專利名稱：Rna的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA的分析方法。
背景技術(shù)：
近年來，對在醫(yī)院、研究機構(gòu)等保存有大量樣本的、以福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織為代表那樣的、被固定液固定了的組織、細(xì)胞的基因的分析技術(shù)的期待大幅提高。特別是對于FFPE組織，由于積累了過去的大量病患數(shù)據(jù)，因而如果 確立能夠從FFPE組織提取基因、分析它們的表達的技術(shù)，則能夠進行使用長期保存后的組織的可追溯研究，可以對將來的病患的治療和/或預(yù)防做出巨大貢獻。然而，認(rèn)為從FFPE等固定組織、固定細(xì)胞中提取出的RNA在一般的固定條件、保管條件下進行分解、片段化，因此難以進行基因表達分析。另外，由于作為固定液最常用的甲醛(福爾馬林)，有時RNA-RNA間、RNA-蛋白質(zhì)間發(fā)生交聯(lián)、和/或甲醛被添加/修飾到RNA上，RNA在這樣的狀態(tài)下難以進行酶反應(yīng)和/或化學(xué)反應(yīng)，基因表達分析變得困難。因此，要求由進行了分解、片段化的RNA樣品、和/或被交聯(lián)、添加/修飾了的RNA樣品進行基因表達分析的技術(shù)。另外，在進行這樣的RNA樣品的基因表達分析時，在分析之前確認(rèn)RNA樣品的分解、片段化、或者交聯(lián)和/或添加/修飾的程度來判斷品質(zhì)、確認(rèn)可否分析，對于進行正確的基因表達分析以及miRNA表達分析是非常有用的，要求能夠進行這些確認(rèn)的技術(shù)。專利文獻I 4中公開了關(guān)于擴增分解了的RNA來進行基因表達分析的方法的技術(shù)。專利文獻I提供與擴增靶多核苷酸、產(chǎn)生其大量拷貝相關(guān)的方法、組合物和試劑盒。I次擴增反應(yīng)中的HiRNA的擴增倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)達50 100或250倍，或者為500 1000倍或500 2000倍以上，從不足納克量的總RNA獲得盡可能多的擴增RNA。然而，如果使用這樣從少量的RNA盡可能多地擴增來分析的方法，則基因的每個擴增倍率產(chǎn)生偏差的所謂擴增偏倚變大，因而可以說不能正確地分析基因的表達量。專利文獻2涉及為了全基因表達譜分析而使用例如保管的固定化石蠟包埋組織材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或極度片段化的RNA試樣，也能夠完全擴增的試樣的調(diào)制方法。然而，該方法包含將被片段化的RNA進行多聚腺苷酸化的工序，認(rèn)為該工序中的反應(yīng)的偏差作為結(jié)果可能嚴(yán)重影響基因表達譜。另外在專利文獻2中，公開了新的線性RNA擴增法。通過合成5’末端具有錨定序列、且3’末端具有RNA聚合酶啟動子序列的雙鏈cRNA，由該cDNA依賴上述RNA聚合酶啟動子序列合成cRNA，由該cRNA通過引發(fā)上述錨定序列而再次合成cDNA的方法，來擴增從利用激光捕獲顯微切割、細(xì)胞分選儀獲得的少量的細(xì)胞和/或組織中得到的微量的RNA，從而抑制作為現(xiàn)有的擴增法的問題的、在每次重復(fù)cDNA合成-cRNA合成循環(huán)時產(chǎn)生的cDNA和cRNA上的mRNA5’相當(dāng)區(qū)的缺失。專利文獻I、專利文獻2均作為無擴增偏倚的方法記載，認(rèn)為每I個循環(huán)的偏倚與以往相比較小，但由于著眼于由少量的RNA盡可能多地擴增，因而作為擴增倍率相當(dāng)大。因此，相應(yīng)地偏倚積累，不可否認(rèn)結(jié)果產(chǎn)生大的擴增偏倚。
專利文獻3涉及為了全基因表達譜分析而使用例如保管的固定化石蠟包埋組織材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或極度片段化的RNA試樣也能夠完全擴增的試樣的調(diào)制方法。然而，該方法包含將被片段化的RNA進行多聚腺苷酸化的工序，認(rèn)為該工序中的反應(yīng)的偏差作為結(jié)果可能嚴(yán)重影響基因表達譜。
專利文獻4公開了包含例如分解度等核酸樣品中的核酸的品質(zhì)測定方法的、分解核酸樣品中的靶標(biāo)的擴增用組合物和方法，以及用于從分解RNA樣品制成基因表達譜的方法。以來源于同一基因的不同尺寸的擴增子(擴增產(chǎn)物)的擴增效率為標(biāo)準(zhǔn)，隨著樣品分解，尺寸較大的擴增子的擴增效率降低，由此來評價品質(zhì)。本方法對于十幾種至二十幾種基因分別進行多個尺寸的PCR。認(rèn)為在RNA分解進行的情況下，PCR的探針尺寸越大則越不被擴增，因而可以一定程度確認(rèn)分解度，但需要對每個RNA樣品PCR擴增總共數(shù)十種基因，因此認(rèn)為本方式難以實際進行。專利文獻5公開了將以不分解的狀態(tài)下長鏈級分所含的RNA的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的分解指標(biāo)核酸探針裝載于核酸陣列，使從總RNA分級出短鏈而得的RNA樣品對該核酸陣列雜交，通過分解指標(biāo)核酸探針的信號的有無來測定RNA樣品的分解度的方法，以及涉及RNA的分解度測定用核酸陣列的技術(shù)。然而，認(rèn)為該核酸陣列限于微小RNA(miRNA)等短鏈RNA，難以適用于基因表達分析。而且，在從FFPE等的固定組織和/或固定細(xì)胞提取RNA的情況下，與從細(xì)胞和/或凍結(jié)組織提取情況不同，常常不能得到大量的RNA，在這樣的狀況下，僅用于RNA樣品的品質(zhì)確認(rèn)就要使用幾yg 幾十y g這樣大量的樣品進行實驗是不現(xiàn)實的，從成本方面也決不能說是優(yōu)選的方法。專利文獻6中有關(guān)于測定核酸的片段化水平的方法的記載。該專利文獻的申請人銷售分別測定RNA樣品所含的2種核糖體RNA(18S、28S)的量，由28S/18S之比來判定能否分析的試劑盒。據(jù)說當(dāng)RNA分解時，首先28S分解，接著18S分解，在該試劑盒中，如果28S/18S為O. I以下，則判定為RNA的品質(zhì)差。然而，從被固定液固定了的組織、細(xì)胞中提取的RNA —般在固定時RNA分解，進而由于固定組織、細(xì)胞一般常溫保管，隨著經(jīng)年RNA進一步分解。因此，從例如福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織提取的RNA經(jīng)常檢測不到上述2種核糖體RNA，在以上述基準(zhǔn)判定RNA樣品的品質(zhì)的情況下，大半樣品被認(rèn)為不能分析。因此，在使用如上所述的長期保存的固定組織、固定細(xì)胞進行可追溯研究時，使用該試劑盒是極為困難的。專利文獻7是通過加熱處理等使包含分解的mRNA的保管組織中的、與RISC(RNA誘導(dǎo)型沉默復(fù)合體)結(jié)合而未被分解的miRNA游離，并通過PCR擴增來檢測的RNA的譜分析方法。由于在從RISC使miRNA游離時，在95°C這樣的高溫下處理，因此不能否定由此發(fā)生分解的可能性，也談不上涉及確認(rèn)RNA的品質(zhì)的方法。此夕卜，在使用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(例如，Agilent Technologies公司制“Bioanalyzer (生物分析儀)”)的情況下，作為RNA分解的指標(biāo),計算出作為由AgilentTechnologies公司所開發(fā)的測定基準(zhǔn)的RIN(RNA Integrity Number, RNA完整性指數(shù))。RIN是以電泳的RNA樣品全體的電泳圖譜為基礎(chǔ)算出的，其值為O 10的范圍(非專利文獻I)。Agilent Technologies公司的Bioanalyzer成為評價核酸的品質(zhì)時一般使用的裝置，在使用該裝置時，RIN成為顯示RNA的品質(zhì)的一般指標(biāo)。然而,用Bioanalyzer分析從固定組織、固定細(xì)胞提取出的RNA時，即使對于其電泳圖譜明顯不同、分解行為各異的RNA，RIN的值也在2 3之間基本不變，因此RIN可能未必能夠反應(yīng)實際的RNA的狀態(tài)。而且，實際情況是，缺乏判斷從被固定液固定了的各種組織、細(xì)胞提取出的RNA是否是能夠供給分析的樣本的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I:特表2006-520603號公報專利文獻2:特開2005-224172號公報專利文獻3:特表2007-515964號公報
專利文獻4:特表2008-541699號公報專利文獻5:特開2008-35779號公報專利文獻6:特開2008-43332號公報專利文獻7:特表2009-501531號公報非專利文獻非專利文獻I:Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, LeiberM，Gassmann M，Lightfoot S，Menzel Wj Granzow Mj Ragg T:The RIN:an RNA integritynumber for assigning integrity values to RNA measurements;BMC Molecular Biology7:3(2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題在現(xiàn)有技術(shù)中，分析從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA時，沒有簡便且高準(zhǔn)確度地判斷所提取的RNA是否適于分析的方法，知曉分析所得的數(shù)據(jù)的有效性是困難的。用于課題的方法鑒于上述課題，本發(fā)明者們進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在進行從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA的基因表達分析時，在分析前對RNA進行電泳，根據(jù)電泳圖譜來判斷是否適于分析，對于判斷為適于分析的RNA進行分析，可獲得符合本來的RNA的存在量的有效性高的數(shù)據(jù)，而且可獲得再現(xiàn)性高的數(shù)據(jù)，從而完成了本發(fā)明。另外發(fā)現(xiàn)，如果在擴增該RNA時，使其擴增倍率為原來的2 20倍，則能夠抑制擴增所產(chǎn)生的偏倚，獲得符合本來的RNA的存在量的有效性高的數(shù)據(jù)，而且發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性高，從而完成了本發(fā)明。gp，本發(fā)明由以下⑴ (7)構(gòu)成。(I)從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA的分析方法，該RNA的分析方法具有以下步驟當(dāng)設(shè)對該RNA總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為A(% )、對該RNA總重量的電泳中的超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為B(%)時，判定該RNA滿足下式，式B/A彡 I。(2)根據(jù)⑴所述的RNA的分析方法，進一步具有以下步驟判定上述比率A(% )為25%以上。
(3)根據(jù)(I)或⑵所述的RNA的分析方法，對上述判定的RNA分析以擴增倍率2 20倍擴增所得的擴增產(chǎn)物。(4)根據(jù)⑴或⑵所述的RNA的分析方法，對上述判定的RNA通過非擴增來進行分析。(5)根據(jù)(4)所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。(6)根據(jù)(I) (5)的任一項所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。(7)根據(jù)⑴ (6)的任一項所述的RNA的分析方法，對上述被固定液固定了的組 織或細(xì)胞進行了石蠟包埋或OCT復(fù)合物包埋。發(fā)明的效果通過本發(fā)明的RNA的分析方法，對于從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA，可以進行正確地反映本來的基因的存在量的分析，特別是在微陣列分析中可獲得良好的效果。另外，通過本發(fā)明的RNA的分析方法，可以在分析前判定從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA是否適于分析，可以將浪費使用試劑等防患于未然。


圖I顯示當(dāng)設(shè)通過Bioanalyzer得到的各種RNA的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為A(% )、超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為B(% )時，以橫軸為A、以縱軸為B/A對各種RNA的數(shù)值作圖而得的圖。圖2顯示對于各種RNA的RIN和擴增量進行作圖而得的圖。圖3將利用小鼠小腦、肝臟的FFPE組織的微陣列的表達分析進行2次，對于第I次、第2次各自的分析所得的各基因的信號強度，將兩者的小腦/肝臟之比進行作圖而得的散點圖。
具體實施例方式以下，更具體地說明本發(fā)明。本發(fā)明的“被固定液固定了的組織或細(xì)胞”，是指通過在稱為固定液的溶液中浸潰組織、或者細(xì)胞，從而進行用于將生物試樣維持在盡可能自然的狀態(tài)下的處理、即固定處理。這里使用的固定液，優(yōu)選使用甲醛溶液、低聚甲醛溶液、包含乙醇、甲醇等醇類、丙酮、氯仿等的溶液、包含苦味酸、重鉻酸鉀等酸的固定液(例如，鮑音固定液、Zamboni固定液、奧爾特氏固定液)、包含乙酸鋅、氯化鋅、硫酸鋅等金屬的溶液等。另外，還優(yōu)選包含乙醇、氯仿、乙酸的卡諾伊固定液、包含甲醇、氯仿、乙酸的Methacarn固定液等、將上述溶液二種以上混合使用。在本發(fā)明中，作為上述固定液，更優(yōu)選使用包含甲醛或低聚甲醛的溶液。甲醛溶液可以使用將市售的福爾馬林(甲醛濃度37% )用水稀釋而得的溶液，還優(yōu)選使用將水稀釋后的溶液的PH值用碳酸鈣、碳酸鎂等調(diào)節(jié)成中性而得的溶液，和/或用磷酸緩沖液稀釋而將PH值調(diào)節(jié)成中性而得的溶液。另外，還可以使用除去了惡臭、刺激性氣味、調(diào)節(jié)了濃度的福爾馬林溶液(商品名'U O卜此外，甲醛溶液中的甲醛含量優(yōu)選為I 30%，更優(yōu)選為2 20%。低聚甲醛溶液可以使用將聚甲醛的粉末用水或磷酸緩沖液等溶解而得的溶液，和/或用水和少量的氫氧化鈉溶解后、用磷酸緩沖液等將pH值調(diào)節(jié)至中性而得的溶液，也可以使用市售的低聚甲醛溶液。其濃度優(yōu)選為I 10%，更優(yōu)選為2 8%。另外，上述被固定了的組織或者細(xì)胞可以被石蠟包埋。在將被固定了的組織或者細(xì)胞進行石蠟包理時，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般方法來操作即可。即，將固定組織或細(xì)胞用醇置換而脫水，接著用二甲苯、苯等置換，然后在注入了加熱而液化的石蠟的鑄模中加入組織、細(xì)胞而包埋，制成石蠟塊。此外，在從石蠟包埋后的組織、細(xì)胞中提取RNA時，使用利用旋轉(zhuǎn)式切片機、滑行式切片機等切片機切成薄片的樣品。此時，對薄切片的厚度不特別限定，優(yōu)選為I 100 μ m，更優(yōu)選為2 50 μ m。此外，可以使用主要用于制作凍結(jié)組織切片的OCT (Optical CuttingTemperature,最佳切削溫度)復(fù)合物代替石臘。另外,還優(yōu)選使用以下方法將石蠟塊切成薄片而得的樣品貼合在載玻片等上，使用激光捕獲顯微切割(LCM)和/或手術(shù)刀等從采取成為分析對象的組織的巨型拼合模塊等將一部分取出而得的組織中提取RNA。在進行LCM時，為了提高視認(rèn)性、確實地取出作為分析對象的組織、細(xì)胞，還可以將組織、細(xì)胞染色。此時，作為色素可利用例如甲酚紫、蘇木精-伊紅(HE)、核固紅(NFR)等。 本發(fā)明的“從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA”，是從使用上述固定液固定了的組織或者細(xì)胞，通過酶消化組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)而提取的RNA，作為該RNA，可列舉mRNA、rRNA、tRNA、miRNA,優(yōu)選為mRNA或miRNA，更優(yōu)選為miRNA。提取液中有時混入了 DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，優(yōu)選提取后進行純化操作。作為這里使用的純化方法不特別限定，可列舉例如，使用硅膠膜、擔(dān)載有陰離子交換樹脂等的柱的方法，使用逆相色譜法等液體色譜法的方法，使用有機溶劑使RNA沉淀的方法，將濃度高的乙酸銨溶液添加到含RNA的溶液中使RNA選擇性沉淀的方法，使用磁珠的方法等。在上述提取、純化中，適合使用例如，aRecoverAll (卜 > 一 K ^ 一 ” ) Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE”(Ambion公司)、“RNeasy FFPE Kit”(Qiagen 公司)、“ ISOGEN PB Kit，，( 二 ” *。> 夕一 >株式會社)、“FFPE RNA Purification Kit”(Norgen 公司)、“PureLink(商標(biāo))FFPE RNA IsolationKit”(Invitrogen 公司)、“High Pure FFPE RNA Micro”(Roche Applied Science 社)、“Agencourt FormaPure (商標(biāo))Kit，，(Beckman Coulter 公司)、“QuickExtract (商標(biāo))FFPEExtraction Kit”(Epicentre社)等福爾馬林固定石臘包埋組織用RNA提取試劑盒。從上述被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA由于被固定液成分分解、和/或交聯(lián)、修飾，因而難以將該RNA供給利用該RNA與能直接或間接地選擇性結(jié)合的物質(zhì)(以下也稱為選擇結(jié)合性物質(zhì))的分子間相互作用的分析的樣品較多，事先判定是否適于分析成為了技術(shù)課題，但本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，如后述的實施例等所示，在從固定組織或細(xì)胞中提取出的RNA中，通過確認(rèn)對該RNA的總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率、和對該RNA的總重量的電泳中的超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率的工序，預(yù)先排除成為RNA的分解和/或片段化的指標(biāo)的分子量小的RNA、和成為交聯(lián)和/或添加/修飾等的指標(biāo)的分子量大的RNA的比率多的RNA樣品，從而可以判斷該RNA是否適于上述微陣列分析。這里所說的“適于分析”，是指在進行利用了 RNA與選擇結(jié)合性物質(zhì)的分子間相互作用的RNA的分析的情況下，能夠正確地測定該樣品所保有的信息的狀態(tài)。如上所述，在將RNA供給分析的情況下，如果分解、片段化的程度大、和/或存在大量交聯(lián)或者添加/修飾物，則有時與選擇結(jié)合性物質(zhì)的分子間相互作用被抑制，而且擴增時得不到充分的擴增量，產(chǎn)生偏倚，作為結(jié)果極有可能不能正確地分析。作為在從被固定了的組織或者細(xì)胞中提取出的RNA中，確認(rèn)對該RNA總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率、和對該RNA的總重量的電泳中的超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率的方法，可列舉將該RNA以分子量大小來區(qū)分并定量各分子量范圍中的RNA的存在比例的方法。作為將從被固定了的組織、細(xì)胞等中提取出的RNA樣品以分子量大小區(qū)分并確認(rèn)分子量分布的方法的電泳的具體例，可列舉瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、芯片電泳，但作為定量特定的核苷酸范圍中的RNA的存在比例的方法，例如在凝膠電泳的情況下，可列舉使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種光密度計和/或“Typh00n”(GE 7社)等的測量將譜帶強度數(shù)值化的方法，另外在芯片電泳的情況下，在使用“Agilent2100Bioanalyzer” (Agilent Technologies公司)等電泳系統(tǒng)進行時，通過進行專用軟件所具有的Smear分析，從而可以適當(dāng)?shù)厍蟪鎏囟ǚ肿恿糠秶械腞NA的存在比例。此外，在將未發(fā)生分解的RNA (完整RNA)用電泳進行分析的情況下，據(jù)說為約4700核苷酸的核糖體RNA的28S有時顯示以比4000核苷酸略小的分子量為峰的譜帶。認(rèn)為這是由于28S的分子中含有較多的雙鏈區(qū)，結(jié)構(gòu)變得緊湊，因而在電泳中比實際的分子量泳動速度快。關(guān)于該現(xiàn)象，在Agilent Technologies公司主頁的FAQ中也可看到同樣的記載。因此，在本發(fā)明中核糖體RNA的28S實質(zhì)上包含在電泳中的1000 4000核苷酸的范圍內(nèi)。另外，18S的分子量為1874核苷酸，在電泳中也能在1000 4000核苷酸的范圍觀察到譜帶，因而也包含在該范圍中。在本發(fā)明中，判斷從被固定了的組織或者細(xì)胞中提取出的RNA是否適于分析的具體方法是，通過確認(rèn)相對于對該RNA的總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率A(% )，對該RNA的總重量的電泳中的超過4000核苷酸的RNA的重量的比率B(%)較小或相同、即B/AS 1，從而判定是否適于分析的方法。認(rèn)為包含超過4000核苷酸的RNA的級分中含有產(chǎn)生交聯(lián)的RNA，它們有時不能與探針雜交，因此在分析比率B大于比率A的RNA樣品的情況下,有定量值小于實際存在的mRNA量或者miRNA量的傾向，而且還有時會發(fā)現(xiàn)本來表達但不能檢測的mRNA或者miRNA。因此，在進行從固定組織或細(xì)胞中提取出的RNA的分析之前，通過確認(rèn)該RNA的B/A是否為I以下，可以迅速判定該RNA是否適于分析。在對應(yīng)于B/A彡I的RNA的情況下，與從相同組織或細(xì)胞提取出的無分解(完整)的RNA的微陣列分析結(jié)果相比，可得到較高的相關(guān)關(guān)系。這里，相關(guān)系數(shù)是定量地表示2個數(shù)據(jù)的相互關(guān)系的強度的指標(biāo)，取-I至I之間，如果為正的值則表示正相關(guān)，如果使負(fù)的值則表示負(fù)相關(guān)，如果是零則表示無相關(guān)。一般地，如果絕對值為O. 5以上則可判斷為有相關(guān)，如果絕對值小于O. 5則可判斷為無相關(guān)，2個數(shù)據(jù)的相關(guān)程度越強，則其絕對值越接近
I。此外,在通過“Microsoft Office Excel "(Microsoft公司)求相關(guān)系數(shù)的情況下,使用稱為“correl”的函數(shù)即可。在本發(fā)明中，在對于確認(rèn)了在兩者中共同表達的基因求信號強度的相關(guān)系數(shù)的情況下，優(yōu)選為0.7以上，更優(yōu)選為0.8以上，進一步優(yōu)選為0.9以上。進而，相對于從被固定了的組織或者細(xì)胞中提取出的RNA的總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率A(% )越大，顯示該RNA越接近未分解的完整狀態(tài)，這時，獲得接近完整RNA的基因或者miRNA的表達行為的傾向高。具體地，如果A的比例優(yōu)選為15%以上，更優(yōu)選為20%以上，進一步優(yōu)選為25%以上，則可以更迅速地判、斷是否是接近完整狀態(tài)的RNA。進而，相對于從被固定了的組織或者細(xì)胞中提取出的RNA的總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率A(% )、與對該RNA的總重量的電泳中的超過4000核苷酸的RNA的重量的比率B (% )的和(A + B)的值(O彡(A + B)彡100)越小,顯示小于1000核苷酸的RNA的重量的比率越大，即分解的RNA越多，但如果分解的RNA多，則特別是在進行短鏈的miRNA的微陣列分析的情況下，有時發(fā)生除本來應(yīng)雜交的RNA以外的RNA與探針結(jié)合的、被稱為所謂交叉雜交的現(xiàn)象的可能性變高。這種情況下，有時得到RNA似乎比實際存在量更強烈地表達這樣的結(jié)果，和/或表達的RNA的數(shù)比實際多的結(jié)果。在本發(fā)明中，A + B的值優(yōu)選為(A + B)彡15，更優(yōu)選為(A + B)彡20，進一步優(yōu)選為(A +B)彡 25。此外，還優(yōu)選通過檢測從被固定了的組織或者細(xì)胞中提取出的RNA所含的特定基因的存在有無，來詳細(xì)判定該RNA能否分析。通過進行該操作，可能能夠以更高比率判定可否分析。這種情況下，通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成cDNA，以該cDNA為模板通過PCR擴增 特定基因，當(dāng)通過電泳評價該擴增產(chǎn)物時認(rèn)定了其存在的情況下，判定為可以分析。此外，作為這里所說的特定基因，優(yōu)選選擇被稱為持家基因或者內(nèi)參基因的、理論上在樣品間基本沒有表達變動的基因，可列舉例如，甘油醛-3-磷酸脫氫酶、β-肌動蛋白、β2-微球蛋白、次黃嘌呤核糖基轉(zhuǎn)移酶、膽色素原脫氨酶、磷酸甘油酸激酶、親環(huán)素Α、β -葡糖醛酸糖昔酶等。本發(fā)明中只要是利用RNA與選擇結(jié)合性物質(zhì)的分子間相互作用的分析即可，不特別限定，作為優(yōu)選的分析工具，可列舉微陣列。微陣列是在包含玻璃、陶瓷、硅等無機材料、不銹鋼、金(鍍)等金屬類、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、硅膠等高分子材料的基板上固定化多種選擇結(jié)合性物質(zhì)而成的，作為一次檢測被固定化的多種選擇結(jié)合性物質(zhì)與被驗物質(zhì)的結(jié)合的有無和/或被驗物質(zhì)的結(jié)合量的分析工具是有用的。作為固定化于微陣列的選擇結(jié)合性物質(zhì)，可列舉核酸或其他抗原性化合物。核酸包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、互補DNA(cDNA)、互補RNA(cRNA)等。作為其他抗原性化合物，包含低分子化合物。特別優(yōu)選的選擇結(jié)合性物質(zhì)是核酸。這樣的選擇結(jié)合性物質(zhì)可以是市售的，或者是合成的，也可以是從活體組織或細(xì)胞等天然來源調(diào)制的。對微陣列不特別限制，作為優(yōu)選的例子，可以在基板表面具有凹凸部，還可以進一步在凸部的上面設(shè)有蓋子。此時，蓋子優(yōu)選具備與空隙連通的I個以上貫通孔。該孔用于注入核酸溶液、結(jié)合用緩沖液等液體，另外同時也用于將基板內(nèi)部的壓力保持在大氣壓。貫通孔優(yōu)選對一個空隙有多個，其中通過為3 6個而使樣本溶液的填充容易，因此是特別優(yōu)選的。此外，對如上所述的蓋子的制造方法不特別限定，例如，在樹脂的情況下優(yōu)選使用注射成型法、熱壓印法、切削的方法等，在玻璃和/或陶瓷的情況下優(yōu)選使用噴砂法，在硅的情況下優(yōu)選使用公知的在半導(dǎo)體工藝中使用的方法等。進而，通過在微陣列與蓋子之間的空隙中封入微粒，從而在空隙中加入樣本溶液并向樣本溶液傳播振動時，封入的微粒在液體中劇烈地來回運動。其結(jié)果是攪拌效率顯著提高，帶來了雜交的反應(yīng)促進效果，因此是優(yōu)選的。這里，對微粒的材質(zhì)不特別限定，優(yōu)選使用例如玻璃、陶瓷(例如氧化釔穩(wěn)定化氧化鋯)、金屬類(例如不銹鋼)、聚合物(例如尼龍、聚苯乙烯)、磁性體等。其中，由于物理、化學(xué)上穩(wěn)定、且比重大，因而優(yōu)選使用陶瓷的微粒。進而，通過合并使用使基板旋轉(zhuǎn)而使微粒沿重力方向落下的方法、和/或振蕩基板的方法、使用磁性微粒通過磁力而使微粒移動的方法等，進一步提高攪拌效率。在本發(fā)明中，上述從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA(以下也稱為被驗物質(zhì))可以不擴增(非擴增產(chǎn)物)供給分析，也可以將擴增產(chǎn)物供給分析，可根據(jù)被驗物質(zhì)的種類適宜選擇。例如在分析miRNA的情況下優(yōu)選非擴增的分析。另外，在mRNA的分析的情況下，被驗物質(zhì)可以是非擴增產(chǎn)物也可以是擴增產(chǎn)物，但在分析需要防止擴增偏倚的被驗物質(zhì)的情況下，優(yōu)選非擴增產(chǎn)物或如后述的以擴增倍率2 20倍擴增而得的擴增產(chǎn)物的分析。 在分析擴增產(chǎn)物的情況下，作為擴增RNA的方法不特別限制，可以使用由各公司上市的與FFPE對應(yīng)的擴增用試劑盒。在使用市售的試劑盒的情況下，優(yōu)選利用例如^ExpressArt FFPE RNA Amplification Kit”(AmpTec 公司)、“WT-Ovation FFPE SystemV2”(NuGen 公司)、“Arcturus Paradise Plus Reagent System”(MDS AnalyticalTechnologies 公司)等。另夕卜,還優(yōu)選使用 “SenseAMP Plus，，、“RumpUp，，、“RumpUpPlus” (Genisphere公司)合成正義鏈RNA，由該正義鏈RNA通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法合成反義鏈RNA。另外，如上所述優(yōu)選分析以擴增倍率2 20倍擴增而得的擴增產(chǎn)物。認(rèn)為僅得到擴增倍率不到2倍的擴增產(chǎn)物的RNA，是由于RNA的分解、片段化劇烈、RNA鏈長非常短，或者由于RNA分子間或者RNA與蛋白質(zhì)間產(chǎn)生的交聯(lián)、和/或固定時甲醛等來源于固定液的物質(zhì)與RNA結(jié)合而產(chǎn)生的添加/修飾物的影響，擴增反應(yīng)被抑制，因此不擴增，或者擴增反應(yīng)不充分，作為其結(jié)果有時不能正確地分析。另外，在擴增產(chǎn)物為超過20倍的擴增倍率的情況下，有時出現(xiàn)分解等的影響較少的RNA容易擴增、另一方面分解相當(dāng)進行的RNA基本不擴增這樣的所謂擴增偏倚顯著出現(xiàn)的可能性高。作為擴增產(chǎn)物，可以是通過RT-PCR等獲得的DNA，也可以是通過RNA聚合酶等合成的RNA，但在本發(fā)明中優(yōu)選為RNA。另外，在擴增產(chǎn)物為RNA的情況下，可以是正義鏈RNA也可以是反義鏈RNA，不特別限定，但現(xiàn)有的微陣列中大部分所擔(dān)載的探針對應(yīng)于反義鏈RNA,因此在使用現(xiàn)有的微陣列的情況下，優(yōu)選作為反義鏈RNA擴增。作為使擴增倍率為2 20倍的方法,可列舉通過增減用于RNA擴增的酶和/或引物、底物等的濃度來使試劑的組成最適化的方法。另外，還有通過調(diào)整反應(yīng)時間而使擴增倍率為2 20倍的方法。例如，在使用擴增倍率比較大的試劑來擴增從固定組織或細(xì)胞中提取出的RNA樣品的情況下，比規(guī)定反應(yīng)時間的時間縮短即可。另外，擴增次數(shù)優(yōu)選為I次。如果將擴增反應(yīng)重復(fù)2次以上，則有時即使在通過第I次擴增而擴增產(chǎn)物中產(chǎn)生了少許偏倚的情況下，第2次以后該偏倚也變得明顯。這里，為了求溶液中的RNA重量，例如，可以由將RNA溶液使用光路長IOmm的比色池用分光光度計測定時的260nm的值和溶液量通過下式A計算。式A (260nm 的值)X 40 (ng/ μ L) X 溶液量(μ L)。此外，為了確認(rèn)擴增RNA的結(jié)果、擴增倍率是否為2 20倍，由使用光路長IOmm的比色池通過分光光度計測定時的260nm的值和溶液量通過上式A求出擴增后的溶液的RNA重量，通過下式B計算出擴增倍率即可。式B :(擴增后的RNA重量)/ (擴增前的RNA重量)。被驗物質(zhì)優(yōu)選被本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的核酸的標(biāo)記物質(zhì)進行標(biāo)記，更優(yōu)選被熒光標(biāo)記。在將被驗物質(zhì)進行熒光標(biāo)記的情況下，熒光標(biāo)記可以在被驗物質(zhì)與選擇結(jié)合性物質(zhì)結(jié)合之前進行，也可以在結(jié)合之后進行。在被驗物質(zhì)是非擴增產(chǎn)物的情況下，優(yōu)選為直接標(biāo)記，作為這里使用的直接標(biāo)記試劑，可列舉例如，iiPlatinumBright Nucleic AcidLabeling Kit”(Kreatech 公司；突光色素為 Dyomics 系列(Dyomics 公司))、“ULS(商標(biāo))microRNA Labeling Kit”(Kreatech 公司；突光色素為 Cy3、Cy5)、“miRCURY LNA(商標(biāo))miRNA Power Labeling Kit”(Exiqon 公司；突光色素為 Hy3、Hy5)、“FlashTag RNALabeling Kit”(Genesphere 公司；突光色素為 0yster-550、0yster_650)等。另一方面，在分析擴增產(chǎn)物的情況下，通過使用在擴增反應(yīng)時所用的核苷酸-3-磷酸(NTP)(腺苷-3-磷酸(ATP)、鳥苷-3-磷酸(GTP)、胞苷-3-磷酸(CTP)、尿苷-3-磷酸(UTP))的一部分、例如 UTP的一部分上添加氨基烯丙基和/或生物素而得的化合物，在擴增產(chǎn)物中導(dǎo)入氨基烯丙基和/或生物素等反應(yīng)基，從而可以將擴增產(chǎn)物容易地進行熒光標(biāo)記，因此是優(yōu)選的。在導(dǎo)入了氨基烯丙基的情況下，容易地與末端具有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基的熒光色素進行偶聯(lián)反應(yīng)。作為這里所使用的熒光色素，可列舉Cy3、Cy5、Hyper5 (GE ^ > 7社)、“AlexaFluor”(注冊商標(biāo))系列(Molecular Probes社)等。另外，也可以不導(dǎo)入氨基烯丙基等反應(yīng)基，與非擴增產(chǎn)物同樣地，使用將所擴增的RNA進行直接熒光標(biāo)記的試劑，這時可以優(yōu)選使用上述的直接標(biāo)記試劑。被熒光標(biāo)記后的被驗物質(zhì)被供給至與固定化于微陣列等載體的選擇結(jié)合性物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)。作為使被驗物質(zhì)與被固定化于載體的選擇結(jié)合性物質(zhì)結(jié)合的方法，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，特別是在選擇結(jié)合性物質(zhì)是核酸的情況下，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的雜交方法使其結(jié)合。另外，對于使核酸與選擇結(jié)合性物質(zhì)結(jié)合時的反應(yīng)液，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的組成，特別是在選擇結(jié)合性物質(zhì)是核酸的情況下，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的雜交緩沖液。另外，作為檢測與固定化于載體的選擇結(jié)合性物質(zhì)結(jié)合的被驗物質(zhì)的結(jié)合的有無、和/或所結(jié)合的被驗物質(zhì)的量的方法，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的熒光掃描裝置讀取標(biāo)記于核酸的熒光的強度，從而檢測、測定。實施例通過以下的參考例、實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。當(dāng)然，本發(fā)明不限于下述實施例。參考例I(RNA的熒光標(biāo)記操作中的收量確認(rèn))在使用“3D_Gene (注冊商標(biāo))Human 25k chip” (東 > 株式會社)進行微陣列分析的情況下，優(yōu)選可以準(zhǔn)備被熒光標(biāo)記后的反義鏈RNA(aRNA) I μ g。于是，研究了用于獲得I μ g以上的熒光標(biāo)記aRNA的條件。將從人胃凍結(jié)組織中提取出的RNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶(“SuperScript (注冊商標(biāo))III”(Invitrogen公司))合成第一鏈cDNA,接著添加DNA合成酶合成與第一鏈DNA互補的第二鏈cDNA。使用二氧化硅基的柱來純化合成的cDNA，然后使用T7RNA聚合酶在42°C進行體外轉(zhuǎn)錄(IVT) 8小時，從而進行aRNA的擴增反應(yīng)。將該反應(yīng)進行5次，合成aRNA共計50 μ g。此外，通過在IVT反應(yīng)時所用的NTP混合物(ATP、GTP、CTP、UTP)中添加附帶了氨基烯丙基(AA)基的UTP (AA-UTP)，從而在合成aRNA中導(dǎo)入AA基。將對合成的AA-aRNA I μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g標(biāo)記Cy5 (GE、> >夕7社)的操作進行各3次。將各樣品中的標(biāo)記后的回收量示于表I。顯示在通過微陣列進行全面基因分析時為了獲得I U g的突光標(biāo)記aRNA,未標(biāo)記的擴增aRNA為2yg以上即可。表I
權(quán)利要求
1.從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA的分析方法，該RNA的分析方法具有以下步驟當(dāng)設(shè)對該RNA總重量的電泳中的1000 4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為A(% )、對該RNA總重量的電泳中的超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為B(% )時，判定該RNA滿足下式， 式B/A ( I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的RNA的分析方法，進一步具有以下步驟判定上述比率A(%)為25%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的RNA的分析方法，對上述判定的RNA分析以擴增倍率2 20倍擴增所得的擴增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的RNA的分析方法，對上述判定的RNA通過非擴增來進行分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5的任一項所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6的任一項所述的RNA的分析方法，對上述被固定液固定了的組織或細(xì)胞進行了石蠟包埋或OCT復(fù)合物包埋。
全文摘要
本發(fā)明涉及從被固定液固定了的組織或細(xì)胞中提取出的RNA的分析方法，其中，通過下述RNA的分析方法來分析被固定液固定了的組織或細(xì)胞的基因的表達信息和/或表達有無，所述RNA的分析方法具有以下步驟當(dāng)設(shè)對該RNA總重量的電泳中的1000～4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為A(％)、對該RNA總重量的電泳中的超過4000核苷酸的范圍的RNA的重量的比率為B(％)時，判定該RNA滿足下式，式B/A≤1。
文檔編號G06F17/30GK102656280SQ20108005669
公開日2012年9月5日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者信正　均, 野村　修, 俊彥 黑田 申請人:東麗株式會社