專利名稱：核酸定量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行核酸定量的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸的定量在從分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究到診斷學(xué)和病原體檢測的許多領(lǐng)域中是重要的。當足夠量的核酸存在時，斑點技術(shù)可被用于定量。但是，這些技術(shù)有限的靈敏度妨礙了它們在許多情況中的應(yīng)用。不久前發(fā)展的定量PCR方法為需要更高靈敏度的情況中的分析提供了工具。這些技術(shù)基于在PCR擴增中產(chǎn)物的量指數(shù)增長并且因此在相對少量的循環(huán)后獲得的產(chǎn)物的量可被傳統(tǒng)方法(例如熒光檢測)檢測到的事實。此外，如果擴增循環(huán)數(shù)是已知的，原則上初始 (即在擴增開始時)存在的產(chǎn)物的量，可從擴增結(jié)束時獲得的產(chǎn)物的量中被確定。簡要概括，實際上，在給定的PCR反應(yīng)條件下靶核酸及標準和/或?qū)Ρ扔脴悠?(comparative sample)進行PCR，并且PCR產(chǎn)物的形成在擴增程序的過程中被監(jiān)控。PCR產(chǎn)物的檢測通過例如當結(jié)合到靶標上發(fā)射特異性信號的熒光標記的雜交探針的方法或允許檢測雙鏈產(chǎn)物的DNA插入熒光染料的方法來完成。對獲得特異地熒光閾值水平必需的擴增循環(huán)數(shù)，指定為Ct值，被確定并且將靶標的Ct值與已知濃度(絕對量)的核酸標準品的稀釋系列的Ct值相比較。為確定靶標的絕對量，標準曲線從標準樣品的Ct值中建立并用于確定靶標的初始濃度?？蛇x擇地，靶標的Ct值與單獨的對比用興趣核酸相比(相對定量)。 在這種情況下靶標和對比用樣品Ct值的比值被確定并用于估定靶標和對比用核酸的初始量的比值。不幸地是，由于一些問題這些方法的實際應(yīng)用是復(fù)雜的，這些問題中的一些將在下文中討論。定量PCR領(lǐng)域中的一些挑戰(zhàn)涉及增長的在短時間間隔中分析大量樣品的需求。由于定量PCR不斷增長的應(yīng)用范圍需要以高通量的方式分析非常大量的樣品，例如在臨床實踐中，開發(fā)可以完全自動化及需要非常少或無人員交互的定量PCR方法是必要的。這在一些情況中具有至關(guān)重要的價值，由于如果需要人員交互，簡單地高通量應(yīng)用(例如在臨床實踐中)無法在必需的短時間內(nèi)進行。用這種自動化方法實現(xiàn)的附加的好處是不同實驗室之間分析數(shù)據(jù)的改進的可比較性，所述實驗室普遍使用很不同的定量PCR實驗室操作規(guī)程。鑒于增長的使用定量PCR 技術(shù)于基礎(chǔ)研究的實驗室的數(shù)量，此問題具有極為重要的價值。建立自動化方法作為定量實驗的客觀參考將徹底地有助于這些研究成果。擴增反應(yīng)過程中形成的PCR產(chǎn)物的典型圖顯示了 4個不同的擴增程序的階段(參見圖1):(1)熒光信號受背景熒光和噪聲控制的本底階段；(2)來自PCR產(chǎn)物的信號上升超過本底水平并指數(shù)增長的指數(shù)階段；(3)由于如PCR試劑的消耗和檢測探針的降解的因素引起擴增效率降低，信號增長少于指數(shù)速度的對數(shù)線性階段；(4)由于上升減慢及擴增反應(yīng)最終停止，信號邊緣上升的平臺階段。盡管表面上簡單易懂的概念，為確定Ct值選擇適當?shù)男盘栭撝邓讲皇且粋€簡單的任務(wù)。如可從圖1的圖中看到的，選擇高閾值水平可導(dǎo)致Ct值在擴增反應(yīng)的對數(shù)線性或平臺階段。這是不合需要的，由于在此區(qū)域中反應(yīng)已經(jīng)從指數(shù)增長減慢下來，使初始和現(xiàn)有核酸量之間的關(guān)系不明顯。選擇低閾值水平，另一方面，可導(dǎo)致Ct值定位在擴增反應(yīng)的本底階段，其中噪聲和背景信號可使測量復(fù)雜化。明顯地，因此，精選導(dǎo)致Ct值閾值水平對應(yīng)到指數(shù)增長的循環(huán)數(shù)，即在指數(shù)階段，是令人滿意的。許多方法已被開發(fā)以達到此目的(參見例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)?；鹃撝捣ㄐ枰獙嶒炄藛T觀察擴增曲線并運用其自己的判斷選擇適當?shù)脑谥笖?shù)階段相交的信號閾值。由于信號的絕對水平依賴于許多因素，包括核酸的長度和用于檢測的方法，這種方法的閾值水平必須被檢查，并如果必要，對每一種應(yīng)用校對。類似地，在擬合點法中，實驗人員必須根據(jù)其自己的判斷選擇適當?shù)拈撝?。但是替代賦值Ct到記錄的信號相交于閾值的循環(huán)數(shù)，線性擬合是以曲線的指數(shù)部分的半對數(shù)圖為模型，并且這條直線通過閾值的循環(huán)數(shù)被設(shè)定為Ct。另一個概念稱為最大二階導(dǎo)數(shù)法，其中擴增曲線的二階導(dǎo)數(shù)的最大值被數(shù)值地確定。相應(yīng)的循環(huán)數(shù)被假設(shè)存在于指數(shù)增長階段的末尾，在此處反應(yīng)開始減慢下來到線性增長。這個循環(huán)數(shù)，類似于Ct，用于確定靶標的量。相對于基本閾值和擬合點法，此方法需要很少或無人員交互，因為閾值水平不必須由實驗人員設(shè)定。還另一種方法稱為S形曲線擬合法，其中S形公式以擴增曲線為模型。對應(yīng)于曲線拐點的循環(huán)數(shù)可以從模型中獲得并類似于Ct被用于確定靶標的量。這種方法也需要很少或無人員交互。最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法，原則上顯示適合于完全地自動化?；鹃撝捣ê蛿M合點法由其特性無論如何需要人員交互，并因此不適合于自動化。最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法，盡管已被發(fā)現(xiàn)對需要高靈敏度的應(yīng)用使用受限 (JD Durtschi 等人 Analytical biochemistry 2007 (361) 55—64)。因此，本發(fā)明的目的是提供適合于完全自動化的高靈敏度的核酸定量的方法。發(fā)明目的和概述
根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于相對定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達到，所述方法包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(b)對比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種對比用核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(C)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(e)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度(ameasure of randomness) M 的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量。可選地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于絕對定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達到，所述方法包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(b)已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增和同時獲得與標準樣品中的核酸的擴增相關(guān)的信號，
(C)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(e)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法來達到，所述方法包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增，
(b)同時獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴增的信號，
(c)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)從Cc值中計算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于定量核酸?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于相對定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對比用核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于絕對定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。可選地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法來達到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)從Cc值中計算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于核酸的定量。此外，本發(fā)明涉及如上描述的方法，所述方法以完全自動化，即無人員交互的方式進行。另外，本發(fā)明涉及其上已儲存用于進行上述方法的步驟(C)到(h)的指令的機器可讀介質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及用于分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進行上述方法的信息的機器可讀記憶裝置。


圖1顯示在擴增反應(yīng)過程中形成的PCR產(chǎn)物的典型圖，揭示了擴增過程中的不同階段=GP=本底階段，EP=指數(shù)階段，LP=對數(shù)線性階段，PP=平臺階段。C表示循環(huán)數(shù)及I。 表示記錄的信號強度。圖2顯示數(shù)值計算的3個在25μ1體積中以IO6拷貝DNA初始量開始的PCR擴增的E(C)曲線。圖3Α顯示由實施例1中獲得的背景修正的擴增曲線。圖:3Β顯示在實施例1中獲得的譜熵曲線。該圖顯示對于106、105、104、IO3UO2拷貝數(shù)/25μ1濃度的樣品，譜熵(M)分別在20、23J6、31、34個循環(huán)數(shù)(C)展示特征性最小值。發(fā)明詳述
擴增效率的隨機性的量度具有不同的最小值，其可被用作擴增的特征性點。在核酸定量的過程中，使用基本閾值法或擬合點法將Ct值賦值(assignment)到擴增曲線需人員介入?；谄渥约旱呐袛?，實驗人員必須選擇在指數(shù)階段末端之前到達的 (在指數(shù)階段末端擴增明顯地減慢下來)并進一步在本底階段之后到達的由本底信號和噪聲控制的信號閾值水平。因此，就其特性而言，這些方法不適合于自動化。相反，最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法包括無人員介入地在曲線上指定特征性點。因此，原則上這些方法對自動化未顯示不適合。但是最近最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法被發(fā)現(xiàn)對于定量低拷貝數(shù)的靶標是不可靠的(JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55—64)。出乎意料地，結(jié)果證明擴增效率的隨機性的量度的圖具有不同的最小值或不同的向最小值的轉(zhuǎn)變。與這個最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變相關(guān)的循環(huán)數(shù)可無人員介入地被賦值為對于每一個擴增曲線的特征性點，并可被用于可靠地定量核酸包括低拷貝數(shù)靶標的定量。
使用擴增效率的隨機性的量度的最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變作為特征性點的優(yōu)勢源自此點通常定位于指數(shù)階段的早期部分的事實。因為擴增效率被多種因素影響，例如PCR 產(chǎn)物的長度、GC含量和潛在的二級結(jié)構(gòu)及可能存在于擴增混合物中的抑制劑，使用在指數(shù)階段早期部分的特征性點是有利的，原因在于在那個階段擴增效率的差異具有有限的影響。另一個使用擴增效率的隨機性的量度的最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變作為特征性點的優(yōu)勢源自對于許多應(yīng)用，期望在單反應(yīng)批中進行多于一種核酸的擴增的事實。多重類型分析(每批多于一種靶標)或使用內(nèi)標可因此容易進行。這些一管式(one-pot)反應(yīng)的主要優(yōu)勢是必須操作的反應(yīng)批次更少以及批次中的每種核酸都置于相同的可包含PCR反應(yīng)抑制劑的化學(xué)環(huán)境。對于這些一管式分析的必要的前提條件是不同標記物必須用于每一種核酸，以便分別地監(jiān)控每一種的擴增。許多不同的在低濃度下可用于此目的的熒光染料是可得到的。但是，隨著增加濃度，熒光團的相互作用可能導(dǎo)致熒光信號的擾亂，因此降低分析的精確性。為了最小化這樣的熒光團相互作用，因此在標記的PCR產(chǎn)物濃度相對低的指數(shù)階段早期部分使用特征性點是有利的。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供用于定量核酸的方法，其中用于定量的信號是在擴增的指數(shù)階段的早期部分獲得的信號。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，擴增的指數(shù)階段的早期部分被認為是以下的一項指數(shù)階段的前半段、指數(shù)階段的前10個循環(huán)、指數(shù)階段的前5個循環(huán)、指數(shù)階段的前3個循環(huán)或指數(shù)階段的第一個循環(huán)。絕對和相對定量
本發(fā)明涉及用于相對定量核酸的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(b)對比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種對比用核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(c)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(e)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量。本發(fā)明進一步涉及用于絕對定量樣品中的至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，
(b)已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增和同時獲得與標準樣品中的核酸的擴增相關(guān)的信號，
(c)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(e)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。本發(fā)明進一步涉及用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增，
(b)同時獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴增的信號，
(c)獲得的信號對背景信號做修正，
(d)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，
(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)從Cc值中計算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于定量核酸。本發(fā)明進一步涉及用于相對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對比用核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量。本發(fā)明進一步涉及用于絕對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。本發(fā)明進一步涉及用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，
(b)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，
(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，
(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)從Cc值中計算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于核酸的定量。根據(jù)本發(fā)明相對定量核酸涉及在分析前獲得樣品中相應(yīng)核酸的量的比例的定量量度。根據(jù)本發(fā)明絕對定量核酸涉及在分析前獲得樣品中核酸量的絕對量度，例如物質(zhì)的拷貝數(shù)或量?？捎糜诒景l(fā)明核酸包含DNA、RNA、及帶有修飾的骨架和/或堿基結(jié)構(gòu)的核酸。通常擴增通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的方法和設(shè)備的幫助由聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行。但是，對于本發(fā)明的目的，不能直接由PCR擴增的核酸可能必須通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法轉(zhuǎn)錄成DNA。例如RNA可能必須在擴增前用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成DNA。為了允許重建相應(yīng)核酸的初始量，這樣的轉(zhuǎn)錄過程必須在能夠合理地良好建立關(guān)于轉(zhuǎn)錄成DNA的核酸和在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的DNA的量的比例的假設(shè)情況下進行。此類反應(yīng)條件是本領(lǐng)域眾所周知的。實施本發(fā)明的過程中擴增的每一種核酸通常以選擇的方法擴增。PCR中一種完成選擇性擴增的方法是使用特異性引物。設(shè)計和使用這樣的引物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明，與核酸擴增相關(guān)的信號在擴增反應(yīng)過程中被記錄。在擴增反應(yīng)的所有循環(huán)的過程中記錄的信號的表示通常命名為擴增曲線。通常這樣的信號是熒光發(fā)射，但是本領(lǐng)域中使用的其他信號也包含在本發(fā)明中。一些熒光染料具有充分分開的吸收和發(fā)射譜以允許相同樣品中的平行檢測。為了本發(fā)明的目的，核酸擴增，即通過擴增反應(yīng)產(chǎn)生核酸，通過記錄相關(guān)于核酸擴增的信號來檢測。這可通過例如當結(jié)合到靶標上時發(fā)射特異性信號的熒光標記的雜交探針的方法或允許檢測雙鏈產(chǎn)物的DNA嵌入式熒光染料的方法來達到。這樣的熒光標記雜交探針和DNA嵌入式熒光染料是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，核酸擴增檢測用以下至少一項的幫助熒光標記雜交探針、FRET雜交探針、分子燈塔、蝎尾引物、Lux引物、Taqman探針、DNA結(jié)合染料。本發(fā)明包含分析核酸的方法和手段。單一分析可涉及單一種類的靶核酸或多于一種的靶核酸。在對多于一種靶核酸進行分析的情況下，記錄的以監(jiān)控每一種靶核酸擴增的信號必須是不同的信號，即可在同時被分別記錄的信號。達到這樣的信號的方法和手段是本領(lǐng)域眾所周知的。一些熒光染料(例如其展示充分分開的吸收和發(fā)射譜)允許同時平行記錄它們的熒光信號。本發(fā)明因此包含樣品中的幾個靶標的同時多重分析。根據(jù)本發(fā)明，對比用核酸可被用于確定靶核酸相對定量的參考值。一種或幾種這樣的對比用核酸可根據(jù)本發(fā)明被使用。分析前樣品中對比用核酸的絕對數(shù)量不必須是已知的。例如細胞中看家基因的mRNA可被用作對比用核酸。為了通過PCR擴增，mRNA通常預(yù)先轉(zhuǎn)錄成DNA。根據(jù)本發(fā)明，已知濃度的核酸標準品的稀釋系列可被用于確定靶核酸絕對定量的參考值。靶標和核酸標準品的稀釋樣品可在不同的反應(yīng)批中分析或可同時在一個反應(yīng)批中分析。如果同時在一個反應(yīng)批中分析，稀釋系列的不同核酸和不同樣品必須用不同的信號 (即可同時分別記錄的信號)檢測。在實施本發(fā)明的過程中，背景項從記錄的信號中減去。為了完成這樣的背景修正， 線性曲線以擴增曲線前幾個循環(huán)為模型建立，即線性回歸。優(yōu)選地，擴增曲線的前10個循環(huán)被用于建立此線性曲線?？蛇x地，統(tǒng)計學(xué)檢驗方法可被用于確定適于建立此線性曲線的擴增曲線的循環(huán)數(shù)，特別是當信號有噪音時。隨后，此線性曲線從擴增曲線中減去。根據(jù)本發(fā)明，使用如下等式計算循環(huán)到循環(huán)擴增效率fi : E(C) = [ (C+l) / (C)] - 1
其中
-β=循環(huán)到循環(huán)擴增效率
-C=循環(huán)數(shù)
-=對背景信號修正的信號強度
在本發(fā)明的一些實施方案中，使用多于2個連續(xù)循環(huán)的值化來計算擴增效率6，即應(yīng)用平滑。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，使用3、5或7個數(shù)據(jù)點應(yīng)用平滑化。圖2顯示數(shù)字化計算的三個以IO6拷貝/25μ1的DNA初始量開始的PCR擴增反應(yīng)的E(C)曲線。根據(jù)本發(fā)明，計算循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度(measure of randomness) Μ。譜熵是這樣的隨機性量度的實例。譜熵可如下計算
(1)形成6(C)的數(shù)組，如
ff(C) = [ E (C-L), E(C-L+1), ... ， E(C),…，E(C+L_1), E (C+L)] 其中2L+1是以循環(huán)數(shù)C為中心的數(shù)組中β的數(shù)量。優(yōu)選地L取3或4的值，那么W(C) 具有7或9個元素。為了不使β的指數(shù)小于1或超過最終可用的擴增曲線循環(huán)數(shù)Cmax，C必須在如下范圍中
L < C <= (Cmax-L)；
(2)對W(C)使用離散傅里葉變換(DFT)以獲得通常是復(fù)質(zhì)的數(shù)組S(C) S(C)= DFT (W(C) } = [ s(l), s (2),…，s(2N-l), s (2N)]
其中2N是DFT大小，并可以是例如16或32 ；
(3)取S(C)的模數(shù)并形成具有其元素的部分的新數(shù)組 P(C) = [|s(2)，s (3)，…，s(N-l)，Is(N)]；
(4)歸一化P(C)的元素的總和到一個以獲得 Pn (C) =P (C)/sum {P (C)}
其中sum{ }是計算數(shù)組元素的總和的數(shù)組運算符；
(5)計算數(shù)組Pn(C)的譜熵(M)，如 M (C) =sum {Pn (C) *log2 {Pn (C)}}
其中乘法*和對數(shù)操作都是元素智能的；
(6)通過將其中心定位在循環(huán)C+1以升級數(shù)組W(C)并重復(fù)步驟(1)到(5)。以上方法將β (C)的譜熵(M)作為C的函數(shù)計算。譜熵越小，信號的隨機性的程度越低。M通過在擴增曲線本底階段后和指數(shù)階段中定位的區(qū)別的最小值特征性化。
本發(fā)明包括使用其它隨機性量度的實施方案。例如其他的隨機性量度是(a)多項式曲線擬合的剩余誤差；(b)零交點計數(shù)；(c)高通濾波后的能量(RMS)計算。所有這些方法在上述數(shù)組W(C)上操作。前者方法(a)基于多項式函數(shù)能夠擬合確定性的函數(shù)直到某精確度而不是隨機的精確度的概念。后面兩個方法(b)和(c)利用噪聲波動多于其平均值附近的確定的信號的觀察以便產(chǎn)生更多零交點及能量。根據(jù)本發(fā)明，循環(huán)數(shù)Cm被確定，其中M具有其最小值。Cm可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的普通運算法則數(shù)字地獲得。在本發(fā)明的一些實施方案中，循環(huán)數(shù)Cm被確定為M第一次到達其最小值的循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明，特征性循環(huán)數(shù)C。從Cm值中計算出。進行此計算為了修正用于計算隨機性測量的任何窗口的寬度。如果例如M如上描述的以譜熵計算，C。通過從Cm中減去L而獲得
Cc _。μ _ L
其中L是數(shù)組W(C)的展式的一半。依賴于用于計算隨機性的量度的方法，從Cm中獲得Cc的其它方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明進一步包括這樣的實施方案，其中Cm值被用作C。值，即其中 Cc _ Cm °C。值可用于計算Ct值(閾值循環(huán)數(shù))，Ct值進而可以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式用于核酸定量(參見例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，Ct值通過取C。值作為Ct值，即Ct = C。，從C。值中計算出。根據(jù)本發(fā)明，確定靶核酸(T)相對于對比用核酸(#)的相對量(R)可通過如下計算
完成
ρ _ 2(CC(T) 一 ccoo)
其中
-R=靶和對比用核酸量的比例
-Cc(T)=靶核酸的Cc值
-Cc(#)=對比用核酸的Cc值
可選地，如果關(guān)于擴增效率E的信息可獲得，比例R可計算為 R = (1 + E)(cc⑴—_。根據(jù)本發(fā)明，通過比較靶和標準樣品的C。值確定樣品中每一種靶核酸的初始量可通過如下完成
從標準樣品中建立標準曲線(標準樣品的初始濃度相對于標準樣品的C。值)及使用此標準曲線從靶標的C。值中獲得靶標的初始濃度。標準曲線可以是C。值對濃度值對數(shù)的線性函數(shù)。但是，可選的本領(lǐng)域已知的方法也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明包含允許以自動化的方式進行本發(fā)明的方法，即無或很少人員交互(human interaction)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及允許無人員交互地進行本發(fā)明方法的方法和裝置。本發(fā)明使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域可得的設(shè)備以無或很少人員交互地進行本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域可得的設(shè)備以無人員交互地進行本發(fā)明的方法。
機器可讀介質(zhì)
本發(fā)明涉及其上已儲存用于進行本發(fā)明方法的步驟(C)到(h)的指令的機器可讀介質(zhì)。分析核酸樣品的儀器
本發(fā)明涉及分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進行本發(fā)明方法的信息的機器可讀記憶裝置。
實施例實施例1
將在25μ1體積中由稀釋獲得的106、105、104、IO3UO2拷貝/25μ1濃度的金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) DNA樣品(442 Sau3Al基因組片段的5，部分，256個堿基對， 在pCR2. 1-T0P0中，從金黃色葡萄球菌ATCC-25923中克隆)在分別的管中通過40個PCR 循環(huán)在ABI 7099HT版本2. 3實時PCR循環(huán)儀上擴增。對于PCR反應(yīng)，使用ABI的Taqman Universal PCR mastermix 禾口 Taqman 探針 FAM—Black Hole Quencher 1。隨后進 亍產(chǎn)物擴增。獲得的信號通過從獲得的PCR前10個循環(huán)的信號建立線性函數(shù)模型并從每一個樣品獲得的擴增曲線中減去此線性曲線來對背景信號進行修正。圖3Α顯示獲得的曲線。對每一個擴增曲線，使用如下等式計算循環(huán)到循環(huán)擴增效率6 (C) E(C) = [ (C+l) / (C)] - 1 其中
-β=循環(huán)到循環(huán)擴增效率
-C=循環(huán)數(shù)
-=對背景信號修正的信號強度。對于每一個擴增曲線，計算譜熵作為循環(huán)到循環(huán)擴增效率6 (C)的隨機性的量度 Μ。計算沿著6(c)曲線的9點的移動窗口，反映窗口內(nèi)的數(shù)據(jù)點的隨機性程度。結(jié)果顯示在圖:3Β中譜熵M對每一個擴增反應(yīng)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率β (C)展示了不同的最小值。對于106、105、IO4UO3和IO2拷貝/25μ1的濃度，得到的Cm值分別是20、23、26、31和34。對于 106、105、IO4UO3和IO2拷貝/25μ1的濃度，Cc值由Cc = Cm - 4計算，因此分別是16、19、 22、27和30。針對分別的拷貝數(shù)的對數(shù)獲得的Cc值的線性回歸產(chǎn)生R2 = 0. 9908的皮爾森系數(shù)，表明結(jié)果與預(yù)期的線性關(guān)系的很好的吻合性。
權(quán)利要求
1.用于相對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，(b)對比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種對比用核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，(c)獲得的信號對背景信號做修正，(d)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(e)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量。
2.用于絕對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增和同時獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴增相關(guān)的信號，(b)已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增和同時獲得與標準樣品中的核酸的擴增相關(guān)的信號，(c)獲得的信號對背景信號做修正，(d)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(e)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。
3.用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴增，(b)同時獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴增的信號，(c)獲得的信號對背景信號做修正，(d)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，(g)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)從Cc值中計算Ct值。
4.用于相對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對比用核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，(b)靶和對比用核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(c)靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和對比用樣品的Cc，與對比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對量。
5.用于絕對定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標準品稀釋系列的樣品的擴增曲線的信號對背景信號做修正，(b)靶和標準樣品的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(c)靶和標準樣品的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于靶和標準樣品是最小的，(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和標準樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。
6.用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴增曲線的信號對背景信號做修正，(b)每一種靶核酸的每一個擴增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的計算，(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率6(C)的隨機性的量度M的計算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的，(e)從Cm值中計算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)從Cc值中計算Ct值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的方法，其中特征性循環(huán)數(shù)C。被定義為等于相應(yīng)的Cm值(C。=CM) ο
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7的方法，其中所述步驟“循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對于每一種靶核酸是最小的”由以下步驟替代“初始循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對靶和對比用核酸達到最小值”。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8的方法，其中計算的隨機性量度選自譜熵、多項式曲線擬合的剩余誤差、零交點計數(shù)、高通濾波后的能量(RMS)計算。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9的方法，其中獲得的信號是熒光信號。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10的方法，其中核酸擴增檢測用以下至少一項的幫助熒光標記雜交探針、FRET雜交探針、分子燈塔、蝎尾引物、Lux引物、TaqMan探針、DNA結(jié)合染料。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11的方法，其中同時分析樣品中多于一種靶核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到11的方法，其中同時分析樣品中的一種靶核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13的方法，其中所有步驟以完全自動化方式進行，即無人員交互。
15.機器可讀介質(zhì)，其上已儲存用于進行根據(jù)權(quán)利要求1到3的方法的步驟(c)到(h) 和/或根據(jù)權(quán)利要求4到6的方法的步驟(a)到(f)的指令。
16.用于分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進行根據(jù)權(quán)利要求1到14的方法的信息的機器可讀記憶裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于定量擴增的核酸的方法，其包括以下步驟計算靶和對比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴增效率ê(C)的隨機性的量度M，-確定循環(huán)數(shù)CM，其中M對于靶和對比用核酸是最小的，從CM值計算特征性循環(huán)數(shù)CC。
文檔編號G06F19/24GK102395977SQ201080016744
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月16日
發(fā)明者尹 B., A. 卡爾曼 J., 尼森 T. 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司