專利名稱：細菌類非點源污染源追蹤方法
技術領域：
本發(fā)明涉及流域水環(huán)境保護技術領域，具體的說是一種細菌類非點源污染源追蹤方法。
背景技術：
非點源(Non-point Source, NPS)污染的嚴重性及防治的重要性已經(jīng)為國內(nèi)外所認識。國內(nèi)外開展的多項研究表明，非點源已經(jīng)成為水環(huán)境的重要污染源；許多發(fā)達國家已經(jīng)證實，農(nóng)業(yè)非點源污染是導致水環(huán)境惡化的主要原因之一。據(jù)報道，美國的非點源污染量占污染總量的2/3，其中農(nóng)業(yè)非點源貢獻率占非點源污染量的75%左右。我國的多項研究也表明，非點源污染已經(jīng)上升為威脅人類飲用水安全的主要原因，許多水域的非點源污染甚至超過點源污染。非點源污染有以下主要特點發(fā)生具有隨機性；污染物的來源和排放點不固定； 排放具有間歇性；污染負荷的時間變化(次降雨徑流過程、年內(nèi)不同季節(jié)及年際間)和空間變化幅度大；監(jiān)測、控制和處理困難而復雜。簡單地說，就是不確定時間、不確定途徑、不確定量。因此，確定非點源污染的來源和污染負荷，是非點源污染控制的重要前提。非點源污染的主要控制指標之一是病原體，病原體產(chǎn)生來源廣泛，有人的排泄物， 家畜、家禽以及鳥類、野生動物的排泄物等，其排放具有無固定位置、難以預見等特點，要準確地確定其來源，其難度很大，要對其進行模擬及控制難度就更大。水體是眾多疾病的傳播媒介，一般而言，由不同方式產(chǎn)生的病原體通過暴雨徑流沖刷進入水體，給人體帶來多種潛在危害，如霍亂、傷寒、痢疾等，特別是近幾年發(fā)現(xiàn)的野生動物病毒向人體的傳播，如2004 年年初全球發(fā)生的高致病禽流感。據(jù)專家介紹，大量攜帶病毒的候鳥的糞便及分泌物會污染遷徙沿途的水源、土壤等環(huán)境，當?shù)厍蓊愐坏┙佑|帶有病毒的環(huán)境，便會感染禽流感，并波及與之接觸的人類；目前，人類認識到以水作為媒介傳播的疾病是有限的，仍有許多疾病未被人所知。因此，對水體特別是飲用水水源地的病原體的控制顯得十分重要。抗生素廣泛應用于治療人類的疾病感染，目前在動物飼料中也加入了抗生素。細菌對于抗生素抵抗力的表現(xiàn)不僅存在于人類糞便，同樣存在于家禽、家畜糞便中。對人類或動物腸道中棲息的大腸桿菌應用抗生素時，不同的大腸桿菌會表現(xiàn)出不同的抗藥性，而不同的抗藥類型恰好反應了不同微生物群落的存在，這些不同的類型就被認為是表型的“生物指紋”?？股氐挚沽Ψ治龇椒ㄊ峭ㄟ^鑒別人類或動物的糞大腸菌群在抗生素抑制生長環(huán)境下不同程度抵抗力的細菌源追蹤方法。目前尚沒有文獻能夠充分反映流域污染特點需要的抗生素種類及濃度。為了準確，有效，快速地追蹤糞大腸菌群非點源污染來源，及時保障飲用水安全，許多學者致力于用最少抗生素及其濃度梯度反映流域污染特點，如美國的Harwood在2000年的研究中應用氨芐青霉素、阿莫西林、頭孢菌素、金霉素、土霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素等9 種抗生素在4種不同濃度下評價糞鏈球菌和糞大腸菌群的抵抗力類型，在此次研究中，分別計算了人類與動物的糞鏈球菌株的平均準確率(ARCC)分別是75. 5%和72.4%。應用不同濃度的抗生素抑制生長實驗并結合確認性分析可為地表水污染細菌來源追蹤提供至關重要的信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研究一種將細菌類非點源污染監(jiān)測轉化為點源污染監(jiān)測，適用于非點源污染治理中的污染源鑒定、追蹤、治理和控制的細菌類非點源污染源追蹤方法。該技術主要思路是采集流域內(nèi)已知非點源污染源環(huán)境樣本，根據(jù)不同來源的細菌對抗生素耐藥性的差異性，利用抗生素抵抗力分析方法對已知的細菌(大腸桿菌、糞大腸菌、腸球菌等)來源進行耐藥性分析，并獲得其“指紋”(Fingerprint)，進而建立“指紋”數(shù)據(jù)庫；在此基礎上，對流域水質進行監(jiān)測，通過細菌源追蹤技術對研究區(qū)域內(nèi)非點源污染物來源進行追蹤鑒別，并鑒別、量化研究區(qū)域內(nèi)不同非點源污染物的來源和貢獻率，識別非點源污染關鍵源區(qū)，為制訂針對性的非點源控制措施提供依據(jù)。本發(fā)明細菌類非點源污染源追蹤方法，其步驟如下 一、建立已知源數(shù)據(jù)庫
1、培養(yǎng)基的選擇及配制
(1)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA=Trypticase Soy Aga)
TSA是一種多用途的培養(yǎng)基，按照說明書將其準備至瓶子中；并倒入IOOml至250ml的燒瓶中用高壓鍋滅菌，在水浴鍋中溫度降至50°C時加入抗生素；
(2)mFC培養(yǎng)基
mFC培養(yǎng)基是一種選擇性的培養(yǎng)基，用于分離培養(yǎng)糞大腸菌群；
(3)腸球菌肉湯(EB:Enterococcosel broth)
EB是一種選擇性的培養(yǎng)基，配方可從微生物培養(yǎng)基手冊得到；
(4)mENT培養(yǎng)基
mENT是一種選擇培養(yǎng)腸道球菌的培養(yǎng)基；
(5)Colilert 肉湯
Colilert是一種選擇性培養(yǎng)總大腸菌群和大腸桿菌的培養(yǎng)基，所有的成分都包含在獨立包裝的管子里；按照說明，每一管試劑加IOml無菌水；
2、抗生素原液的配制(AntibioticStock Solutions)
(1)抗生素選擇
抗生素應在較大范圍(抗生素的種類、濃度)進行測試，然后盡可能減少抗生素的種類和濃度組成，使所建立的數(shù)據(jù)庫能夠達到足夠的分辨率；經(jīng)過實驗室反復實驗，最終確定適合于國內(nèi)的抗生素種類有利福平(RIF)、土霉素(0TC)、鏈霉素(STR)、頭孢菌素(CEP)^l 霉素(ERY)、四環(huán)素(ΤΕΤ)、新霉素(NEO)；
(2)配制方法
按如下介紹的方法配制抗生素原液；配制10mg/ml濃度的抗生素原液40ml ；分裝適當體積的原液至消毒過的小瓶中，并置于4°C儲存(有效期6個月)；包含有抗生素的培養(yǎng)皿也需儲存于4°C環(huán)境中(有效期為1個月)；
3、樣品采集
已知源樣品的采集按照項目區(qū)的面積來確定樣品數(shù)量，并對已知污染來源進行分類；為了提高已知源數(shù)據(jù)庫分析識別的準確率，樣品采集必須滿足以下兩個條件①建立已知源數(shù)據(jù)庫需要有足夠的數(shù)據(jù)量，每一類已知源不少于15個樣品；②采集源樣本的范圍要求全面涵蓋整個研究區(qū)域或流域；
水質樣品的采集按照流域的特點進行監(jiān)測點的布設，并進行定期采集； 表1源樣品數(shù)分配表
權利要求
1.一種細菌類非點源污染源追蹤方法，其特征在于對已知的細菌來源進行耐藥性分析，并獲得其“指紋”，進而建立“指紋”數(shù)據(jù)庫；鑒別、量化研究區(qū)域內(nèi)不同非點源污染物的來源和貢獻率，識別非點源污染關鍵源區(qū)。
2.根據(jù)權利要求1所述的細菌類非點源污染源追蹤方法，其特征在于所述建立“指紋”數(shù)據(jù)庫，即采集流域內(nèi)已知非點源污染源環(huán)境樣本，根據(jù)不同來源的細菌對抗生素耐藥性的差異性，利用抗生素抵抗力分析方法對已知的細菌來源進行耐藥性分析，并獲得其“指紋”。
3.根據(jù)權利要求1所述的細菌類非點源污染源追蹤方法，其特征在于在建立“指紋” 數(shù)據(jù)庫的基礎上，對流域水質進行監(jiān)測，通過細菌源追蹤技術對研究區(qū)域內(nèi)非點源污染物來源進行追蹤鑒別，并鑒別、量化研究區(qū)域內(nèi)不同非點源污染物的來源和貢獻率，識別非點源污染關鍵源區(qū)，為制訂針對性的非點源控制措施提供依據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明為一種新型的非點源污染源追蹤方法-“細菌類非點源污染源追蹤方法”，針對非點源污染的不確定性問題和污染無固定位置、不可預見性等特點，根據(jù)不同細菌的宿主群體或種群差異性對抗生素耐藥性的不同，建立已知細菌非點源污染來源的數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)學統(tǒng)計的方法構建細菌源和水體中細菌的相關關系，進而分析水體中細菌類非點源污染的來源，以及各種來源的貢獻率。本方法提供一種將非點源污染監(jiān)測轉化為點源污染監(jiān)測的技術，適用于非點源污染治理中的污染源鑒定、追蹤、治理和控制。本發(fā)明其先進性在于將由暴雨徑流產(chǎn)生的、隨機性和不確定性強的非點源污染進行有效識別和準確測定，能夠解決目前非點源污染難以識別、控制的問題。
文檔編號G06F19/28GK102212606SQ201110097768
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權日2011年4月19日
發(fā)明者余秋梅, 葉閩, 李超, 李迎喜, 楊芳, 王孟, 蔣固政, 賈海燕, 雷阿林 申請人:長江水資源保護科學研究所