用于預測胃癌預后的標記和用于預測胃癌預后的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于預測胃癌預后的標記、用于預測胃癌預后的組合物和試劑盒，所述組合物和試劑盒包含用于測量該標記表達水平的制劑，和使用所述標記預測胃癌預后的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以精確地預測胃癌預后，并且可以基于預測的預后有利地建立適宜的治療計劃，以顯著減少由胃癌引起的死亡。尤其，根據(jù)本發(fā)明，可以對Ib/II期胃癌患者中已經(jīng)預測具有消極預后的患者使用用于III期胃癌患者的治療方法，借此大幅度提高存活率。
【專利說明】用于預測胃癌預后的標記和用于預測胃癌預后的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及用于預測胃癌預后的標記、用于預測胃癌預后的包含測量該標記表達水平的試劑的組合物和試劑盒和使用所述標記預測胃癌預后的方法。
【背景技術】
[0002]在2005年，總計65，479人死于癌癥，占全部死亡的26.7%。造成最多死亡的癌癥是肺癌，每100，000人群中有28.4位患者死亡(21.1%)，按順序其次是胃癌，22.6位患者死亡(16.8%);肝癌，22.5位患者死亡(16.7%);結直腸癌，12.5位患者死亡(9.3%)。已知胃癌是世界范圍內(nèi)因癌癥造成的死亡當中造成第二多死亡的因素。
[0003]胃癌的癥狀顯示出多個方面，范圍從無癥狀至嚴重疼痛。此外，胃癌癥狀似乎像常見的消化癥狀，沒有任何特異特征。通常，在胃癌早期，大部分病例沒有癥狀，即便有任何癥狀的話，也很輕微，如輕微消化不良或上腹部不適，這造成大部分人忽視并因此可能增加胃
癌死亡率。
[0004]大部分用于胃癌的檢驗方法迄今是物理檢驗方法。首選是胃X射線法，這包括雙重對比方法、壓縮X射線法、粘膜圖法，并且其次是胃鏡檢查法，所述胃鏡檢查法通過找到非常小的病灶并且允許在疑似部位進行胃活組織檢查而提高診斷率，其中所述非常小的病灶在X射線檢查法中通過用肉眼檢查胃部時不顯現(xiàn)。然而，這種方法具有以下缺點:存在衛(wèi)生問題和患者在檢查期間感覺疼痛。因此，近年來，已經(jīng)進行了通過測量胃中特異性表達的標記基因的表達水平而診斷胃癌的研究，但是關于預測胃癌患者預后的遺傳標記的研究相對較少。
[0005]胃癌患者存活率取決于診斷時的病理學分期。根據(jù)三星醫(yī)學中心的數(shù)據(jù)，胃癌患者的 5 年存活率如下(KimS 等人，Int J Radiat Oncol Biol Phys2005;63:1279-85)。
[0006]II 期:76.2%, IIIA 期:57.6%,
[0007]IIIB 期:39.6%, IV 期 26.3%
[0008]結果顯示早期檢出胃癌能明顯有助于提高存活率。然而，由于已經(jīng)診斷為處于相同階段的胃癌根據(jù)患者的不同而顯示出了預后的差異，因此精確預測胃癌預后以及早期檢出胃癌是有效治療胃癌的最重要因素。
[0009]在另一方面，為診斷胃癌，醫(yī)生開始對患者實施必要的、據(jù)認為是最適宜的治療方案的檢查。存在用于治療癌癥的方法，如手術、內(nèi)窺鏡療法、化療和放射療法。一般通過考慮胃癌療法、胃癌尺寸、位置和范圍、患者總體健康狀態(tài)以及許多其他因素確定治療方法。
[0010]在僅用手術治療I B/II期胃癌的情況下，已知大約30%患者在5年內(nèi)復發(fā)。在這種情況下，由于不能預測胃癌在哪些患者中復發(fā)，因此不同醫(yī)生采用不同療法。因此，如果可以精確預測胃癌患者預后，則可以基于這種預后確定適宜的治療方法，如手術或化療，這可能很有助于胃癌患者存活，并且因此需要可以精確預測胃癌患者預后的技術。
[0011]常規(guī)上，已經(jīng)使用解剖觀察法(癌細胞侵入程度和轉(zhuǎn)移的淋巴結數(shù)目)以便預測胃癌患者的預后，但是該方法存在醫(yī)師主觀判斷的可能介入和精確預測預后的局限。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明公開
[0013]技術問題在這種背景下，作為研究可以通過精確預測胃癌預后并根據(jù)預測的預后確定適宜治療方向而提高胃癌患者存活率的結果，本發(fā)明人確定，可以通過鑒定用于預測胃癌預后的標記并且測量所述標記的表達水平來精確預測胃癌預后，以便完成本發(fā)明。
[0014]技術方案
[0015]本發(fā)明的目的是提供一種用于預測胃癌預后的標記，所述標記包括選自以下的一個或多種基因:C20orfl03、C0L10A1、MATN3、FM02、FOXSl、C0L8A1、THBS4、CDC25B、CDKl、CLIP4、LTB4R2、N0X4、TFDPl、ADRA2C、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNU LYN, MRGPRX3、ALASl、CASP8、CLYBL, CST2、HSPC159、MADCAMU MAF, REG3A、RNF152、UCHLl、ZBED5、GPNMB,HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBARl、CPSl、BCLllB 和 PCDHGA8 基因。
[0016]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預測胃癌預后的組合物，所述組合物包含用于測量用于預測胃癌預后標記的mRNA或蛋白質(zhì)表達水平的試劑。
[0017]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預測胃癌預后的試劑盒，所述試劑盒包含用于測量用于預測胃癌預后標記的mRNA或蛋白質(zhì)表達水平的試劑。
[0018]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預測胃癌預后的方法，所述方法包括a)獲得從胃癌患者采集的樣品中用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式；和b)比較從步驟a)所獲得的表達水平或表達模式與預后已知的胃癌患者中相應基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式。
[0019]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預測胃癌預后的方法，所述方法包括a)測量從胃癌患者采集的樣品中用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式，以獲得定量的表達值；b)將步驟a)中獲得的表達值應用于預后預測模型以獲得胃癌預后評分；和c)將步驟b)中獲得的胃癌預后評分與參比值比較以確定患者的預后。
[0020]有益效果
[0021]根據(jù)本發(fā)明，可以迅速和精確地預測胃癌預后，并且可以基于預測的預后確定適宜的治療，這具有有助于顯著減少由胃癌引起的死亡的優(yōu)點。尤其是，根據(jù)本發(fā)明，可以通過使用針對III期胃癌所開發(fā)的靶向療法大幅度提高存活率，因為Ib/II期胃癌患者當中已經(jīng)預測具有消極預后的患者顯示與III期胃癌患者相似的預后并且耐受現(xiàn)有的標準化療。
[0022]附圖簡述
[0023]圖1是顯示在使用參比基因基于分位數(shù)歸一化和自我標準化的多種風險之間關系的圖。
[0024]圖2代表根據(jù)C20orfl03、COLIOAI基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0025]圖3代表根據(jù)MATN3、FM02基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0026]圖4代表根據(jù)FOXSl、C0L8A1基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0027]圖5代表根據(jù)THBS4、ALASl基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0028]圖6代表根據(jù)CASP8、CLYBL基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0029]圖7代表根據(jù)CST2、HSPC159基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0030]圖8代表根據(jù)MADCAM1、MAF基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。[0031]圖9代表根據(jù)REG3A、RNF152基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0032]圖10代表根據(jù)UCHLl、ZBED5基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0033]圖11代表根據(jù)GPNMB、HIST1H2AJ基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0034]圖12代表根據(jù)RPL9、DPP6基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0035]圖13代表根據(jù)ARL10、ISLR2基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0036]圖14代表根據(jù)GPBARl、CPSl基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0037]圖15代表根據(jù)BCLlIB、PCDHGA8基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0038]圖2至圖15的P-值是借助高表達或低表達和基因表達水平劃分基因的表達水平并進行對數(shù)秩檢驗的結果值。
[0039]圖16是顯示積極預后組(低風險)或消極預后組(高風險)的無疾病存活率的Kaplan-Meier曲線，所述組根據(jù)使用表5中所列出基因的預后預測模型劃分。
[0040]圖17是顯示Ib/II期胃癌患者的無疾病存活率的Kaplan-Meier曲線，所述Ib/II期胃癌患者使用表5中所列出基因的預后預測模型劃分成積極預后組或消極預后組。
[0041]圖18是顯示積極 預后組(低風險)或消極預后組(高風險)的無疾病存活率的Kaplan-Meier曲線，所述組根據(jù)使用表7中所列出基因的預后預測模型劃分。圖18中的HR是累積性風險函數(shù)比，并且使用100個排列計算P-值。
[0042]圖19是通過劃分患者(高對低)后患者組的Kaplan-Meier曲線,其中根據(jù)使用表7中列出的基因并根據(jù)病理學分期(IB+II對III+IV)的預后預測模型將所述患者分類。通過雙側對數(shù)秩檢驗計算p_值。
[0043]圖20代表根據(jù)CDC25B、CDKl基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0044]圖21代表根據(jù)CLIP4、LTB4R2基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0045]圖22代表根據(jù)N0X4、TFDPl基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0046]圖23代表根據(jù)ADRA2C、CSK基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0047]圖24代表根據(jù)FZD9、GALRl基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0048]圖25代表根據(jù)GRM6、INSR基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0049]圖26代表根據(jù)LPHNl、LYN基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0050]圖27代表根據(jù)MRGPRX3基因的表達水平的Kaplan-Meier曲線。
[0051]圖20至圖27的P-值是借助高表達或低表達和基因表達水平劃分基因的表達水平并進行對數(shù)秩檢驗的結果值。
[0052]圖28代表在表10中列出的基因的GCPS的臨界值分析。最佳區(qū)分是將患者劃分為高風險組75%和低風險組25%的情況。
[0053]圖29代表基于表10中列出的基因的GCPS的優(yōu)化臨界值，在發(fā)現(xiàn)集合中的II期
胃癌患者的無疾病存活率。
[0054]圖30代表發(fā)現(xiàn)集合對驗證集合中表10中列出的基因的GCPS的分布，并且顯示發(fā)現(xiàn)集合中GCPS的分布與發(fā)現(xiàn)集合中GCPS的分布重合。這代表這種測定法的分析穩(wěn)健性。
[0055]圖31代表根據(jù)預定義算法GCPS和臨界值(紅色=高風險)的驗證隊列的無疾病存活率。
[0056]圖32代表II期胃癌患者的無疾病存活率，其中所述II期胃癌患者基于表11中列出的基因的GCPS接受手術和放射療法。藍顏色代表由GCPS定義的高風險。[0057]圖33代表II期胃癌患者的無疾病存活率，其中所述II期胃癌患者僅基于表11中列出的基因的GCPS接受手術。藍顏色代表由GCPS定義的高風險。
【具體實施方式】
[0058]優(yōu)選發(fā)明模式
[0059]作為實現(xiàn)目標的一個方面，本發(fā)明提供用于預測胃癌預后的標記，所述標記包括選自以下基因的一個或多種:C20orfl03、C0L10A1、MATN3、FM02、FOXSU C0L8A1、THBS4、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、N0X4、TFDPl、ADRA2C、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNl、LYN、MRGPRX3、ALASl、CASP8、CLYBL, CST2、HSPC159、MADCAMK MAF, REG3A、RNF152、UCHLl、ZBED5、GPNMB, HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBARl、CPSl、BCLllB 和 PCDHGA8 基因。
[0060]作為另一個方面，本發(fā)明提供一種用于預測胃癌預后的組合物，所述組合物包含用于測量用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平的試劑。
[0061]雖然處于相同病理學分期，但是每種胃癌的臨床預后是不同的，并且必須根據(jù)這種預后使用適宜的治療方法以便增加胃癌患者的存活率。因而，本發(fā)明提供一種用于預測胃癌預后的組合物，所述組合物包含用于預測胃癌預后的標記和用于測量其表達水平的試劑，以便精確預測被診斷患有胃癌的患者的預后并且基于預測的預后確定適宜治療方向，以增加胃癌患者的存活率。
[0062]如本文所用，術語“標記”指與生物學現(xiàn)象的存在定量或定性相關的分子，并且本發(fā)明的標記指作為預測胃癌患者存在良好或不良預后的基礎的基因。
[0063]本發(fā)明的標記具有用于預測胃癌預后的顯著低的P-值和高度可靠性，并且尤其，表5、7、10和11中列出的標記可以根據(jù)所述標記的表達水平，將患者組劃分成積極預后組或消極預后組，并且可以通過測量標記的表達水平精確地預測胃癌患者的預后，因為根據(jù)顯示這些組的存活率的Kapla n-Meier曲線，積極預后組的存活率高于消極預后組的存活率。
[0064]如本文所用，術語“預后”指關于醫(yī)學發(fā)展(例如，長期存活可能性、無疾病存活率等)的預期，包括積極預后或消極預后，所述消極預后包括疾病進展如復發(fā)，腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥死亡率(mortality)，并且積極預后包括疾病緩解如無疾病狀態(tài)，疾病改善如腫瘤消退或穩(wěn)定(stabilization)。
[0065]如本文所用，術語“預測”指關于醫(yī)學發(fā)展的猜測，并且出于本發(fā)明的目的，指猜測診斷為胃癌的患者的疾病發(fā)展(疾病進展、改善、胃癌復發(fā)、腫瘤生長、耐藥)。
[0066]在本發(fā)明的例子中，通過將診斷患有胃癌的患者劃分成積極預后組或消極預后組來預測胃癌患者的預后，并且另外，通過根據(jù)所述預后劃分診斷存在胃癌病理學分期的患者來預測胃癌患者的預后(實施例7至9)。
[0067]用于預測胃癌預后的標記可以優(yōu)選地是以下基因的組合:C20orfl03、C0L10A1、MATN3、FM02、FOXSU C0L8A1 和 THBS4 基因；以下基因的組合:ALASK C20orfl03、CASP8、CLYBL、C0L10A1、CST2、FM02、FOXSK HSPC159, MADCAMK MAF, REG3A、RNF152、THBS4、UCHLl、ZBED5、GPNMB, HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBARl、CPSl、BCLllB 和 PCDHGA8 基因；以下基因的組合:C20orfl03、CDC25B、CDKl、CLIP4、LTB4R2、MATN3、N0X4 和 Ti7DPl 基因；或以下基因的組合:ADRA2C、C20orf 103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHNU LYN,MATN3、MRGPRX3和N0X4基因；并且更優(yōu)選地是以下基因的組合:C20orf 103、CDC25B、CDKl、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4 和 TFDPl 基因，或以下基因的組合:ADRA2C、C20orf 103、CLIP4、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNU LYN, MATN3、MRGPRX3 和 N0X4 基因。
[0068]本發(fā)明人確定通過以下方法，以上基因可以精確地預測胃癌預后。本發(fā)明人從福爾馬林固定的石蠟包埋的胃癌腫瘤組織中提取RNA，使用提取的RNA和全基因組DASL測定試劑盒(Whole-Genome DASL assay kit)測量基因表達水平，并且隨后使用其中將基因表達水平作為連續(xù)變量處理的Cox比例風險模型(Cox proportional hazard model)進行標準統(tǒng)計分析(standard statistical analysis)。作為結果,鑒定到與無疾病存活率存在巨大相關性的、用于通過單變量分析(Univariate analysis)預測胃癌預后的369種基因(表2)，和用于預測病理學分期Ib/II胃癌預后的基因(表3)。隨后，通過對鑒定的基因的表達水平應用superPC算法，產(chǎn)生包含表5中基因的預后預測模型，并且根據(jù)這個預測模型，將胃癌患者劃分成積極預后組或消極預后組。通過顯示積極預后組的存活率高于消極預后組(實施例7和圖16、圖17), Kaplan-Meier曲線針對劃分組的結果驗證了使用本發(fā)明標記的預后預測模型的有效性和可靠性。此外，通過對鑒定的基因的表達水平應用梯度套索算法(gradient lasso algorithm)而產(chǎn)生的包含表7中基因的預后預測模型并且將胃癌患者劃分成積極預后組或消極預后組的結果確定這種分類與臨床結果重合(實施例8和圖18、圖19)。
[0069]如本文所用，術語“用于測量標記的表達水平的試劑”指可以用來確定標記基因或由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平的分子，并且可以優(yōu)選地是對對所述標記特異的抗體、引物或探針。
[0070]如本文所用，術語“抗體”是本領域已知的術語，指針對抗原性位點的特異性蛋白質(zhì)分子。出于本發(fā)明的目的，抗體指與本發(fā)明標記特異性結合的抗體并且可以通過常規(guī)方法從標記基因編碼的蛋白質(zhì) 中制備，其中通過以常規(guī)方式將每種基因克隆至表達載體中獲得所述蛋白質(zhì)。其中，包括可以從所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的部分肽。
[0071]如本文所用，術語“引物”指短核酸序列，作為具有短的游離3'末端羥基(游離3'羥基)的核酸序列，它可以與互補模板(template)形成堿基對(base pair)并充當復制模板的起點。在本發(fā)明中，可以通過以下方式預測胃癌預后:通過進行使用本發(fā)明的標記多核苷酸的有義和反義引物的PCR擴增，所需的產(chǎn)物是否產(chǎn)生。可以基于本領域已知內(nèi)容修改PCR條件和有義引物和反義引物的長度。
[0072]如本文所用，術語“探針”指短至幾個到長達數(shù)百堿基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以與mRNA建立特異性結合并且可以因維持標記(Labeling)作用而確定特定mRNA的存在。探針可以按寡核苷酸探針、單鏈DNA (single stranded DNA)探針、雙鏈DNA(double stranded DNA)探針和RNA探針等形式制備。在本發(fā)明中，可以通過使用本發(fā)明的標記多核苷酸及互補探針實施雜交，借助是否雜交來預測胃癌預后?？梢曰诒绢I域已知內(nèi)容修改對探針和雜交條件的恰當選擇。
[0073]本發(fā)明的引物或探針可以使用磷酰亞胺固相支持法或其他熟知方法化學合成。也可以使用本領域已知的許多手段修飾所述核酸序列。這些修飾的非限制性實例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一種或多種類似物進行的置換和在核苷酸之間的修飾，例如，修飾不帶電荷的連接體(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亞胺、氨基甲酸酯等)，或修飾帶電荷的連接體(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。
[0074]在本發(fā)明中，用于預測胃癌預后的標記的表達水平可以通過確定標記標記基因的mRNA或由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平來確定。
[0075]如本文所用，術語“測量mRNA的表達水平”指確定生物樣品中標記基因的mRNA存在及其表達水平以便預測胃癌預后的過程并且通過測量mRNA的量可實現(xiàn)。用于此目的分析方法是但不限于 RT-PCR、競爭性 RT-PCR(competitive RT-PCR)、實時 RT_PCR(Real-timeRT PCR)、RNA 酶保護測定法(RPA ;RNase protection assay)、northern 印跡法(northernblotting)、DNA微陣列芯片等。
[0076]如本文所用，術語“測量蛋白質(zhì)的表達水平”指確定生物樣品中標記基因內(nèi)表達的蛋白質(zhì)存在及其表達水平以便預測胃癌預后的過程，并且可以通過使用與上述基因中表達的蛋白質(zhì)特異性結合的抗體來確定蛋白質(zhì)的量。用于此目的分析方法是但不限于western印跡法(western blotting)、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)、放射性免疫測定(Radioimmunoassay)、放射性免疫擴散法(Radioimmunodiffusion)、奧克特洛尼(Ouchterlony )免疫擴散法、火箭(Rocket)電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀測定法(immunoprecipitation assay)、補體結合測定法(complete fixation assay)、FACS、蛋白質(zhì)芯片(protein chip)等。
[0077]作為另一個方面，本發(fā)明提供一種用于預測胃癌預后的試劑盒，所述試劑盒包含用于測量用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平的試劑。
[0078]本發(fā)明的試劑盒可以用于鑒定用于預測胃癌預后的標記的表達水平以便預測胃癌預后。
[0079]本發(fā)明的試劑盒可以是RT-PCR試劑盒、實時RT-PCR試劑盒、實時QRT-PCR試劑盒、微陣列芯片試劑盒或蛋白質(zhì)芯片試劑盒。
[0080]本發(fā)明的試劑盒可以不僅包含用于測量預測胃癌預后的標記的表達水平的引物、探針，或特異性識別所述標記的抗體，還包含適用于分析方法的一類或多類其他組分的組合物、溶液或裝置。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的例子，用于測量標記基因的mRNA的表達水平的試劑盒可以是包含進行RT-PCR所要求的必需要素的試劑盒。除了對標記基因特異的每對引物之外，這種RT-PCR試劑盒還可以包含試管或其他適宜容器、反應緩沖溶液、脫氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑和DEPC水(DEPC_water)以及無菌水。
[0082]根據(jù)本發(fā)明的另一個例子，用于測量標記基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平的試劑盒可以包含底物、適宜的緩沖溶液、以生色酶或熒光物質(zhì)標記的第二抗體和生色底物。
[0083]根據(jù)本發(fā)明的另一個例子，本發(fā)明中的試劑盒可以是用于檢測預測胃癌預后的標記的試劑盒，其包含為進行DNA微陣列芯片所要求的必需要素。DNA微陣列芯片試劑盒可以包含底物，其中作為探針的基因或與其片段相對應的cDNA與所述底物連接，并且所述底物可以包括定量性對照基因或與其片段相對應的cDNA。
[0084]作為另一個方面，本發(fā)明提供一種用于預測胃癌預后的方法，所述方法包括a)獲得從胃癌患者采集的樣品中用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式jPb)比較步驟a)中所獲得的表達水平或表達模式和預后已知的胃癌患者中相應基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式。
[0085]如本文所用，術語“從胃癌患者采集的樣品”可以是但不限于源自胃癌患者胃部的組織、細胞、全血、血清、血漿，并且優(yōu)選地是胃腫瘤組織。
[0086]如本文所用，術語“預后已知的胃癌患者”指在診斷為患有胃癌的患者當中其疾病進展已經(jīng)被揭示的患者，例如，因手術后3年內(nèi)復發(fā)而證實具有消極預后的患者或因手術后徹底治愈而證實具有積極預后的患者，并且可以通過從樣品獲得并且比較表達水平或表達模式精確預測待發(fā)現(xiàn)其預后的患者的預后，其中所述樣品從上述患者和待發(fā)現(xiàn)其預后的患者采集。
[0087]根據(jù)本發(fā)明的例子，可以通過以下方式預測預后:測量來自許多胃癌患者的標記基因的表達水平或表達模式，用所述患者的預后建立測量值的數(shù)據(jù)庫，并且將待發(fā)現(xiàn)其預后的患者的表達水平或表達模式輸入數(shù)據(jù)庫中。在這種情況下，已知的算法或統(tǒng)計分析程序可以用來比較表達水平或表達模式。此外，該數(shù)據(jù)庫可以進一步再劃分成病理學分期、接受的治療等。
[0088]根據(jù)本發(fā)明的例子，在步驟a)和b)中的胃癌患者是接受相同治療的患者，并所述治療可以是放射性療法、化療、化放療、輔助化療(adjuvant chemotherapy)、胃切除術、胃切除術后化療或化放療和輔助化療或手術后無放射性療法情況下的胃切除術。
[0089]根據(jù)本發(fā)明的例子，胃癌可以是Ib期或II期胃癌。
[0090]在本發(fā)明中，可以在mRNA或蛋白質(zhì)的水平測量標記基因的表達水平，并且可以使用公眾已知的方法從生物樣品分離mRNA或蛋白質(zhì)。
[0091]用于測量mRNA或 蛋白質(zhì)的水平的分析方法如上文所述。
[0092]借助以上分析方法，從預后已知的胃癌患者的樣品中測量的胃癌基因標記的表達水平可以與從待發(fā)現(xiàn)其預后的患者的樣品中測量的胃癌基因標記的表達水平相比較，并且可以通過確定所述表達水平的增加或減少而預測胃癌預后。換言之，如果通過比較表達水平的結果，待發(fā)現(xiàn)其預后的患者的樣品顯示與存在積極預后的胃癌患者的樣品相似的表達水平或表達模式，則可以確定具有積極預后，并且相反地，如果它顯示與存在消極預后的胃癌患者的樣品相似的表達水平或表達模式，則可以確定具有消極預后。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的例子，可以通過以下方式預測預后:將標記基因的表達水平與選自表4中列出的基因中的一個或多種基因的表達水平比較并歸一化，并且隨后使用歸一化(normalization)的表達水平。
[0094]作為另一個方面，本發(fā)明提供一種用于預測胃癌預后的方法，所述方法包括a)測量從胃癌患者采集的樣品中用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平以獲得定量的表達值；b)將步驟a)中獲得的表達值應用于預后預測模型以獲得胃癌預后評分；和c)將步驟b)中獲得的胃癌預后評分與參比值比較以確定患者的預后。
[0095]步驟a)是用于定量測量標記基因的表達水平的步驟?？梢允褂靡阎浖⒃噭┖泻拖到y(tǒng)來定量如上文所述的用于測量mRNA或蛋白質(zhì)水平的分析方法所測量的表達水平，獲得標記基因的定量表達值。根據(jù)本發(fā)明的例子，測量標記基因的表達水平可以使用nCounter分析試劑盒(NanoString Technologies)進行。在這種情況下,標記基因的表達水平可以通過與參比基因的表達水平比較而進行歸一化。根據(jù)本發(fā)明的例子，測量的標記基因表達水平可以通過與選自表4內(nèi)所列出的參比基因中的一個或多個參比基因的表達水平進行比較而歸一化。
[0096]根據(jù)本發(fā)明的例子，在步驟a)中，可以測量C20orfl03、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、N0X4 和 TFDPI 基因，或者 ADRA2C、C20orΠ03、CLIP4、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNl、LYN、MATN3、MRGPRX3和N0X4基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平。
[0097]步驟b)是將步驟a)中獲得的表達值應用于預后預測模型以獲得胃癌預后評分的步驟。
[0098]根據(jù)本發(fā)明的例子，這個預后預測模型可以表述為:
[0099][S= β !X1+...+ β ηχη]
[0100]其中，χη是第η個基因的定量表達值，
[0101]β η是第η個基因的Cox回歸估計值(Cox Regression estimate),并且
[0102]S代表胃癌預后評分。
[0103]步驟c)是將步驟b)中獲得的胃癌預后評分與參比值比較以確定患者預后的步驟。
[0104]可以將參比值確定為在多個胃癌預后評分分布中第三個四分位數(shù)(thirdquartile)的臨界值至第四個四分位數(shù)的臨界值的范圍內(nèi)的值，其中通過輸入來自多位胃癌患者的標記基因的表達值來獲得所述多個胃癌預后評分分布。此外，可以將參比值確定為在多個胃癌預后評分分布中第二個四分位數(shù)(Second quartile)的臨界值至第三個四分位數(shù)的臨界值的范圍內(nèi)的值，其中通過輸入來自多位胃癌患者的標記基因的表達值來獲得所述多個胃癌預后評分分布。優(yōu)選地 ，可以將參比值確定為在多個胃癌預后評分分布中第三個四分位數(shù)的臨界值至第四個四分位數(shù)的臨界值的范圍內(nèi)的值，其中通過輸入來自多位胃癌患者的標記基因的表達值來獲得所述多個胃癌預后評分分布。
[0105]四分位數(shù)的臨界值可以定義為在多位胃癌患者根據(jù)胃癌預后評分的尺度而分布時，與1/4、2/4、3/4和4/4點相對應的值。在這種情況下，第四個四分位數(shù)的臨界值可以是從患者所獲得的胃癌預后評分當中最大的評分。
[0106]根據(jù)本發(fā)明的一個例子，可以確定具有步驟b)中獲得的與參比值相同或較之更大的胃癌預后評分的病例具有消極預后。
[0107]根據(jù)本發(fā)明的一個例子，該臨界值可以是0.2205或-0.4478，并且可以確定具有步驟b)中獲得的與臨界值相同或較之更大的胃癌預后評分的病例具有消極預后。優(yōu)選地，如果在步驟 a)中測量 C20orfl03、CDC25B、CDKl、CLIP4，LTB4R2、MATN3、N0X4 和 TFDPl 基因的表達水平，則臨界值可以是0.2205，并且如果在步驟a)中測量ADRA2C、C20orf 103、CLIP4、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3 和 N0X4 基因的表達水平，則臨界值可以是-0.4478。
[0108]在本發(fā)明的一個例子中，通過應用梯度套索算法而產(chǎn)生包含表10和表11中基因的預后預測模型，并且通過比較胃癌預后值將胃癌患者劃分成積極預后組或消極預后組，其中通過輸入表達值和參比值至上式而獲得所述胃癌預后值。通過證實消極預后組(高風險)的存活率顯著低于積極預后組(低風險)(實施例9，和圖29、圖31、圖32)，針對劃分組的Kaplan-Meier曲線結果驗證了使用本發(fā)明標記的預后預測模型的有效性和可靠性。此外，根據(jù)以僅接受胃切除術的患者作為受試者而測量標記基因的表達水平所獲得的胃癌預后值劃分患者的結果確定了，通過證實消極預后組(高風險)的存活率顯著低，也可以用本發(fā)明的標記預測僅接受胃切除術的患者的預后(實施例9和圖33)。
[0109]因此，可以根據(jù)本發(fā)明精確地預測胃癌預后，并且可以獲得與預測的預后一致的適宜治療方案的益處。例如，可以確定對經(jīng)判定具有積極預后的患者進行標準療法或侵入性較小的治療選項，可以確定對經(jīng)判定具有消極預后的患者進行用于早期胃癌患者的治療方法或非常具有侵入性(invasive treatment)或?qū)嶒炐辕煼?。具體而言,對于經(jīng)診斷患有Ib或II期胃癌的患者，可以根據(jù)本發(fā)明預測的預后選擇適宜治療方法，因為這些患者可能顯示不同的預后。例如，用于III期胃癌患者的治療方法如手術或抗癌藥物可以用于經(jīng)診斷患有Ib或II期胃癌的患者中預測具有消極預后的患者。
[0110]發(fā)明方式
[0111]下文通過提供實施例更詳細地描述了本發(fā)明。然而，這些實施例僅意在說明，而不以任何方式限制要求保護的發(fā)明。
[0112]實施例1:胃癌患者的選擇
[0113]本研究在三星醫(yī)學中心(Samsung Medical Center)和三星癌癥研究所(SamsungCancer Research Institue)按照赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)而實施。本研究由三星醫(yī)學中心指導委員會批準。在1994年至2005年12月期間，1152位患者的隊列(cohort)根據(jù)以下標準選自1557位在5-FU/LV (INT-0116方案)輔助化療后準接受胃切除術的患者:
[0114]I)腺瘤組織學診斷，切除腫瘤，無殘余腫瘤，
[0115]2) D2 淋巴結清掃術(D21ymph node dissection),
[0116]3)年滿18歲的男性和女性，
[0117]4)根據(jù)AJCC (美 國癌癥聯(lián)合委員會)第6版，病理學分期Ib (T2bN0、TlNl或不是T2aN0)至 IV 期，
[0118]5)完整保留手術記錄和治療記錄，且根據(jù)以下方法接受5-氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸(5_f luorouraci 1/leucovorin)輔助化療(INT-0116方案)至少2次的患者。即，這樣的患者，其接受化放療(總計4500cGy輻射，每日180cGy，I周/5日，持續(xù)5周)，隨后施用5-氟尿嘧啶(400mg/m2/日)和甲酰四氫葉酸(20mg/m2/日)5日(I次)，和額外施用I次5-氟尿H密唳(400mg/m2/日)和甲酰四氫葉酸(20mg/m2/日)。
[0119]1557位患者組中有405位患者從本分析中排除，歸因于如下原因:
[0120]I)接受5-FU/LV輔助化療少于2次的患者(N=144)，
[0121]2)顯微鏡下存在陽性切緣(microscopically positive resection margin)的患者(N=73)，
[0122]3)雙重原發(fā)性癌癥(double primary cancer)患者(N=53),
[0123]4)胃次全切除術后殘余胃(remnant stomach)內(nèi)胃癌復發(fā)的患者(N=5),
[0124]5)無完整醫(yī)療記錄的患者(N=ll)，
[0125]6)使用非INT-0116方案的方案的患者(N=65)
[0126]7)其他(N=54)。
[0127]這項研究采用432位患者進行，其從1557位初步篩選的患者中二次篩查1152位患者后最終隨機篩選而來，并且表I中顯示了所述患者的醫(yī)學特征。432位患者根據(jù)胃癌病理分期的分類顯示了以下組成:1b期68位、II期167位、IIIA期111位、IIIB期19位和
【權利要求】
1.一種用于預測胃癌預后的標記，其包含選自以下基因的一種或多種:C20orfl03 (染色體20可讀框103)、C0L10A1 (X型膠原蛋白al)、MATN3 (母系蛋白3)、FM02 (含黃素的單加氧酶2)、F0XS1 (叉頭框蛋白SI)、⑶L8A1 (VIII型膠原蛋白a 1)、THBS4 (血小板應答蛋白4)、⑶C25B (細胞分裂蛋白25同源物B)、⑶Kl (細胞周期蛋白依賴性激酶I)、CLIP4(含有CAP-GLY結構域的接頭蛋白家族成員4)、LTB4R2 (白三烯B4受體2)、NOX4 (NADPH氧化酶4)、TFDP1 (轉(zhuǎn)錄因子Dp-1)、ADRA2C ( a-2C-腎上腺素能受體)、CSK (c_src酪氨酸激酶)、FZD9 (卷曲家族受體9)、GALRl (甘丙肽受體I )、GRM6 (谷氨酸受體促代謝型6)、INSR(胰島素受體)、LPHN1 (蛛毒素受體1)、LYN (v-yes-1 Yamaguchi肉瘤病毒相關癌基因同源物)、MRGPRX3 (MAS相關性GPR成員X3)、ALAS1 ( δ -氨基乙酰丙酸合酶I)、CASP8 (胱天蛋白酶8，凋亡相關性半胱氨酸肽酶)、CLYBL (類檸檬酸裂合酶i3)、CST2 (半胱氨酸蛋白酶抑制物SA)、HSPC159 (半乳糖苷結合樣凝集素)、MADCAM1 (粘膜血管地址素細胞黏附分子I)、MAF(v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物(禽))、REG3A (再生性胰島起源蛋白3 α )、RNF152(環(huán)指蛋白152)、UCHLl (遍在蛋白羧基端酯酶LI (遍在蛋白硫酯酶))、ZBED5 (含有BED型的鋅指蛋白5)、GPNMB (糖蛋白(跨膜)nmb)、HISTlH2AJ (組蛋白簇1，H2aj)、RPL9 (核糖體蛋白L9)、DPP6 (二肽基肽酶6)、ARLlO (ADP-核糖基化因子樣10)、ISLR2 (富含亮氨酸重復的免疫球蛋白超家族2)、GPBARl (G蛋白偶聯(lián)膽酸受體I)、CPSl (氨甲?；?磷酸合酶1)、BCL11B (B-細胞CLL/淋巴瘤IlB (鋅指蛋白))和K:DHGA8 (原鈣粘蛋白Y亞家族A8)基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的標記，其中所述標記是C20orfl03、C0L10A1、MATN3、FM02、FOXS1、COL8A1 和 THBS 4 基因。
3.根據(jù)權利要求1所述的標記，其中所述標記是ALAS1、C20orfl03、CASP8、CLYBL,C0L10A1、CST2、FM02、FOXSK HSPC159, MADCAMK MAF, REG3A、RNF152、THBS4、UCHLl、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBARl、CPSl、BCLllB 和 PCDHGA8 基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的標記，其中所述標記是C20orfl03、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、N0X4 和 TFDPl 基因。
5.根據(jù)權利要求1所述的標記、其中所述標記是ADRA2C、C20orfl03、CLIP4、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNl、LYN、MATN3、MRGPRX3 和 N0X4 基因。
6.根據(jù)權利要求1所述的標記，其中所述胃癌是Ib或II期胃癌。
7.一種用于預測胃癌預后的組合物，其包含用于測量根據(jù)權利要求1至6任一項所述的用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平的試劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的組合物，其中用于測量所述基因的mRNA表達水平的試劑是與所述基因特異性結合的引物對或探針。
9.根據(jù)權利要求7所述的組合物，其中用于測量所述蛋白質(zhì)表達水平的試劑是對所述基因編碼的蛋白質(zhì)特異的抗體。
10.一種用于預測胃癌預后的試劑盒，其包含用于測量根據(jù)權利要求1至6任一項所述的用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平的試劑。
11.一種用于預測胃癌預后的方法，其包括a)獲得從胃癌患者采集的樣品中根據(jù)權利要求I至6任一項所述的用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式jPb)比較步驟a)中獲得的表達水平或表達模式與預后已知的胃癌患者中相應基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述樣品是胃腫瘤組織。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中通過使用與所述基因特異性結合的引物對或探針測量所述基因的mRNA的表達水平并且通過使用對相應蛋白質(zhì)特異的抗體測量所述蛋白質(zhì)的表達水平。
14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中通過與選自表4中列出的參比基因的一個或多個參比基因的mRNA表達水平或由所述參比基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平比較，將所述基因的mRNA或由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平歸一化。
15.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中在步驟a)和b)中的胃癌患者是接受相同治療的患者，并所述治療選自放射性療法、化療、化放療、輔助化療、胃切除術、胃切除術后的化療或化放療，和輔助化療或手術后無放射性療法情況下的胃切除術。
16.一種用于預測胃癌預后的方法，包括a)測量從胃癌患者采集的樣品中根據(jù)權利要求I至6任一項所述的用于預測胃癌預后的標記的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平或表達模式，以獲得定量的表達值；b)將步驟a)中獲得的表達值應用于預后預測模型以獲得胃癌預后評分；和c)將步驟b)中獲得的胃癌預后評分與參比值比較以確定所述患者的預后。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中在步驟a)中測量C20orfl03、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、N0X4 和 TFDPl 基因；或 ADRA2C、C20orf 103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHNU LYN, MATN3、MRGPRX3 和 N0X4 基因的 mRNA 或蛋白質(zhì)的表達水平。
18.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中步驟b)中的預后預測模型表述為:
[S= & !X1+...+& nxn] 其中，Xn是第n位基因的定量表達值， 3 n是第n位基因的Cox回歸估計值，并且 S代表胃癌預后評分。
19.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中將步驟c)中的參比值定義為在胃癌預后評分分布中第三個四分位數(shù)臨界值至第四個四分位數(shù)臨界值范圍內(nèi)的值，所述胃癌預后評分根據(jù)下式從多位胃癌患者獲得:
[S= & !X1+...+& nxn] 其中，Xn是第n位基因的定量表達值， 3 n是第n位基因的Cox回歸估計值，并且 S代表胃癌預后評分。
20.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中將步驟c)中的參比值定義為在胃癌預后評分分布中第二個四分位數(shù)臨界值至第三個四分位數(shù)臨界值范圍內(nèi)的值，所述胃癌預后評分根據(jù)下式從多位胃癌患者獲得:
[S= & !X1+...+& nxn] 其中，Xn是第n位基因的定量表達值， 3 n是第n位基因的Cox回歸估計值，并且 S代表胃癌預后評分。
21.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中確定具有步驟b)中獲得的與所述參比值相同或較之更大的胃癌預后評分的病例具有消極預后。
22.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中第三個四分位數(shù)的臨界值是0.2205或-0.4478，并且確定具有步驟b)中獲得的與所述臨界值相同或較之更大的胃癌預后評分的病例具有消極預后。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中在步驟a)中測量C20orfl03、CDC25B、CDK1、CLIP4，LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDPl基因的表達水平的情況下，所述臨界值是0.2205。
24.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中在步驟a)中測量ADRA2C、C20orfl03、CLIP4、CSK、FZD9、GALRl、GRM6、INSR、LPHNU LYN, MATN3、MRGPRX3 和 N0X4 基因的表達水平的情況下，所述臨界值是-0.4478。`
【文檔編號】G06F17/10GK103459597SQ201180065578
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2011年12月13日 優(yōu)先權日:2010年12月13日
【發(fā)明者】白淳明, 金圣 , 姜元基, 李芝淵, 裴栽問, 孫太成, 盧載瀅, 崔珉奎, 樸英錫, 樸埈旿, 樸世勛, 林浩永, 丁信豪 申請人:社會福祉法人三星生命公益財團