專利名稱：用于生物樣本的光學分割的方法和器件的制作方法
用于生物樣本的光學分割的方法和器件
背景技術(shù)：
在用于分子病理學的典型的熒光成像場景中，使用染料以標識具體的蛋白質(zhì)或亞細胞區(qū)室。通常最感興趣的蛋白質(zhì)在激發(fā)用于成像的熒光指示器的過程中以低水平來表現(xiàn)；照明整個生物樣本(例如，組織切片)，由于內(nèi)生來源或作為目標的感興趣的區(qū)域外部的非具體的鍵聯(lián)(binding)而生成熒光發(fā)射。所發(fā)射的光的額外來源是噪聲信號并且典型地必須通過后處理方法移除或排除以準確地量化低表現(xiàn)蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(StructuredIllumination Microscopy, SIM)是成像技術(shù),其涉及這樣的后處理方法的使用，在其中照明圖案或掩模用來允許感興趣的具體的細胞區(qū)域的照明和分辨率的空間控制。此方法用于這樣的應用作為自體熒光減小、擴展的動態(tài)范圍成像以及光學深度分段。然而，存在用于方法的需要，該方法可在圖像采集自身期間用于將感興趣的具體 區(qū)域作為目標或在本地增加對比度和信噪比。實時SIM過程會改進熒光激發(fā)的效率或特異性以及使用以前的信息或組織圖像中的具體特征以調(diào)整后續(xù)照明圖案的樣本分析。然而，為了完成此情況，過程要求所采集的圖像與照明掩模配準以便照明掩?？梢栽诤罄m(xù)圖像采集期間精確地重疊在樣本上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對使用光學分割的生物樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)和位置的成像。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，包含一種用于放置于固體支撐上且裝配在熒光顯微鏡上的生物樣本的光學分割的方法，該方法包含將來自光源的處于預定波長的光傳送到生物樣本上，其中光引起生物樣本發(fā)熒光；使用圖像捕獲裝置采集生物樣本的熒光圖像；至少部分利用基于特征的信息或像素強度信息來分析該熒光圖像以生成對應于生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)的掩蔽圖案；將掩蔽圖案變換為重定格式(reformatted)的掩蔽圖案以將圖像捕獲裝置的圖像與數(shù)字微鏡裝置(digital micro-mirror device, DMD)的空間坐標配準；使用數(shù)字微鏡裝置(DMD)將重定格式的掩模圖案投影到生物樣本上，其中所述DMD放置于光源和生物樣本之間，并且其中重定格式的掩蔽的圖案與生物樣本配準；用圖像捕獲裝置來采集生物樣本的掩蔽的熒光圖像；以及將掩蔽的熒光圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。在另一實施例中，本發(fā)明包含一種用于放置于固體支撐上的生物樣本的光學分割的圖像分析系統(tǒng)。該圖像分析系統(tǒng)包含熒光顯微鏡，該熒光顯微鏡具有用于裝配生物樣本的臺；光源，用于照明生物樣本并且放置該光源以便引導光通過熒光顯微鏡的孔徑以及引導光到生物樣本上；數(shù)字微鏡裝置(DMD)，其中所述DMD放置于光源和熒光顯微鏡的孔徑之間；圖像捕獲裝置，附著于熒光顯微鏡并且配置為采集生物樣本的熒光圖像；以及數(shù)字光處理器。該數(shù)字光處理器配置為接收來自圖像捕獲裝置的熒光圖像；至少部分利用基于特征的信息或像素強度信息來分析熒光圖像以生成掩蔽圖案，其中掩蔽圖案對應于生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)；以及將掩蔽圖案變換為重定格式的掩蔽圖案以將圖像捕獲裝置的圖像與DMD的空間坐標配準。


當參考附圖閱讀下文的詳細描述時，本發(fā)明的這些和其它特征、方面以及優(yōu)勢將變得更好理解，其中在通篇附圖中類似的標號表示類似的部件。圖I是示出以“開”和“關(guān)”的狀態(tài)在微鏡面上的光入射的DMD操作的示意圖。圖2是示出使用用于引導光的DMD裝置的通過照明系統(tǒng)的照明路徑的示意圖。圖3是示出可用于求解將照相機坐標映射到DMD坐標的參數(shù)的一個校正例程的流程圖。圖4是用于校正照相機圖像以匹配DLP坐標的目標DMD圖像的顯微圖。圖5是在與漢寧窗口相乘后的照相機和DMD圖像的顯微圖。 圖6是DMD (A)和照相機(B)圖像的傅里葉變換幅度的對數(shù)-極變換的顯微圖。圖7是在300ms的曝光時間(在該時間血紅細胞引起飽和)成像的均勻地照明的前列腺樣本的顯微圖。圖8是在900ms曝光時間使用減小以前飽和區(qū)域的激發(fā)的照明掩模成像的前列腺樣本的顯微圖。圖9是在DAPI通道(A)成像結(jié)腸樣本的顯微圖，示出染色的細胞核、在Cy3帶(B)中染色的角質(zhì)以及在DAPI通道成像的使用角質(zhì)圖像作為照明掩模的上皮細胞核(C)。
具體實施例方式在傳統(tǒng)的熒光成像系統(tǒng)中，使用空間均勻的光源來激發(fā)感興趣的熒光標識的生物標記，導致在生物樣本中發(fā)現(xiàn)的外生的熒光團和內(nèi)生的熒光化合物的激發(fā)。然而，如果已知給定蛋白質(zhì)主要在具體細胞區(qū)域(例如，細胞核或上皮)表現(xiàn)，則可以利用此信息來改進熒光激發(fā)的效率或特異性。通過首先在給定通道捕獲感興趣的結(jié)構(gòu)的均勻地照明的圖像，并且使用此圖像作為照明掩模用于對應于感興趣的標記的通道，來避免蛋白質(zhì)表現(xiàn)區(qū)域外部的激發(fā)。本發(fā)明通常涉及圖像采集方法，其使用從均勻地照明的生物樣本獲得的信息以選擇性地照明生物樣本內(nèi)的感興趣的結(jié)構(gòu)特征。該方法包含建立對應于生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)的掩蔽圖案。具體的結(jié)構(gòu)是高表現(xiàn)形態(tài)學信號，包含但不限于隔膜標記、血管標記、細胞核染色、腫瘤標記、上皮標記或間質(zhì)標記。所建立的掩蔽圖案可以用于假設低豐度標記存在的區(qū)域的照明。因此，該方法通過減輕與樣本內(nèi)的高發(fā)射來源關(guān)聯(lián)的一些組織(例如，脂褐質(zhì)和紅血細胞)用來擴展樣本的動態(tài)范圍成像。例如，用于所選擇的亞細胞組織區(qū)域的動態(tài)范圍成像可以通過在需要的地方送出更多的照明，并避免樣本內(nèi)其它對象(例如，紅血細胞)的激發(fā)來最佳化。換句話說，可以減少在生物樣本中發(fā)現(xiàn)的沒有作為目標的外生的熒光團和內(nèi)生的熒光化合物的激發(fā)。此外，使用形態(tài)學標記所設計的照明掩?？墒鼓茉诰唧w細胞和組織結(jié)構(gòu)上的其它生物標記的檢測。在某些實施例中，生物樣本可以裝配在固體支撐上并且安放在熒光顯微鏡上用于使用掩蔽圖案來分析，該掩蔽圖案投影于生物樣本上。術(shù)語生物樣本指的是從生物對象獲得的樣本，包含在體內(nèi)或體外獲得的生物組織或流體起源(origin)的樣本。這樣的樣本可以是但不限于，身體流體(例如，血液、血漿、血清或尿液)、器官、組織、片段以及從包含人類的哺乳動物隔離的細胞。生物樣本也可包含生物樣本的切片，其包含組織(例如，器官或組織的切片的部分)。生物樣本還可包含來自生物樣本(例如，來自生物的流體(例如，血液或尿液)的抗原)的提取物。生物樣本可以是原核生物起源或真核生物起源(例如，昆蟲、原生動物、鳥、魚、爬蟲類)。在一些實施例中，生物樣本是哺乳動物(例如，老鼠、鼠、牛、狗、驢、豚鼠或兔子)。在某些實施例中，生物樣本是靈長類動物起源(例如，示例，黑猩猩或人類)。此外，固體支撐指的是在其上可以使生物樣本不移動并且然后由本文所公開的方法來檢測的物品。可以通過物理吸附、通過共價鍵形成或通過其組合使生物樣本在固體支撐上不移動。固體支撐可包含聚合物材料、玻璃材料或金屬材料。固體支撐的示例包含膜片、微量滴定板、珠、過濾器、測試條、載玻片、蓋玻片、以及試管。在成像之前，生物樣本可以首先使用具有熒光染料或熒光團的分子標記(燃料和抗體)來標識。例如，細胞核可以用DAPI (具體地鍵聯(lián)DNA的熒光染料)來染色，而組織內(nèi) 的其它區(qū)域可以免疫熒光地標識，在那里通過直接地共軛的抗體或通過主要二次放大檢測來將感興趣的分子作為目標。對于一些結(jié)構(gòu)，例如紅血細胞(RBC)，可能發(fā)生自體熒光。建立掩蔽圖案的方法包含將來自光源的處于預定波長的光傳送到生物樣本上，其中該光引起生物樣本發(fā)熒光。在某些實施例中，在表面到處均勻地照明生物樣本。在其它實施例中，從以前的掃描或類似樣本獲得的圖像信息可用于選擇性地照明樣本。選擇性的照明可增加后續(xù)捕獲的寬場熒光圖像信噪比、保真度、特異性或其組合?？梢允褂脠D像捕獲裝置來捕獲生物樣本的寬場熒光圖像，并且轉(zhuǎn)移到用于分析的數(shù)字光處理器(Digtal Light Processor, DLP)。至少部分利用基于特征的信息或像素強度信息來分析圖像以生成對應于生物樣本內(nèi)具體結(jié)構(gòu)的掩蔽圖案?？梢允褂肈LP來重定格式掩蔽圖案以將寬場熒光圖像與數(shù)字微鏡裝置(DMD)的空間坐標配準，該數(shù)字微鏡裝置(DMD)放置于成像系統(tǒng)的光源和照明光學器件之間并用來將重定格式的掩蔽的圖像投影到所裝配的生物樣本上。將圖像重定格式進DMD坐標來移除與寬場圖像和DMD裝置之間的陣列密度相關(guān)的差異的圖像分辨率的變化，因此，細化重疊的圖像的安放。DMD可以包含各種像素陣列。在某些實施例中，DMD可以是MEMS鏡，其允許引導光進入或離開照明路徑，或液晶裝置。MEMS鏡(微機電系統(tǒng))是光刻產(chǎn)生的鏡，其用通過用類似光刻技術(shù)產(chǎn)生的集成電路所施加的電壓信號來操作。這些鏡典型地具有以毫米或毫米的分數(shù)來測量的尺寸。在某些實施例中，包含DMD的微鏡以對應于“開”和“關(guān)”的狀態(tài)的兩個角度之一來放置。為了在狀態(tài)間進行切換，每個鏡個別地關(guān)于其對角線軸轉(zhuǎn)動。如圖I所示，引導從每個微鏡反射的光以“開”狀態(tài)進入顯微鏡的照明光學器件，或以“關(guān)”狀態(tài)從顯微鏡入口偏離。圖2是本發(fā)明的一個實施例的示出通過會附著于顯微鏡的系統(tǒng)的照明路徑的圖示。準直透鏡40通過成像元件50 (例如但不限于非球面透鏡)將來自光源(未示出)的光聚焦，其中在成像元件50該光從寬帶鏡60反射到DMD 70。在DMD微鏡面上入射的光，被引導進顯微鏡物鏡80，穿過非球面成像透鏡90到視場光闌孔徑100上。通過將圖像聚焦到圖2中所示的照明路徑的視場光闌上，只要樣本自身是對準焦點的，則DMD圖案嚴格成像到樣本上。視場光闌結(jié)合到物鏡的焦平面，并且因此，與視場光闌共面的圖像將轉(zhuǎn)達到物鏡的焦平面。為了將在照相機上采集的圖像用作DMD圖案，可以應用仿射變換以匹配由于圖像通過顯微鏡光學器件投影而發(fā)生的縮放、變換以及位移。仿射變換指的是維持共線性以便最初位于線上的所有點在轉(zhuǎn)換后仍然位 于線上并且線段的中點、距離率在變換后仍是中點的任何轉(zhuǎn)換。除仿射變換的需要以外，可能在波形因數(shù)存在不匹配。例如，DMD可具有測量768x1024鏡的鏡陣列，然而照相機傳感器可具有測量1728x2352像素的像素陣列。因此，重定格式用于在DMD上使用的照相機圖像的過程可包含降采樣，因為最終格式具有比原始照相機圖像更低的像素。一旦已知變換參數(shù)，這些參數(shù)可應用于在照相機上采集的圖像以產(chǎn)生重定格式的圖像，該圖像可以上傳到DMD。當通過顯微鏡投影時，將正確地將所重定格式的圖像與樣本配準。圖3是示出可用于求解將照相機坐標映射到DMD坐標的仿射參數(shù)的一個校正例程的流程圖。配準目標的圖像到原始圖像以分別求解參數(shù)S、x以及y或縮放、轉(zhuǎn)動、X位移以及y位移。在一個實施例中，如圖3所示，上傳(I)目標圖像到DMD上并且投影到校正樣本上
(2)。用顯微鏡照相機采集(3)樣本上此目標的圖像。然后可向下選擇(down select) (4)樣本以匹配兩個圖像之間的波形因數(shù)以建立重采樣的照相機圖像。將重采樣的照相機圖像與目標DMD圖像配準并且用來求解仿射變換參數(shù)、轉(zhuǎn)動、縮放以及兩個圖像之間的x-y變換(5和6)。一旦計算變換參數(shù)，可以存儲(7)參數(shù)，并使用相同的顯微鏡照相機和DMD應用于生物樣本圖像的配準(8 )。在一個實施例中，校正例程可使用目標DMD圖像用于變換參數(shù)，由此DMD圖像使用明確定義的特征(例如，角和直線)以有助于目標和其在樣本平面的投影之間的牢固配準(robust registration)。用于此類型校正的校正目標圖像示出于圖4中并且包含壓在玻璃載玻片與蓋玻片之間的高度集中的Cy3染料的薄層。當用Cy3過濾裝置觀察時，此目標導致明亮的、均勻的熒光層。最薄的染料層確保了具有高對比度的最佳聚焦的窄范圍。圖4示出(A)在配準前(B)和配準(C)后的DMD目標圖像以及其在樣本上的投影。給定目標DMD在對象上的投影具有768x1024像素并且在照相機上的圖像具有1728x2352像素，重采樣照相機圖像可用于在配準前產(chǎn)生兩個圖像之間的匹配波形因數(shù)。在某些實施例中，雙線性插值用來確定在照相機圖像的非整數(shù)坐標的像素值。在某些實施例中，可以使用2D錐形或邊緣過濾函數(shù)，例如，漢寧窗口(Hanningwindow)。例如，圖4中所示出的圖像可以與2D漢寧窗口函數(shù)相乘以便平滑地錐化圖像的外部50個像素下降為零。這樣的錐形窗口可用于避免邊緣偽影的存在，其可以在配準中誤作為圖像特征。在窗口操作(windowing)后，可以配準目標DMD圖像和重采樣的照相機圖像以求解仿射變換參數(shù)。給定兩個圖像之間的轉(zhuǎn)動、縮放以及x-y變換，可以應用適當?shù)淖儞Q以系統(tǒng)地隔離和求解每個參數(shù)。在某些實施例中，由于移位圖像不改變其傅里葉變換的幅度，所以可以使用傅里葉變換。因此，通過僅考慮每個圖像的傅里葉變換的幅度，圖像配準可限于轉(zhuǎn)動和縮放因數(shù)。圖像的轉(zhuǎn)動導致其傅里葉變換幅度的相等的轉(zhuǎn)動。以因數(shù)a縮放圖像產(chǎn)生以因數(shù)I/a縮放的傅里葉變換幅度。然而，這些參數(shù)通常難以直接從傅里葉變換中測量。備選方式可以在對數(shù)-極空間(log-polar space)表示傅里葉變換幅度。可以應用對數(shù)-極變換，因為其將圖像投射為徑向和角度坐標，其實質(zhì)上將縮放和轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換為P和e軸上的變換。圖像的傅里葉變換的幅度是
C = / g(abs( F(c)l)
以及
D = /ogAibsl—Rd}ll
其中c和d分別表示與漢寧窗口相乘后的照相機和DMD圖像。圖像C和D在圖5中示出，其中上面的行是完整圖像并且下面的行示出放大的區(qū)。
如在圖5中觀察的，圖像C是D的縮放的和轉(zhuǎn)動的型式，因此，極變換Cp和Dp具有以下關(guān)系
Cpfp0j = Dp{p/a,8 -il
其中a是縮放因數(shù)，以及e ’是以度為單位的轉(zhuǎn)動。因此降低轉(zhuǎn)動到沿著e軸的變換。為了將縮放因數(shù)降低到沿著徑向軸的變換，p軸可以使用對數(shù)標尺來表示。結(jié)果是對數(shù)-極圖像Clp和Dlp，其具有關(guān)系
Ci1, Cp;#)=Dn,, (log(p) - bg(a).S -01
縮放因數(shù)現(xiàn)在可通過在對數(shù)-極空間中找出變換k>g(al來求解，并且指數(shù)化為以下
a —. W⑴
類似地，通過求解沿著P軸的位移來確定轉(zhuǎn)動。在圖6中示出對數(shù)-極表示Clr^PDlpt5圖6是DMD (A)和照相機(B)圖像的傅里葉變換幅度的對數(shù)-極轉(zhuǎn)換的顯微圖。這些轉(zhuǎn)換選取傅里葉變換的中心或DC項作為中心，并且因此將在以前的傅里葉變換中觀察到的縮放和轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換為沿著P和9軸的變換。變換可使用相位相關(guān)來確定，相位相關(guān)是基于兩個圖像的相位偏置確定這兩個圖像的相對位移的頻域技術(shù)。來自兩個圖像a和b的相位相關(guān)，可以通過首先計算兩個信號的歸一化互功率頻譜來確定，定義為
R = AB*/ [AB ]
其中A和B是圖像a和b的傅里葉變換。在此情況下，a和b是對數(shù)-極變換Clp和Dlp。函數(shù)r然后從R的逆傅里葉變換獲得。對應于r的峰值的水平和垂直位置的后續(xù)位移
{Avu\v} := imgmaMn □此技術(shù)可用于求解在對數(shù)-極坐標中的log(r)和0位移。類似地，在應用縮放和轉(zhuǎn)動后，兩個結(jié)果圖像僅在X和y上的位移不同?？梢詰孟辔幌嚓P(guān)以找出兩個圖像上的X和y變換。實驗
使用DLP DISC0VERY 4000 (德州儀器公司，德克薩斯，達拉斯)商業(yè)可用的DMD開發(fā)板來實現(xiàn)所構(gòu)造的照明。此模塊使8位灰度級圖像能上傳和以XGA分辨率(768x1024像素)來顯示。EXFO X-CITE 120Q (EXF0電光工程公司，加拿大，魁北克)，寬帶汞燈用作系統(tǒng)的照明來源。液體光導用于輸送來自燈的輸出光到準直透鏡。200mm焦距非球面然后聚焦準直的光束以粗略地探明DMD的大小(0. 7”對角線長度)。首先，在聚焦到DMD的表面上之前用轉(zhuǎn)向鏡引導聚焦的光束的路徑到適當?shù)慕嵌取Ｗ詈?，IOOmm非球面加倍2’’直徑用來中繼DLP的圖像到奧林巴斯 BX-51顯微鏡(奧林巴斯美國公司，賓夕法尼亞，中心谷)的視場光闌上。A.動態(tài)范圍擴展
在空間上變化照明強度可用于減小從會以其它方式使檢測器飽和的區(qū)域所發(fā)射的信號的量。此使用包含紅血細胞的前列腺樣本來演示，其在如圖7所示的Cy3通道中來成像。紅血細胞用足夠大強度來發(fā)熒光以超過照相機的動態(tài)范圍，其結(jié)果是使感興趣的信號處于相對低的信噪比(SNR)。在用減小至紅血細胞的激發(fā)的掩模照明后，積分時間乘以3而不使檢測器飽和。這在圖8中示出。平均0.35百萬像素面積的信號區(qū)域在飽和均勻照明的圖像中展示了 43. I的平均像素值，相對于在所構(gòu)造的照明的相同區(qū)域中的91. 9的平均值。所構(gòu)造的照明的使用在平均信號中提供大于2倍的增加并避免飽和。此結(jié)果演示 了在系統(tǒng)的動態(tài)范圍中的有效增加以處置強大的自體熒光來源。在飽和的情況下，通過使用均勻照明的圖像并且設置飽和的像素為零來形成照明掩模。B.光學分割
生物結(jié)構(gòu)的光學分割通過采集感興趣的形態(tài)學特征的染色的樣本的圖像來進行。通過處理此圖像，建立照明掩模，其允許激發(fā)僅到達對應于感興趣的結(jié)構(gòu)的那些區(qū)域。在不同的通道使用此掩模使能對應于掩模的生物樣本的形態(tài)學結(jié)構(gòu)的空間界限內(nèi)的任何生物標記的分割。此已經(jīng)以用于上皮相對間質(zhì)細胞核的分割的各種組織樣本來演示。圖9是結(jié)腸組織的示例，其對角質(zhì)和細胞核染色；在DAPI通道(A)成像的染色的細胞核、在Cy3帶(B)染色的角質(zhì)以及在DAPI通道成像的上皮細胞核使用角質(zhì)圖像作為照明掩模(C)。角質(zhì)、上皮的豐富的蛋白質(zhì)在Cy3帶用在DAPI中染色的細胞核來染色。給定上皮的CY3通道圖像，后面有閾值的直方圖歸一化給出上皮組織的二值圖。然后配準此圖并輸送給DMD。切換到DAPI通道并且應用上皮照明掩模將允許僅激發(fā)上皮細胞核。本發(fā)明包含通常涉及使用生物樣本用于分析、診斷或預言應用(例如，分析物檢測、組織化學、免疫組織化學或免疫熒光法)的實施例。在一些實施例中，本文所公開的方法可以特別地應用于組織化學、免疫染色、免疫組織化學、免疫化驗或免疫熒光法。在一些實施例中，本文所公開的方法可以特別地應用于免疫印跡技術(shù)(例如，蛋白質(zhì)印跡(westernblots))或免疫化驗(例如，酶聯(lián)免疫吸附化驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA))。本發(fā)明可以其它具體形式實施而不背離其精神或?qū)嵸|(zhì)特性。上文的實施例因此從所有方面認為是說明性的而不限于本文所公開的本發(fā)明。本發(fā)明的范圍因此由所附的權(quán)利要求而不是由上文的描述來指示，并且因此旨在落入權(quán)利要求的等效的范圍和意思的所有改變包含于其中。
權(quán)利要求
1.一種用于放置于固體支撐上且裝配在熒光顯微鏡上的生物樣本的光學分割的方法，包含 將來自光源的處于預定波長的光傳送到所述生物樣本上，其中所述光引起所述生物樣本發(fā)突光； 使用圖像捕獲裝置采集所述生物樣本的熒光圖像； 至少部分利用基于特征的信息或像素強度信息來分析所述熒光圖像，以生成對應于所述生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)的掩蔽圖案； 將所述掩蔽圖案變換為重定格式的掩蔽圖案以將所述圖像捕獲裝置的所述圖像與數(shù)字微鏡裝置(DMD)的空間坐標配準； 使用所述數(shù)字微鏡裝置(DMD)將所述重定格式的掩模圖案投影到所述生物樣本上，其中所述DMD放置于所述光源和所述生物樣本之間，并且其中所述重定格式的掩蔽的圖案與所述生物樣本配準； 用所述圖像捕獲裝置來采集所述生物樣本的掩蔽的熒光圖像；以及 將所述掩蔽的熒光圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述將所述掩蔽圖案變換為重定格式的掩蔽圖案包含將仿射變換參數(shù)應用于所述掩蔽圖案。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述仿射變換參數(shù)使用校正過程來計算，其中所述校正過程包含 將目標圖像上傳到所述DMD上并且將所述圖像投影到校正樣本； 采集投影到所述校正樣本上的所述目標圖像的校正圖像； 向下選擇所述校正圖像以匹配所述圖像捕獲裝置與所述數(shù)字微鏡裝置(DMD)的空間坐標之間波形因數(shù)以建立重定格式的圖像；以及 將所述重定格式的圖像與所述目標圖像配準并且求解所述仿射變換參數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述向下選擇包含將雙線性插值和2D錐形函數(shù)應用于來自所述圖像捕獲裝置的圖像。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中求解所述仿射變換參數(shù)包含將傅里葉變換操作應用于圖像配準。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述傅里葉變換操作的幅度在對數(shù)-極空間中表示。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中將所述重定格式的掩模圖案投影到所述生物樣本上導致變化所述生物樣本的空間照明。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中變化所述生物樣本的空間照明通過減少所述生物樣本中發(fā)現(xiàn)的沒有作為目標的外生的熒光團或內(nèi)生的熒光化合物的激發(fā)來擴展所述圖像捕獲裝置的動態(tài)范圍。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中變化所述生物樣本的空間照明允許用所述掩蔽的圖像的空間界限的一個或多個生物標記的光學分割。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其中將所述掩蔽的熒光圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像表示所述重定格式的掩模圖案的正圖像或負圖像。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中采集所述生物樣本的熒光圖像包含使用來自以前圖像的圖像信息以選擇性地照明所述樣本，用于增加所述熒光圖像信噪比、保真度、特異性或其組合。
12.一種用于放置于固體支撐上的生物樣本的光學分割的圖像分析系統(tǒng)，包含 熒光顯微鏡，具有用于裝配所述生物樣本的臺； 光源，用于照明所述生物樣本并且放置所述光源以便引導光通過所述熒光顯微鏡的孔徑并且引導到所述生物樣本上； 數(shù)字微鏡裝置(DMD)，其中所述DMD放置于所述光源和所述熒光顯微鏡的孔徑之間； 圖像捕獲裝置，附著于所述熒光顯微鏡并且配置為采集所述生物樣本的熒光圖像；以及 數(shù)字光處理器，配置為 接收來自所述圖像捕獲裝置的熒光圖像； 至少部分利用基于特征的信息或像素強度信息來分析所述熒光圖像以生成掩蔽圖案，其中所述掩蔽圖案對應于所述生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)；以及 將所述掩蔽圖案變換為重定格式的掩蔽圖案以將所述圖像捕獲裝置的圖像與所述DMD的空間坐標配準。
13.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)字光處理器配置為將仿射變換參數(shù)應用于所述掩蔽圖案。
14.如權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)字光處理器還配置為存儲來自一個或多個以前分析的樣本的仿射變換參數(shù)。
15.如權(quán)利要求14所述的系統(tǒng),其中所述以前分析的樣本來自于校正樣本。
16.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述DMD是二維MEMS鏡陣列，配置為在個別微鏡面入射的光偏離進入或離開所述熒光顯微鏡的孔徑，以便圖案圖像能投影到所述生物樣本上。
17.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)字光處理器還配置為使用來自以前圖像的圖像信息以控制所述生物樣本的照明并且其中所述照明增加所采集的熒光圖像信噪比、保真度、特異性或其組合。
全文摘要
提供一種用于使用光學分割的生物樣本內(nèi)蛋白質(zhì)表現(xiàn)和位置的成像的方法。步驟包含采集生物樣本的熒光圖像，分析圖像并且生成對應于生物樣本內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)的掩蔽圖案，將掩蔽圖案變換到數(shù)字微鏡裝置(DMD)的空間坐標，其然后可以投影到生物樣本上并且獲得掩蔽的熒光圖像。還提供一種用于使用光學分割的生物樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)和位置的成像的圖像分析系統(tǒng)。
文檔編號G06K9/00GK102804205SQ201180015777
公開日2012年11月28日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者R.菲爾金斯, K.塔西米, B.E.卡舍夫 申請人:通用電氣公司