專利名稱：用于拋物線狀曲線的pcr的肘值的確定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于處理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)和方法，并且更特別地涉及用于確定PCR放大曲線中的特性循環(huán)閾值(Ct)或肘值、或具有拋物線形狀的其它生長曲線中的肘值的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用于對定義核酸序列進(jìn)行酶合成或放大的體外方法。該反應(yīng)通常使用兩個低聚核苷酸引物，其混合成相反的股并且位于將被放大的模板或目標(biāo)DNA序列之側(cè)。引物的延伸物被熱穩(wěn)定的DNA聚合酶催化。涉及模板變性、引物退火和由聚合酶進(jìn)行的退火引物的擴(kuò)展的重復(fù)循環(huán)系列導(dǎo)致特定DNA片段的指數(shù)積累。在該過程中通常使用熒光探針或標(biāo)記以促進(jìn)放大過程的檢測和量化。 特別地，均質(zhì)且不要求在放大的開始或反應(yīng)的物理采樣之后添加試劑以進(jìn)行分析的熒光技術(shù)是吸引人的。示例性均質(zhì)技術(shù)使用低聚核苷酸引物來對感興趣區(qū)域和熒光標(biāo)簽或染料進(jìn)行定位以進(jìn)行信號生成?；赑CR的典型方法使用具有兩個相交互發(fā)色團(tuán)的FRET低聚核苷酸探針(相鄰混合探針、TaqMan探針、分子信標(biāo)(Molecular Beacon) > Scorpion)具有僅一個突光團(tuán)的單低聚核苷酸探針(G退火探針、Crockett, A. 0.和C. T. Wittwer,Anal. Biochem. 2001 ；290 :89 97 和 SimpleProbe, Idaho Technology)以及使用 dsDNA 染料(例如SYBR綠色I(xiàn))來代替共價的熒光標(biāo)記低聚核苷酸探針的技術(shù)。結(jié)合到PCR中的所有雙股(ds)DNA的DNA結(jié)合染料在結(jié)合時引起染料的熒光。因此，PCR期間的DNA產(chǎn)物的增加因此導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加，并在每個循環(huán)進(jìn)行測量，從而允許將DNA濃度量化。然而，潛在的缺點(diǎn)是到所有dsDNA PCR產(chǎn)品的非特定綁定，影響精確的量化。參考標(biāo)準(zhǔn)稀釋，能夠確定RCR中的dsDNA濃度。熒光報告探針僅檢測特定探針被綁定到的DNA序列，并因此顯著地增加特殊性。這即使在存在非特定DNA擴(kuò)增的情況下，也允許進(jìn)行擴(kuò)增的量化。為了同一反應(yīng)中的多個靶的檢測，可以在多重試驗中使用熒光探針，其中，對每個靶使用具有不同色彩的標(biāo)簽的特定探針。熒光報告探針的特殊性還防止由引物二聚體引起的測量干擾，其是擴(kuò)增期間的不期望的副產(chǎn)物。大多數(shù)應(yīng)用是基于熒光報告化合物與被綁定到探針的熒光的猝滅劑之間的相互作用。只要報告和猝滅劑化合物非常接近，則可以在用激勵源(例如激光器、LED等)進(jìn)行激勵時僅檢測基本熒光。一旦發(fā)生擴(kuò)增，則報告和淬滅劑化合物的相互作用被破壞，導(dǎo)致可檢測的熒光信號。在每個PCR循環(huán)處擴(kuò)增的產(chǎn)物的增加引起由于報告和淬滅劑化合物的減少的相互作用而導(dǎo)致的熒光的成比例增加。通常，在每個擴(kuò)增循環(huán)中檢測并測量熒光，并且使用與產(chǎn)物的指數(shù)式增加相對應(yīng)的其幾何增加來確定每個反應(yīng)中的閾值循環(huán)(CT)。在圖I中示出了典型的實時PCR曲線(實線)，其中，對比用于典型PCR過程的循環(huán)數(shù)目對熒光強(qiáng)度值進(jìn)行繪圖。在這種情況下，在PCR過程的每個循環(huán)中監(jiān)視PCR產(chǎn)物的形成。通常在熱循環(huán)儀中測量擴(kuò)增，其包括用于測量擴(kuò)增反應(yīng)期間的熒光信號的部件和器件。此類熱循環(huán)儀的示例是Roche Diagnostics LightCycler (商品目錄號No. 20110468)。例如借助于熒光標(biāo)簽混合探針來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，其僅在其被綁定到靶核酸時發(fā)射熒光信號，或者在某些情況下還借助于綁定到雙股DNA的熒光染料。對于典型PCR曲線而言，識別基線區(qū)域的末端處的轉(zhuǎn)折點(diǎn)(其通常被稱為肘值或循環(huán)閾值(Ct)值)對理解PCR擴(kuò)增過程的特性極其有用。可以使用Ct值作為PCR過程的效率的度量。例如，通常針對要分析的所有反應(yīng)來確定定義的信號閾值，并針對靶核酸以及針對諸如標(biāo)準(zhǔn)或管家基因的基準(zhǔn)核酸來確定達(dá)到此閾值值所需的循環(huán)數(shù)目(Ct)?？梢曰卺槍Π泻怂岷突鶞?zhǔn)核酸獲得的Ct值來確定靶分子的絕對或相對拷貝數(shù)(Gibson等人；Genome Research 6 :995 1001 ；Bieche 等人，Cancer Research 59 :2759 2765,1999 ；WO 97/46707 ；W0 97/46712 ；W097/46714)。在圖I中的基線區(qū)域15的末端處的區(qū)域20中的肘值將在循環(huán)數(shù)36左右?？梢酝ㄟ^將結(jié)果與由RNA或DNA的已知量的連續(xù)稀釋的實時PCR產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較來確定RNA或DNA的量?？梢酝ㄟ^將循環(huán)閾值(Ct)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線、與基準(zhǔn)核酸的循環(huán)閾值(Ct)或與絕對量化標(biāo)準(zhǔn)核酸相比較來確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增中的靶分子的絕對或相對拷貝數(shù)。另外，可以通過將用于要分析的每個反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)與基準(zhǔn)核 酸的循環(huán)閾值(Ct)相比較來確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的效率。實時PCR(RT-PCR)的定量分析需要用于PCR曲線的肘值(或循環(huán)閾值Ct)的確定。已針對此用途開發(fā)了許多算法，例如，基于歸一化數(shù)據(jù)曲線與閾值的交點(diǎn)或通過在分析上(例如使用曲率算法)或在數(shù)值上確定歸一化數(shù)據(jù)曲線上的最大曲率或二階導(dǎo)數(shù)，如在2005年12月20日提交的美國申請序號No. 11/316,315 ;2006年2月6日提交的美國申請序號No. 11/349，550，；2006年7月19日提交的美國申請序號No. 11/458644 ;2006年9月19日提交的美國申請序號No. 11/533,291 ;2007年9月25日提交的美國申請序號No. 11/861，188 ;2008年9月12日提交的美國申請序號No. 12/209，912 ( “ELCA算法”)中所述。如果底層曲線近似S形狀，則這些方法將非常好地工作。在原始數(shù)據(jù)曲線具有拋物線形狀的罕見情況下，則由這些方法確定的肘值通常將導(dǎo)致比一個人通過數(shù)據(jù)曲線的檢驗將預(yù)期的更大的肘值。考慮來自圖I所示的西尼羅河病毒(West Nile Virus, WNV)試驗的實時PCR(RT-PCR)曲線。實黑色曲線具有典型的S形狀，其是可用先前開發(fā)的算法針對分析進(jìn)行修正的。然而，虛線曲線類似于拋物線且缺少平坦區(qū)域。當(dāng)用例如ELCA算法來分析時，圖I所示的兩個曲線的肘值具有在下表I中給出的值。ELCA算法在數(shù)值上確定作為曲率或二階導(dǎo)數(shù)中的最大值的點(diǎn)的肘值。
權(quán)利要求
1.ー種確定用于具有拋物線形狀的實時PCR數(shù)據(jù)曲線的Ct值的計算機(jī)實現(xiàn)方法，該方法包括在計算機(jī)系統(tǒng)中實現(xiàn)的以下步驟 -接收表示PCR生長曲線的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集具有多個坐標(biāo)值(x，y)； -使用具有在X*處終止的第一直線段且在X*處開始的第二直線段的兩段分段線性函數(shù)來對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近； -確定 a)到從Z開始至數(shù)據(jù)集的末端的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二次擬合的R2值是否在0.90的預(yù)定閾值值以上；以及 b)在基本上所有數(shù)據(jù)集范圍內(nèi)的兩段分段擬合的R2值是否在0.85的閾值值以上；以及 c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，則第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是這樣的話 -通過確定第二直線段與基線相減水平線的平均值的交叉點(diǎn)來估計數(shù)據(jù)集的Ct值；以及 -輸出Ct值以進(jìn)行顯示或進(jìn)ー步處理。
2.權(quán)利要求I的方法，其中，所述兩段分段線性函數(shù)具有以下形式
3.權(quán)利要求I或2中的任ー項的方法，其中，對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近包括使Z處的目標(biāo)函數(shù)最小化，其中，所述目標(biāo)函數(shù)具有以下形式
4.權(quán)利要求3的方法，其中，通過對從X= Iitl至n-1的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)用目標(biāo)函數(shù)來確定其中，n是數(shù)據(jù)集的長度，nO是預(yù)定起始坐標(biāo)，并且其中，X*被確定為具有最小Akaike信息系數(shù)(AIC)的X的值。
5.權(quán)利要求4的方法，其中，由以下等式來定義AIC:
6.權(quán)利要求I至5中的任ー項的方法，其中，估計Ct值包括應(yīng)用以下形式的等式
7.權(quán)利要求I至6中的任ー項的方法，其中，為了確定到從Z開始至數(shù)據(jù)集的末端的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二次擬合的R2值是否在預(yù)定閾值值以上，所述預(yù)定閾值值是0. 99。
8.權(quán)利要求I至7中的任ー項的方法，其中，為了確定在基本上所有數(shù)據(jù)集的范圍內(nèi)的兩段分段擬合的R2值是否在閾值值以上，該閾值值是0. 95。
9.ー種存儲用于控制處理器確定用于具有拋物線形狀的實時PCR數(shù)據(jù)曲線的Ct值的代碼的有形計算機(jī)可讀介質(zhì)，該代碼包括指令，所述指令在被處理器執(zhí)行時促使處理器 -接收表示PCR生長曲線的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集具有多個坐標(biāo)值(x，y)； -使用具有在X*處終止的第一直線段且在X*處開始的第二直線段的兩段分段線性函數(shù)來對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近； -確定 a)到從Z開始至數(shù)據(jù)集的末端的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二次擬合的R2值是否在0.90的預(yù)定閾值值以上；以及 b)在基本上所有數(shù)據(jù)集范圍內(nèi)的兩段分段擬合的R2值是否在0.85的閾值值以上；以及 c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，則第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果a)、b)和c) -通過確定第二直線段與基線相減水平線的平均值的交叉點(diǎn)來估計數(shù)據(jù)集的Ct值；以及 -輸出Ct值以進(jìn)行顯示或進(jìn)ー步處理。
10.權(quán)利要求9的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其中，所述兩段分段線性函數(shù)具有以下形式
11.權(quán)利要求9或10的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其中，對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近的指令包括使Z處的目標(biāo)函數(shù)最小化的指令，其中，所述目標(biāo)函數(shù)具有以下形式
12.權(quán)利要求9至11中的任一項的計算機(jī)可讀介質(zhì)，其中，估計Ct值的指令包括應(yīng)用以下形式的等式的指令
13.ー種實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)，包括 -PCR分析模塊，其生成表示PCR擴(kuò)增曲線的PCR數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集包括多個數(shù)據(jù)點(diǎn)，每個具有ー對坐標(biāo)值U，y)，其中，所述數(shù)據(jù)集包括包含循環(huán)閾值(Ct)值的感興趣區(qū)域中的數(shù)據(jù)點(diǎn)；以及 -智能模塊，其適合于處理PCR數(shù)據(jù)集以通過下述來確定Ct值 -使用具有在X*處終止的第一直線段且在X*處開始的第二直線段的兩段分段線性函數(shù)來對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近； -通過下述來確定PCR生長曲線是否具有拋物線形狀 a)確定到從Z開始至數(shù)據(jù)集的末端的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二次擬合的R2值是否在0.90的預(yù)定閾值值以上；以及 b)確定在基本上所有數(shù)據(jù)集范圍內(nèi)的兩段分段擬合的R2值是否在0.85的閾值值以上；以及 c)確定如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，則第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是這樣的話 -通過確定第二直線段與基線相減水平線的平均值的交叉點(diǎn)來估計數(shù)據(jù)集的Ct值；以及 -輸出Ct值以進(jìn)行顯示或進(jìn)ー步處理。
14.權(quán)利要求13的PCR系統(tǒng)，其中，所述兩段分段線性函數(shù)具有以下形式
15.權(quán)利要求13或14中的PCR系統(tǒng)，其中，對數(shù)據(jù)集進(jìn)行逼近包括使Z處的目標(biāo)函數(shù)最小化，其中，所述目標(biāo)函數(shù)具有以下形式
全文摘要
提供了用于處理PCR曲線且用于識別拋物線狀PCR曲線的存在的系統(tǒng)和方法。PCR曲線的分段線性逼近的使用使得在拋物線狀PCR曲線的情況下能夠確定更實際的肘值。
文檔編號G06F17/18GK102782674SQ201080038063
公開日2012年11月14日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者M·蒂茨, R·T·庫爾尼克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司