一種以煙草花葉病毒rna解旋酶為靶標的抗病毒藥物虛擬篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標的抗煙草花葉病毒藥物的虛擬篩選方法，同時通過分子模擬軟件確定用于虛擬篩選的解旋酶結(jié)合ATP時的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)。該方法可用于具有防治煙草花葉病毒活性的化合物的快速篩選。
【專利說明】-種W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標的抗病毒藥物虛擬 篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物篩選方法，尤其涉及W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀點，利用分 子對接進行的新型抗煙草花葉病毒藥物的虛擬篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草花葉病毒（7b知CCO fflfwaic Fir"s, TMV)是一種典型的煙草花葉病毒屬 病毒，能感染^煙草為代表的一系列茄科植物，病征包括萎縮、壞死、葉片卷 曲W及葉片組織上深淺綠色混合的特征性的花斑圖案等。
[0003] 現(xiàn)有煙草花葉病的綜合防治措施包括選擇抗性品種、合理施服、煙草生長發(fā)育過 程中進行衛(wèi)生管理W及化學(xué)防治等。其中，化學(xué)防治手段大體可W分為天然源抗病毒劑和 化學(xué)合成抗病毒劑兩大類，其作用機制主要可W分為W下H類；（1)抑制病毒侵染宿主； (2)抑制病毒增殖和擴散；（3)誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性。而在醫(yī)藥抗病毒藥物方面，其藥物分 子設(shè)計與作用機制研究的焦點還包括了逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶、蛋白酶、解旋酶等病毒復(fù)制所必 須的功能蛋白。
[0004] TMV的RNA基因組含有四個開放讀碼框（open reading化ame, 0RF)，共編碼四個 蛋白，分別是126-kDa和183-kDa復(fù)制蛋白、30-kDa運動蛋白W及17. 5-kDa的外殼蛋白。 126-kDa的復(fù)制蛋白W-個玻巧終止密碼子（amber codon)UAG結(jié)束，該終止密碼子通讀為 酪氨酸時產(chǎn)生一個183-kDa的蛋白。126-kDa和183-kDa蛋白均含有甲基轉(zhuǎn)移酶W及解旋 酶結(jié)構(gòu)域，183-kDa蛋白的通讀部分則包含了一個典型的RNA依賴的RNA聚合酶基序。
[0005] 實驗證明，在缺乏解旋酶的情況下，病毒不能繼續(xù)侵染或破壞宿主細胞。近十幾年 來，W解旋酶作為抗病毒藥劑作用祀標已有一定的研究。常見的解旋酶抑制劑結(jié)構(gòu)主要包 括核巧類似物、聚苯、金屬離子馨合劑、黃麗、多環(huán)芳香族聚合物、香豆素等，根據(jù)其作用機 制又可W分為H類；（1)抑制解旋酶催化的ATP水解；（2)抑制解旋酶催化的核酸分離；（3) 擾亂解旋酶與寄主因子之間的相互作用。而截至目前，尚無W TMV解旋酶作為藥物作用祀 標的藥物分子設(shè)計或藥物作用機制研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是建立一種W TMV的RNA解旋酶為祀點的抗TMV藥物的虛擬篩選方 法，W豐富現(xiàn)有的篩選方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種確定TMV的RNA解旋酶與ATP結(jié)合時活性構(gòu)象的 H維結(jié)構(gòu)的方法。
[0008] 本發(fā)明利用先進的計算機技術(shù)，結(jié)合活體抗TMV治療活性測試方法，旨在發(fā)現(xiàn)能 有效結(jié)合TMV的RNA解旋酶的活性位點W抑制其ATP依賴的解旋酶活性的藥物，從而阻斷 TMV的復(fù)制進而達到防治煙草花葉病毒引起的多種植物病毒病。
[0009] 本發(fā)明提供一種W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標的抗病毒藥物的虛擬篩選方 法，其特征在于，包括w下步驟： (1) 通過分子模擬軟件確定解旋酶結(jié)合ATP時的活性構(gòu)象的H維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)； (2) 采用分子對接軟件，依據(jù)活性位點的氨基酸殘基，確定分子對接的活性中也，設(shè)定 活性口袋； (3) 對小分子配體進行篩選，建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫； (4) 根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分 子配體與活性口袋一一進行對接； (5) 根據(jù)對接結(jié)果的排序，進行綜合評價，初步確定具有抗煙草花葉病毒效果的候選 化合物。
[0010] 上述的虛擬篩選方法中，步驟（1)所述結(jié)合ATP的解旋酶的H維結(jié)構(gòu)通過W下步 驟確定： (1) 通過氨基酸序列比對得到已知H維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，采用分子模擬方法，同源模 建煙草花葉病毒RNA解旋酶H維結(jié)構(gòu)； (2) 對同源模建的煙草花葉病毒RNA解旋酶結(jié)構(gòu)進行分子動力學(xué)優(yōu)化； (3) 通過H維結(jié)構(gòu)比對，得到H維結(jié)構(gòu)類似的解旋酶與ATP復(fù)合物H維結(jié)構(gòu)，通過活 性位點氨基酸殘基疊合的方式，得到煙草花葉病毒RNA解旋酶與ATP結(jié)合的初始結(jié)構(gòu)； (4) 通過分子動力學(xué)優(yōu)化，得到解旋酶結(jié)合ATP時的活性構(gòu)象的H維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
[0011] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對接活性位點，可W是解旋酶 結(jié)合RNA或ATP的活性位點。
[0012] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對接活性位點，可W是解旋酶 的變構(gòu)中也。
[0013] 上述虛擬篩選方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子對接活性位點，可W是影響解 旋酶活性的其他氨基酸殘基。
[0014] 上述虛擬篩選方法，所述的小分子配體數(shù)據(jù)庫，可W是已有的免費或商用數(shù)據(jù) 庫； 上述虛擬篩選方法，所述的小分子配體數(shù)據(jù)庫，可W是個人自行建立的數(shù)據(jù)庫。
[0015] 按照上述的W煙草花葉病毒RNA解旋酶為祀標的抗病毒藥物的虛擬篩選方法，篩 選出的候選化合物作為防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用。
[0016] 按照上述的虛擬篩選方法篩選出的候選化合物在防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥 和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用，所指的候選化合物為心1，A-1和A-2。L-1的化學(xué)名稱為： (々-(((1-(6-氨基-9/^嘿嶺-9-取代）丙焼-2-取代氧代）甲基）磯醜基雙（氧代）雙 (亞甲基）異丙基二碳酸醋，A-1的化學(xué)名稱為；2-(2-(6-氯-9/^嘿嶺-9-取代）己氧 基-苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋，A-2的化學(xué)名稱為；2-(2-(2-氨基-9/^嘿嶺-9-取 代）己氧基-3-甲基苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋。結(jié)構(gòu)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標的抗病毒藥物的虛擬篩選方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 通過分子模擬軟件確定解旋酶結(jié)合三磷酸腺苷ATP時的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)； (2) 采用分子對接軟件，依據(jù)活性位點的氨基酸殘基，確定分子對接的活性中心，設(shè)定 活性口袋； (3) 對小分子配體進行篩選，建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫； (4) 根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分 子配體與活性口袋一一進行對接； (5) 根據(jù)對接結(jié)果的排序，進行綜合評價，初步確定具有抗煙草花葉病毒效果的候選 化合物。
2. 按照權(quán)利要求1所述一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標的抗病毒藥物的虛擬篩 選方法，其特征在于：步驟（1)所述解旋酶結(jié)合ATP時的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)通過以下步驟 確定： (1) 通過氨基酸序列比對得到已知三維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，采用分子模擬方法，同源模 建煙草花葉病毒RNA解旋酶三維結(jié)構(gòu)； (2) 對同源模建的煙草花葉病毒RNA解旋酶結(jié)構(gòu)進行分子動力學(xué)優(yōu)化； (3) 通過三維結(jié)構(gòu)比對，得到三維結(jié)構(gòu)類似的解旋酶與ATP復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，通過活 性位點氨基酸殘基疊合的方式，得到煙草花葉病毒RNA解旋酶與ATP結(jié)合的初始結(jié)構(gòu)； (4) 通過分子動力學(xué)優(yōu)化，得到解旋酶結(jié)合ATP時的活性構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的一種以煙草花葉病毒RNA解旋酶為靶標的抗病毒藥物的 虛擬篩選方法篩選出的候選化合物作為防治煙草花葉病毒的農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的虛擬篩選方法篩選出的候選化合物在防治煙草花葉病毒的 農(nóng)藥和農(nóng)藥添加劑中的應(yīng)用，其特征是所指的候選化合物為A-I和A-2，A-1的化學(xué)名稱為： 2-(2-(6-氯-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-苯甲酸（二乙氧基磷?；┘柞?，A-2的化學(xué) 名稱為2-(2-(2-氨基-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-3-甲基苯甲酸（二乙氧基磷?；┘?酯，結(jié)構(gòu)式如下 ：
【文檔編號】G06F19/16GK104504301SQ201410848300
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】楊松, 周青, 鄭玉濤, 葉意強, 趙遠超, 陳玉婷, 胡德禹, 薛偉, 吳志兵 申請人:貴州大學(xué)