纖維化疾病的診斷方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及肝臟病學(xué)領(lǐng)域的新的診斷方法，其組合血清標(biāo)記物和肝臟彈性的測(cè)量。
【專利說(shuō)明】纖維化疾病的診斷方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肝臟病學(xué)領(lǐng)域新的診斷方法，以及在缺乏絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的情況下用于改進(jìn) 診斷測(cè)試的通用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在過(guò)去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了允許通過(guò)測(cè)量血清標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)肝臟疾病的不同 的診斷方法，其代替了肝活組織檢查。尤其是，人們可以引證W0 2002/016949所描述的 PibroTcst? (FT) (Biopredictive (巴黎，法國(guó)）銷售），和使用 Fibroscan? (Echosens (巴黎， 法國(guó)）銷售）測(cè)量肝硬度（LSM)。
[0003] 使用這些方法可以減少活組織檢查的數(shù)目，以前認(rèn)為活組織檢查是對(duì)肝病患者管 理所必須的，（尤其是感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus) (HCV)的患者），尤其是對(duì)纖 維化分期。肝活組織檢查的確是侵襲的步驟。
[0004] FibroTest? (FT),以及使用Fibroscan?的肝硬度測(cè)量（LSM)現(xiàn)在是在慢性丙型 肝炎（CHC)患者中用于纖維化分期的非侵入性評(píng)估的最有效的技術(shù)[1-3]。自從Castera 等[4]的第一個(gè)研究以來(lái)，一些研究已經(jīng)評(píng)價(jià)了 FT或其它生物標(biāo)記物與LSM之間的組合 [5-8]。這些研究沒有一個(gè)使用最合適的統(tǒng)計(jì)方法（考慮到適用率和范圍效應(yīng)（spectrum effect) [9-11])，以及假設(shè)肝活組織檢查不是完美的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的方法[9,12-13]。
[0005] 事實(shí)上，對(duì)纖維化的分期，相對(duì)于大外科手術(shù)活組織檢查，即使長(zhǎng)度為25mm的活 組織檢查標(biāo)本還具有大于20%的假陽(yáng)性或假陰性[13-15]。因此，診斷測(cè)試的精確度（靈 敏度、特異性和R0C曲線下面積[AUR0C])的傳統(tǒng)估計(jì)是錯(cuò)誤的[12]?；罱M織檢查的這個(gè)誤 差影響的大小是如此重要以至于AUR0C測(cè)定>0. 90不可能達(dá)到（即使對(duì)完美測(cè)量疾病的標(biāo) 記物[16])。
[0006] 這是提醒理想的"絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)"測(cè)試對(duì)該疾病的存在具有100%的靈敏度（其識(shí)別所 有有明確疾病進(jìn)程的個(gè)體；其不具有任何假陰性結(jié)果）并且100%的特異性（其不錯(cuò)誤地 將不具有病狀的人識(shí)別為有病狀；其不具有任何假陽(yáng)性結(jié)果）。
[0007] 靈敏度和特異性非常接近100%的一些絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試對(duì)一些疾病是存在的。作為 例子，特異于疾病決定因素的DNA或抗體檢測(cè)將表明所述疾病是存在的。靈敏度可能仍然 不能正好是100%，因?yàn)橐恍┗颊呖赡苡屑膊?，而DNA或抗體不能檢出（例如如果感染是近 期的）。
[0008] 診斷測(cè)試質(zhì)量可以通過(guò)繪制接收操作特征曲線（R0C)和測(cè)量接收操作特征曲線 下面積（AUR0C)確定。
[0009] 患者分類后，對(duì)不同閾值（從0到1)，根據(jù)診斷測(cè)試獲得的結(jié)果，R0C曲線通過(guò)靈 敏度對(duì)（1-特異性）繪制。
[0010] 對(duì)于絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，AUR0C是1或非常接近1。
[0011] 通常認(rèn)為其下面積的值大于0. 7的R0C曲線，對(duì)于診斷是良好的預(yù)測(cè)曲線。R0C曲 線不得不被公認(rèn)為允許預(yù)測(cè)診斷測(cè)試質(zhì)量的曲線。AUR0C最好盡可能的接近1，這個(gè)值描述 100 %特異的和敏感的測(cè)試。
[0012] 然而，如以上所指出，因肝活組織檢查不可以被認(rèn)為是肝纖維化的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)這 種疾病，非侵入性診斷方法不可能達(dá)到〇. 9以上。
[0013] 因此，考慮到在某些情況下，肝活組織檢查缺少可靠性，不斷改進(jìn)非入侵性診斷方 法是必要的。
[0014] 使用不使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的方法（"無(wú)絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的事實(shí)" [TAGS])，發(fā)明人觀察到單獨(dú) 進(jìn)行FT和LSM對(duì)肝硬化的診斷是相似的，并支持纖維化測(cè)試（FibroTest)對(duì)晚期纖維化的 診斷，使用標(biāo)準(zhǔn)的截點(diǎn)，其有更高的靈敏度。
[0015] 在本發(fā)明中，提出組合FT和LCM的新算法（彈力纖維化測(cè)試 (Elast〇Fibr 〇TeSt[E-FT]))，基于強(qiáng)的臨床標(biāo)準(zhǔn)，其使用改進(jìn)的F4分期定義（肝硬化）。應(yīng) 用TAGS方法評(píng)估新算法可能的好處。
[0016] 此外，對(duì)沒有絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)存在的疾病，發(fā)明人開發(fā)出一種可以改進(jìn)現(xiàn)存診斷測(cè)試的 方法。特別是，這個(gè)方法對(duì)其中患者可能呈現(xiàn)多種臨床分期（與疾病的發(fā)展有關(guān)）以及在 缺少絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的情況下根據(jù)所述臨床分期的患者分類是困難的疾病非常引人關(guān)注。
[0017] 特別是，這種改進(jìn)診斷測(cè)試的方法在以下情況中是有趣的，其中在疾病發(fā)展中具 有連續(xù)性，當(dāng)評(píng)價(jià)一個(gè)特定患者的疾病分期時(shí)，存在一定的不確定性。
[0018] 這是提醒所述診斷（或診斷的）方法包括
[0019] i.從患者收集信息的步驟
[0020] ii.相對(duì)閾值比較所述信息的步驟
[0021] iii.從患者信息和閾值間的不同推導(dǎo)患者是否有特異的疾病或患者疾病的分期 的步驟。
[0022] 作為說(shuō)明
[0023] i.可以從患者收集的信息可以直接收集自患者（如來(lái)自NMR、掃描、放射照相術(shù)、 對(duì)比度增強(qiáng)型計(jì)算機(jī)斷層掃描的圖像），或來(lái)自已經(jīng)從患者獲得的生物樣品（如尿、血液樣 品。信息可以存在（或不存在），以及特異性生物標(biāo)記物的水平，無(wú)論是特異于致病決 定因素（細(xì)菌或病毒DNA)，還是患者標(biāo)記物水平的升高
[0024] ii. -旦獲得信息，其與不同的值/標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，并且評(píng)估相對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)的偏 差。作為說(shuō)明，一些生物標(biāo)記物的水平應(yīng)該與通常在健康患者身上觀察到的水平和通常在 有疾病的患者身上觀察到的水平進(jìn)行比較?？赡艽嬖陂撝?，已超過(guò)閾值的患者的95%患有 疾病，而未超過(guò)閾值的患者的95%沒有疾病。對(duì)于多個(gè)臨床分期可以確定的疾病，這種閾值 可以分辨不同的分期。
[0025] iii.實(shí)際上，最后的步驟是進(jìn)行診斷，尤其是考慮從患者收集的信息，如上所述的 閾值。醫(yī)生還可以考慮其它的因素（如所收集信息的一致性等），來(lái)做出診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 因此，本發(fā)明涉及在缺少絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試時(shí)開發(fā)診斷特定健康狀態(tài)的診斷測(cè)試的方 法，包括：
[0027] a)在第一時(shí)間期間，在大量的患者上進(jìn)行一個(gè)現(xiàn)有的診斷測(cè)試并根據(jù)所述現(xiàn)有診 斷測(cè)試的結(jié)果將所述患者按疾病級(jí)別分類（對(duì)應(yīng)于疾病發(fā)展分期）
[0028] b)在第二時(shí)間期間，記錄所述患者發(fā)生的所有事件，其中所述事件與所述健康狀 態(tài)相關(guān)
[0029] c)為了識(shí)別在所述第一時(shí)間期間被錯(cuò)誤地分類的患者，所述第二時(shí)間期間后重新 評(píng)價(jià)患者分類
[0030] d)為了考慮在第一時(shí)間期間被錯(cuò)誤地分類的患者，修改所述現(xiàn)有診斷測(cè)試的參數(shù) (如要考慮的參數(shù)或?qū)τ趨?shù)的閾值），從而開發(fā)新的診斷測(cè)試，所述診斷測(cè)試相對(duì)于所述 現(xiàn)有診斷測(cè)試具有增加的靈敏度和/或靈敏度。
[0031] 因此，本發(fā)明涉及在缺少絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試時(shí)開發(fā)診斷特定健康狀態(tài)的診斷測(cè)試的方 法，包括：
[0032] a)在第一時(shí)間期間，在大量的患者上進(jìn)行多種現(xiàn)有診斷測(cè)試，并根據(jù)所述現(xiàn)有診 斷測(cè)試的結(jié)果將所述患者按疾病級(jí)別分類（對(duì)應(yīng)于疾病發(fā)展分期）
[0033] b)在第二時(shí)間期間，記錄所述患者發(fā)生的所有事件，其中所述事件是與所述健康 狀態(tài)相關(guān)
[0034] c)為了識(shí)別在所述第一時(shí)間期間被錯(cuò)誤地分類的患者，所述第二時(shí)間期間后重新 評(píng)價(jià)患者分類
[0035] d)組合所述現(xiàn)有診斷測(cè)試到新的診斷測(cè)試，其考慮在第一時(shí)間期間被錯(cuò)誤地分類 的患者，以及其相對(duì)于所述現(xiàn)有診斷測(cè)試呈現(xiàn)增加的靈敏度和/或靈敏度。
[0036] 尤其是，所述方法用于沒有絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)存在的疾病。
[0037] 它還可用于呈現(xiàn)疾病演變連續(xù)性的疾病。
[0038] 它還可用于呈現(xiàn)疾病演變的不同臨床分期的疾病。
[0039] 尤其是，本發(fā)明涉及開發(fā)針對(duì)肝纖維化診斷的體外診斷測(cè)試的方法，包括步驟：
[0040] 1)在第一時(shí)間期間，測(cè)量一大群患者的血液或血清中生物標(biāo)記物的濃度值，并且 為了獲得第一最終值，通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述值，
[0041] 2)任選地，為了獲得第二最終值，在所述患者上測(cè)量肝硬度
[0042] 3)根據(jù)所述現(xiàn)有診斷測(cè)試的結(jié)果，根據(jù)METAVIR得分將所述患者分類
[0043] 4)記錄在第二時(shí)間期間所述患者發(fā)生的事件，其中所述事件和肝臟疾病演變相關(guān)
[0044] 5)所述第二時(shí)間期間后，重新評(píng)價(jià)遭受所述事件的患者的分類，從而使得如果已 經(jīng)遭受所述事件的患者在步驟3)中被分類為METAVIR R)，F(xiàn)1，F(xiàn)2或F3,分類為METAVIR F4
[0045] 6)
[0046] a.為了得到修改的第一邏輯函數(shù)，修改步驟1的第一邏輯函數(shù)的參數(shù)，和/或
[0047] b.使用所述第一邏輯函數(shù)的第一最終值（是否根據(jù)a修改）和肝硬度測(cè)量后獲得 的第二最終值設(shè)計(jì)新的邏輯函數(shù)，
[0048] 從而開發(fā)對(duì)肝纖維化診斷具有增加的靈敏度和/或靈敏度的新的診斷測(cè)試。
[0049] 在如上所述的方法中，步驟1)和6. a)的邏輯函數(shù)通過(guò)如下獲得
[0050] i)根據(jù)他們疾病的延伸（尤其是根據(jù)用于步驟1)中第一邏輯函數(shù)的肝活組織檢 查獲得的METAVIR得分）、通過(guò)運(yùn)行第一邏輯函數(shù)獲得的METAVIR得分、以及重新評(píng)價(jià)步驟 6)中遭受不良事件的患者），將患者分類在不同小組中；
[0051] ii)通過(guò)一維分析識(shí)別這些組間顯著不同的因子；
[0052] iii)邏輯回歸分析評(píng)估用于纖維化和/或肝臟炎癥壞死損傷診斷的標(biāo)記物的獨(dú) 立判別值；
[0053] iv)通過(guò)組合這些已識(shí)別的獨(dú)立因子構(gòu)建新的邏輯函數(shù)，以及
[0054] 本領(lǐng)域已描述可以獲得邏輯函數(shù)的不同手段，其最終值是肝臟纖維化程度的 指征。特別是，人們可以引證W0 2002/016949,以及首次描述在W0 2002/016949 :W0 2010/149767, W0 2006/10357, WO 2006/082522, WO 2003/073822, W02011/039321, WO 2005/116901，WO 2010/058295, WO 2010/097472 中的方法的不同偏差。
[0055] 根據(jù)以上步驟1)，"大量的病人"的意思是多于50例患者，優(yōu)選多于100例患者， 優(yōu)選多于200例患者，更優(yōu)選多于500例患者。
[0056] 根據(jù)以上步驟4)，對(duì)每個(gè)患者，第二時(shí)間期間開始在步驟1)和任選地步驟2)已經(jīng) 執(zhí)行之后。第二時(shí)間期間持續(xù)（對(duì)每例患者）優(yōu)選多于1年，更優(yōu)選多于2年，更優(yōu)選多于 3年，更優(yōu)選多于大約5年。第二時(shí)間期間優(yōu)選少于6年。
[0057] 在步驟4)中記錄的不良事件是諸如肝臟相關(guān)死亡、肝臟移植、腹水史或內(nèi)窺鏡檢 查中存在食管靜脈曲張。在第二時(shí)間期間存在這些不良事件表明患者的METAVIR狀態(tài)是 F4。
[0058] 在步驟6. b)中，通過(guò)使用所述第一邏輯函數(shù)的最終值（是否根據(jù)a修改）和肝臟 硬度測(cè)量后獲得的第二最終值進(jìn)行邏輯回歸獲得邏輯函數(shù)。這個(gè)方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)并且 根據(jù)考慮的METAVIR分期（F2F3F4,或F4)可以獲得不同的函數(shù)。
[0059] 在步驟2)中，所述第二最終值可以是測(cè)量的肝硬度的對(duì)數(shù)值（Log也寫作L)。
[0060] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一邏輯函數(shù)是如下描述的Hbroicsl?。
[0061] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，尤其是通過(guò)如以下所描述的Fibroscan?測(cè)量肝硬度。
[0062] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟6. a)不進(jìn)行（即新的診斷測(cè)試是通過(guò)組合第一邏輯函 數(shù)和肝硬度測(cè)量開發(fā)，不修改第一邏輯函數(shù)。
[0063] 值得注意的是改進(jìn)肝硬化檢測(cè)（如以上所描述的方法可能將患者重新分類為肝 硬化，而他們起初不是按照這樣識(shí)別）導(dǎo)致全面的測(cè)試改進(jìn)，即使對(duì)在METAVIR分類中，被 分類為〈F4的患者的分類。
[0064] 發(fā)明人已經(jīng)應(yīng)用以上方法用于改進(jìn)肝纖維化、特別是肝硬化的體外診斷。
[0065] 如以上所示，活組織檢查不能被認(rèn)為是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，因活組織檢查可能不包含 所有興趣信息，并且因不同的病理學(xué)家看組織切片對(duì)纖維化發(fā)展分期可能有不同的解釋。 [0066] 肝纖維化根據(jù)METAVIR得分（F0,無(wú)損傷到F4,硬化）評(píng)價(jià)，其中呈現(xiàn)METAVIR得 分> F2的患者需要治療。
[0067] 發(fā)明人已經(jīng)在一群患者中進(jìn)行了Fibroiest?, Fibrosean?、肝活組織檢查?；颊咦?初根據(jù)獲自不同測(cè)試的結(jié)果分類。
[0068] 隨訪幾年后，評(píng)估不良事件（肝臟相關(guān)的死亡、或其他肝臟相關(guān)的事件）。這些事 件預(yù)計(jì)僅來(lái)自分類為METAVIR F4的患者。
[0069] 因此，最初考慮是F3或F2的患者可以重新分類為F4患者。
[0070] 發(fā)明人之后設(shè)計(jì)了組合Fibrotest?和Fibroscan?測(cè)試的函數(shù)。這個(gè)新函數(shù) (ElastoFibroTest?)對(duì)F4患者檢測(cè)比Flbrotest?.和Fibroscan?呈現(xiàn)更高的特異性和靈敏 度。
[0071] Fibrotest?組合五個(gè)標(biāo)記物：α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總膽紅素、 谷酰胺轉(zhuǎn)肽酶（GGT)，并根據(jù)性別和年齡調(diào)整。用于Fibroted?的算法按以下讀?。?4. 467 X Log ( α 2-巨球蛋白（g/1)) -1. 357 X Log (觸珠蛋白（g/Ι)) +1. 017 X Log (GGT (IU/ 1))+0·0281Χ 年齡（年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男=1)-5. 540。其來(lái)自法國(guó)巴黎援助醫(yī)院（Assistance Publiqueffipitaux de Paris),受美國(guó)和歐洲專利保護(hù)，并許可給生物預(yù)測(cè)公司（Biopredictive)。
[0072] 其在從患者獲得的生物樣品（血液或血清）上體外進(jìn)行。
[0073] Fibroscan?.通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量肝硬度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，單一的元件超 聲換能器安裝在振動(dòng)器的軸上。振動(dòng)存在于一段時(shí)間的正弦曲線（50Hz的頻率和2mm的 峰-峰振幅）。因此振動(dòng)僅持續(xù)20ms。振動(dòng)的傳播速度通過(guò)超聲換能器測(cè)量并取決于其穿 過(guò)的器官的硬度。獲得的測(cè)量用于定量肝臟的硬度：肝臟越硬（纖維化），振動(dòng)傳播越快。
[0074] 通常病人側(cè)臥位躺下，右臂最大外展，通過(guò)肋間隙對(duì)肝臟右葉進(jìn)行肝硬度測(cè)量 (LSM)。通過(guò)時(shí)間-運(yùn)動(dòng)超聲圖像輔助，操作員應(yīng)該定位至少6-cm厚和無(wú)大的血管結(jié)構(gòu)的 肝臟部分。當(dāng)靶區(qū)域定位時(shí)，操作員按下探頭按鈕開始測(cè)量。
[0075] 使用纖維掃描（FibroScan)的Μ探頭，測(cè)量深度在25和65mm之間。在每例患者 上進(jìn)行多個(gè)（通常10次左右）有效的測(cè)量。結(jié)果用千帕（kPa)表示。僅有效測(cè)量至少10 次，成功率至少60%和中值四分位差〈30%的步驟認(rèn)為是可靠的。
[0076] Castera 等（Gastroenterology2〇05 ;I28 :343_35〇)已經(jīng)描述組合使用 FT 和 LS 可以可靠地用于HCV-感染患者中纖維化的一線治療前評(píng)價(jià)，并且這可以避免在患有慢性 丙型肝炎的大多數(shù)患者中的LB檢查。在本申請(qǐng)中，組合的意圖是實(shí)施兩種方法并對(duì)比每種 方法的結(jié)果。
[0077] Vergniol 等（Gastroenterology2011 ; 140 :1970-1979)已經(jīng)描述延時(shí)隨訪的患 者，并評(píng)價(jià)Fibrotest?和Fibroscan?的預(yù)后能力。
[0078] 因而本發(fā)明涉及用于診斷患者肝硬化的體外方法，包括步驟：
[0079] a)測(cè)量所述患者的血清或血漿中的α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、 總膽紅素、谷酰胺-轉(zhuǎn)肽酶（GGT)的值，并通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述的值，包含 所述標(biāo)記物、所述患者的年齡和性別，其中所述第一邏輯函數(shù)是4. 467XLog(a 2-巨球 蛋白（g/l))_1.357XLog(觸珠蛋白（g/l))+1.017XL〇g(GGT(IU/l))+0.0281X 年齡 (年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男= 1)-5. 540,并獲得第一指數(shù)
[0080] b)對(duì)所述患者通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量肝硬度并獲得第二指數(shù)
[0081] c)為了獲得最終指數(shù)，用第二邏輯函數(shù)組合所述第一和第二指數(shù)，其中所述第二 邏輯函數(shù)是al+a2X [第一指數(shù)]+a3X [第二指數(shù)]其中所述al在-9. 27和-9. 07之間； a2在3. 08和3. 1之間；a3在5. 67和5. 87之間。
[0082] 在這個(gè)實(shí)施例中，第二邏輯命名為EFT-F4。
[0083] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二邏輯函數(shù)是-9. 1753+3. 0893X [第一指 數(shù)]+5. 7786 X [第二指數(shù)]。
[0084] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷患者晚期肝纖維化的體外方法，包括步驟：
[0085] a)測(cè)量所述患者的血清或血漿中α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總膽 紅素、谷酰胺-轉(zhuǎn)肽酶（GGT)的值，并通過(guò)所述標(biāo)記物第一邏輯函數(shù)組合所述的值，包 含所述的標(biāo)記物、所述患者的年齡和性別，其中所述第一邏輯函數(shù)是4. 467XLog(a 2-巨 球蛋白（g/1)) -1. 357 X Log (觸珠蛋白（g/1)) +1. 017 X Log (GGT (IU/1)) +0· 0281 X 年齡 (年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男= 1)-5. 540,并獲得第一指數(shù)
[0086] b)對(duì)所述患者通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量肝硬度并獲得第二指數(shù) [0087] c)為了獲得最終指數(shù)，通過(guò)第二邏輯函數(shù)（EFT-F2)組合所述第一和第二指數(shù)，其 中所述第二邏輯函數(shù)是bl+b2X [第一指數(shù)]+b3X [第二指數(shù)]，其中所述bl在2. 35和 2. 55之間；b2在2. 8和3之間；b3在2. 25和2. 45之間。
[0088] 在這個(gè)實(shí)施方案中，第二邏輯函數(shù)命名為EFT-F2。
[0089] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二邏輯函數(shù)是2. 4518+2. 8935X [第一指 數(shù)]+2. 3657 X [第二指數(shù)]。
[0090] 這個(gè)新的診斷測(cè)試對(duì)醫(yī)生是非常有價(jià)值的。事實(shí)上，使用EFT-F4函數(shù)可以提高肝 硬化的診斷，并比單獨(dú)使用FibroTcsl?、Fibroscan?或肝活組織檢查獲得更好的結(jié)果。這是 特別的重要，因?yàn)楦斡不颊撸∕ETAVIS F4)應(yīng)接受適當(dāng)?shù)闹委煛?br> [0091] 尤其是，相對(duì)于現(xiàn)有測(cè)試，發(fā)明人設(shè)計(jì)的新的算法EFT-F4,提高了檢測(cè)肝硬化的特 異性和靈敏度。
[0092] 尤其是，它預(yù)見醫(yī)生應(yīng)該：
[0093] i.從Fibrotest-- FibroscanR和 ElastoFibrotest?(EFT-F4)獲得數(shù)據(jù)
[0094] ii.如果對(duì)于F4其在閾值之上，使用EFT-F4的結(jié)果
[0095] iii. EFT-F4結(jié)果在閾值之下，使用Fibrotest1?數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)纖維化程度
[0096] 如圖1所示，當(dāng)Fibroscan?數(shù)據(jù)不可用時(shí)（大約20 %案例）醫(yī)生應(yīng)該僅使用 Fibrotest?結(jié)果，以及如果Fibrotest?結(jié)果不可應(yīng)用時(shí)僅使用Flbroscan?結(jié)果。如果兩個(gè)測(cè) 試都給出不可用的結(jié)果，應(yīng)該進(jìn)行肝活組織檢查或另外的有效的纖維化生物標(biāo)記物測(cè)試。
[0097] 因此，本發(fā)明涉及確定患者中肝臟纖維化水平的方法，其包括步驟：
[0098] a)為了獲得用于EFT-F4的函數(shù)（作為第二邏輯函數(shù)）的結(jié)果，進(jìn)行如上所描述的 方法
[0099] b)如果所述第二邏輯函數(shù)的結(jié)果高于或等于0. 25,患者評(píng)價(jià)為METAVIR F4分期 [0100] c)如果所述第二邏輯函數(shù)的結(jié)果低于〇. 25,使用Fribrotest?評(píng)價(jià)所述患者的纖維 化分期
[0101] 如果Fibrotcsl?結(jié)果是高于或等于0. 48,所述患者分配到"晚期纖維化"（METAVIR F2或F3)狀態(tài)，或以及如果Fibroicsi?結(jié)果是低于〇. 48,所述患者分配到"無(wú)或低纖維 化"（METAVIR R)或 F1)
[0102] 因而發(fā)明還涉及可用于確定患者肝纖維化水平的診斷方法中的方法，包括步驟：
[0103] a)測(cè)量所述患者的血清或血漿中的α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、 總膽紅素、谷酰胺-轉(zhuǎn)肽酶（GGT)的值，并通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述的值，包含所 述的標(biāo)記物、所述患者的年齡和性別，其中所述第一邏輯函數(shù)是4. 467XLog(a 2-巨球 蛋白（g/l))_1.357XLog(觸珠蛋白（g/l))+1.017XL〇g(GGT(IU/l))+0.0281X 年齡 (年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男= 1)-5. 540,并獲得第一指數(shù)
[0104] b)對(duì)所述患者通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量肝硬度并獲得第二指數(shù)
[0105] c)如果a)和b)的方法給出可解釋的結(jié)果，為了獲得最終指數(shù)，通過(guò)第二邏輯 函數(shù)組合所述第一和第二指數(shù)，其中所述第二邏輯函數(shù)是-9. 1753+3. 0893X [第一指 數(shù)]+5. 7786 X [第二指數(shù)]。
[0106] 所述方法可以完成診斷
[0107] 如果步驟c)已經(jīng)進(jìn)行，
[0108] 1)如果最終指數(shù)高于或等于0. 25,確定患者肝臟是METAVIR F4
[0109] 2)如果所述最終指數(shù)低于0. 25,使用第一指數(shù)確定所述患者的肝臟纖維化分期，
[0110] 如果步驟c)沒有執(zhí)行，（如果a)或b)的一個(gè)方法給出不可解釋的結(jié)果），為了確 定所述患者的肝臟纖維化水平，使用其他方法獲得的指數(shù)。
[0111] 以上兩種方法是體外方法。這兩種方法應(yīng)用于Rbrotes懷和/或Fibraseanf'給出 可解釋結(jié)果的患者中。
[0112] 本發(fā)明方法還可以用作疾病演變的預(yù)測(cè)手段。尤其是，當(dāng)患者感染丙型肝炎病毒， 其通?？梢源_定感染的日期（通常通過(guò)輸液）。因此，使用本發(fā)明的方法通過(guò)診斷日期確定 疾病演變的程度，還能夠允許疾病未來(lái)發(fā)展的預(yù)后。
[0113] 根據(jù)本發(fā)明的診斷方法獲得的數(shù)據(jù)還對(duì)醫(yī)生為病人選擇合適的治療方案（根據(jù) 疾病的分期）是非常有價(jià)值。
[0114] 在常規(guī)基礎(chǔ)上重復(fù)本發(fā)明的方法還可以確定治療的有效性。
[0115] 本發(fā)明的方法意圖用于患肝纖維化的患者，所述纖維化可以發(fā)展到肝硬化。特別 是，本發(fā)明的方法有利地用于對(duì)患者進(jìn)行肝臟纖維化檢測(cè)，所述患者患有的疾病包括乙型 和丙型肝炎、酒精中毒、血色素沉著、代謝疾病、糖尿病、肥胖、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁 性肝硬化、α-抗胰蛋白酶缺陷、威爾森氏病疾病。
[0116] 本發(fā)明的方法最好在感染了肝炎病毒的患者上進(jìn)行，特別是是丙型肝炎病毒。
[0117] 本發(fā)明還涉及診斷患者中肝纖維化和/或肝硬化的試劑盒，包含說(shuō)明書，其允許 在生物化學(xué)標(biāo)記物的劑量和肝臟硬度測(cè)量后，確定所述患者中肝臟纖維化和/或肝硬化損 傷的存在。
[0118] 說(shuō)明書包含用于生物化學(xué)標(biāo)記物的劑量確定后和為了合并Fibratest?和 Rbroscan?結(jié)果的兩個(gè)邏輯函數(shù)。它可以顯示為打印載體以及計(jì)算機(jī)可用的載體，如軟件。 說(shuō)明書還可以包含閾值和表格，所述閾值和表格允許根據(jù)在患者群體中纖維化的預(yù)期發(fā)生 率獲得預(yù)測(cè)值。
[0119] 以下實(shí)施例的旨在描述本發(fā)明的一個(gè)方面，但不應(yīng)該限于本發(fā)明。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0120] 圖1 :組合Fibrolesl?和LSM的算法的總結(jié)

【具體實(shí)施方式】
[0121] 實(shí)施例
[0122] 材料和方法
[0123] 方法
[0124] 患者
[0125] 使用包含1893例受試者的之前描述的整合數(shù)據(jù)庫(kù)[13]:三個(gè)具有CHC的患者群 (η = 1289)，以及一個(gè)顯然健康的志愿者群體（健康群，η = 604)。
[0126] 被收錄的患者必須有慢性丙型肝炎、是PCR陽(yáng)性、并有肝活組織檢查、纖維化測(cè)試 (FibroTest)、LSM的結(jié)果，所述結(jié)果按照通常使用的建議和注意事項(xiàng)可解釋。所有這些群 中，每個(gè)測(cè)試在不知道其它三個(gè)的情況下進(jìn)行。
[0127] 為了明確每項(xiàng)測(cè)試的特異性，分析了 604例無(wú)任何肝臟疾病危險(xiǎn)的健康志愿受試 者的組，因真正的晚期肝纖維化的概率是非常低的。
[0128] 包含標(biāo)準(zhǔn)是：無(wú)肝臟疾病史，無(wú)或低酒精消耗（女< 10g/天，男<20g/天），HBsAg 陰性，HCV抗體陰性，和Fibrotest?和LSM結(jié)果可解釋。由于不可能對(duì)這些健康志愿者進(jìn)行 肝活組織檢查，我們使用獲自四例無(wú)肝臟疾病的受試者的大外科手術(shù)活組織檢查。從全部 切片的數(shù)字化圖像，產(chǎn)生626個(gè)20mm長(zhǎng)的實(shí)質(zhì)上的活組織樣品[13]。
[0129] 獲得實(shí)質(zhì)上的活組織檢查
[0130] 因不可能在健康志愿者中進(jìn)行肝活組織檢查，大外科手術(shù)活組織檢查獲得自無(wú)肝 臟疾病史，F(xiàn)ibrotest?結(jié)果正常（范圍0· 13-0. 26)和LSM正常（范圍4. 4-5. 6kPa)的四例 患者（3男，1女，年齡范圍40-68歲）。
[0131] 在病理學(xué)單位內(nèi)，對(duì)每個(gè)外科手術(shù)樣品的全部切片染色。從全部切片的數(shù)字化圖 像（Aperio Scanner，TRIBVN，法國(guó)），產(chǎn)生長(zhǎng)度增加的實(shí)質(zhì)上的活組織檢查標(biāo)本。
[0132] 對(duì)本研究，評(píng)估了 626個(gè)20mm長(zhǎng)的活組織檢查標(biāo)本。有假陽(yáng)性發(fā)生率的每個(gè)這樣 的標(biāo)本之后隨機(jī)地分配到626個(gè)中的每個(gè)健康對(duì)照志愿者。
[0133] 晚期纖維化（METAVIR F2)分配到存在的纖維化區(qū)域多于樣品表面的>5. 3%的樣 品。
[0134] 肝硬化（METAVIR F4)分配到存在的纖維化區(qū)域多于樣品表面的>16. 5 %的樣品。
[0135] >5. 3%的閾值對(duì)應(yīng)于相當(dāng)于METAVIR F2分期的纖維化的平均面積的95%置信區(qū) 間的上限，以及>16. 5 %對(duì)應(yīng)于相當(dāng)于METAVIR F4分期的纖維化平均面積的95 %置信區(qū)間 的下限，在5例患有慢性丙型肝炎的患者中（2909個(gè)20mm長(zhǎng)的實(shí)質(zhì)上的活組織檢查），在大 外科手術(shù)標(biāo)本上獲得（P〇ynard2010)。這些閾值接近于Bedossa等（Hepatology2003)對(duì) F2和F4觀察的那些閾值。
[0136]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于診斷患者中肝硬化的體外方法，其包括步驟： a) 測(cè)量所述患者的血清或血漿中的α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總 膽紅素、谷酰胺-轉(zhuǎn)肽酶（GGT)的值，并通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述的值，包含所 述患者的所述標(biāo)記物、年齡和性別，其中所述第一邏輯函數(shù)是4. 467XLog(a 2-巨球 蛋白（g/l))_1.357XLog(觸珠蛋白（g/l))+1.017XL〇g(GGT(IU/l))+0.0281X 年齡 (年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男= 1)-5. 540,并獲得第一指數(shù) b) 通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量所述患者肝硬度并獲得第二指數(shù) c) 為了獲得最終指數(shù)，用第二邏輯函數(shù)組合所述第一和第二指數(shù)，其中所述第二邏輯 函數(shù)是al+a2 X [第一指數(shù)]+a3 X [第二指數(shù)]，其中所述al在-9. 27和-9. 07之間；a2在 3. 08和3. 1之間；a3在5. 67和5. 87之間。
2. -種用于診斷患者中晚期肝纖維化的體外方法，包括步驟： a) 測(cè)量所述患者的血清或血漿中的α 2-巨球蛋白、觸珠蛋白、載脂蛋白A1、總 膽紅素、谷酰胺-轉(zhuǎn)肽酶（GGT)的值，并通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述的值，包含所 述患者的所述標(biāo)記物、年齡和性別，其中所述第一邏輯函數(shù)是4. 467XLog(a 2-巨球 蛋白（g/l))_1.357XLog(觸珠蛋白（g/l))+1.017XL〇g(GGT(IU/l))+0.0281X 年齡 (年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο1/1))-1· 184XApoAl(g/l)+0.301X 性別（女=0,男= 1)-5. 540,并獲得第一指數(shù) b) 通過(guò)振動(dòng)控制的瞬時(shí)彈性成像測(cè)量所述患者肝硬度并獲得第二指數(shù) c) 為了獲得最終指數(shù)，用第二邏輯函數(shù)組合所述第一和第二指數(shù)，其中所述第二邏輯 函數(shù)是bl+b2X [第一指數(shù)]+b3X [第二指數(shù)]，其中所述bl在2. 35和2. 55之間；b2在 2. 8和3之間；b3在2. 25和2. 45之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二邏輯函數(shù)是-9. 1753+3. 0893X [第一指 數(shù)]+5. 7786 X [第二指數(shù)]。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二邏輯函數(shù)是2. 4518+2. 8935X [第一指 數(shù)]+2. 3657 X [第二指數(shù)]。
5. -種用于確定患者中肝纖維化水平的方法，包括步驟： a) 進(jìn)行權(quán)利要求1所述的方法 b) 如果第二邏輯函數(shù)的結(jié)果高于或等于0. 25,對(duì)患者評(píng)價(jià)為METAVIR F4分期 c) 如果第二邏輯函數(shù)的結(jié)果低于0. 25,使用rnbrohH結(jié)果評(píng)價(jià)所述患者的纖維化分 期。
6. -種用于開發(fā)用于肝纖維化診斷的體外診斷測(cè)試的方法，其包括步驟： 1) 在第一時(shí)間期間，在一大群患者上測(cè)量血液或血清中生物化學(xué)標(biāo)記物的濃度值，并 通過(guò)第一邏輯函數(shù)組合所述值以獲得第一最終值， 2) 可選地在所述患者上測(cè)量肝硬度以獲得第二最終值 3) 根據(jù)所述現(xiàn)有診斷測(cè)試的結(jié)果，根據(jù)METAVIR得分對(duì)所述患者進(jìn)行分類 4) 在第二時(shí)間期間，記錄所述患者發(fā)生的事件，其中所述事件和肝臟疾病演變相關(guān) 5) 所述第二時(shí)間期間后，重新評(píng)價(jià)遭受所述事件的患者的分類，從而如果他們?cè)诓襟E 3)中已經(jīng)被分類為METAVIR F0, Fl，F(xiàn)2或F3,將遭受所述事件的患者分類為METAVIR F4 6)a.為了產(chǎn)生修改的第一邏輯函數(shù)，修改步驟1的第一邏輯函數(shù)的參數(shù)，和/或 b.使用所述第一邏輯函數(shù)的第一最終值（是否根據(jù)a修改）和肝臟硬度測(cè)量后獲得的 第二最終值設(shè)計(jì)新的邏輯函數(shù) 從而產(chǎn)生新的診斷測(cè)試，其具有對(duì)肝臟纖維化診斷增加的靈敏度和/或靈敏度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一大群患者包含大于50例患者。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二時(shí)間期間持續(xù)（對(duì)每例患 者）多于1年并少于6年。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟4)中記錄的所述事件選自肝 臟相關(guān)死亡、肝臟移植、腹水發(fā)生和內(nèi)窺鏡檢查中存在食管靜脈曲張。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一邏輯函數(shù)是 Hbrolcst?,其算法是 4. 467 X Log ( α 2-巨球蛋白（g/1)) -1. 357 X Log (觸珠蛋白（g/ l))+1.017XLog(GGT(IU/l))+0.0281X 年齡（年）+1.737XLog(膽紅素（μπιο?/ 1))-1. 184XApoAl(g/l)+0. 301Χ 性別（女=0,男=1)-5. 540。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟2)中測(cè)量肝硬度。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中不進(jìn)行步驟6. a)。
【文檔編號(hào)】G06F19/00GK104094264SQ201280068253
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】T·普納德 申請(qǐng)人:法國(guó)公立援助醫(yī)院, 生物預(yù)測(cè)公司