一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：（1）采集人脂肪組織；（2）獲取和分離人脂肪干細(xì)胞；（3）干細(xì)胞培養(yǎng)；（4）檢測(cè)、凍存；（5）建庫(kù)。本發(fā)明采用D-Hanks平衡鹽液配制的含有Ⅰ型和Ⅵ型膠原酶的混合膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化，使得組織消化的更徹底，明顯降低雜細(xì)胞數(shù)量和除去組織塊；用含有10-15%胎牛血清、103-105U/mlLIF的MCDB-201培養(yǎng)液對(duì)分離后的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞增殖快、形態(tài)好，能有效抑制干細(xì)胞的分化，保證原代干細(xì)胞的特性，同時(shí)還能促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，以及保持自我更新及多向分化潛能等特點(diǎn)；將得到的干細(xì)胞建庫(kù)保存，保證了更為優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞來(lái)源。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種人脂肪干細(xì)胞的分罔培養(yǎng)方法和干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]干 細(xì)胞研究是近年來(lái)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點(diǎn)之一。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。通過(guò)研究他們的分化潛能，擴(kuò)增能力，分化后的細(xì)胞功能以及取材是否安全方便等問(wèn)題，選擇最合適的干細(xì)胞源來(lái)進(jìn)行組織細(xì)胞再生修復(fù)。人脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年來(lái)從人體脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞在特定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，同時(shí)具有較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，移植同種異基因ADSCs將不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和后期的排斥反應(yīng)，為ADSCs的同源異體移植提供了有利條件。此外，ADSCs來(lái)源廣泛，可以通過(guò)脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)從任何人體內(nèi)獲得，安全無(wú)痛苦，且在體外培養(yǎng)穩(wěn)定，擴(kuò)增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成為目前研究的新熱點(diǎn)，不論在再生醫(yī)學(xué)還是基因治療方面都具有重大的應(yīng)用潛力。
[0003]人們通過(guò)美容、肥胖過(guò)度或其他原因進(jìn)行的吸脂手術(shù)或脂肪切除術(shù)，不僅能夠?qū)⑹中g(shù)后廢棄的脂肪組織通過(guò)提取分離獲取所需的脂肪干細(xì)胞，達(dá)到治療各種疾病的目的，還能通過(guò)吸脂或脂肪切除達(dá)到減肥的效果。
[0004]中國(guó)專(zhuān)利ZL201010120944.4公開(kāi)了一種“人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法”，方便了人們有效儲(chǔ)存和使用脂肪干細(xì)胞資源，該專(zhuān)利中采用I型膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化，消化產(chǎn)物濾網(wǎng)過(guò)濾去除未消化組織塊，離心后用DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，最后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4-5天后換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后消化傳代；中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN201210018269.3針對(duì)現(xiàn)有的細(xì)胞分離方法作了進(jìn)一步的改進(jìn)，采用I型、II型和IV型的混合膠原酶進(jìn)行消化，該方法雖然使得消化效果有所提高，但不能夠完全去除組織塊和大量雜細(xì)胞；另外將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時(shí)，使用的培養(yǎng)液保存不太穩(wěn)定，細(xì)胞增殖較低，有一定分化，導(dǎo)致凍存的干細(xì)胞庫(kù)中細(xì)胞的純度仍受影響。
[0005]為克服上述技術(shù)的不足，我們?cè)趯?shí)際操作中更進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化了脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使得組織消化的更徹底，明顯降低雜細(xì)胞數(shù)量和除去組織塊，采用的培養(yǎng)基具有細(xì)胞增殖快、形態(tài)好，有效抑制干細(xì)胞的分化，保證原代干細(xì)胞的特性，同時(shí)還能促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，以及保持自我更新及多向分化潛能等特點(diǎn)，從而保證了更為優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞來(lái)源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服以上分離提取技術(shù)的不足，而提供的一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其具有操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細(xì)胞資源的特點(diǎn)。[0007]本發(fā)明提供的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，其采用D-Hanks平衡鹽溶液配制的混合膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化，所述混合膠原酶由I型膠原酶和IV型膠原酶組成。
[0008]所述混合膠原酶的1%母液配制方法為:100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.7gI型膠原酶、0.3g IV型膠原酶。
[0009]使用混合膠原酶消化脂肪組織時(shí)的終濃度為0.1%-0.2%(m/v)。優(yōu)選終濃度為
0.l%(m/v)。
[0010]消化得到的脂肪干細(xì)胞在含胎牛血清的MCDB-201培養(yǎng)液中培養(yǎng)1_2天后將原有培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后再次換新鮮培養(yǎng)液。
[0011]所述含胎牛血清的培養(yǎng)液中還含有LIF。
[0012]具體地說(shuō)，所述培養(yǎng)液是含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養(yǎng)液。
[0013]優(yōu)選地，培養(yǎng)液是含有12%胎牛血清、103U/ml LIF的MCDB-201培養(yǎng)液。
[0014]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0015]一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0016](I)采集人脂肪組織；
[0017](2)獲取和分離人脂肪干細(xì)胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見(jiàn)的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂`肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機(jī)中以1600-1800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復(fù)清洗，清洗下來(lái)的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；
[0018](3)干細(xì)胞培養(yǎng):將獲得的干細(xì)胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL含胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37°C、C02濃度5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1-2天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞；
[0019](4)檢測(cè)、凍存:檢測(cè)和凍存同時(shí)進(jìn)行，在細(xì)胞凍存過(guò)程中進(jìn)行免疫表型檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、生物學(xué)效力檢測(cè)、細(xì)胞分化能力檢測(cè)等以確定其是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，比例干細(xì)胞數(shù)/胎牛血清為1-2X106細(xì)胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內(nèi)混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內(nèi)；24小時(shí)后，按照編號(hào)放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長(zhǎng)期保存，待檢測(cè)結(jié)果出來(lái)之后，將檢測(cè)不合格的細(xì)胞按照其編號(hào)將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄。
[0020]所述步驟(1)中，人脂肪組織是人體吸脂手術(shù)中獲得的廢棄物，采集至人體腹部、大腿或皮下脂肪。
[0021]本發(fā)明的又一目的是提供上述人脂肪干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法。便于人們有效儲(chǔ)存和使用干細(xì)胞資源.[0022]構(gòu)建方法包括以下步驟:[0023](1)采集人脂肪組織；
[0024](2)獲取和分離人脂肪干細(xì)胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見(jiàn)的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的DHanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機(jī)中以1600-1800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復(fù)清洗，清洗下來(lái)的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；
[0025](3)干細(xì)胞培養(yǎng):將獲得的干細(xì)胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL 含有 10-15% 胎牛血清、103-105U/ml LIF 的 MCDB-201 培養(yǎng)液，置于 37°C、C02 濃度 5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1-2天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞；
[0026](4)檢測(cè)、凍存:檢測(cè)和凍存同時(shí)進(jìn)行，在細(xì)胞凍存過(guò)程中進(jìn)行免疫表型檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、生物學(xué)效力檢測(cè)、細(xì)胞分化能力檢測(cè)等以確定其是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，比例干細(xì)胞數(shù)/胎牛血清為1-2X106細(xì)胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內(nèi)混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內(nèi)；24小時(shí)后，按照編號(hào)放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長(zhǎng)期保存，待檢測(cè)結(jié)果出來(lái)之后，將檢測(cè)不合格的細(xì)胞按照其編號(hào)將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄；
[0027](5)建庫(kù):將獲得的每一份人脂肪干細(xì)胞按供者姓名、身份證號(hào)碼及存儲(chǔ)日期分別保存，建立每一份干細(xì)胞的詳細(xì)檔案的電腦數(shù)據(jù)庫(kù)，建立人脂肪干細(xì)胞庫(kù)。
[0028]以下通過(guò)試驗(yàn)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述分離培養(yǎng)方法的有益效果:
[0029]試驗(yàn)例1、人脂肪干細(xì)胞提取分離方法研究
[0030]將采集到的人脂肪組織分別采用以下方法進(jìn)行消化，研究消化液的組成和濃度對(duì)細(xì)胞分離的影響，然后將消化后的細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行記錄:
[0031]方法1、按照實(shí)施例1-3的分離培養(yǎng)方法，消化液母液是用100ml DHanks平衡鹽溶液中加入0.7g I型膠原酶、0.3g IV型膠原酶的方法獲得，選擇混合膠原酶的終濃度分別為 0.05%,0.1%、0.15%、0.2%、0.25% ；
[0032]方法2、按照專(zhuān)利ZL201010120944.4實(shí)施例1的方法，消化液為0.2%的I型膠原
酶磷酸鹽緩沖液，終濃度為0.1% ；
[0033]方法3、按照專(zhuān)利申請(qǐng)CN201210018269.3說(shuō)明書(shū)第2頁(yè)優(yōu)選實(shí)施方案的方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.5g I型膠原酶、0.25g II型膠原酶、
0.25g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15%-0.2% ；
[0034]方法4、按照實(shí)施例1-3的分離培養(yǎng)方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.6g I型膠原酶、0.4g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15% ；
[0035]方法5、按照實(shí)施例1-3的分離培養(yǎng)方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.5g I型膠原酶、0.5g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15% ；[0036]方法6、按照實(shí)施例1-3的分離培養(yǎng)方法，消化液母液是用100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.8g I型膠原酶、0.2g IV型膠原酶的方法獲得，混合膠原酶終濃度為0.15%。
[0037]對(duì)上述消化方法得到的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)P0-2代細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)觀察，結(jié)果如下表:
[0038]表1不同消化液對(duì)脂肪干細(xì)胞分離的影響
【權(quán)利要求】
1.一種人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集人脂肪組織； (2)獲取和分離人脂肪干細(xì)胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見(jiàn)的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機(jī)中以1600-1800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復(fù)清洗，清洗下來(lái)的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞； (3)干細(xì)胞培養(yǎng):將獲得的干細(xì)胞按照2-3XIOVcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL含胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37°C、C02濃度5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1-2天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞； (4)檢測(cè)、凍存:檢測(cè)和凍存同時(shí)進(jìn)行，在細(xì)胞凍存過(guò)程中進(jìn)行免疫表型檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、生物學(xué)效力檢測(cè)、細(xì)胞分化能力檢測(cè)等以確定其是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，比例干細(xì)胞數(shù)/胎牛血清為1-2 X IO6細(xì)胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和 冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內(nèi)混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內(nèi)；24小時(shí)后，按照編號(hào)放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長(zhǎng)期保存，待檢測(cè)結(jié)果出來(lái)之后，將檢測(cè)不合格的細(xì)胞按照其編號(hào)將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:人脂肪組織是人體吸脂手術(shù)或脂肪切除術(shù)中獲得的廢棄物，采集至人體腹部、大腿或皮下脂肪。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:混合膠原酶是以D-Hanks平衡鹽溶液配制的混合膠原酶，所述混合膠原酶由I型膠原酶和IV型膠原酶組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述混合膠原酶的1% (m/v)母液配制方法為:100ml D-Hanks平衡鹽溶液中加入0.7g I型膠原酶、0.3g IV型膠原酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:使用所述混合膠原酶消化脂肪組織時(shí)的終濃度為0.1%-0.2% (m/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述混合膠原酶消化脂肪組織時(shí)的終濃度為0.1% (m/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述含胎牛血清的培養(yǎng)液中還含有LIF。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7任一所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述培養(yǎng)液是含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養(yǎng)液。
9.如權(quán)利要求8所述的人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述培養(yǎng)液是含有12%胎牛血清、103U/ml LIF的MCDB-201培養(yǎng)液。
10.如權(quán)利要求1-8任一所述的人脂肪成體干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括: (1)采集人脂肪組織； (2)獲取和分離人脂肪干細(xì)胞:取采集的脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見(jiàn)的血管和纖維部分，剪碎成l_2mm3大小組織塊，用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液洗滌多次至洗出液清亮，去除殘留的血液，加入與脂肪組織等體積的0.2-0.4% (m/v)混合膠原酶，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化40-80分鐘，再置于離心機(jī)中以1600-1800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-10分鐘，去除表層脂肪，將底層細(xì)胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復(fù)清洗，清洗下來(lái)的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化組織，將濾液以1200轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞； (3)干細(xì)胞培養(yǎng):將獲得的干細(xì)胞按照2-3X IOVcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培養(yǎng)液，置于37°C、C02濃度5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2-3天后將原培養(yǎng)液吸棄，更換新鮮的含胎牛血清的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每1-2天更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化，按1:3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細(xì)胞； (4)檢測(cè)、凍存:檢測(cè)和凍存同時(shí)進(jìn)行，在細(xì)胞凍存過(guò)程中進(jìn)行免疫表型檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定、生物學(xué)效力檢測(cè)、細(xì)胞分化能力檢測(cè)等以確定其是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為:向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，比例干細(xì)胞數(shù)/胎牛血清為1-2X106細(xì)胞/0.9mL，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上編碼；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1:1比例加入到冷凍管內(nèi)混合，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入到-80° C冰箱內(nèi)；24小時(shí)后，按照編號(hào)放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長(zhǎng)期保存，待檢測(cè)結(jié)果出來(lái)之后，將檢測(cè)不合格的細(xì) 胞按照其編號(hào)將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄； (5)建庫(kù):將獲得的每一份人脂肪干細(xì)胞按供者姓名、身份證號(hào)碼及存儲(chǔ)日期分別保存，建立每一份干細(xì)胞的詳細(xì)檔案的電腦數(shù)據(jù)庫(kù)，建立人脂肪干細(xì)胞庫(kù)。
【文檔編號(hào)】G06F19/28GK103667187SQ201210336264
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】張芝庭 申請(qǐng)人:貴州神奇集團(tuán)控股有限公司