段B全部取代下來的時間，實驗證明為4分鐘?？疾?種不同濃度nm23的計算結(jié)果。不同濃度的nm23分別從樣品池6中輸入，在液池6和8之間施加48v的電壓，電泳時間為4分鐘，然后將液池8中的液體棄去，重新加入緩沖液1XTE和0.5MNaCl，將樣品池6中的液體改為1XTE，切換液池6和8之間的電壓方向，電泳6分鐘，然后再經(jīng)第三步電泳(液池8和13之間)，時間為8分鐘。結(jié)果如圖13所示經(jīng)4分鐘電泳，nm23表達(dá)降低時(0.2和0.02ym)，尚未到達(dá)第一段水凝膠的右側(cè)邊緣，不能將藥物片段B完全取代，保留的藥物片段B在改變電泳條件時，經(jīng)第二步電泳，被沖洗下來，被沖洗下來的藥物片段B經(jīng)過第三步電泳，經(jīng)過兩段空白水凝膠到達(dá)液池13。當(dāng)nm23表達(dá)不降低時(1和0.2ym)，經(jīng)第一步電泳藥物片段B被完全取代下來后并棄除，因此，即使改變電泳條件，也不會有藥物片段B被沖洗下來。以上結(jié)果驗證了，只有抑癌基因表達(dá)降低時才會有相應(yīng)的藥物片段被傳遞到輸出單元。在液池13中預(yù)先存放有藥物模板和T4DNA連接酶反應(yīng)體系，在經(jīng)過上下兩條通道均完成三步電泳后，于室溫下(25t:左右)，在酶連池中進(jìn)行30分鐘的酶連反應(yīng)。由于藥物片段分子是否連接成完整的雙鏈，僅依靠熒光無法證明，需要通過長度來驗證。因此，酶連結(jié)果在另一塊十字芯片上，進(jìn)行芯片電泳，將酶連反應(yīng)后的不同組分分離后，激光誘導(dǎo)熒光檢測，電泳譜圖如圖1418所示。圖中B表示藥物片段B，AB表示藥物片段A和B連接后的完整的功能性藥物，藥物片段A標(biāo)記的熒光在本實驗檢測條件下被濾掉，因此檢測不到藥物片段A的峰。圖14為標(biāo)準(zhǔn)樣品的電泳譜圖；圖15為原癌基因升高、并且抑癌基因降低時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖；圖16為只有原癌基因升高、抑癌基因表達(dá)不降低時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖；圖17為只有抑癌基因表達(dá)降低、原癌基因不升高時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖；圖18為原癌基因不升高、并且抑癌基因也不降低時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖。從圖中可以看出，只有原癌基因和抑癌基因表達(dá)均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，即診斷成立時，才會有功能性的藥物合成并釋放，只要有一種不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，即診斷不成立時，沒有功能性的藥物合成并釋放，釋放的僅為無功能的藥物片段。這說明該DNA計算機(jī)有助于癌癥的靶向治療。實施例2針對與肝癌相關(guān)的四種基因設(shè)計了四種相應(yīng)的計算分子、藥物片段分子和有四個缺口的自殺基因分子以及有四條并行通道的微流控芯片。按照與實施例l相同的計算原理對基因的表達(dá)情況進(jìn)行計算當(dāng)匪P-9和CD34基因表達(dá)升高，同時野生型P53和Rb基因表達(dá)降低時，有相應(yīng)的藥物片段傳遞到輸出單元，將自殺基因上的缺口填補(bǔ)，形成完整的自殺基因；當(dāng)其中任何一種基因表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)時，則沒有完整的自殺基因形成并釋放。實施例3本實施例與實施例1內(nèi)容基本相同，其不同之處主要在于針對與前列腺癌相關(guān)的六種基因設(shè)計了六種相應(yīng)的計算分子、藥物片段分子和有六個缺口的自殺基因分子以及有六條并行通道的微流控芯片。按照與實施例l相同的計算原理對基因的表達(dá)情況進(jìn)行計算當(dāng)PSMA、Pim-l、KLKll、PSA表達(dá)升高，同時IGF1和P27表達(dá)降低時，有相應(yīng)的藥物片段傳遞到輸出單元，將自殺基因上的缺口填補(bǔ)，形成完整的自殺基因；當(dāng)其中任何一種基因表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)時，則沒有完整的自殺基因形成并釋放。實施例4一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法本實施例與實施例1內(nèi)容基本相同，其不同之處主要在于1)我們針對下述與乳腺癌相關(guān)的原癌基因(C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin)中的至少一種和與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因(P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2)中的至少一種作為設(shè)計依據(jù)，進(jìn)行藥物片段分子的設(shè)計工作。2)我們針對1)中所選的藥物片段分子設(shè)計帶有缺口的不完整的自殺基因分子，具體為帶有與其所選定的藥物片段分子相對應(yīng)的相同序列的缺口的雙鏈DNA分子。3)作為載體的微流控芯片的計算單元以及計算通道根據(jù)上述1)、2)過程的具體情況選用，試驗參數(shù)等也與之匹配。1權(quán)利要求一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述藥物的制備方法是使用作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子，通過生化反應(yīng)，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達(dá)情況進(jìn)行計算，并在計算結(jié)果符合要求時，自動合成并靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；在其所述的計算過程中，所述作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子具體是DNA分子和/或酶。2.按照權(quán)利要求1所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中，作為運(yùn)算介質(zhì)的DNA分子具體為與每種癌癥相關(guān)基因相對應(yīng)的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個缺口的不完整的自殺基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數(shù)量與藥物片段分子的序列和數(shù)量相對應(yīng)。3.按照權(quán)利要求2所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述作為運(yùn)算介質(zhì)的DNA分子中，與每種癌癥相關(guān)基因相對應(yīng)的計算分子和藥物片段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。4.按照權(quán)利要求3所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中，當(dāng)被檢測對象中對應(yīng)的癌癥相關(guān)基因表達(dá)超出正常范圍時，超出部分的癌癥相關(guān)基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與計算分子的匹配關(guān)系中置換取代下來，使原有的計算分子與癌癥相關(guān)基因雜交的結(jié)構(gòu)變?yōu)樾碌母鼮榉€(wěn)定的結(jié)構(gòu)；當(dāng)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部沒有從其與計算分子的匹配關(guān)系中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺基因分子結(jié)合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。5.按照權(quán)利要求4所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法中所述作為運(yùn)算介質(zhì)的酶為T4DNA連接酶；所述藥物片段分子與計算分子在結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)，其二者能夠?qū)崿F(xiàn)雜交；具體而言，所述藥物片段分子與不完整的自殺基因分子上的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接酶的作用下能夠?qū)⒉煌暾淖詺⒒蛏系娜笨谔钛a(bǔ)，使其形成完整的自殺基因；相對于藥物片段分子而言，癌癥相關(guān)基因與計算分子互補(bǔ)序列較長，癌癥相關(guān)基因更易于與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。6.按照權(quán)利要求5所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于當(dāng)癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳?yīng)的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應(yīng)關(guān)系中取代下來后，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應(yīng)的目的區(qū)域；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。7.按照權(quán)利要求6所述自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的制備方法，其特征在于當(dāng)癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳?yīng)的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應(yīng)關(guān)系中取代下來后，藥物片段分子被輸送到特定的目標(biāo)區(qū)域和不完整的自殺基因雜交并在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行酶連反應(yīng)，將相應(yīng)的缺口填補(bǔ)；所述的特定目標(biāo)區(qū)域中包含有不完整的自殺基因；當(dāng)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)符合要求時，相應(yīng)的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補(bǔ)，此時即有完整的自殺基因被合成并作為抗癌藥物釋放；只要有一種基因表達(dá)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，缺口就不會被完全填補(bǔ)，對應(yīng)地就不能有完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。全文摘要一種自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物的方法，其特征在于所述藥物使用作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子，通過生化反應(yīng)，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達(dá)情況進(jìn)行計算，并在計算結(jié)果符合要求時，自動合成并靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；在其所述的計算過程中，所述作為運(yùn)算介質(zhì)的生物分子具體是DNA分子和/或酶。本發(fā)明首次提出一種新型的應(yīng)用于癌癥治療的能夠自動合成并可靶向釋放的抗癌藥物及其制備方法，在條件成立時合成并釋放功能性的藥物完整的自殺基因。該方法與納米技術(shù)和微加工技術(shù)相結(jié)合，有助于提高癌癥的靶向治療。文檔編號G06N3/00GK101745123SQ20081022939公開日2010年6月23日申請日期2008年12月8日優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日發(fā)明者于浩,張宇,林炳承,秦建華申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所