專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及應(yīng)用生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體是涉及一種挖掘UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中特異表達(dá)基因的方法。
背景技術(shù)：
：EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)測(cè)序是高通量檢測(cè)基因表達(dá)信息的方法之一，近些年來(lái)，由于EST序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，特異性較好，比基因芯片的噪音低，使得EST測(cè)序得到了廣泛的應(yīng)用。但是，由于EST測(cè)序的成本較高，單個(gè)研究人員在建立EST序列信息時(shí)，對(duì)EST序列的挖掘工作，主要集中在EST序列信息的發(fā)現(xiàn)方面，例如，EST序列的拼接，拼接結(jié)果的注釋以及SSR和SNP的發(fā)現(xiàn)等方面，往往EST測(cè)序的EST序列數(shù)目較少，即對(duì)EST序列的定量方面的研究較少，只能基于EST序列信息定性分析生物體的性狀，無(wú)法通過(guò)EST序列定量分析基因和性狀間的關(guān)系。但是，隨著大規(guī)模EST測(cè)序計(jì)劃的進(jìn)行，公共數(shù)據(jù)庫(kù)(EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù))中的EST序列積累越來(lái)越多，研究人員開(kāi)始利用EST序列來(lái)定量分析基因和性狀間的關(guān)系，例如，Aouacheria.A.等人在2006年第7期的BMCGenomics上，發(fā)表了名為"BioinformaticscreeningofhumanESTsfordifferentiallyexpressedgenesinnormalandtumortissues(利用人類(lèi)EST的生物信息學(xué)方法篩選正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)基因)"的文章，闡述了采用BLAST搜索的方法對(duì)EST表達(dá)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，定量分析了基因和癌癥的關(guān)系，挖掘出了人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因。但是，由于旁系同源基因和一些高相似性的保守結(jié)構(gòu)域序列的干擾，使得該方法計(jì)數(shù)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致EST表達(dá)量計(jì)數(shù)錯(cuò)誤，從而使得后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生較大的誤差，無(wú)法正確挖掘與性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有的基因挖掘方法中EST表達(dá)量計(jì)數(shù)出現(xiàn)假陽(yáng)性進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)法正確挖掘與性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法的具體過(guò)程為步驟A:下載EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)所述的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列信息按照物種類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟B;步驟B:對(duì)所述的EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行信息檢索，進(jìn)而對(duì)EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟C;步驟C:根據(jù)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息計(jì)算表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量，接下來(lái)執(zhí)行步驟D;步驟D:對(duì)所獲得的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，接下來(lái)執(zhí)行步驟E;步驟E:采用FDR方法調(diào)整表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，接下來(lái)執(zhí)行步驟F;步驟F:設(shè)置表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.01，篩選異常狀態(tài)響應(yīng)基因，接下來(lái)執(zhí)行步驟G;步驟G:利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的異常狀態(tài)響應(yīng)基因?yàn)榕c性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因。本發(fā)明綜合EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，避免了拼接或是比對(duì)過(guò)程中人為引入的誤差；本發(fā)明還完成了對(duì)EST數(shù)據(jù)的定量分析，而不是簡(jiǎn)單的定性的分析，從表達(dá)量水平上揭示了異常狀態(tài)所響應(yīng)的基因本質(zhì)；本發(fā)明還采用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value,結(jié)合FDR方法調(diào)整所計(jì)算的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value,避免了多次檢驗(yàn)引入的誤差，使得基因挖掘的結(jié)果更加精確。本發(fā)明可以應(yīng)用于人類(lèi)疾病發(fā)生、動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、動(dòng)植物疾病調(diào)控過(guò)程以及動(dòng)植物逆境脅迫等性狀相關(guān)誘導(dǎo)基因的挖掘，本發(fā)明從公共數(shù)據(jù)庫(kù)(EST和UniGene)中挖掘得到了目的性狀的響應(yīng)基因，高效、準(zhǔn)確地解析了生物性狀，為生物重要過(guò)程的揭示奠定了重要的基礎(chǔ)。圖l是本發(fā)明的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法的工作流程圖，圖2是大豆逆境脅迫誘導(dǎo)基因的RT-PCR半定量分析結(jié)果示意圖。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一參見(jiàn)圖l，本具體實(shí)施方式所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法的具體過(guò)程為步驟A:下載EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)所述的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列信息按照物種類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟B;步驟B:對(duì)所述的EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行信息檢索，進(jìn)而對(duì)EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟C;步驟C:根據(jù)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息計(jì)算表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量，接下來(lái)執(zhí)行步驟D;10步驟D:對(duì)所獲得的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，接下來(lái)執(zhí)行步驟E;步驟E:采用FDR方法調(diào)整表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，接下來(lái)執(zhí)行步驟F;步驟F:設(shè)置表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.01，篩選異常狀態(tài)響應(yīng)基因；步驟G:利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的異常狀態(tài)響應(yīng)基因?yàn)榕c性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因。本具體實(shí)施方式中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)含有EST序列，本具體實(shí)施方式中的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)是NCBI開(kāi)發(fā)的，是通過(guò)蛋白質(zhì)的相似性、基因表達(dá)信息、cDNA克隆和基因組位置等信息，將同一轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的一組轉(zhuǎn)錄序列拼接成的一致性序列。UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)包含兩部分信息即EST序列信息及EST文庫(kù)注釋信息，所述信息具有較高可信度，是真實(shí)存在的轉(zhuǎn)錄本信息，適用于性狀相關(guān)誘導(dǎo)基因的挖掘。本具體實(shí)施方式中所述步驟B的具體過(guò)程為首先，收集生物體異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，將所收集的每一個(gè)生物體異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞在所述的EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索，篩選異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，收集生物體正常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，將所收集的每一個(gè)生物體正常狀態(tài)的關(guān)鍵詞在所述的EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索，篩選正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，所述的在EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索的檢索項(xiàng)包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項(xiàng)。本具體實(shí)施方式中所述步驟C的具體過(guò)程為在步驟C中，根據(jù)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中提取表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為EST表達(dá)量；如果某生物體的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)對(duì)每個(gè)UniGene轉(zhuǎn)錄組按照EST文庫(kù)注釋信息建立完善的分類(lèi)信息，則直接提取EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息，將所述計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的EST表達(dá)量。本具體實(shí)施方式中所述步驟D的具體過(guò)程為設(shè)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量為a，表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量為b，且UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量為c，所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量為d，以a、b、c和d四個(gè)數(shù)構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，公式一Y。"'daJ利用公式一計(jì)算獲得表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue。本具體實(shí)施方式中步驟E的具體過(guò)程為將UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值P-value,同時(shí)設(shè)所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue為P-Value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關(guān)系。本具體實(shí)施方式中步驟F的具體過(guò)程為將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為異常狀態(tài)的響應(yīng)基因。在本具體實(shí)施方式中，以表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST序列信息的條數(shù)作為表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量，依據(jù)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST文庫(kù)描述信息，對(duì)所述EST文庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)，通過(guò)對(duì)比正常狀態(tài)EST表達(dá)量和異常狀態(tài)EST表達(dá)量構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用FDR方法進(jìn)行基因差異表達(dá)的誤差控制，篩選異常狀態(tài)的響應(yīng)基因。本具體實(shí)施方式適用于生物異常過(guò)程差異表達(dá)基因的挖掘，如人類(lèi)疾病發(fā)生、動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、動(dòng)植物疾病調(diào)控過(guò)程以及動(dòng)植物逆境脅迫等過(guò)程。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，與具體實(shí)施方式一的不同之處在于它是對(duì)人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因的挖掘在步驟A中，下載人類(lèi)EST數(shù)據(jù)庫(kù)和人類(lèi)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)；在步驟B中，直接提取人類(lèi)EST文庫(kù)注釋信息，首先，提取人類(lèi)異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取所述的人類(lèi)異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，提取人類(lèi)正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取所述的人類(lèi)正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID;在步驟C中，根據(jù)人類(lèi)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述人類(lèi)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中提取人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的健康狀態(tài)HealthState下孚L房月中瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢月中瘤ovariantumor，中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS的原始神經(jīng)夕卜胚層月中瘤primitiveneuroectodermaltumor，前歹[J腺癌prostatecancer和正常狀態(tài)normal的人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)和人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的人類(lèi)EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量；在步驟D中，對(duì)所獲得的人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，其中，以人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據(jù)作為人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量，以人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中其它癌癥病變狀態(tài)作為異常狀態(tài)，并將所述異常狀態(tài)下的數(shù)據(jù)作為人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量，利用所獲得的人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量、人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量、人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量和人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調(diào)整人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，該調(diào)整過(guò)程為將人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，同時(shí)設(shè)人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關(guān)系；在步驟F中，設(shè)置人類(lèi)癌癥所響應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.Ol，篩選人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因，在此篩選過(guò)程中，將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為人類(lèi)癌癥的響應(yīng)基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因?yàn)榕c人類(lèi)癌癥相關(guān)的誘導(dǎo)基因。本實(shí)施方式提供了一種對(duì)人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因的挖掘方法，本實(shí)施方式中所述的人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles內(nèi)容為>2IHealthStateadrenaltumor□/12841breast(mammsrytumoi:cervicaltumor0/chondros&rc0/colorectaltumor□esophagealtumoi:□gei:mcelltumor0/glioma□/107493hesd&ndnecktuinor3458182865/114863/173552647250/13740Sinsulinoma□/30305kidneytumor□/69383leukeniis0/956271ivertumor1/96641lungtumor□/103480lymphoma0/72064norL-neoplasis□/97513noi:脆l(xiāng)16/3374366ovariantumoi:□/77210pancreaticcsncei:□/74633primitiveneuroectodermaltumoi:oftheCNS□prostatecancer0/103951retinolnlastoina0/46517skintumoi:□/124881sins11intestineadenocsrcinorna□/12684125405本實(shí)施方式中提取的Hs.profiles中健康狀態(tài)HealthState下乳房腫瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢腫瘤ovariantumor，中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS的原始神經(jīng)外胚層腫瘤primitiveneuroectodermaltumor，前列腺癌prostatecancer禾口正常狀態(tài)normal的EST序列信息的計(jì)數(shù)信息為Hs.2163374366Hs.46343374366Hs.ll113374366Hs.127337436601633743668337436603873374366Hs.6688337436612033743"18033743662Hs.1021593374366133374366Hs.109463374366Hs.Ill233374366Hs.120403374366Hs.129233743"□2053374366□94573□95627077210□126405□103951394573□077210□126405□103951□945731196627□772100126405010395194573196627□7721001264050103951094573095627094573249562701294573696627□945731956270194573209662729457349562743945733966270945730966271945733094573□96627094573□9662794573□0772100126405010395177210□126405□103951□77210491264051010395177210□126405□1039512772100126405010395177210131264051103951□772102126405010395127721001264050103951□772100126405o103951□772100126405o103951□772100126405110395177210□126405□1039511264057103951從人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中提取人類(lèi)EST序列信息計(jì)數(shù)信息的方法可采用下述程序?qū)崿F(xiàn)open(human—file,〃〈$ARGV〃)；while(defined($in—liiie=〈humaii—file>))14chomp$in—line;if($in—line=/"〉/&&$in—line=/HealthState/)$ugid=(split(/\s+/，$in—line))[1];$ugid=(split(AI/，$ugid));$ugid="Hs.$ugid";if($in—line=/breast\(mammarygland\)tumor/)錢(qián)temp二split(/\s+/，$in—line);@br=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=廠(chǎng)leukemia/)錢(qián)temp二split(/\s+/，$in—line);@leu=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=廠(chǎng)normal/)錢(qián)temp二split(/\s+/，$in—line);@nm=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=/ovariantumor/)錢(qián)temp二split(/\s+/，$in—line);@ov=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=/primitiveneuroectodermaltumoroftheCNS/)錢(qián)temp二split(/\s+/，$in—line);@cns=@temp[$frtemp-2，$frtemp];if($in—line=/prostatecancer/)@temp=split(/\s+/，$in—line);@pr=@temp[$frtemp-2，$frtemp];if($in—line=/BodySites/)print〃$ugid\t$nm\t$nm[l]\t$br\t$br[1]\t$leu\t$leu[l]\tprint〃$ov\t$ov[1]\t$cns\t$cns[1]\t$pr\t$pr[1]\t〃；close(human—file);本實(shí)施方式中對(duì)人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得的人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組在各種癌癥狀態(tài)下與在正常狀態(tài)(normal)下差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，所述超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue具體為UGID朋LEovPR0s-2..11111Bs-41111Bs.111t13E—12111Bs-12111.1Bs-3611111Bs-4113_細(xì)—31111OL40594401OL9^304031p1i17E—120-74^512125Bs-6611110l9647277740lGOO4S31111Bs-960l65^43390-206558605Ol119573633u07.E—050.91*364717Bs_10^.pL3314743021p_"11333491Bs.10411OL04331600911Bs.I*OL727236779OL15571853711111111111Bs.12011110.7117GS821Bs.129111110l1331908276l35E~05Ol506409974&"E—05Ol44326299上述獲得超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue可通過(guò)下述程序?qū)崿F(xiàn)data—all=read.table("human—est.txt〃，header=F，sep=〃\t〃)data=data—all[(data—all[，1]%in%microarray.pvalue[，l])，];16鼎鼎BR鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，4]-1，data[，5]，data[，3]，data[，2]+data[，4]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);BR=pvalue;鼎鼎LE鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，6]-1，data[，7]，data[，3]，data[，2]+data[，6]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);LE=pralue;鼎鼎OV鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，8]-1，data[，9]，data[，3]，data[，2]+data[，8]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);0V=pralue;鼎鼎CNS鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，IO]-I，data[，ll]，data[，3]，data[，2]+data[，10]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);CNS=pvalue;鼎鼎PR鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，12]-1，data[，13]，data[，3]，data[，2]+data[，12]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);PR=pvalue;UGID=data[，1];est.pvalue=data.frame(UGID，BR，LE，0V，CNS，PR);write,table(est.pvalue，〃Hs—est—pvalue.txt〃，col.names=T，row.names=F，sep=〃\tquote二F);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃BR〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃BR〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃LE〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃LE〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃0V〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃0V〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃CNS〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃CNS〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃PR〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃PR〃]〈=fdr.off，1]);具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，與具體實(shí)施方式一的不同之處在于它是對(duì)大豆逆境脅迫響應(yīng)基因的挖掘在步驟A中，下載大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)和大豆UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)；在步驟B中，以"cold"，"salt"和"drought"作為與大豆逆境脅迫相關(guān)的異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，將所述關(guān)鍵詞在大豆EST文庫(kù)注釋信息文件Gma.lib.info中進(jìn)行信息檢索，篩選大豆異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取大豆異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，將大豆EST文庫(kù)中的其他EST文庫(kù)作為大豆正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取大豆正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，所述的在大豆EST文庫(kù)注釋信息文件Gma.lib.info中進(jìn)行信息檢索的檢索項(xiàng)包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項(xiàng)；在步驟C中，根據(jù)大豆EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述大豆UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)和大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的大豆EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量；在步驟D中，對(duì)所獲得的大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，其中，以大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據(jù)作為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量，以大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中異常狀態(tài)下的數(shù)據(jù)作為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量，利用所獲得的大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量、大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量、大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉(zhuǎn)錄20組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量和大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—1id中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value;在步驟E中，采用FDR方法調(diào)整大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，該調(diào)整過(guò)程為將大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，同時(shí)設(shè)大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關(guān)系；在步驟F中，設(shè)置大豆逆境脅迫所響應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.Ol，篩選大豆逆境脅迫響應(yīng)基因，在此篩選過(guò)程中，將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因。在步驟G中，利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因?yàn)榕c大豆逆境脅迫相關(guān)的誘導(dǎo)基因，具體驗(yàn)證過(guò)程為第一挑選步驟F中所述的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證具體挑選過(guò)程為將步驟F中篩選出的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因按照超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue從小到大的順序排列，挑選出最小的8個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因，所述8個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因分別為Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774和Gma.22054;第二大豆總RNA提取以正常培養(yǎng)的大豆21日齡幼苗進(jìn)行4。C低溫cold、200mmolL—1NaCl鹽salt和lOOmmolL—工甘露醇干旱drought脅迫處理l小時(shí)后的大豆21日齡幼苗葉片為材料，采用TRIZOL試劑法提取大豆總RNA，所述采用TRIZOL試劑法提取總RNA的方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體為i.稱(chēng)取100mg所述幼苗葉片樣品放入高溫高壓消毒研缽，迅速在液氮中研磨成粉末，然后加入lmlTRIZOL研磨成勻漿組織；ii.將所述勻漿組織作為標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，在153(TC環(huán)境下放置5min，21以徹底分離核蛋白復(fù)合體；iii.向所述離心管中加入0.2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15s，在1530。C環(huán)境下放置23min，然后離心12000rmin—、15min，28。C，離心后離心管內(nèi)物質(zhì)分成三層，下層為紅色的酚，中間層為氯仿相，上層為無(wú)色的水相，RNA只存在于水相中，水相占總TRIZOL的60o/o;iv.將上層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，加入0.5ml異丙醇，在153(TC環(huán)境下靜置IOmin，然后離心12000rmin—、10min，28。C;v.去步驟iv中所述離心管中上清，加入lml75。/。乙醇洗滌RNA沉淀，采用振蕩器混勻，然后離心7500r.min—、5min，28°C;vi.繼續(xù)去步驟v中離心管中上清，并將去上清后的離心管置于真空或空氣中510min，干燥RNA沉淀，加DEPC處理的無(wú)菌水15yl，并將加入無(wú)菌水的離心管置于-2(TC環(huán)境下保存?zhèn)溆?，提取總RNA完成；第三cDNA的合成以所提取的總RNA為模板，在下游引物的引導(dǎo)下，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系如下在O.2mlPCR管中依次加入總RNA2X)卩1下游引物0O卩mol/L)1.0卩1dNTPs(10mmol/L)2.0卩1Supe「HI(反婦酶)1.0卩1RNaseInhibito「〔RNA酶抑制劑)1.O卩l(xiāng)5xRTBuffe「(5xRT緩沖液)4.0卩1滅菌重蒸水_9.0MlTotalVolume〔總體枳)20.0pl所述反應(yīng)體系混合均勻后稍稍離心，將管壁上的液滴收集到管底，將所述反應(yīng)體系按如下程序運(yùn)行65°C，5min;4°C，lmin;55°C，60min;7CTC，15min;瞬時(shí)離心，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行樣品cDNA的合成；第四RT-PCR半定量分析合成大豆逆境脅迫誘導(dǎo)基因Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774、Gma.22054和內(nèi)參基因Actin的引物，引物如表l:表l大豆逆境脅迫誘導(dǎo)基因RT-PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>PCR反應(yīng)總體積為25yl，其中O.2ymolL—^勺前向引物和反向引物，800ymolL—MnTP，1.5mmolL—1MgCl2，1UrTaq聚合酶和2.5y1的10XPCRbuffer,其余體積的物質(zhì)用去離子水補(bǔ)齊，輕彈離心管底部使所加各試劑充分混勻，稍稍離心將管壁液滴收集到離心管底部，并將所述液滴放置于PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增；取8.0y1PC財(cái)廣增產(chǎn)物，用2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在10Vcm—、恒壓條件下電泳30min后，在凝膠成像儀下觀(guān)察并照相，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行RT-PCR半定量分析，所述凝膠成像儀為紫外燈；從圖2中可以看出，內(nèi)參基因Actin在4種大豆材料中表達(dá)水平相同，說(shuō)明基因表達(dá)的內(nèi)參基因Actin(表達(dá)量參照基因)已經(jīng)調(diào)平，所述4種大豆材料分別為正常培養(yǎng)下大豆，低溫、鹽和干旱逆境脅迫下大豆，由于在低溫，鹽和干旱逆境脅迫下的基因表達(dá)量與正常培養(yǎng)下的基因表達(dá)量相比上升，故所挑選出的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因?yàn)榕c大豆逆境脅迫相關(guān)的誘導(dǎo)基因。本實(shí)施方式提供了一種對(duì)大豆逆境脅迫響應(yīng)基因的挖掘方法，本實(shí)施方式中所述的R平臺(tái)來(lái)源于http:〃www.r-project.org/，本實(shí)施方式中所述的大豆轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid內(nèi)容為本實(shí)施方式中提取的大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—1id中大豆逆境脅迫狀態(tài)下和大豆正常狀態(tài)下EST序列信息的計(jì)數(shù)信息為.1000339753351551Qua.10001339753351552Qna.1000433397533515521&na.100060339753351554Qna.10010339753351554Qna.1001373397533515531Qua.1001533397533515512(^na.63397533515524Qna.10020339753351559Qua.100240339753351552從大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆EST序列信息計(jì)數(shù)信息可利用下述程序?qū)崿F(xiàn)open(lib—file,〃〈$ARGV〃)；while(defined($in—line=〈lib—file》)chomp$in—line;$library{$in—line}++;close(libfile);■08678墜^卿亟涵i17241，Z.〖涵JL涵雄^i涵,io5S2:2:2iCN-:2;2;oio:o:oio一o;o！o;o:OIojo;lili1:li1;1.i1:2i24open(cid—file,〃〈$ARGV[1]〃)；while(defined($in—line=〈cid—file》)chomp$in—line;if($in—line!八-/)@data=split(/\s+/，line);$gb=$data;$ug="Gma.$data[l]";$library=$data[2];$all—contig{$ug}++;if(!exists($ist—contig{$ug})){$ist—contig{$ug}=0;};{$ist—contig{$ug}++;};close(cid—file);foreach(sort(keys%all—contig))$all—num+=$all—contig{$—};$ist—num+=$ist—contig{$—};foreach(sort(keys%all—contig))print"$—\t$ist—contig{$—}\t$all—num\t$ist—num\t$all—contig{$—}\n差異表達(dá)的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)計(jì)算，獲得的大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組在逆境脅迫狀態(tài)下與在正常狀態(tài)下差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，所述超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue具體為Gna.20441223515530459^1314.01E—110Gna.33428106351563045981207.19E~90Gna.3251659351563045961056.50E—32Gna.349622035156304596224.04E—20Gna.85182935155304596497.02E—18Gna.381935156304596232.56E—17Gna.37742435155304596383.2犯—1642351553045961312.81E—12Gna.175171435155304596214.90E—11pna一15941235155304596166.43E—11Gna.78SO2235155304596498.艦—11G^ia.508281351553045963801.15E—10Gna.195311035155304596139.29E—10Gna.215841135155304598161.83E~09G叫.268^71635155045984.03E""Q9Gna.142722435155304598674.88E""09Gna.3006120304^98506.81E~09Gna.166441335155304598241.15E""08Gna.220588351553Q4598101.Gna.3507173515530459881.31E""08上述數(shù)據(jù)的獲得方法可以采用實(shí)施方式二中的獲得人類(lèi)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue的方法。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，與具體實(shí)施方式三的不同之處在于步驟G中所述內(nèi)參基因Actin的調(diào)平通過(guò)調(diào)節(jié)RT-PCR模板cDNA的上樣量完成，具體為如果PCR儀中擴(kuò)增產(chǎn)物條帶過(guò)亮，則按比例減少模板cDNA，如果PCR儀中擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較暗，則增加模板cDNA，直到內(nèi)參基因Actin在4種大豆材料下的擴(kuò)增條帶亮度相同為止，此時(shí)內(nèi)參基因Actin已經(jīng)調(diào)平。權(quán)利要求1.一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于它的挖掘過(guò)程為步驟A下載EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)所述的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列信息按照物種類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟B；步驟B對(duì)所述的EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行信息檢索，進(jìn)而對(duì)EST文庫(kù)注釋信息進(jìn)行分類(lèi)，接下來(lái)執(zhí)行步驟C；步驟C根據(jù)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息計(jì)算表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量，接下來(lái)執(zhí)行步驟D；步驟D對(duì)所獲得的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value，接下來(lái)執(zhí)行步驟E；步驟E采用FDR方法調(diào)整表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value，接下來(lái)執(zhí)行步驟F；步驟F設(shè)置表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value閾值為0.01，篩選異常狀態(tài)響應(yīng)基因，接下來(lái)執(zhí)行步驟G；步驟G利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的異常狀態(tài)響應(yīng)基因?yàn)榕c性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟B的具體過(guò)程為首先，收集生物體異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，用所收集的每一個(gè)生物體異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞在EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索，篩選異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，收集生物體正常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，用所收集的每一個(gè)生物體正常狀態(tài)的關(guān)鍵詞在所述的EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索，篩選正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，所述的在EST文庫(kù)注釋信息中進(jìn)行信息檢索的檢索項(xiàng)包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項(xiàng)。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟C的具體過(guò)程為根據(jù)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中提取表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中的所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中的所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為EST表達(dá)量。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟C的具體過(guò)程為根據(jù)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中按照EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息對(duì)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組所完善建立的EST序列信息，直接提取EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息，將所述計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的EST表達(dá)量。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟D的具體過(guò)程為設(shè)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量為a，表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量為b，且UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量為c，所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量為d，以a、b、c和d四個(gè)數(shù)構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，公式一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>利用公式一計(jì)算獲得表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟E的具體調(diào)整過(guò)程為將UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，同時(shí)設(shè)所述UniGene轉(zhuǎn)錄組文件中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關(guān)系。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟F的具體篩選過(guò)程為將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為異常狀態(tài)的響應(yīng)基因。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于所述挖掘方法是對(duì)人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因的挖掘在步驟A中，下載人類(lèi)EST數(shù)據(jù)庫(kù)和人類(lèi)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)；在步驟B中，直接提取人類(lèi)EST文庫(kù)注釋信息，首先，提取人類(lèi)異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取所述的人類(lèi)異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，提取人類(lèi)正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取所述的人類(lèi)正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID;在步驟C中，根據(jù)人類(lèi)EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述人類(lèi)UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中提取人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的健康狀態(tài)HealthState下乳房月中瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢月中瘤ovariantumor，中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS的原始神經(jīng)夕卜胚層月中瘤primitiveneuroectodermaltumor,前歹[J腺癌prostatecancer和正常狀態(tài)normal的人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profi1es中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)和人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)人類(lèi)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的人類(lèi)EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量；在步驟D中，對(duì)所獲得的人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，其中，以人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據(jù)作為人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量，以人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中其它癌癥病變狀態(tài)作為異常狀態(tài)，并將所述異常狀態(tài)下的數(shù)據(jù)作為人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量，利用所獲得的人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量、人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量、人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量和人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調(diào)整人類(lèi)表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，該具體調(diào)整過(guò)程為將人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，同時(shí)設(shè)人類(lèi)UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關(guān)系；在步驟F中，設(shè)置人類(lèi)癌癥所響應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.Ol，篩選人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因，在此篩選過(guò)程中，將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為人類(lèi)癌癥的響應(yīng)基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的人類(lèi)癌癥響應(yīng)基因?yàn)榕c人類(lèi)癌癥相關(guān)的誘導(dǎo)基因。9.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于它是對(duì)大豆逆境脅迫響應(yīng)基因的挖掘在步驟A中，下載大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)和大豆UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)；在步驟B中，以"cold"，"salt"和"drought"作為與大豆逆境脅迫相關(guān)的異常狀態(tài)的關(guān)鍵詞，將所述關(guān)鍵詞在大豆EST文庫(kù)注釋信息文件Gma.lib.info中進(jìn)行信息檢索，篩選大豆異常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取大豆異常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，然后，將大豆EST文庫(kù)中的其他EST文庫(kù)作為大豆正常狀態(tài)EST文庫(kù)，并提取大豆正常狀態(tài)EST文庫(kù)的ID，所述的在大豆EST文庫(kù)注釋信息文件Gma.lib.info中進(jìn)行信息的檢索，檢索項(xiàng)包括所述EST文庫(kù)注釋信息文件Gma.lib.info中的主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項(xiàng)；在步驟C中，根據(jù)大豆EST文庫(kù)注釋信息的分類(lèi)信息，從所述大豆UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)和大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述所獲得的大豆EST序列信息的所有計(jì)數(shù)信息轉(zhuǎn)化為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量；在步驟D中，對(duì)所獲得的大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量進(jìn)行超幾何分布檢驗(yàn)，其中，以大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據(jù)作為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量，以大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中異常狀態(tài)下的數(shù)據(jù)作為大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量，利用所獲得的大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的正常狀態(tài)EST表達(dá)量、大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的異常狀態(tài)EST表達(dá)量、大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—1id中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的正常狀態(tài)EST表達(dá)量和大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總的異常狀態(tài)EST表達(dá)量構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，利用免費(fèi)開(kāi)源軟件R平臺(tái)的phyper完成超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算獲得大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調(diào)整大豆表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，該調(diào)整過(guò)程為將大豆UniGene轉(zhuǎn)錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue，同時(shí)設(shè)大豆所有UniGene轉(zhuǎn)錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調(diào)整后的第i個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue為Pialue=p(i)*n/i，此等式中所述的Pialue和p(i)是重新賦值關(guān)系；在步驟F中，設(shè)置大豆逆境脅迫所響應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值為O.Ol，篩選大豆逆境脅迫響應(yīng)基因，在此篩選過(guò)程中，將調(diào)整后的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組作為大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所篩選出的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因?yàn)榕c大豆逆境脅迫相關(guān)的誘導(dǎo)基因，具體驗(yàn)證過(guò)程為第一挑選步驟F中所述的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證具體挑選過(guò)程為將步驟F中篩選出的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因按照超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue從小到大的順序排列，挑選出最小的8個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因，所述8個(gè)超幾何分布檢驗(yàn)值Pialue所對(duì)應(yīng)的大豆逆境脅迫的響應(yīng)基因分別為Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774和Gma.22054;第二大豆總RNA提取以正常培養(yǎng)的大豆21日齡幼苗進(jìn)行4。C低溫cold、200mmolL-1NaCl鹽salt和100mmolL-l甘露醇干旱drought脅迫處理l小時(shí)后的大豆21日齡幼苗葉片為材料，采用TRIZOL試劑法提取大豆總RNA，所述采用TRIZOL試劑法提取總RNA的方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體為i.稱(chēng)取100mg所述幼苗葉片樣品放入高溫高壓消毒研缽，迅速在液氮中研磨成粉末，然后加入lmlTRIZOL研磨成勻漿組織；ii.將所述勻漿組織作為標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，在153(TC環(huán)境下放置5min，以徹底分離核蛋白復(fù)合體；iii.向所述離心管中加入0.2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15s，在1530。C環(huán)境下放置23min，然后離心12000rmin-1，15min，28。C，離心后離心管內(nèi)物質(zhì)分成三層，下層為紅色的酚，中間層為氯仿相，上層為無(wú)色的水相，RNA只存在于水相中，水相占總TRIZOL的60o/o;iv.將上層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，加入0.5ml異丙醇，在153(TC環(huán)境下靜置IOmin，然后離心12000rmin-1，10min，28。C;v.去步驟iv中所述離心管中上清，加入lml75。/。乙醇洗滌RNA沉淀，采用振蕩器混勻，然后離心7500r*min-1，5min，28°C;vi.繼續(xù)去步驟v中離心管中上清，并將去上清后的離心管置于真空或空氣中510min，干燥RNA沉淀，加DEPC處理的無(wú)菌水15y1，并將加入無(wú)菌水的離心管置于-2(TC環(huán)境下保存?zhèn)溆?，提取總RNA完成；第三cDNA的合成以所提取的總RNA為模板，在下游引物的引導(dǎo)下，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系如下在O.2mlPCR管中依次加入總RNA2X)卩1下游引物0O卩mol/L)1.0卩1dNTPs(10mmol/L)2.0卩1Supe「HI(反婦酶)1.0卩1RNaseInhibito「〔RNA酶抑制劑)1.O卩l(xiāng)5xRTBuffe「(5xRT緩沖液)4.0卩1滅菌重蒸水_9.0MlTotalVolume〔總體枳)20.0pl所述反應(yīng)體系混合均勻后稍稍離心，將管壁上的液滴收集到管底，將所述反應(yīng)體系按如下程序運(yùn)行65°C，5min;4°C，lmin;55°C，60min;7CTC，15min;瞬時(shí)離心，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行樣品cDNA的合成；第四RT-PCR半定量分析合成大豆逆境脅迫誘導(dǎo)基因Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774、Gma.22054和內(nèi)參基因Actin的引物，引物如表l:表lt豆.細(xì)辦迫i紹細(xì)RT-PCR引物_站E"I時(shí)向引物反向3f物Gma-2044MACTTTGACTGGCAAfiACCATTATCTGAACTCTO:ACCTCCAAGG恥GAAGTGAAC下CAGACMGACCCfflXAAGCTGAGAGAGGAAACcOTCTGcrGAAAGAGA肌虹ACCACTACCTTCACAACGma.33ACATGCCTTCTACAACACCOTCKTGC(TCAtCCCT(TATAnTG亂3774CTGGTTCTATGCCACCrTCTT匚TCTCCTCTGTATTTTCTCCTCGGTG亂22054ActknCKAGCACTG恥TCATCACAACTACTGCTKAGCAGTGKAAATGTPCR反應(yīng)總體積為25y1，其中0.2ymo1L-l的前向引物和反向引物，800ymolL-ldNTP，1.5mmolL-lMgC12，1UrTaq聚合酶和2.5y1的10XPCRbuffer，其余體積的物質(zhì)用去離子水補(bǔ)齊，輕彈離心管底部使所加各試劑充分混勻，稍稍離心將管壁液滴收集到離心管底部，并將所述液滴放置于PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增；取8.0y1PC財(cái)廣增產(chǎn)物，用2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在10Vcm-l恒壓條件下電泳30min后，在凝膠成像儀下觀(guān)察并照相，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行RT-PCR半定量分析，所述凝膠成像儀為紫外燈；內(nèi)參基因Actin在4種大豆材料中表達(dá)水平相同，說(shuō)明基因表達(dá)的內(nèi)參基因Actin已經(jīng)調(diào)平，所述4種大豆材料分別為正常培養(yǎng)下大豆，低溫、鹽和干旱逆境脅迫下大豆，由于在低溫，鹽和干旱逆境脅迫下的基因表達(dá)量與正常培養(yǎng)下的基因表達(dá)量相比上升，故所挑選出的大豆逆境脅迫響應(yīng)基因?yàn)榕c大豆逆境脅迫相關(guān)的誘導(dǎo)基因。10根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，其特征在于步驟G中所述內(nèi)參基因Actin的調(diào)平通過(guò)調(diào)節(jié)RT-PCR模板cDNA的上樣量完成，具體為如果PCR儀中擴(kuò)增產(chǎn)物條帶過(guò)亮，則按比例減少模板cDNA，如果PCR儀中擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較暗，則增加模板cDNA，直到內(nèi)參基因Actin在4種大豆材料下的擴(kuò)增條帶亮度相同為止，此時(shí)內(nèi)參基因Actin已經(jīng)調(diào)平。全文摘要一種基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因挖掘方法，它涉及應(yīng)用生物信息學(xué)領(lǐng)域。它克服了現(xiàn)有的基因挖掘方法中無(wú)法正確挖掘與性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因的問(wèn)題。本發(fā)明的方法利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列將UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的EST表達(dá)量數(shù)字化，構(gòu)建超幾何分布檢驗(yàn)，并結(jié)合FDR方法調(diào)整表達(dá)基因UniGene轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)的超幾何分布檢驗(yàn)值P-value，篩選異常狀態(tài)響應(yīng)基因，最后利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證所述響應(yīng)基因?yàn)榕c性狀相關(guān)的誘導(dǎo)基因。本方法可以用于人類(lèi)疾病發(fā)生、動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、動(dòng)植物疾病調(diào)控過(guò)程以及動(dòng)植物逆境脅迫等性狀相關(guān)誘導(dǎo)基因的挖掘。文檔編號(hào)G06F19/00GK101661536SQ20091030848公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2009年10月20日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者季佐軍,華才,朱延明,勇李,束永俊,錫柏,巍紀(jì)申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)