專利名稱：滯留層析和蛋白質(zhì)芯片排列在生物學(xué)和醫(yī)藥上的應(yīng)用的制作方法
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背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及分離技術(shù)和分析生物化學(xué)。
本發(fā)明的方法可用于生物學(xué)或醫(yī)藥，包括分析基因功能，基因差異表達(dá)，蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞和臨床診斷，以及藥物篩選。
不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的基因(即基因功能)?；虻谋磉_(dá)有質(zhì)與量?jī)煞矫娴膬?nèi)容。即，細(xì)胞在所表達(dá)的特定基因和同一基因的相對(duì)表達(dá)量上都可能不同?；虻牟町惐磉_(dá)表現(xiàn)在，例如，基因編碼蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，或所表達(dá)蛋白翻譯后修飾的差異。例如，蛋白質(zhì)可以被糖基或磷酸基修飾，也可以通過(guò)肽剪切加工。所以，在生物化學(xué)水平上，細(xì)胞代表著有機(jī)生物分子的復(fù)雜混合物。
基因組學(xué)(genomics)(“蛋白組學(xué)(protomics)”)的目的之一是鑒定和描述由不同細(xì)胞差異表達(dá)的有機(jī)生物分子。通過(guò)比較表達(dá)情況可以鑒定出造成細(xì)胞特定病理活性的分子。例如，鑒定出只在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而不在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)可用于診斷，并最終用于藥物開(kāi)發(fā)和疾病治療。人類基因組計(jì)劃一旦完成，將完成人類全部基因的克隆，測(cè)序，并組織成數(shù)據(jù)庫(kù)。在這一“后基因組”世界，鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的能力將繼而使人能夠鑒定編碼它們的基因。這樣，將可用遺傳學(xué)來(lái)解決細(xì)胞功能問(wèn)題。
基因表達(dá)和功能的差異化學(xué)分析需要能夠分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物，即使它們以微量存在，并加以定量和鑒定的方法。但是，目前用于這一目的的分析化方法在上述各方面都有局限。一種常用的生物分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內(nèi)等電點(diǎn)聚焦先分離蛋白質(zhì)，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行第二次分離。結(jié)果得到一張根據(jù)等電點(diǎn)范圍(凈電荷)和大小(質(zhì)量)來(lái)區(qū)分蛋白質(zhì)的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項(xiàng)特征一質(zhì)量和等電點(diǎn)(pI)。其次，各維度(dimension)的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質(zhì)量差異小于5％或pI差異小于0.5的分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限；可能無(wú)法檢測(cè)出少量表達(dá)的生物分子。第四，無(wú)法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項(xiàng)，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據(jù)多種分析物/吸附劑相互作用來(lái)分離生物分子，但是作多緯度(multi-dimensional)分析卻困難而費(fèi)時(shí)。而且，該方法的靈敏度也很有限。
臨床診斷要求能夠特異性地檢測(cè)出疾病的已知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記或能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時(shí)間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。
藥物開(kāi)發(fā)要求迅速篩選出調(diào)節(jié)配體/受體相互作用的藥物。通常，這類篩選中的限速步驟是對(duì)配體/受體相互作用的檢測(cè)能力。所以，鑒定結(jié)合的迅速特異性方法將是該領(lǐng)域的一大進(jìn)展。
至今，從鑒定潛在標(biāo)記或配體/受體對(duì)的成員到產(chǎn)生藥物這一過(guò)程一直很難。在一種方法中，將正常組織與病理組織相比，鑒定在病理組織中mRNA的增加或減少或被表達(dá)的序列標(biāo)簽(“EST”)。用常規(guī)重組DNA法分離出這些序列并產(chǎn)生它們編碼的多肽。然后，將這些多肽分離出來(lái)用作免疫原提供標(biāo)記的特異性抗體。這些抗體可以用于例如ELISA試驗(yàn)中測(cè)定患者樣品中的標(biāo)記含量。
該方法費(fèi)時(shí)而費(fèi)事。產(chǎn)生所述抗體可能需要9個(gè)月到1年，其中許多時(shí)間耗費(fèi)在開(kāi)發(fā)能夠分離出足量多肽以用于免疫的方法上。而且，該方法寄希望于RNA表達(dá)的差異所表現(xiàn)的就是蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。但是，這一假設(shè)并不一定正確。所以，直接檢測(cè)被差異表達(dá)的蛋白并且能夠在明顯縮短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生特異性配體的方法將對(duì)該領(lǐng)域大有裨益。
所以，分析生物化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域所需要的是能夠分辨有機(jī)生物分子的復(fù)雜混合物，鑒定混合物中各生物分子并鑒定出涉及一種或多種靶分析物的特異性分子識(shí)別的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了進(jìn)行滯留層析的裝置和方法。滯留層析是一種組合方法，它使用多維度分離方法提供復(fù)雜混合物中分析物的高分辨信息。它為生物學(xué)和藥學(xué)提供了統(tǒng)一的分析物檢測(cè)和功能分析能力，其特征在于是一個(gè)直接檢測(cè)與基因功能、蛋白質(zhì)功能、細(xì)胞功能和生物體整體功能相關(guān)的分析物表達(dá)方式的單一完整操作系統(tǒng)。本發(fā)明內(nèi)容之一提供一種統(tǒng)一的操作系統(tǒng)，用于基因功能、蛋白質(zhì)功能、或整個(gè)大分子組功能、細(xì)胞功能和生物體整體功能的發(fā)現(xiàn)和診斷。
更具體的說(shuō)，可以多種兩維度形式分辨分析物，從而提供多維度信息。首先，根據(jù)分析物在至少兩種不同選擇性條件下吸附于固定相的能力(例如陰離子/陽(yáng)離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識(shí)別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質(zhì)譜)根據(jù)質(zhì)量在第二維度上分離分析物，進(jìn)一步檢測(cè)已分離的分析物。分析物所吸附的吸附劑的性質(zhì)提供了分析物的物理-化學(xué)信息。
所以，本發(fā)明提供了一種分子發(fā)現(xiàn)和診斷裝置，其特征在于具有并行和多路分析物處理能力。因?yàn)槭菍?duì)分析物的直接檢測(cè)，本發(fā)明能夠在一個(gè)操作單元中從同一循環(huán)(“circuit”)同時(shí)發(fā)出兩種或更多種靶分析物的信號(hào)(即，可定址的“芯片”位置)。
滯留層析與常規(guī)層析存在以下區(qū)別。首先，滯留層析中檢測(cè)的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規(guī)層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進(jìn)行檢測(cè)。在常規(guī)層析中沒(méi)有常規(guī)或方便的方法來(lái)檢測(cè)不從吸附劑上洗脫的分析物。所以，滯留層析提供了有關(guān)滯留分析物化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。第二，吸附層析與解吸譜檢測(cè)相結(jié)合提供了毫微微摩爾級(jí)的優(yōu)良靈敏度以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因?yàn)樵试S直接檢測(cè)分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供對(duì)樣品中分析物的快速多維度描述。第四，吸附劑可以于預(yù)先確定的排列、可定址位置附著于基質(zhì)上。這就能夠?qū)υ诓煌疵摋l件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點(diǎn)”)的分析物進(jìn)行并行處理。
滯留層析在生物學(xué)和藥學(xué)上具有諸多用途。其中包括組合在一起的分析物生物化學(xué)分離與純化，基因差異表達(dá)和分子識(shí)別的研究，診斷和藥物開(kāi)發(fā)。
滯留層析作為分析手段的一種基本用途包括樣品與不同吸附劑/洗脫劑組合接觸，檢測(cè)分析物在不同條件下的表現(xiàn)。這樣，既純化了分析物又確定了用于檢測(cè)樣品中某分析物的條件。帶有由此鑒定的吸附劑的基質(zhì)可用作某分析物或多種分析物的特異性檢測(cè)劑。在一種逐步提取法中，樣品與第一吸附劑/洗脫劑組合接觸并洗滌，去除了被第一吸附劑吸附的分析物再與第二吸附劑接觸，從中去除其它分析物。在制備性純化過(guò)程中也可以使用經(jīng)鑒定可滯留分析物的選擇性條件，此時(shí)，含有分析物的不純樣品依次接觸保留分析物的吸附劑，從而去除雜質(zhì)，再?gòu)奈絼┥鲜占瘻舻姆治鑫镞M(jìn)行下一輪。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一是，直接檢測(cè)以排列內(nèi)可定址位置上特定選擇性條件為特征的各類或各種分子識(shí)別的情況(例如靶吸附劑-靶分析物的相互作用)，同時(shí)，被結(jié)合的分子仍然位于(即，滯留在)可定址的位置上。也就是說(shuō)，直接的選擇和檢測(cè)不需要洗脫、回收、擴(kuò)增或標(biāo)記靶分析物。
本發(fā)明另一方面的內(nèi)容是，檢測(cè)可定址排列內(nèi)一處或多處的一種或多種分子識(shí)別情況只需取出或消耗吸附劑-分析物總量中很小的一部分。這樣，未用過(guò)的部分可以經(jīng)一種或多種原位(即在可定址位置內(nèi))“二次處理”進(jìn)一步測(cè)知其結(jié)構(gòu)和功能，包括進(jìn)一步的組裝或拆解，修飾，或(直接或間接)擴(kuò)增。
可以用一種被稱為“逐步分辨”的重復(fù)過(guò)程開(kāi)發(fā)對(duì)分析物的特異性提高的吸附劑，該過(guò)程中，用其它變量測(cè)試已知保留分析物的吸附劑或洗脫劑，由此鑒定具有更好結(jié)合特性的吸附劑于洗脫劑的組合。另一種方法則能夠迅速形成帶有分析物的特異性抗體吸附劑的基質(zhì)。該方法包括將分析物錨定于某吸附劑，在噬菌體展示文庫(kù)中篩選與分析物結(jié)合的噬菌體。
滯留層析還可以用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測(cè)系統(tǒng)所無(wú)法達(dá)到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細(xì)胞提取物中差異表達(dá)的蛋白質(zhì))。根據(jù)吸附劑/洗脫劑組合的化學(xué)特性測(cè)定包括分子量在內(nèi)的理化特征可以鑒定未知靶蛋白，而這一信息可用來(lái)在數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選具有類似特征的蛋白質(zhì)。
分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷方面的用途。更具體的說(shuō)，可以開(kāi)發(fā)出化學(xué)或生物特異性吸附劑以檢測(cè)重要的診斷標(biāo)記。在某實(shí)施例中，基質(zhì)可具有為診斷某疾病或綜合征所用標(biāo)記組合而選用的吸附位點(diǎn)排列。
滯留層析還可以用于藥物開(kāi)發(fā)。將受體/配體對(duì)的成員之一錨定于一種吸附劑，并在藥物存在下檢測(cè)其與結(jié)合伴侶結(jié)合的能力。因?yàn)槲阶饔玫臏y(cè)試很迅速，所以可方便地在藥物文庫(kù)中測(cè)試各藥物調(diào)節(jié)相互作用的能力。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一提供了高信息分辨樣品中至少一種分析物的方法。該方法是包括并行分離與檢測(cè)多個(gè)分析物在內(nèi)的組合型分離法。該方法包括的步驟有a)將分析物置于至少兩種不同的選擇性條件中，使得吸附劑能夠保留分析物，不同的選擇性條件由吸附劑與洗脫劑所成的組合確定；和b)在不同選擇性條件下通過(guò)解吸譜檢測(cè)滯留的分析物。不同選擇性條件下的滯留分析物檢測(cè)提供了分析物的高信息分辨。
在實(shí)施例之一中，各種不同的選擇性條件被確定在不同的預(yù)定可定址位置上，用于并行處理。在另一實(shí)施例中，所述的方法包括i)分析物與確切位置上的第一選擇性條件接觸，使得分析物被吸附劑保留；ii)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測(cè)滯留的分析物；iii)在確切位置上不同的第二選擇性條件下洗滌吸附劑，使得分析物滯留在吸附劑上；和iv)在第二選擇性條件下用解吸譜檢測(cè)滯留的分析物。
在另一實(shí)施例中，分析物是一種有機(jī)生物分子，多元分子復(fù)合物或大分子組。在另一實(shí)施例中，有機(jī)生物分子是酶、免疫球蛋白、細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體。
在另一實(shí)施例中，吸附劑包含陰離子、陽(yáng)離子、疏水作用吸附劑、多肽、核酸、糖、凝集素、染料、還原劑、烴或它們的組合。在另一實(shí)施例中，吸附劑結(jié)合在包含玻璃、陶瓷、磁性材料、有機(jī)聚合物、導(dǎo)電聚合物、天然生物聚合物、用有機(jī)物包被的金屬或非金屬的基質(zhì)上。在另一實(shí)施例中，吸附劑的形式是微乳液、膠乳、層或珠。在另一實(shí)施例中，基質(zhì)上的位置呈線形或正交排列。在另一實(shí)施例中，在分析物與選擇性條件接觸前，吸附劑在基質(zhì)上位于不同的位置。在另一實(shí)施例中，在分析物與選擇性條件接觸后，吸附劑在基質(zhì)上位于不同的位置。在另一實(shí)施例中，不同的選擇性條件包括不同的結(jié)合條件和不同的洗脫條件。
在另一實(shí)施例中，檢測(cè)步驟包括用激光解吸質(zhì)譜測(cè)定分析物的質(zhì)量。
在另一實(shí)施例中，所選的選擇性條件盡可能優(yōu)化吸附劑對(duì)分析物的保留。在另一實(shí)施例中，所述的至少一種分析物多余一種。在另一實(shí)施例中，多種選擇性條件的吸附劑不同而洗脫劑相同。
另一實(shí)施例還包括一步提供在可定址位置上包含吸附劑的基質(zhì)，各吸附劑是經(jīng)鑒定可保留分析物的選擇性條件中的吸附劑。在另一實(shí)施例中，洗脫條件的差異在于pH、緩沖能力、離子強(qiáng)度、水結(jié)構(gòu)特征、除垢劑種類、除垢劑強(qiáng)度、疏水性或介電常數(shù)。在另一實(shí)施例中，多種選擇性條件中的洗脫劑相同。
本發(fā)明另一實(shí)施例提供從樣品中順次抽提分析物的方法。這是一種適合對(duì)多種分析物并行的組合型連續(xù)分離純化法。該方法包括a)將含分析物的樣品與第一選擇性條件接觸，使得分析物被第一吸附劑保留并產(chǎn)生非滯留樣品；b)收集含分析物的非滯留樣品，將非滯留樣品與第二選擇性條件接觸，使得分析物被第二吸附劑保留并產(chǎn)生非滯留樣品；c)在不同選擇性條件下用解吸譜檢測(cè)滯留分析物。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種解吸譜用基質(zhì)，它包含結(jié)合特征沿單軸線或多軸線梯度變化的吸附劑。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種逐步鑒定選擇性條件的方法，該條件對(duì)樣品中的某種分析物具有更高的分辨率。該方法包括(a)如下鑒定保留樣品中一種分析物的選擇性條件i)將樣品與一組選擇性條件接觸，各選擇性條件具有至少一種結(jié)合特性和至少一種洗脫特性；ii)用解吸譜檢測(cè)各選擇性條件下被滯留的分析物；iii)鑒定保留該分析物的選擇性條件；和(b)鑒定對(duì)分析物具有更高分辨率的選擇性條件i)從已鑒定出的選擇性條件中選取至少一種結(jié)合特性或洗脫特性，將它加入選擇特征常數(shù)組；ii)將樣品與一組經(jīng)修飾的選擇性條件組接觸，該修飾組中的各選擇性條件包含(1)常數(shù)組中的選擇特征和(2)常數(shù)組所沒(méi)有的結(jié)合特性或洗脫特性；和iii)用解吸譜法從修飾組中鑒定出與先前鑒定的選擇性條件相比以更高的分辨率保留分析物的選擇性條件。實(shí)施例之一中重復(fù)步驟(b)至少一次。另一實(shí)施例重復(fù)步驟(b)直到鑒定出只保留樣品中靶分析物的選擇性條件。
本發(fā)明的另一方面提供用于解吸譜法的基質(zhì)，包含經(jīng)鑒定可逐步分辨分析物的選擇性條件中的吸附劑。實(shí)施例之一中，吸附劑來(lái)自一試劑盒，該試劑盒還包含選擇性條件中的洗脫劑或如何將洗脫劑與吸附劑結(jié)合使用的說(shuō)明書。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種從不純樣品中制備性純化分析物的方法。該方法包括a)在多種不同選擇性條件下將樣品與基質(zhì)接觸；用解吸譜法檢測(cè)不同條件下滯留的分析物；鑒定使得分析物被保留的選擇性條件；b)對(duì)鑒定出的多種不同選擇性條件順次重復(fù)以下步驟以純化分析物i)在鑒定出的條件下將樣品與吸附劑接觸使得分析物被吸附劑保留；ii)將分析物與不被基質(zhì)保留的雜質(zhì)分離；和iii)從吸附劑上收集分析物。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種制備用于檢測(cè)樣品中至少一種分析物的基質(zhì)的方法。該方法是用于設(shè)計(jì)和鑒定分析物特異性吸附劑的組合型方法。它可以用于檢測(cè)靶分析物。該方法包括a)將樣品與至少兩種不同的選擇性條件接觸使得分析物被吸附劑保留，各選擇性條件定義為不同的吸附劑與洗脫劑組合；b)用解吸譜法鑒定至少一種使得分析物被保留的選擇性條件；和c)制備包含至少一種所鑒定的選擇性條件的吸附劑。在實(shí)施例之一中，鑒定步驟包括鑒定至少一種使得多種分析物被保留的選擇性條件。另一實(shí)施例中的制備步驟包括制備包含多種吸附劑的作為多元吸附劑的基質(zhì)的方法，所述的吸附劑可在同一洗脫條件下保留分析物。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供診斷以至少一種診斷標(biāo)記為特征的疾病的方法。這是一種用于同時(shí)檢測(cè)多種診斷標(biāo)記的組合型方法。該方法包括a)提供用于解吸譜法的基質(zhì)，該基質(zhì)包含至少一個(gè)可定址的位置，每個(gè)可定址的位置包含在某種洗脫條件下至少分辨一種診斷標(biāo)記的吸附劑；b)在洗脫條件下將基質(zhì)與來(lái)自患者的生物樣品接觸使得診斷標(biāo)記滯留；和c)用解吸譜法檢測(cè)滯留的生物標(biāo)記。檢測(cè)滯留的檢測(cè)標(biāo)記即是對(duì)疾病的診斷。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容提供一種用于檢測(cè)樣品中某分析物的試劑盒，它包括(1)用于解吸譜法的基質(zhì)，它包含至少一個(gè)可定址的位置，每個(gè)可定址的位置上包含在由吸附劑和洗脫劑構(gòu)成的選擇性條件下分辨分析物的吸附劑；和2)將樣品與選擇性條件接觸的洗脫劑或說(shuō)明書。在實(shí)施例之一中，試劑盒的特征在于有多種診斷標(biāo)記，并且，基質(zhì)包含多個(gè)可定址位置，每個(gè)可定址位置包含分辨至少一種診斷標(biāo)記的吸附劑。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供用于解吸譜法的基質(zhì)盒，它包含可定址位置上的至少一種吸附劑，這至少一種吸附劑可分辨患者樣品中某種病理狀態(tài)的多種診斷標(biāo)記。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供選擇某蛋白分析物候選特征的方法。該方法是根據(jù)至少兩種理化特征鑒定蛋白質(zhì)的組合型方法。該方法包括a)測(cè)定一組說(shuō)明樣品中某蛋白分析物的至少第一和第二理化特征的匹配參數(shù)的數(shù)據(jù)，這是通過(guò)i)將分析物置于不同的選擇性條件中，由鑒別蛋白分析物某理化特征的引力基礎(chǔ)介導(dǎo)分析物被基質(zhì)所吸附；和ii)在不同選擇性條件下用解吸譜法檢測(cè)滯留的分析物；和b)在可編程計(jì)算機(jī)中運(yùn)行以下步驟i)訪問(wèn)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)中參比多肽組中的每一成員都具有說(shuō)明參比多肽至少第一和第二理化特征的一組數(shù)據(jù)；ii)輸入說(shuō)明該蛋白分析物理化特征的數(shù)據(jù)組；iii)從數(shù)據(jù)庫(kù)中選出數(shù)據(jù)組在匹配參數(shù)內(nèi)的參比多肽。選出的參比多肽提供了蛋白分析物的候選特征。沒(méi)有被選出的參比多肽無(wú)此候選特征。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種順次保留分析物的方法。該方法是檢測(cè)多元大分子或超分子組裝的方法。它通過(guò)對(duì)分子識(shí)別的干擾用作藥物開(kāi)發(fā)的方法。該方法包括a)將第一樣品與最初吸附劑和洗脫劑接觸使得第一分析物被吸附劑保留，并用解吸譜法檢測(cè)被吸附的分析物，滯留的第一分析物由此變成第二吸附劑；b)將第二樣品與第二吸附劑和洗脫劑接觸使得第二分析物被第二吸附劑保留，用解吸譜法檢測(cè)被吸附的第二分析物，滯留的第二分析物由此變成第三吸附劑。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種檢測(cè)樣品中的酶的方法。該方法包括a)提供包含吸附劑和與該吸附劑結(jié)合的酶底物的固相，酶對(duì)酶底物的活性產(chǎn)生具有特征性分子量的產(chǎn)物；b)將底物與樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測(cè)產(chǎn)物。檢測(cè)產(chǎn)物就是檢測(cè)酶。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供一種確定某分析物在第一和第二樣品中是否差異存在(例如差異表達(dá))的方法。該方法可以用于通過(guò)差異蛋白質(zhì)展示檢測(cè)差異基因表達(dá)的組合方法。該方法包括a)測(cè)定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；b)測(cè)定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和c)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在。
該方法的實(shí)施例之一是測(cè)定某種蛋白是否在兩種不同細(xì)胞，包含細(xì)胞的第一和第二樣品或來(lái)自細(xì)胞的材料中差異表達(dá)。該方法的另一實(shí)施例是測(cè)定某種藥物是否改變生物樣品中某蛋白質(zhì)的表達(dá)，這還包括將藥物用于第一生物樣品但不用于第二生物樣品的步驟。在另一實(shí)施例中，第一生物樣品來(lái)自健康者，第二生物樣品來(lái)自某種病癥的患者。樣品可選自例如血液、尿液、血清和組織。以在患者樣品中增加的分析物作為候選診斷標(biāo)記。通常，確認(rèn)一種診斷標(biāo)記需在多個(gè)受試者中檢測(cè)到該標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供鑒定某受體的配體的方法。該方法包括a)提供包含結(jié)合受體的吸附劑的基質(zhì)；b)在允許受體與配體之間發(fā)生結(jié)合的條件下將被結(jié)合的受體與含配體的樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測(cè)被結(jié)合的配體。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供用于測(cè)定藥物是否調(diào)節(jié)靶分析物與某吸附劑之間的結(jié)合的篩選方法。這是一種用于藥物開(kāi)發(fā)的組合型方法。該方法包括a)提供包含靶分析物在洗脫條件下與之結(jié)合的吸附劑的基質(zhì)；b)在允許靶分析物與吸附劑相互結(jié)合的洗脫條件下將基質(zhì)與靶分析物和藥物接觸；c)用解吸譜法定量檢測(cè)靶分析物與吸附劑之間的結(jié)合；和d)確定測(cè)得的量是否與對(duì)照結(jié)合量不同，在對(duì)照中，基質(zhì)在不含藥物的洗脫條件下與靶分析物接觸。測(cè)得量與對(duì)照量之間的差異說(shuō)明藥物調(diào)節(jié)了結(jié)合作用。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一提供一種檢測(cè)基因組件(genetic package)的方法，基因組件中包含一段編碼特異性結(jié)合靶吸附劑的多肽的聚核苷酸。就某一方面而言，這是一種用于從展示文庫(kù)中挑選出分析物的特異性噬菌體的組合型方法，包括使用通過(guò)測(cè)定滯留圖而分離得到的靶蛋白或在原位通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的靶蛋白。該方法包括a)提供包含靶吸附劑的基質(zhì)；b)提供包含多種不同基因組件的展示文庫(kù)，不同的基因組件各自包含一段所含核酸序列編碼某種多肽的聚核苷酸，而且，不同的基因組件各自具有展示所編碼多肽的表面；c)在允許多肽與靶吸附劑特異性結(jié)合的洗脫條件下將基質(zhì)與展示文庫(kù)接觸，使得含有多肽的基因組件滯留在基質(zhì)上；和d)用解吸譜法檢測(cè)滯留在基質(zhì)上的基因組件。
該方法的實(shí)施例之一中，展示文庫(kù)是噬菌體文庫(kù)。另一實(shí)施例中，噬菌體是M13。另一實(shí)施例中，多肽是單鏈抗體。另一實(shí)施例中，靶分析物是在不同表型的細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的多肽分析物。另一實(shí)施例中，基質(zhì)包含細(xì)胞或細(xì)胞膜。
實(shí)施例之一中，提供靶吸附劑的步驟包括i)提供包含吸附劑的基質(zhì)，所述的吸附劑在某種洗脫條件下保留靶分析物；和ii)在允許靶分析物被吸附劑保留的洗脫條件下將吸附劑與靶分析物接觸，靶分析物由此變成靶吸附劑。在實(shí)施例之一中，靶分析物是靶多肽，步驟ii)接觸吸附劑包括通過(guò)體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸在吸附劑上原位產(chǎn)生靶多肽的步驟，還可以包括在吸附劑上原位擴(kuò)增靶多肽序列。
在另一實(shí)施例中，基質(zhì)包含(1)結(jié)合錨定多肽的吸附劑和(2)至少一個(gè)具有展示錨定多肽的表面和靶吸附多肽的靶基因組件，靶基因組件所含的聚核苷酸含有編碼靶吸附劑的核酸序列，靶基因組件通過(guò)錨定多肽與吸附劑結(jié)合。
在另一實(shí)施例中，該方法包括任意以下步驟檢測(cè)編碼多肽的核酸序列；分離滯留的基因組件或產(chǎn)生多肽。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供用于解吸譜法的基質(zhì)，它包含結(jié)合展示于基因組件表面的錨定多肽的吸附劑，所述的基因組件表面還展示靶多肽，所述的基因組件包含具有編碼靶多肽的核酸序列的聚核苷酸。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供檢測(cè)聚核苷酸翻譯的方法。所述方法包括a)提供用于解吸譜法的包含吸附劑的基質(zhì)；b)將基質(zhì)與編碼多肽的聚核苷酸和體外翻譯聚核苷酸所需的物質(zhì)接觸，由此產(chǎn)生多肽；c)基質(zhì)與洗脫劑接觸使得多肽被吸附劑保留；和d)用解吸譜法檢測(cè)滯留的多肽。檢測(cè)多肽就是檢測(cè)聚核苷酸的翻譯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是包含多個(gè)吸附劑位點(diǎn)的條形基質(zhì)。基質(zhì)條有6組根據(jù)引力基礎(chǔ)(疏水力，離子力，配位共價(jià)鍵及混合作用)來(lái)區(qū)分的不同吸附劑?；|(zhì)條針對(duì)不同吸附劑各有多個(gè)位點(diǎn)，允許在不同的時(shí)刻用不同的洗脫劑來(lái)檢查這些位點(diǎn)，或用于記錄和后繼分析。
圖2是吸附劑(表面相互作用潛力)位于預(yù)定可定址位置上的正交排列。排列也可以呈板式。排列中包含多種吸附劑。在與分析物接觸后，各條可用不同的洗脫劑(選擇閥值修飾劑)洗滌。分析不同選擇性條件下的滯留情況得到滯留圖或識(shí)別概況。
圖3表示通過(guò)將分析物從排列的給定位置上解吸進(jìn)行的分析物的定量分析和用激光解吸質(zhì)譜法進(jìn)行的解吸分析物的定量分析。
圖4A顯示的是用來(lái)執(zhí)行分析本發(fā)明數(shù)據(jù)所用軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。圖4A顯示的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1包括顯示器3，顯示屏5，機(jī)箱7，鍵盤9和鼠標(biāo)11。鼠標(biāo)11可具有一個(gè)或多個(gè)按鍵，例如鼠標(biāo)鍵13。機(jī)箱7內(nèi)包含CD-ROM驅(qū)動(dòng)器15和硬盤驅(qū)動(dòng)器(未顯示)，它們可用來(lái)存儲(chǔ)和檢索包含本發(fā)明代碼的計(jì)算機(jī)程序。雖然顯示了一個(gè)CD-ROM17作為計(jì)算機(jī)可讀記錄介質(zhì)，但也可以使用包括軟盤、DRAM、硬盤、內(nèi)存(flash memory)、磁帶等在內(nèi)的其他計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。機(jī)箱7內(nèi)還有諸如處理器、存儲(chǔ)器等常規(guī)計(jì)算機(jī)組件(未顯示)。
圖4B顯示的是用于執(zhí)行使用本發(fā)明數(shù)據(jù)的軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1的系統(tǒng)圖。如圖4A所示，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1包括顯示器3和鍵盤9。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1還包括諸如中央處理器102、系統(tǒng)存儲(chǔ)器104、I/O控制器106、顯示卡108、可換磁盤112、固定磁盤116、網(wǎng)絡(luò)界面118和話筒120等子系統(tǒng)?？蓳Q磁盤112代表了諸如軟盤、磁帶、CD-ROM、可換硬盤、內(nèi)存(flash memory)等可換的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。固定磁盤116代表內(nèi)置硬盤驅(qū)動(dòng)器、DRAM等。適用于本發(fā)明的其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可能還包括更多或更少的子系統(tǒng)。例如，其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可具有一個(gè)以上處理器102(即，多處理器系統(tǒng))或高速緩沖存儲(chǔ)器。
圖5A-5F是溶菌酶在6種不同吸附劑和數(shù)種不同洗脫劑組成的選擇性條件下的滯留圖。
圖6A-6B是用固定化金屬吸附劑分辨人血清中的低分子量和高分子量分析物。
圖7A-7B是用不同吸附劑和相同洗脫劑分辨人血清中的低分子量和高分子量分析物。
圖8A-8B是用不同吸附劑并以水為洗脫劑分辨早產(chǎn)嬰兒尿液中的低分子量和高分子量分析物。
圖9顯示用疏水性苯基吸附劑和三種洗脫劑分辨早產(chǎn)嬰兒尿液中的分析物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tween洗滌選擇性保留一種分析物(*)。
圖10A-10D是分辨兩不同乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)液中的分析物。
圖11顯示早產(chǎn)嬰兒尿液在6種吸附劑和3種洗脫劑組成的選擇性條件下的混合物滯留圖。
圖12顯示早產(chǎn)嬰兒尿液的兩維度聚丙烯酰胺凝膠(pI和表觀分子量)。
圖13顯示用噬菌體文庫(kù)篩選表面蛋白特異性結(jié)合靶分析物的噬菌體的方法。上方的基質(zhì)顯示，通過(guò)檢測(cè)噬菌體所含的許多包被蛋白，即使少量的特異性結(jié)合噬菌體也能夠用解吸譜法檢測(cè)出來(lái)。下方，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了具有數(shù)個(gè)吸附劑位置使得靶分析物與之特異性結(jié)合的的基質(zhì)。使噬菌體接觸這些位點(diǎn)，用解吸譜法檢測(cè)結(jié)合的噬菌體?？梢苑蛛x出與另一位置結(jié)合的噬菌體并進(jìn)行培養(yǎng)。
圖14顯示如何用篩選法鑒定的配體(此處為一種單鏈抗體)作為吸附劑固定用于蛋白-蛋白相互作用研究的靶蛋白。原位純化靶蛋白(位置2)并用來(lái)篩選噬菌體展示文庫(kù)(位置4)。分離出單鏈抗體，作為吸附劑與基質(zhì)結(jié)(位置6)。然后，靶蛋白與單鏈抗體結(jié)合。這就固定了靶蛋白，可用于研究蛋白-蛋白相互作用(位置8)。
圖15顯示篩選能干擾蛋白質(zhì)結(jié)合配體(此處為一種單鏈抗體)的候選藥物的方法。通過(guò)例如自身可經(jīng)蛋白A或蛋白G固定的抗噬菌體抗體將某靶蛋白的特異性單鏈抗體固定于基質(zhì)上的某一位置。使該單鏈抗體接觸靶蛋白和候選藥物，用解吸譜法來(lái)檢測(cè)藥物結(jié)合蛋白分析物和干擾配體結(jié)合分析物的能力。
圖16顯示篩選能干擾蛋白質(zhì)結(jié)合配體的候選藥物的方法。該方法與上一圖中的相似，所不同的是通過(guò)解吸譜法檢測(cè)藥物本身與配體的結(jié)合來(lái)檢測(cè)藥物干擾分析物結(jié)合的能力。
圖17顯示篩選能干擾靶蛋白(靶蛋白I)結(jié)合第二配體(靶蛋白II)的候選藥物的方法。和前兩圖一樣，靶蛋白被固定在基質(zhì)上，本身由此變成配體的吸附劑。此處，分析物通過(guò)單鏈抗體被固定。然后，靶蛋白與配體和候選藥物接觸。用解吸譜法檢測(cè)藥物干擾分析物與配體之間結(jié)合(通過(guò)例如與靶分析物結(jié)合)的能力。
圖18是從鑒定差異表達(dá)的mRNA或多肽開(kāi)始，至產(chǎn)生特異性結(jié)合用于解吸譜法檢測(cè)的多肽的診斷平臺(tái)結(jié)束的流程圖。
圖19A-19D顯示嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液在某吸附劑排列上的滯留圖。圖19A陰離子吸附劑；圖19B常態(tài)吸附劑；圖19CNi(II)吸附劑；圖19D疏水性吸附劑。
圖20A-20C顯示嗜血桿菌裂解液中某分析物的逐步分辨。吸附劑都是陰離子吸附劑。圖20A第一步，在接觸樣品后，用150μl 20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0洗滌該位置。第二步，在一組常數(shù)特征中加入吸附劑和洗脫劑的磷酸鈉特征。圖20B除20mM磷酸鈉，pH7.0之外，還用0.05％Triton X100和0.15M NaCl(總共150μl)洗滌該位置。圖20C除20mM磷酸鈉，pH7.0之外，還用100mM咪唑，0.15M NaCl(總共150μl)洗滌該位置。
圖21A-21D顯示常人血清和患病血清中成分的比較結(jié)果。圖21A正常血清在吸附劑排列(Cu(II))位置上的滯留圖。圖21B患病血清在吸附劑排列(Cu(II))位置上的滯留圖。圖21C將兩種血清樣品中的滯留分析物重疊。為了簡(jiǎn)化表示，各滯留分析物峰轉(zhuǎn)化成條柱，虛線柱代表正常血清中被滯留的分析物，實(shí)心柱代表疾病血清中被滯留的分析物。圖21D為了更清楚地區(qū)分兩樣品，繪制了一張比較圖，計(jì)算并顯示了兩樣品中滯留分析物之比。用“*”標(biāo)記的兩分析物顯示在疾病血清中明顯增加(增加5至10倍)。
圖22A-22D顯示的是對(duì)照、疾病和藥物治療的小鼠的尿液在Cu(II)吸附劑上的滯留圖的比較，以及對(duì)疾病和藥物處理尿液中標(biāo)記的定量。
圖23A-23D顯示以“凝膠視圖(gel view)”形式顯示的4名癌癥患者尿液中分析物的滯留圖?；颊?，2和3之間的差異圖顯示有兩種共有分析物在患者尿液中增加。
圖24A-24E顯示通過(guò)檢測(cè)基因VIII包被蛋白用激光解吸質(zhì)譜法檢測(cè)M13噬菌體。對(duì)原來(lái)的1012噬菌體/ml進(jìn)行1∶10至1∶100,000,000的稀釋。
圖25A-25B為解吸譜法顯示的以抗M13抗體為吸附劑捕獲M13。圖22A顯示被捕獲的M13噬菌體，其中的峰代表基因VIII和基因III蛋白。圖22B是對(duì)照，其中的峰代表抗體吸附劑(單倍和雙倍帶電)。
圖26A-26D顯示帶有抗-tat單鏈抗體的M13噬菌體被tat蛋白吸附劑吸附的情況。只顯示了噬菌體稀釋度為1∶10至1∶10,000時(shí)的強(qiáng)度。
圖27A-27B顯示濃度為1μg/ml(圖27A)和100ng/ml(圖27B)時(shí)，TGF-β結(jié)合固定化TGF-β受體融合蛋白的滯留圖。實(shí)線代表沒(méi)有游離TGF-β受體時(shí)的結(jié)合。虛線代表有游離TGF-β受體時(shí)的結(jié)合。
圖28至31顯示滯留層析的分辨能力。圖28A-28C顯示用疏水性，陽(yáng)離子和Cu(II)吸附劑分辨嗜血桿菌裂解液中分子量范圍從0kD至30kD的蛋白質(zhì)。各滯留分析物均以條柱表示，條柱高度代表滯留分析物的強(qiáng)度。圖29A-29C顯示用疏水性，陽(yáng)離子和Cu(II)吸附劑分辨嗜血桿菌裂解液中分子量范圍從30kD至100kD的蛋白質(zhì)。圖30顯示三種吸附劑聯(lián)合分辨0kD至30kD的嗜血桿菌蛋白。圖31顯示三種吸附劑聯(lián)合分辨的30kD至100kD的嗜血桿菌蛋白。
圖32顯示GST融合蛋白與普通吸附劑的結(jié)合。
圖33A-33B顯示特異性配體與固定在吸附劑排列上的GST融合蛋白受體的結(jié)合(圖33A)，配體與沒(méi)有GST融合蛋白的排列不結(jié)合(圖33B)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明I.定義除非另作定義，本發(fā)明所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用許多術(shù)語(yǔ)的一般解釋Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2ed.1994)；TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walder編，1988)；The Clossary ofGenetics，5thed.，R.Rieger等編，Spring Verlag(1991)；和Hale & Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另作定義，本發(fā)明中以下術(shù)語(yǔ)的定義為“分析物”樣品中需要滯留和檢測(cè)的組分。它可以表示樣品中單獨(dú)一種組分或一組組分。
“吸附劑”任何能夠吸附分析物的物質(zhì)?！拔絼痹诖思幢硎痉治鑫锼佑|的單獨(dú)一種物質(zhì)“單吸附劑(monoplex adsorbent)”(例如一種化合物或官能團(tuán))，又表示樣品所接觸的多種物質(zhì)“多重吸附劑(multiplex adsorbent)”。多重吸附劑中的吸附性物質(zhì)稱為“吸附劑種類”。例如，基質(zhì)上某可定址位置可包含以多種具有不同結(jié)合特性的不同吸附劑種類(例如，陽(yáng)離子物質(zhì)，金屬螯合劑或抗體)為特征的多重吸附劑。
“吸附”表示用洗脫劑(選擇閾值修飾劑)洗滌前或后，吸附劑與分析物之間可被測(cè)得的結(jié)合。
“基質(zhì)”吸附劑結(jié)合或沉淀所在的固相。
“結(jié)合特性”指導(dǎo)致吸附劑吸引分析物的化學(xué)和物理特征。如果在相同的洗脫條件下，兩種吸附劑結(jié)合相同分析物的親合性程度不同，則這兩種吸附劑具有不同的結(jié)合特征。結(jié)合特性包括，例如，鹽促相互作用程度，疏水性相互作用程度，親水性相互作用程度，靜電相互作用程度等。
“結(jié)合條件”指分析物所接觸的結(jié)合特性。
“洗脫劑”指用來(lái)介導(dǎo)分析物被吸附劑吸附的物質(zhì)，通常是一種溶液。洗脫劑又稱“選擇閾值修飾劑”。
“洗脫特性”指造成特定洗脫劑(選擇閾值修飾劑)能夠介導(dǎo)某分析物與某吸附劑之間吸附作用的特征。如果兩種洗脫劑與分析物和吸附劑接觸時(shí)，分析物與吸附劑之間的親合性不同，則這兩種洗脫劑具有不同的洗脫特性。洗脫特征包括，例如，pH，離子強(qiáng)度，水結(jié)構(gòu)的修飾，除垢劑強(qiáng)度，疏水相互作用的修飾等。
“洗脫條件”指分析物所接觸的洗脫特性。
“選擇特征”指具有特定結(jié)合特性的吸附劑與具有特定洗脫特性的洗脫劑相結(jié)合，產(chǎn)生的特異性使得分析物在用洗脫劑洗滌后仍然滯留的特征。
“選擇性條件”指分析物所接觸的選擇特征。
“引力基礎(chǔ)”指使得分子彼此吸引的化學(xué)和/或理化特征。
“引力強(qiáng)度”分子彼此吸引的強(qiáng)度(又稱親合力)。
“分辨”“分辨作用”或“分析物的分辨”指對(duì)樣品中至少一種分析物的檢測(cè)。分辨包括通過(guò)先分離然后差異性檢測(cè)來(lái)檢測(cè)樣品中的多種分析物。分辨不要求將一種分析物與混合物中的其余分析物完全分離。相反，任何分離只要能夠區(qū)分至少兩種分析物就足夠了。
“高信息分辨”指分辨分析物的方式不僅能檢測(cè)出分析物，還可評(píng)價(jià)分析物的至少一種理化性能，例如分子量。
“解吸譜法”是一種檢測(cè)分析物的方法，其中，分析物接觸能量后，從固定相解吸到氣相中，被解吸的分析物或其可區(qū)別性部分直接被檢測(cè)器測(cè)得，不需要將分析物捕捉到第二固定相上的中間步驟。
“檢測(cè)”指鑒定待測(cè)物質(zhì)是否存在或存在量。
“滯留”指經(jīng)洗脫劑洗滌后分析物被吸附劑所吸附。
“滯留數(shù)據(jù)”指表明檢測(cè)到在特定選擇性條件下分析物被保留的數(shù)據(jù)(可包括檢測(cè)質(zhì)量)。
“滯留圖”指說(shuō)明多種選擇性條件下被保留的某分析物的滯留信息的數(shù)據(jù)組。
“識(shí)別概況”指說(shuō)明某分析物在多種選擇性條件下相對(duì)滯留作用的數(shù)據(jù)組。
“復(fù)合物”指兩種或兩種以上聯(lián)合而成的分析物。
“片段”指分析物的化學(xué)，酶法或物理降解產(chǎn)物。片段可能是中性的，也可能是離子態(tài)的。
“差異表達(dá)”指某分析物的存在在質(zhì)與量上可測(cè)得的差異。
“生物樣品”指來(lái)自病毒，細(xì)胞，組織，器官或生物體的樣品，包括但不限于細(xì)胞，組織或器官裂解物或勻漿，或體液樣品，例如血液，尿液或腦髓液。
“有機(jī)生物分子”指具有生物來(lái)源的有機(jī)分子，例如甾體，氨基酸，核苷酸，糖，多肽，聚核苷酸，復(fù)合糖或脂質(zhì)體。
“有機(jī)小分子”指與藥學(xué)中常用有機(jī)分子大小相當(dāng)?shù)挠袡C(jī)分子。它不包括有機(jī)生物聚合物(例如蛋白質(zhì)，核酸等)。較好的有機(jī)小分子最大約5000Da，最大約2000Da，或者，最大約1000Da。
“生物聚合物”指生物來(lái)源的聚合物，例如多肽，聚核苷酸，多糖或聚甘油酯(例如二或三甘油酯)。
“多肽”指由氨基酸殘基、相關(guān)天然結(jié)構(gòu)變體及其非天然合成類似物通過(guò)肽鍵連接而成的聚合物，及其天然變體和非天然合成類似物?？梢杂米詣?dòng)多肽合成儀來(lái)合成合成多肽?！暗鞍踪|(zhì)”一般指大多肽?！半摹币话阒付潭嚯?。
“聚核苷酸”指由核苷酸單元構(gòu)成的聚合物。聚核苷酸包括諸如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)的天然核酸和核酸類似物。核酸類似物包括非天然堿基和核苷酸以非天然磷酸二酯鍵與其它核苷酸連接的哪些，或包含以非磷酸二酯鍵連接的堿基的哪些。這樣，核苷酸類似物包括但不限于磷酸硫酯，磷酸二硫酯，磷酸三酯，磷酸甲芐咪唑，磷酸硼烷酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)等。這些聚核苷酸可以用例如自動(dòng)DNA合成儀來(lái)合成?！昂怂帷币话阒复蟮木酆塑账?，“寡核苷酸”一般指短的聚核苷酸，一般不超過(guò)50個(gè)核苷酸?？梢岳斫獾氖?，當(dāng)用DNA序列(即，A，T，G，C)表示核苷酸序列時(shí)，也包括以“U”代替“T”的RNA序列(即，A，U，G，C)。
“可測(cè)部分”或“標(biāo)記”指可以用分光學(xué)，光化學(xué)，生物化學(xué)，免疫化學(xué)或化學(xué)方法測(cè)定的組分。例如，有用的“標(biāo)記”包括32P，35S，熒光顏料，電子-密度(electron-dense)試劑，酶(例如ELISA中常用的那些)，生物素-鏈霉親和素，分子氧(dioxygenin)，可以得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原或蛋白質(zhì)，或者序列與靶分子互補(bǔ)的核酸分子。這些可測(cè)部分通常產(chǎn)生一個(gè)可測(cè)信號(hào)，例如放射性、生色性或熒光信號(hào)，這些信號(hào)可用來(lái)確定樣品中可測(cè)部分被結(jié)合的量?？蓽y(cè)部分可以通過(guò)共價(jià)鍵、離子引力，范德華力或氫鍵摻入或結(jié)合引物或探針，例如，摻入放射性核苷酸或可被鏈霉親和素識(shí)別的生物素化核苷酸?？蓽y(cè)部分可能直接可測(cè)或間接可測(cè)。間接可測(cè)可能涉及將第二直接可測(cè)或間接可測(cè)部分與原可測(cè)部分結(jié)合。例如，原可測(cè)部分可以是與結(jié)合伴侶特異性雜交的配體，例如作為鏈霉親和素結(jié)合伴侶的生物素，或作為互補(bǔ)序列結(jié)合伴侶的一段核苷酸序列。結(jié)合伴侶本身可能是直接可測(cè)的，例如抗體本身可被熒光分子所標(biāo)記。結(jié)合伴侶也可能是間接可測(cè)的，例如，具有互補(bǔ)序列的核酸可能是分支DNA分子的一部分，后者再通過(guò)與其它經(jīng)標(biāo)記核酸分子雜交而被測(cè)得。(參見(jiàn)，PD.Fahrlander & A.Klausner，Bio/Technology(1988)61165)。信號(hào)定量可通過(guò)例如閃爍計(jì)數(shù)，測(cè)密度或流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行。
“多”表示不少于2。
“純化”表示去除待純化組合物中至少一種雜質(zhì)。純化并不要求純化后的化合物100％純。
“配體”是與靶分子特異性結(jié)合的化合物。
“受體”是與配體特異性結(jié)合的化合物。
“抗體”指主要由一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因編碼的多肽配體，或其片段，它們特異性地結(jié)合并識(shí)別某表位(例如抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括κ和λ輕鏈恒區(qū)基因，α、β、δ、ε和μ重鏈恒區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白變區(qū)基因?？贵w是，例如，完整的免疫球蛋白或各種肽酶消化所產(chǎn)生、并已經(jīng)被充分描述的片段之一。包括Fab’和F(ab)2’片段。本文中的“抗體”還包括修飾完整抗體而產(chǎn)生的或用重組DNA方法全新合成的抗體片段。它還包括單克隆抗體，多克隆抗體，嵌合抗體，和人源化抗體?？贵w的“Fc”部分指包含一個(gè)或多個(gè)重鏈恒區(qū)CH1，CH2和CH3，不包括重鏈變區(qū)的重鏈部分。
在確定包含多種化合物的樣品中是否存在分析物的試驗(yàn)中，當(dāng)配體或受體發(fā)生作用時(shí)就會(huì)與分析物化合物“特異性結(jié)合”或“發(fā)生特異性免疫反應(yīng)”。這樣，在設(shè)計(jì)好的試驗(yàn)(例如免疫試驗(yàn))條件下，配體或受體優(yōu)先結(jié)合特定的分析物，與樣品中的其它化合物則基本上不結(jié)合。例如，一段聚核苷酸在雜交條件下特異性結(jié)合一段包含互補(bǔ)序列的聚核苷酸分析物；一種抗體在免疫試驗(yàn)條件下特異性結(jié)合帶有激發(fā)該抗體的表位的抗原分析物；吸附劑在合適的洗脫條件下特異性結(jié)合某種分析物。
“制劑”指一種化合物，化合物的混合物，組成尚不確定的樣品，小分子組合而成的排列，生物大分子，噬菌體肽展示文庫(kù)，噬菌體抗體(例如scFv)展示文庫(kù)，聚核糖體展示文庫(kù)，或由細(xì)菌、植物、真菌、或動(dòng)物細(xì)胞或組織等生物材料制備的提取物。合適的技術(shù)包括噬菌體或類似載體上重組抗體文庫(kù)的挑選。參見(jiàn)，Huse等，(1989)Science 2461275-1281；和Ward等，(1989)Nature 341544-546。Huse的方法與噬菌體展示文庫(kù)聯(lián)用更有效。參見(jiàn)，例如，Dower等，WO91/17271和McCafferty等，WO92/01047。
“重組聚核苷酸”指包含的序列在天然條件下并不連接在一起的聚核苷酸?？蓪U(kuò)增或組裝而成的重組聚核苷酸包含在合適的載體內(nèi)，再用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。含有重組聚核苷酸的宿主細(xì)胞被稱為“重組宿主細(xì)胞”。然后在重組宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因，產(chǎn)生例如“重組多肽”。重組聚核苷酸也可以是非編碼功能的(例如，啟動(dòng)子，復(fù)制起點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。合適的單細(xì)胞宿主包括常用于表達(dá)真核或哺乳動(dòng)物聚核苷酸的哪些，包括例如大腸桿菌的原核細(xì)胞；包括酵母之類真菌的真核細(xì)胞；包括昆蟲(chóng)細(xì)胞(如sf9)和諸如CHO，R1.1，B-W，L-M，非洲綠猴腎細(xì)胞(例如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10)等動(dòng)物細(xì)胞和培養(yǎng)的人細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
“表達(dá)調(diào)控序列”指聚核苷酸內(nèi)一段調(diào)節(jié)與之操作性連接的核苷酸序列的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的核苷酸序列?！安僮餍赃B接”指兩個(gè)部分之間的一種功能性關(guān)系，在這種關(guān)系中，一部分的活性(例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)對(duì)另一部分產(chǎn)生作用(例如序列的轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子序列(例如誘導(dǎo)型，抑制型或組成型)，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子(即ATG)，內(nèi)含子的剪接信號(hào)和終止密碼子。
“表達(dá)載體”指包含重組聚核苷酸的載體，該聚核苷酸又包含與待表達(dá)核苷酸序列操作性連接的表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)載體含有足量的順式作用表達(dá)元件；其它表達(dá)元件可由宿主細(xì)胞或體外表達(dá)系統(tǒng)提供。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域已知的那些，例如含有重組聚核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如裸露的或被脂質(zhì)體包被的)和病毒。
“編碼”指聚核苷酸內(nèi)特殊核苷酸序列(例如基因，cDNA或mRNA)的遺傳特性，即作為模板在生物過(guò)程中合成具有確切核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或確切氨基酸序列以及由此產(chǎn)生的生物特性的其它聚合物或大分子。所以，如果在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)內(nèi)由基因產(chǎn)生的mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，則稱該基因編碼該蛋白。某基因或cDNA的編碼鏈(核苷酸序列與mRNA的一致而且通常顯示在序列表內(nèi)的鏈)和非編碼鏈(用作轉(zhuǎn)錄模板的鏈)都可以稱為編碼該基因或cDNA的蛋白或其它產(chǎn)物。除非另做說(shuō)明，“編碼某氨基酸序列的核苷酸序列”包括編碼相同氨基酸序列的所有簡(jiǎn)并版本。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包含內(nèi)含子。
“吸能分子”指在解吸分光光譜儀中從能源吸收能量使得分析物從探針表面解吸的分子。MALDI中所用的吸能分子常稱為“基體(matrix)”。在生物有機(jī)分子激光解吸中常用肉桂酸、cinapinic酸和二羥基苯甲酸作為吸能分子。II.滯留層析滯留層析是一種多維度分辨樣品中分析物的方法。該方法包括(1)在多種不同的吸附劑/洗脫劑組合(“選擇性條件”)下將樣品中的分析物吸附到基質(zhì)上和(2)用解吸譜法檢測(cè)被吸附分析物的滯留情況。各選擇性條件提供分離的第一維度，將被吸附分析物與不被吸附的那些分離。解吸質(zhì)譜提供分離的第二維度，根據(jù)質(zhì)量將吸附分析物與其它的分離。因?yàn)闇魧游鍪褂枚喾N不同的選擇性條件，所以可以獲得分離的許多維度。兩種選擇性條件下一種或多種分析物的相對(duì)吸附也可以確定。這種多維度分離既分辨了分析物又對(duì)它們進(jìn)行了描述。
而且，由此分離的分析物仍然滯留為一張滯留圖，便于以后用來(lái)檢測(cè)(例如)分析物的結(jié)構(gòu)和/或功能。而且，固定分析物本身可以用作吸附劑固定接觸基質(zhì)的其它分析物?？傊景l(fā)明提供了一種迅速、多維度而且高信息分辨分析物的方法。
本發(fā)明方法可采用多種形式。實(shí)施例之一中，分析物在兩個(gè)不同的物理位置被兩種不同的吸附劑吸附，每種吸附劑用相同的洗脫劑(選擇閾值修飾劑)洗滌。另一實(shí)施例中，分析物在兩個(gè)不同的物理位置被相同的吸附劑吸附，每種吸附劑用不同的洗脫劑洗滌。另一實(shí)施例中，分析物在不同的物理位置被兩種不同的吸附劑吸附，并用兩種不同的洗脫劑洗滌。另一實(shí)施例中，分析物先用一種吸附劑吸附，用第一洗脫劑洗滌，檢測(cè)滯留情況；然后用不同的第二洗脫劑洗滌，再檢測(cè)滯留情況。
A.進(jìn)行滯留層析的方法1.分析物與選擇性條件接觸a.基質(zhì)的制備在滯留層析過(guò)程中，被吸附劑保留的分析物被呈遞給基質(zhì)上的能源。含分析物的樣品可在吸附劑固定于用于向解吸機(jī)制呈遞分析物的基質(zhì)之前或之后與吸附劑接觸。為了接觸，吸附劑可以是液態(tài)或固態(tài)(即位于基質(zhì)上或呈固相)。具體地說(shuō)，吸附劑的形式可以是溶液，懸浮液，分散系，油包水乳液，水包油乳液，或微乳液。當(dāng)吸附劑的形式是懸浮液，分散系，乳液或微乳液時(shí)，可以有合適的表面活性劑存在。在這樣的實(shí)施例中，可以通過(guò)將液態(tài)樣品與液態(tài)吸附劑相互混合來(lái)使樣品與吸附劑接觸?；蛘?，樣品可以位于固體支持物上，則可通過(guò)含樣品的支持物在液體吸附劑中的淋浴、浸泡或蘸來(lái)完成接觸。此外，可用液體吸附劑噴涂或洗滌固體支持物上的樣品來(lái)進(jìn)行接觸。在這種實(shí)施例中，不同吸附劑可用不同容器提供。
在實(shí)施例之一中，吸附劑位于基質(zhì)上。基質(zhì)可以是能夠結(jié)合或固著吸附劑的任何材料。通常，基質(zhì)包含玻璃；陶瓷；導(dǎo)電聚合物(例如炭化PEEK)；TEFLON包被的材料有機(jī)聚合物；天然生物聚合物；金屬(例如鎳，銅，鋼或鋁)；薄膜；多孔和無(wú)孔交聯(lián)聚合物微珠(例如瓊脂糖，纖維素或葡聚糖)；其他不溶性聚合物；或以上的組合。
在實(shí)施例之一中，基質(zhì)的形式是插在解吸檢測(cè)器內(nèi)的探針或樣品呈遞機(jī)制。例如，見(jiàn)圖1，基質(zhì)是條形的。固定在基質(zhì)上的吸附劑可以呈線形排列的位點(diǎn)，位點(diǎn)各自與分析物接觸。可將數(shù)條基質(zhì)連在一起，許多吸附劑由此形成在確定列中具有30個(gè)分開(kāi)的位點(diǎn)的排列?；|(zhì)還可以是板型的，具有水平和垂直的吸附劑列，形成諸如正方形、矩形或圓等規(guī)則的幾何圖案。
可如下生產(chǎn)探針?；|(zhì)可以是任何合適的固體材料，例如不銹鋼、鋁或硅薄片。然后，可用能修飾表面的材料包被金屬基質(zhì)。例如，可用二氧化硅、二氧化鈦或金包被金屬表面。
然后用雙官能接頭修飾表面。雙官能接頭一端具有的官能團(tuán)能夠共價(jià)結(jié)合表面上的官能團(tuán)。這樣，該官能團(tuán)可以是無(wú)機(jī)氧化物或針對(duì)金的巰基。接頭的另一端通常具有一個(gè)氨基官能團(tuán)。有用的雙官能接頭包括氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基乙基二硫化物。
一旦與表面結(jié)合，接頭用作為吸附劑的基團(tuán)進(jìn)一步衍生。通常，吸附劑被加在探針上的可定址位置。在一種探針中，直徑約3mm的位點(diǎn)排列成相互垂直的陣列。吸附劑本身可以是雙官能分子的一部分，該雙官能分子包含一個(gè)與可得氨基反應(yīng)的基團(tuán)和另一個(gè)作為吸附劑的官能團(tuán)。官能團(tuán)包括正常相(氧化硅)，反相(C18脂肪烴)，季胺和磺酸酯。還可以用其它雙官能分子，例如碳二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，進(jìn)一步修飾表面形成一張預(yù)-活化毯。可用生物有機(jī)吸附劑(例如核酸，抗體和其它蛋白質(zhì)配體)將這類毯官能化。生物聚合物能夠通過(guò)胺殘基或巰基殘基結(jié)合毯上的官能團(tuán)。在實(shí)施例之一中，吸附劑與交聯(lián)聚合物(例如薄膜)結(jié)合，交聯(lián)聚合物本身則通過(guò)可得官能團(tuán)與探針表面結(jié)合。這類聚合物包括纖維素，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，聚丙烯酰胺和以上的混合物。固定有吸附劑的探針就可供使用了。
在另一實(shí)施例中，吸附劑固定在提供固定相的第一基質(zhì)(例如聚合物或玻璃微珠)上，第一基質(zhì)再位于用于向解吸檢測(cè)器的解吸能呈遞樣品的第二基質(zhì)上。例如，第二基質(zhì)可以呈板式，在預(yù)定的可定址位置具有一系列孔。這些孔可以作為經(jīng)吸附劑衍生的第一基質(zhì)(例如用吸附劑衍生的聚合物珠)的容器。這種實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是分析物可以以一種物理關(guān)系吸附于第一基質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到樣品呈遞基質(zhì)上進(jìn)行解吸譜分析。
通常，將基質(zhì)改變成可用本發(fā)明方法中的檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)與吸附劑結(jié)合并被保留的分析物。在實(shí)施例之一中，基質(zhì)以非固定方式插在一解吸檢測(cè)器內(nèi)，能量源在此擊中位點(diǎn)并解吸分析物。可使基質(zhì)適合水平和/或垂直安裝在一可平移管內(nèi)，從而沿一條路徑水平和/或垂直移動(dòng)基質(zhì)到連續(xù)的預(yù)定的吸附劑的可定址位置上，接受能量源的詢問(wèn)，檢測(cè)結(jié)合在位置上的分析物?；|(zhì)的形式可以是常規(guī)的質(zhì)譜探針。
條、板或探針形式的基質(zhì)可用常規(guī)技術(shù)來(lái)制造。然后，在與含分析物的樣品接觸前，吸附劑可直接或間接偶聯(lián)、裝配或沉積在基質(zhì)上?？捎酶鞣N合適的固著或固定化方法將吸附劑與基質(zhì)直接或間接偶聯(lián)。例如，可用吸附劑衍生基質(zhì)使得吸附劑通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵與基質(zhì)直接結(jié)合來(lái)將吸附劑與基質(zhì)直接偶聯(lián)。
吸附劑在基質(zhì)上的固著可通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)?？捎弥苽渫耆奈絼﹣?lái)衍生基質(zhì)，即將預(yù)先制備好的吸附劑與基質(zhì)連接?；蛘撸蓪⑶绑w分子固定在基質(zhì)上，然后再向靠第一前體分子結(jié)合在基質(zhì)上的成長(zhǎng)鏈添加其它前體分子，由此在基質(zhì)上形成吸附劑。這種在基質(zhì)上構(gòu)建吸附劑的方法尤其適用于聚合物，特別是諸如DNA或RNA分子等生物聚合物的吸附劑?？捎帽绢I(lǐng)域已知的寡核苷酸芯片技術(shù)，通過(guò)向固著于基質(zhì)上的第一堿基連續(xù)添加堿基來(lái)制成生物聚合物吸附劑。參見(jiàn)，美國(guó)專利5,445,934(Fodor等)。
如圖2所示，可與一片基質(zhì)偶聯(lián)少到2種多達(dá)10種，100種，1000種10,000種或更多種吸附劑。吸附劑位點(diǎn)的大小可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩煌?。但是不能超過(guò)沖擊能源的直徑(例如激光點(diǎn)的直徑)。連續(xù)的位點(diǎn)上可以是相同或不同的吸附劑。有時(shí)，宜使同一吸附劑位于基質(zhì)的多個(gè)不同位置，以允許用多種不同的洗脫劑進(jìn)行評(píng)價(jià)或保存被吸附的分析物以備后用或參考(可能是在第二過(guò)程中)。提供帶有多種不同吸附劑的基質(zhì)就能利用由不同吸附劑與一種樣品組合而產(chǎn)生的多種結(jié)合特性結(jié)合和檢測(cè)多種不同的分析物。在基質(zhì)上用多種不同的吸附劑評(píng)價(jià)一種樣品基本上等同于用不同的層析柱同時(shí)進(jìn)行的多個(gè)層析，但是本方法的優(yōu)點(diǎn)在于只需要一個(gè)系統(tǒng)。
當(dāng)基質(zhì)包含多種吸附劑時(shí)，特別有用的是使吸附劑位于預(yù)定的可定址位置。吸附劑在預(yù)定的可定址位置上就能夠在預(yù)定第一可定址位置用第一洗脫劑洗滌吸附劑，在預(yù)定第二可定址位置用第二洗脫劑洗滌吸附劑。由此，可在以不同方式修飾吸附劑結(jié)合特性的不同洗脫劑存在下評(píng)價(jià)一種吸附劑對(duì)分析物的結(jié)合特性。可定址位置可排列成各種形式，但以規(guī)則圖案為宜，例如線形、矩形或如圓等規(guī)則曲線。同樣，當(dāng)基質(zhì)包含多種吸附劑時(shí)，可為了評(píng)價(jià)某給定吸附劑在洗脫劑存在下的結(jié)合特性而就各種不同吸附劑評(píng)價(jià)一種洗脫劑。還可以在不同洗脫劑存在下評(píng)價(jià)不同吸附劑的結(jié)合特性。
(1)遞增或梯度吸附表面通過(guò)在基質(zhì)上合成不同的聚合吸附劑，可提供一系列具有不同結(jié)合特性的吸附劑。將一個(gè)前體分子固定在基質(zhì)上，引發(fā)聚合反應(yīng)，然后在各吸附劑完成不同程度時(shí)終止反應(yīng)，如此可提供不同的聚合吸附劑。還可以與聚合物的末端官能團(tuán)反應(yīng)以便用不同的親合性試劑(例如-NH3或COO-)對(duì)其進(jìn)行不同程度的化學(xué)衍生。通過(guò)終止聚合或衍生反應(yīng)產(chǎn)生出聚合或衍生程度不同的吸附劑。不同的聚合或衍生程度使各種不同的聚合吸附劑具有不同的結(jié)合特性。該實(shí)施例尤其適合在基質(zhì)上提供多種不同的吸附劑。
如果需要，可以在容器中而不是就在基質(zhì)上進(jìn)行聚合反應(yīng)。例如，可以在聚合/衍生反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中從反應(yīng)器中抽取等份的產(chǎn)物，得到具有不同結(jié)合特性的聚合吸附劑。在聚合/衍生反應(yīng)過(guò)程中不同時(shí)刻收取的各等份將表現(xiàn)出不同的聚合/衍生程度，由此得到多種不同的吸附劑。然后，可將不同等份的產(chǎn)物用作具有不同結(jié)合特性的吸附劑。或者，可以順次重復(fù)終止反應(yīng)的步驟，抽取等份的產(chǎn)物，然后重新啟動(dòng)聚合/衍生反應(yīng)，由此產(chǎn)生多種不同的吸附劑。在不同終止點(diǎn)抽取的產(chǎn)物將具有不同的聚合/衍生程度，由此產(chǎn)生多種具有不同結(jié)合特性的吸附劑。
實(shí)施例之一中，基質(zhì)是被一種或多種結(jié)合特性呈單維或雙維梯度改變的吸附劑所包被的條形或板形。例如這樣的含吸附劑的條形，其一端為弱疏水性，另一端為強(qiáng)疏水性。或者這樣的板形，其一角為弱疏水性陰離子性，對(duì)角為強(qiáng)疏水性陰離子性?？赏ㄟ^(guò)有控噴涂或令材料按時(shí)間流經(jīng)表面從而在梯度方向上逐步完成反應(yīng)來(lái)形成這樣的吸附梯度。可以在垂直方向上重復(fù)這一過(guò)程，從而形成相同或不同結(jié)合特性的不同吸附劑的正交梯度。
可在吸附劑定位在基質(zhì)上之前或之后，用能令分析物與吸附劑結(jié)合的合適方法讓含分析物的樣品接觸吸附劑?？珊?jiǎn)單地將吸附劑與樣品混合或合并。樣品與吸附劑接觸可以通過(guò)將基質(zhì)浸浴或浸漬在樣品中，或基質(zhì)蘸涂以樣品，或?qū)悠穱娡吭诨|(zhì)上，用樣品淋洗基質(zhì)，或在與吸附劑的接觸中產(chǎn)生樣品或分析物。此外，樣品與吸附劑的接觸還可以通過(guò)將樣品溶于某種洗脫劑或與其混合，然后用上述技術(shù)(即浸浴，浸漬，蘸涂，噴涂或淋洗)使洗脫劑和樣品溶液與吸附劑接觸。
b.分析物與吸附劑接觸在分析物結(jié)合吸附劑前先讓樣品接觸洗脫劑，這具有在樣品接觸吸附劑的同時(shí)改變吸附劑選擇性的作用。結(jié)合吸附劑并因此滯留的樣品組分將只包括能夠在與樣品混合的特定洗脫劑存在下結(jié)合吸附劑的那些，而不是在沒(méi)有洗脫劑修飾吸附劑選擇性時(shí)能結(jié)合吸附劑的所有組分。
樣品必須與吸附劑接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以令分析物與吸附劑結(jié)合。通常，樣品與吸附劑接觸約30秒至12小時(shí)。較好的是樣品與吸附劑接觸約30秒至15分鐘。
樣品接觸吸附劑時(shí)的溫度與具體樣品和選用的吸附劑有關(guān)。通常，樣品在常溫常壓條件下接觸吸附劑，但是有些樣品可能需要改變溫度(通常在4℃至37℃之間)和壓力條件，這可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員方便地加以確定。
本發(fā)明方法與常規(guī)方法相比的另一優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明能夠在少量樣品上進(jìn)行許多不同的實(shí)驗(yàn)。通常，含數(shù)埃摩爾至100皮摩爾分析物的1微升至500微升樣品就足以與吸附劑結(jié)合了。分析物可在與吸附劑結(jié)合后被保存，以用于以后的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)闆](méi)有經(jīng)歷解吸和檢測(cè)所有滯留分析物這些步驟的位置將仍然保留分析物。所以，如果只有小部分樣品可供分析，本發(fā)明就提供了能夠在不同時(shí)間用不同吸附劑和/洗脫劑進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)而不浪費(fèi)樣品的優(yōu)點(diǎn)。
c.用洗脫劑洗滌吸附劑在樣品與吸附劑接觸使得分析物與吸附劑結(jié)合后，用洗脫劑洗滌吸附劑。通常，為了進(jìn)行多維度分析，每個(gè)吸附劑位置至少用不同的第一和第二洗脫劑洗滌。洗脫劑洗滌改變了滯留在特定吸附劑上的分析物的量。吸附劑的結(jié)合特性與洗脫劑的洗脫特性結(jié)合形成了選擇性條件，控制著洗滌后被吸附劑保留的分析物的量。所以，洗滌步驟從吸附劑上選擇性地去除樣品組分。
可用多種技術(shù)進(jìn)行洗滌步驟。例如前文所述，樣品可在接觸吸附劑前溶于或與第一洗脫劑混合。樣品在接觸吸附劑之前或同時(shí)接觸第一洗脫劑中的作用與先讓分析物結(jié)合吸附劑再用第一洗脫劑洗滌吸附劑的凈效果最接近。合并后的溶液與吸附劑接觸后，可用第二洗脫劑或后繼洗脫劑洗滌吸附劑。
洗滌結(jié)合有分析物的吸附劑可通過(guò)在洗脫劑中浸浴、浸漬、或蘸涂帶吸附劑的基質(zhì)；或用洗脫劑淋洗、噴涂或洗滌來(lái)完成。最好用微流體工藝將洗脫劑引入小直徑的親合性試劑位點(diǎn)。
當(dāng)分析物與一個(gè)位置上的吸附劑結(jié)合，并在洗滌步驟中使用了多種不同的洗脫劑時(shí)，可獲得有關(guān)吸附劑在各種洗脫劑存在下的選擇性信息。用第一洗脫劑洗滌，解吸并檢測(cè)滯留分析物，然后用第二洗脫劑洗滌，解吸并檢測(cè)滯留分析物，可通過(guò)如此重復(fù)在每次用洗脫劑洗滌后測(cè)定與一個(gè)位置上的吸附劑結(jié)合的分析物?？捎孟嗤奈絼┮远喾N不同的洗脫劑重復(fù)洗滌，然后解吸和檢測(cè)。如此，可用多種不同的洗脫劑重復(fù)檢測(cè)一個(gè)位置上滯留有分析物的吸附劑，由此得出一系列有關(guān)各次洗滌后滯留的分析物的信息。
以上方法當(dāng)吸附劑位于多個(gè)預(yù)定可定址位置時(shí)也有用，不論這些吸附劑是否相同。但是，當(dāng)分析物與不同位置上相同或不同的吸附劑結(jié)合時(shí)，洗滌步驟可改用包括并行操作的更系統(tǒng)化、更有效的方法進(jìn)行。即，洗滌步驟可以通過(guò)用洗脫劑洗滌第一位置上的吸附劑，再用洗脫劑洗滌第二吸附劑，然后解吸并檢測(cè)被第一吸附劑保留的分析物，再解吸和檢測(cè)被第二吸附劑保留的分析物。換言之，所有的吸附劑都用洗脫劑洗滌，然后解吸被各種吸附劑保留的分析物，并檢測(cè)吸附劑的位置。如有必要，在檢測(cè)了各吸附劑的位置后，可進(jìn)行第二階段的洗滌，然后是第二階段的解吸和檢測(cè)。洗滌所有的吸附劑位置，然后在各個(gè)吸附劑位置解吸和檢測(cè)，可對(duì)多種不同的洗脫劑重復(fù)進(jìn)行這些步驟。用這種方法，可用整個(gè)陣列有效鑒定樣品中各分析物。不論在第一階段洗滌中是用同一種洗脫劑洗滌所有的吸附劑位置還是用多種不同洗脫劑洗滌多個(gè)吸附劑，該方法都有用。
2.檢測(cè)洗滌后仍被吸附劑保留的分析物吸附在基質(zhì)上。用解吸譜法來(lái)檢測(cè)滯留在基質(zhì)上的分析物從吸附劑上解吸分析物，然后直接檢測(cè)解吸下的分析物。
a.解吸方法從吸附劑上解吸分析物包括令分析物接觸合適的能源。這通常意味著用放射能或能量粒子撞擊分析物。例如，能量可以是激光能(例如UV激光)或閃光燈能形式的光能。或者，能量可以是一股快速原子流。也可以用熱能來(lái)誘導(dǎo)/協(xié)助解吸。
解吸和/或離子化分析物以便直接分析的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。其中之一稱為由基體協(xié)助的激光解吸/離子化或MALDI。MALDI中，分析物溶液與基體溶液混合，混合物沉積在惰性探針表面，然后結(jié)晶，分析物因被晶體包埋而解吸。選用的基體吸收激光能并傳遞給分析物，導(dǎo)致解吸和離子化。通常，基體吸收UV范圍內(nèi)的光。有關(guān)大蛋白的MALDI可參見(jiàn)美國(guó)專利5,118,937(Hillenkamp等)和美國(guó)專利5,045,694(Beabis和Chait)。
由表面強(qiáng)化的激光解吸/離子化或SELDI代表了比之MALDI在特異性，選擇性和靈敏度方面的一大進(jìn)步。有關(guān)SELDI參見(jiàn)美國(guó)專利5,719,060(Hutchens和Yip)。SELDI是一種固相解吸法，在其中，分析物被呈遞給表面上的能流，該表面強(qiáng)化分析物的捕獲和/或解吸。相比之下，MALDI是一種液相方法，在其中，分析物與液體物質(zhì)混合，液體物質(zhì)包圍著分析物形成結(jié)晶。
SELDI的一種方式稱SEAC(由表面強(qiáng)化的親合性捕捉)，包括將分析物呈遞給與一親合性捕捉機(jī)構(gòu)(即吸附劑)偶聯(lián)的解吸能。已發(fā)現(xiàn)，用這種方法將被吸附的分析物呈遞給解吸能源時(shí)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物解吸的機(jī)會(huì)更大。可向探針添加吸能物質(zhì)協(xié)助解吸。然后可向能源呈遞探針以解吸分析物。
另一種SELDI稱SEND(由表面強(qiáng)化的凈解吸)，包括使用一吸能物質(zhì)層，上面放以分析物?；|(zhì)表面有一層與之化學(xué)結(jié)合的吸能分子，而且/或者基本無(wú)晶體。然后將純(即凈)分析物涂在層的表面，不與其發(fā)生實(shí)質(zhì)性混合。吸能分子象基體那樣吸收解吸能并使分析物被解吸。這一進(jìn)步是實(shí)質(zhì)性的，因?yàn)橛捎谙巳芤夯旌衔锖碗S機(jī)結(jié)晶的作用，現(xiàn)在可以更簡(jiǎn)單更均一的方式將分析物呈遞給能源。這使得結(jié)果更統(tǒng)一更可預(yù)計(jì)，因此可能實(shí)現(xiàn)過(guò)程的自動(dòng)化。吸能物質(zhì)可以是經(jīng)典基體材料或者是pH被調(diào)至中性或堿性的材料。吸能分子可通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與探針結(jié)合。
另一種SELDI稱SEPAR(由表面強(qiáng)化的光不穩(wěn)定附著與釋放)，包括使用光不穩(wěn)定附著分子。光不穩(wěn)定分子是一種二價(jià)分子，具有一個(gè)與固相(例如可作為探針一部分的探針平表面或珠體等其它固相)共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)，和可與親合性試劑或分析物共價(jià)結(jié)合的第二位點(diǎn)。當(dāng)光不穩(wěn)定附著分子與表面和分析物結(jié)合時(shí)另含一個(gè)可在光照后釋放親合性試劑或分析物的光不穩(wěn)定鍵。光不穩(wěn)定鍵可在附著分子內(nèi)，或者在與分析物(或親合性試劑)或探針表面附著的位置。
b.直接檢測(cè)分析物的方法有數(shù)種方法可檢測(cè)解吸下的分析物。當(dāng)分析物在解吸過(guò)程(例如激光解吸/離子化質(zhì)譜法)中被離子化時(shí)，檢測(cè)器可以是離子檢測(cè)器。質(zhì)譜儀一般包括測(cè)定解吸離子飛行時(shí)間的手段。這一信息被轉(zhuǎn)化為質(zhì)量。但是，沒(méi)有必要測(cè)定解吸離子的質(zhì)量來(lái)分辨和檢測(cè)它們離子化的分析物在不同時(shí)刻撞擊檢測(cè)器這一事實(shí)實(shí)現(xiàn)了它們的檢測(cè)和解吸。
或者，可用例如熒光基團(tuán)或放射性基團(tuán)可測(cè)性標(biāo)記分析物。此時(shí)，檢測(cè)器可以是熒光或放射性檢測(cè)器。
可相繼使用多種檢測(cè)方法來(lái)充分獲得與陣列中各位置上滯留物相關(guān)的分析物組分和功能信息。
c.解吸檢測(cè)器解吸檢測(cè)器具有將分析物從吸附劑上解吸的機(jī)構(gòu)和直接檢測(cè)解吸下的分析物的機(jī)構(gòu)。即，解吸檢測(cè)器不需要將分析物捕捉到另一固相內(nèi)然后進(jìn)行分析的中間步驟就可檢測(cè)解吸分析物。檢測(cè)分析物一般涉及檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。后者反映與吸附劑吸附的分析物的量。
解吸檢測(cè)器還具有除上述兩元件外的其它元件。其中之一是加速解吸分析物向檢測(cè)器移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。另一元件是測(cè)定分析物從解吸到被檢測(cè)器測(cè)得之間飛行時(shí)間的機(jī)構(gòu)。
較好的解吸檢測(cè)器是本領(lǐng)域熟知的激光解吸/離子化質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀具有一個(gè)供插入攜帶被吸附分析物的基質(zhì)(例如探針)的端口。解吸通過(guò)用能量例如激光能撞擊分析物來(lái)進(jìn)行。該設(shè)備可具有表面平移機(jī)構(gòu)，使得陣列上的任一點(diǎn)都可與激光束共線。激光撞擊分析物使完整的分析物解吸進(jìn)入飛行管并被離子化。飛行管一般是一個(gè)真空。真空管一段內(nèi)的帶電板產(chǎn)生一個(gè)電勢(shì)能，加速離子化的分析物向檢測(cè)器移動(dòng)。由時(shí)鐘測(cè)定飛行時(shí)間，由系統(tǒng)電子設(shè)備測(cè)定分析物的速度并轉(zhuǎn)化為質(zhì)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，以上各元件中任何一個(gè)都可以與本發(fā)明所述的其它元件組合，組裝成利用各種解吸、加速、檢測(cè)、時(shí)間測(cè)定等手段的解吸檢測(cè)器。
B.選擇性條件本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)之一是能夠令分析物處于多種不同的結(jié)合和洗脫條件下，由此既提高了分析物分辨率，又增加了有關(guān)它們識(shí)別特征形式的信息。和常規(guī)層析法一樣，吸附劑保留分析物的能力直接與比之分析物與洗脫劑之間或洗脫劑與吸附劑之間的引力或親合性的分析物對(duì)吸附劑的引力或親合性相關(guān)。當(dāng)樣品與吸附劑接觸時(shí)，樣品中的某些組分可能因沒(méi)有與吸附劑的親合性而不與之結(jié)合。因?yàn)椴荒芙Y(jié)合吸附劑，它們可立即與待分辨分析物分離。但是，根據(jù)樣品的性質(zhì)和所用的具體吸附劑，許多不同組分在一開(kāi)始能夠與吸附劑結(jié)合。
1.吸附劑吸附劑即結(jié)合分析物的物質(zhì)。滯留層析可使用多種吸附劑。不同的吸附劑表現(xiàn)出大不相同的結(jié)合特性，有些不同的結(jié)合特性，或略有不同的結(jié)合特性。結(jié)合特性大不相同的吸附劑一般在引力基礎(chǔ)或相互作用模式上有差異。引力基礎(chǔ)一般是一種化學(xué)或生物分子識(shí)別功能。吸附劑與分析物之間的引力基礎(chǔ)包括，例如(1)鹽促相互作用，例如疏水性相互作用，親硫性相互作用和固定化染料相互作用；(2)氫鍵和/或范德華力相互作用和電荷轉(zhuǎn)移相互作用，例如在親水性反應(yīng)中；(3)靜電相互作用，例如離子電荷相互作用，尤其是正負(fù)離子電荷相互作用；(4)分析物與吸附劑中的金屬離子形成配位共價(jià)鍵(即形成配位配合物)的能力；(5)酶活位置的結(jié)合；(6)可逆共價(jià)相互作用，例如二硫鍵互換作用；(7)糖蛋白相互作用；(8)生物特異性相互作用；或(9)上述兩種或兩種以上相互作用方式的組合。即，吸附劑可以表現(xiàn)出兩種或兩種以上引力基礎(chǔ)，即所謂“混合官能”吸附劑。
a.鹽促相互作用吸附劑用于評(píng)定鹽促相互作用的吸附劑包括疏水性相互作用吸附劑。疏水性相互作用吸附劑包括具有脂肪烴，尤其是C1-C18脂肪烴的基體；和具有芳香烴官能團(tuán)例如苯基的基體。疏水性相互作用吸附劑所結(jié)合的分析物包括暴露于溶劑中的不帶電氨基酸殘基，特別是常說(shuō)的非極性、芳香族疏水性氨基酸殘基，例如苯丙氨酸和色氨酸。與疏水性相互作用吸附劑結(jié)合的分析物的具體例子包括溶菌酶和DNA。在特定理論之外，DNA被認(rèn)為是因?yàn)槠渲械姆枷阈院塑账?，具體地說(shuō)即嘌呤和嘧啶基團(tuán)與疏水性相互作用吸附劑結(jié)合的。
用于評(píng)定鹽促相互作用的其他吸附劑包括親硫性相互作用吸附劑，例如T-GEL，這是Pierce，Rockford，Illinois出售的一種親硫性吸附劑。親硫性相互作用吸附劑吸附(例如)IgG等免疫球蛋白。IgG與T-GEL之間相互作用的機(jī)制尚不完全清楚，但暴露于溶劑中的trp基團(tuán)可能起著一定的作用。
涉及鹽促離子相互作用和疏水性相互作用的第三種吸附劑包括固定化染料相互作用吸附劑。固定化染料相互作用吸附劑包括固定化染料的母質(zhì)，例如Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey的CIBACHRONTM藍(lán)。固定化染料相互作用吸附劑通常結(jié)合蛋白質(zhì)和DNA。與固定化染料相互作用吸附劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的一個(gè)具體例子是牛血清白蛋白(BSA)。
b.親水性相互作用吸附劑用于評(píng)定基于親水性相互作用的氫鍵和/或范德華力的吸附劑包括包含諸如氧化硅(玻璃)的常態(tài)吸附劑的表面。常態(tài)或氧化硅表面起著官能團(tuán)的作用。此外，包含親水性聚合物(例如聚乙二醇，葡聚糖，瓊脂糖或纖維素)修飾表面的吸附劑也可以作為親水性相互作用吸附劑。大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合親水性相互作用吸附劑，因?yàn)樵S多氨基酸殘基(即親水性氨基酸殘基)通過(guò)氫鍵或范德華力的親水性相互作用結(jié)合。結(jié)合親水性相互作用吸附劑的蛋白質(zhì)的例子包括肌紅蛋白，胰島素和細(xì)胞色素C。
通常，極性或帶電氨基酸比例較高的蛋白質(zhì)將滯留在親水性表面上?；蛘?，親水性糖基暴露于表面的糖蛋白對(duì)親水性吸附劑的親合性也很高。
c.靜電相互作用吸附劑用于評(píng)定靜電或離子相互作用的吸附劑包括陰離子吸附劑，例如硫酸根陰離子基體(即SO3-)和羧基陰離子(即COO-)或磷酸根陰離子(即OPO3-)基體。帶有硫酸根陰離子的基體始終帶負(fù)電。但是，帶羧基陰離子的基體只有當(dāng)pH高于其pKa時(shí)才帶負(fù)電。當(dāng)pH低于pKa時(shí)，基體基本上呈電中性。合適的陰離子吸附劑還包括基體帶有硫酸根和羧基和磷酸根的組合的的吸附劑。這種組合可令負(fù)電荷強(qiáng)度隨pH連續(xù)變化。這類吸附劑吸引并結(jié)合帶正電的蛋白質(zhì)或大分子，例如核糖核酸酶和乳鐵蛋白。除特定理論之外，據(jù)信是吸附劑與正電氨基酸殘基(包括賴氨酸殘基，精氨酸殘基和組氨酸殘基)之間的靜電相互作用造成了結(jié)合。
用于評(píng)定靜電或離子相互作用的吸附劑還包括陽(yáng)離子吸附劑。具體例子包括仲胺，叔胺或季胺基體。季胺總是帶正電。但是，仲胺和叔胺所帶電荷具有pH依賴性。當(dāng)pH低于pKa時(shí)，仲胺和叔胺帶正電，當(dāng)pH高于pKa時(shí)，仲胺和叔胺帶負(fù)電。合適的陽(yáng)離子吸附劑還有包含仲胺，叔胺和季胺的組合的基體。這種組合使得正電強(qiáng)度隨pH連續(xù)變化。陽(yáng)離子吸附劑與分子上的陰離子位置結(jié)合，所述的分子包括氨基酸殘基(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基)暴露于溶劑中的蛋白質(zhì)。
如果是離子(既包括陰離子也包括陽(yáng)離子)相互作用吸附劑，常需要使用既包含陰離子又包含陽(yáng)離子的混合型離子吸附劑。這樣的吸附劑具有與pH相關(guān)的連續(xù)緩沖能力。這種連續(xù)緩沖能力使得多種分析物能夠與含有不同緩沖組分(尤其是pH在2至11之間)的洗脫劑接觸。由此形成由固定化可滴定質(zhì)子交換基團(tuán)決定的吸附劑上的局部pH環(huán)境。這樣的系統(tǒng)等同于稱為色譜聚焦的固相分離技術(shù)。區(qū)別主要在于帶電糖組分的促卵泡素異構(gòu)體是在色譜聚焦吸附劑上分離的。
用于評(píng)定靜電或離子相互作用的其它吸附劑包括偶極-偶極相互作用吸附劑，其中的相互作用是靜電力，但是不涉及正規(guī)的電荷或可滴定蛋白供體或受體。
d.配位共價(jià)鍵相互作用吸附劑用于評(píng)定與金屬離子形成配位共價(jià)鍵的能力的吸附劑包括帶有(例如)二價(jià)或三價(jià)金屬離子的基體。固定化金屬離子螯合劑基體提供的固定化合成有機(jī)分子具有一個(gè)或兩個(gè)供電子基團(tuán)，這些基團(tuán)形成與過(guò)渡金屬離子之間配位共價(jià)鍵相互作用的基礎(chǔ)。作為固定化金屬離子螯合劑的基本供電子基團(tuán)包括氧，氮和硫。金屬離子與固定化金屬離子螯合劑結(jié)合，形成留有數(shù)個(gè)位置與分析物上供電子基團(tuán)反應(yīng)的金屬離子配合物。合適的金屬離子一般為例如銅、鎳、鈷、鋅、鐵等過(guò)渡金屬離子，以及諸如鋁和鈣等其它金屬離子。除特定的理論之外，金屬離子被認(rèn)為與肽、蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基或核酸選擇性反應(yīng)。通常，參與這類相互作用的氨基酸殘基有組氨酸殘基，酪氨酸殘基，色氨酸殘基，半胱氨酸殘基，以及具有氧基的氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。例如，固定化三價(jià)鐵離子與蛋白質(zhì)上的磷酸絲氨酸，磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸殘基反應(yīng)。根據(jù)固定化的金屬離子，只有那些上述氨基酸殘基的局部密度足夠大的蛋白質(zhì)才被保留。某些金屬離子與蛋白質(zhì)之間的相互作用如此之強(qiáng)以致于無(wú)法用常規(guī)方法從配合物中切取蛋白質(zhì)。高度磷酸化的人β酪蛋白與固定化Fe(III)的結(jié)合非常強(qiáng)。表達(dá)時(shí)帶有6-組氨酸標(biāo)記的重組蛋白與固定化Cu(II)和Ni(II)的結(jié)合非常強(qiáng)。
e.酶活位點(diǎn)相互作用吸附劑用于評(píng)定酶活位點(diǎn)結(jié)合的吸附劑包括蛋白酶(例如胰蛋白酶)，磷酸酯酶，激酶和核酸酶。這種相互作用是分析物(通常是一種生物聚合物)上酶結(jié)合位點(diǎn)與酶上催化性結(jié)合位點(diǎn)之間的一種序列特異性相互作用。這類酶結(jié)合位點(diǎn)包括例如胰蛋白酶上與序列中具有賴氨酸-賴氨酸或賴氨酸-精氨酸的蛋白質(zhì)和肽相互作用的活性位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，大豆胰蛋白酶抑制劑與固定化胰蛋白酶吸附劑作用并結(jié)合?；蛘撸z氨酸蛋白酶選擇性滯留在固定化L-精氨酸吸附劑上。
f.可逆共價(jià)相互作用吸附劑用于評(píng)定可逆共價(jià)相互作用的吸附劑包括二硫鍵互換作用吸附劑。二硫鍵互換作用吸附劑包括具有固定化巰基(例如巰基乙醇或固定化二硫蘇糖醇)的吸附劑。相互作用的基礎(chǔ)是在吸附劑與分析物上暴露于溶劑中的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。這類吸附劑結(jié)合具有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)或肽以及堿基被修飾成包含還原硫化合物的核酸。
g.糖蛋白相互作用吸附劑用于評(píng)定糖蛋白相互作用的吸附劑包括例如內(nèi)有固定化凝集素(即帶有寡糖的蛋白質(zhì))的吸附劑，例如Pharmacia Biotech of Piscataway，New Jersey出售的CONCONAVALINTM。這類吸附劑的作用基礎(chǔ)涉及對(duì)大分子上糖部分的分子識(shí)別的相互作用。與糖蛋白相互作用吸附劑反應(yīng)并與之結(jié)合的分析物包括例如糖蛋白，特別是富含組氨酸的糖蛋白，全細(xì)胞或分離的亞細(xì)胞成分。
h.生物特異性相互作用吸附劑用于評(píng)定生物特異性相互作用的吸附劑通常稱為“生物特異親合性吸附劑”。如果吸附作用有選擇性，而且親合力至少為10-3M至例如10-5M、10-7M，10-9M，則認(rèn)為是生物特異性的。生物特異親合性吸附劑的例子包括任何與特定生物分子特異性反應(yīng)并與之結(jié)合的吸附劑。生物特異親合性吸附劑包括例如結(jié)合抗原的固定化抗體；結(jié)合DNA結(jié)合蛋白、DNA和RNA的固定化DNA；結(jié)合蛋白質(zhì)或酶的固定化底物或抑制劑；結(jié)合藥物結(jié)合蛋白的固定化藥物；結(jié)合受體的固定化配體；結(jié)合配體的固定化受體；結(jié)合DNA和RNA結(jié)合蛋白的固定化RNA；結(jié)合生物素和生物素化分子的固定化親合素或鏈霉親合素；結(jié)合脂質(zhì)體結(jié)合蛋白的磷酸脂質(zhì)膜和運(yùn)載體。酶是可用來(lái)修飾與之結(jié)合的分析物的吸附劑。細(xì)胞是有用的吸附劑。它們的表面具有復(fù)雜的結(jié)合特性。與細(xì)胞的吸附可用來(lái)鑒定例如結(jié)合表面受體的配體或信號(hào)分子。病毒和噬菌體也可用作吸附劑。病毒常具有細(xì)胞表面受體的配體(例如CD4的gp120)。而且，在噬菌體展示文庫(kù)形式中，噬菌體包被蛋白起著與靶分子結(jié)合的檢測(cè)劑的作用。生物特異性相互作用吸附劑依賴于上述公知的特異性反應(yīng)。吸附劑可利用的其它生物特異性相互作用的例子對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，而且包括在本發(fā)明構(gòu)思中。
實(shí)施例之一中，生物特異性吸附劑還具有某種助劑，或“輔助者”，即不直接參與與靶分析物結(jié)合的分子。
i.結(jié)合特異性程度通過(guò)接觸具有不同相互作用方式的吸附劑，樣品中的組分根據(jù)其與不同吸附劑的相互作用被大致區(qū)分。這樣，分析物與具有不同相互作用方式的吸附劑之間的引力提供了第一分離參數(shù)。例如，通過(guò)含分析物的樣品與以疏水性為引力基礎(chǔ)的第一吸附劑和以離子電荷為引力基礎(chǔ)的第二吸附劑接觸，可從樣品中分離出結(jié)合疏水性吸附劑的分析物，和分離出結(jié)合帶有特定離子電荷的吸附劑的分析物。
具有不同引力基礎(chǔ)的吸附劑能夠低特異性地分辨分析物，因?yàn)槲絼┎粌H結(jié)合分析物，而且結(jié)合樣品中以同一引力基礎(chǔ)吸引吸附劑的其它成分。例如，疏水性吸附劑不僅結(jié)合疏水性分析物，還結(jié)合樣品中其它疏水性成分；負(fù)電吸附劑不僅結(jié)合正電分析物，還結(jié)合樣品中其它正電成分；等等。
通過(guò)采用相對(duì)中等特異性的結(jié)合特性或改變引力強(qiáng)度可以進(jìn)一步改善以分析物與吸附劑之間的引力為基礎(chǔ)的分析物分辨率?；谥械忍禺愋越Y(jié)合特性的分析物分辨率可用混合官能團(tuán)吸附劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)以較低特異性完成分析物的分辨后，可結(jié)合多種其它結(jié)合和洗脫特性利用吸引感興趣的分析物的結(jié)合特性，以去除仍為不需要的組分，由此分辨出分析物。
例如，如果分析物結(jié)合疏水性吸附劑，可通過(guò)提供以疏水性相互作用為引力基礎(chǔ)之一且另含第二種不同的引力基礎(chǔ)的混合官能吸附劑將分析物進(jìn)一步與其它疏水性樣品組分分開(kāi)?；旌瞎倌芪絼┛赡鼙憩F(xiàn)出疏水性相互作用和負(fù)電離子相互作用，所以結(jié)合帶正電的疏水性分析物。或者，混合官能吸附劑可能表現(xiàn)出疏水性相互作用和與金屬離子形成配合共價(jià)鍵的能力，所以結(jié)合能與吸附劑上金屬離子形成配位配合物的疏水性分析物。基于以上公開(kāi)內(nèi)容和舉例，表現(xiàn)出中等特異性結(jié)合特性的其它吸附劑例子對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
基于中等特異性結(jié)合特性分辨分析物可以通過(guò)利用較高特異性的結(jié)合特性來(lái)進(jìn)一步精細(xì)化。利用較高特異性的結(jié)合特性可以通過(guò)使用引力基礎(chǔ)相同但引力強(qiáng)度不同的多種吸附劑。換言之，雖然引力基礎(chǔ)相同，但是用對(duì)分析物親合性程度不同的吸附劑可以進(jìn)一步將分析物與其它樣品組分區(qū)分。
例如，基于自身酸性結(jié)合吸附劑的某分析物可用特定酸性pH范圍內(nèi)對(duì)分析物具有親合性的吸附劑將其與其它酸性樣品組分進(jìn)一步區(qū)分。這樣，分辨分析物可以是用一種吸附劑吸引pH1-2的樣品組分，用另一種吸引pH3-4的樣品組分，用第三種吸附劑吸引pH5-6的樣品組分。以這種方式，可以將對(duì)結(jié)合pH5-6分析物的吸附劑具有親合性的分析物與pH1-4的分析物分辨開(kāi)來(lái)。通過(guò)降低引力間隔，即表現(xiàn)出相同引力基礎(chǔ)的吸附劑結(jié)合特性間的差異，可以使用更高特異性的吸附劑。
吸附于原吸附劑的原分析物本身可能具有吸附劑性能。此時(shí)，吸附于基質(zhì)的原分析物可變成第二吸附劑用于分離第二分析物。以此類推，滯留的第二分析物可以作為第三吸附劑從樣品中分離第三分析物。以上過(guò)程可重復(fù)數(shù)次。
2.洗脫劑洗脫劑或稱洗滌溶液選擇性地改變分析物與吸附劑之間的吸附閾值。洗脫劑解吸和洗脫已結(jié)合分析物的能力與其洗脫特性有關(guān)。不同的洗脫劑可能表現(xiàn)出大不相同的洗脫特性，有些不同的洗脫特性或略有不同的洗脫特性。
洗脫劑與吸附劑的接觸溫度與具體的樣品和選用的吸附劑有關(guān)。通常，洗脫劑在0℃至100℃間的某溫度接觸吸附劑，以4℃至37℃為佳。但是，對(duì)有某些洗脫劑來(lái)說(shuō)，其它溫度更合適，這些，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易確定。
和吸附劑一樣，洗脫特性大不相同的洗脫劑通常引力基礎(chǔ)不同。例如，洗脫劑與分析物之間各種引力基礎(chǔ)包括電荷或pH，離子強(qiáng)度，水結(jié)構(gòu)，特定競(jìng)爭(zhēng)性試劑的濃度，表面張力，介電常數(shù)以及上述數(shù)者。
a.基于pH的洗脫劑基于pH(即電荷)改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括已知的pH緩沖劑，酸溶液和堿溶液。通過(guò)用特定pH的緩沖劑洗滌結(jié)合的分析物可以改變電荷，所以可能削弱特定pH下吸附劑與分析物之間的結(jié)合強(qiáng)度。在洗脫劑的pH下競(jìng)爭(zhēng)性較低的分析物將從吸附劑上解吸而洗脫，僅留下在洗脫劑的pH下與吸附劑結(jié)合更牢固的分析物。
b.基于離子強(qiáng)度的洗脫劑在離子強(qiáng)度上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括各種類型和濃度的鹽溶液。溶于洗脫劑溶液的鹽量影響著洗脫劑的離子強(qiáng)度，相應(yīng)改變吸附劑的結(jié)合能力。低鹽濃度的洗脫劑在離子強(qiáng)度上對(duì)吸附劑結(jié)合能力的改變較小。高鹽濃度的洗脫劑在離子強(qiáng)度上對(duì)吸附劑結(jié)合能力的改變較大。
c.基于水結(jié)構(gòu)的洗脫劑通過(guò)改變水結(jié)構(gòu)或濃度來(lái)改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括尿素和離液性鹽溶液。通常，尿素溶液包括濃度在0.1至8M的溶液。可用來(lái)提供洗脫劑的離液鹽包括硫氰化鈉?；谒Y(jié)構(gòu)的洗脫劑因水合作用或結(jié)合水的改變而改變吸附劑的吸附能力。這類洗脫劑包括例如甘油，乙二醇和有機(jī)溶劑。離液陰離子提高非極性成分的水溶性因而降低分析物與吸附劑之間的疏水作用。
d.基于除垢劑的洗脫劑在表面張力和分析物結(jié)構(gòu)上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括除垢劑和表面活性劑。適合用作洗脫劑的除垢劑包括離子型和非離子型除垢劑，例如CHAPS，TWEEN和NP-40?；诔竸┑南疵搫└淖兾絼┙Y(jié)合分析物的能力是因?yàn)椋?dāng)引入了除垢劑的疏水性和親水性基團(tuán)時(shí)，疏水相互作用被改變。分析物和吸附劑之間以及分析物內(nèi)部的疏水相互作用被改變并且引入了帶電基團(tuán)，例如，離子型除垢劑SDS引起蛋白質(zhì)變性。
e.基于疏水性的洗脫劑在介電常數(shù)上改變吸附劑選擇性的洗脫劑是在疏水相互作用方面改變吸附劑選擇性的洗脫劑。具有此種能力的洗脫劑的合適實(shí)例有尿素有機(jī)溶劑(0.1-8M)，例如丙醇、乙腈、乙二醇和甘油，還有前文所述的除垢劑。乙腈常在反相層析中用作洗脫劑。在洗脫劑中包含乙二醇能夠從用親硫型吸附劑進(jìn)行的鹽促反應(yīng)中洗脫免疫球蛋白。
f.組合洗脫劑合適的洗脫劑可以是選自以上的任何一種，也可以由以上兩種或兩種以上組合而成。包含兩種或兩種以上上述洗脫劑的洗脫劑能夠基于多種洗脫特性改變吸附劑對(duì)分析物的選擇性。
3.兩參數(shù)的可變性通過(guò)選用不同吸附劑來(lái)提供不同吸附特性的能力和通過(guò)用不同洗脫劑洗滌來(lái)提供不同洗脫特性的能力允許兩參數(shù)各自改變，各自都能影響分析物結(jié)合吸附劑的選擇性。這兩個(gè)參數(shù)能夠作較大范圍的改變提供了一個(gè)較大范圍的結(jié)合引力和洗脫條件，使得本發(fā)明方法能夠用于結(jié)合并由此檢測(cè)多種不同類型的分析物。
即使尚不知道分析物的性質(zhì)，在分析特定樣品時(shí)吸附劑和洗脫劑的選擇仍取決于樣品的性質(zhì)和有待描述的具體分析物或分析物所屬類別。通常，較適宜的是提供一個(gè)表現(xiàn)出多種結(jié)合特性和多種洗脫特性的系統(tǒng)，尤其是在樣品組成未知時(shí)。通過(guò)提供選擇特性范圍較寬的系統(tǒng)，目標(biāo)分析物被一種或多種吸附劑保留的可能性將顯著提高。
化學(xué)或生物化學(xué)分析領(lǐng)域的技術(shù)人員都能夠確定用于通過(guò)提供具有廣泛結(jié)合和洗脫特性的系統(tǒng)來(lái)保留特定分析物的選擇性條件，并評(píng)定出提供最佳分析物分辨率的結(jié)合和洗脫特性。因?yàn)楸景l(fā)明提供了具有多種選擇性條件的系統(tǒng)，無(wú)需過(guò)多的試驗(yàn)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員就能夠方便地確定特定分析物的最適結(jié)合和洗脫特性。
C.分析物本發(fā)明能夠基于分析物的多種生物、化學(xué)、或理化特性通過(guò)合適的選擇性條件利用這些特性來(lái)分辨分析物。眾多通過(guò)合適的選擇性條件可加以利用的分析物特性包括疏水性指數(shù)(或分析物中疏水性殘基的量度)，等電點(diǎn)(即分析物不帶電時(shí)的pH)，疏水性力矩(分析物的兩性量度或極性與非極性殘基分布的不對(duì)稱性)，側(cè)向偶極力矩(或分析物內(nèi)電荷分配布的不對(duì)稱性)，分子結(jié)構(gòu)因子(引起分析物分子表面構(gòu)形改變，例如沿分子骨架大側(cè)鏈的分布改變)，二級(jí)結(jié)構(gòu)組成(例如螺旋、平行和反平行平面)，二硫鍵，暴露于溶劑的供電子基團(tuán)(例如His)，芳香性(或分析物內(nèi)芳香基之間pi-pi相互作用的量度)和帶電原子間的線性距離。
以上是可用本發(fā)明方法通過(guò)選擇合適的選擇性特性從樣品中分辨出給定分析物的特性種類的代表性舉例?？勺鳛榉直鏄悠分刑囟ǚ治鑫锏幕A(chǔ)的其它合適的分析物特性是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的，并且包括在本發(fā)明構(gòu)思中。
本發(fā)明在可分析的樣品類型上沒(méi)有限制。樣品可以是固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)，但通常，樣品是液態(tài)的。固態(tài)或氣態(tài)樣品最好用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)溶于合適的溶劑成為液態(tài)樣品。樣品可以是生物組合物，非生物有機(jī)組合物或無(wú)機(jī)組合物。本發(fā)明特別適用于分辨生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物；還特別適用于分辨非生物有機(jī)組合物中的分析物，尤其是有機(jī)小分子和無(wú)機(jī)分子的組合物。
分析物可以是分子，多聚分子復(fù)合物，大分子組合物，細(xì)胞，亞細(xì)胞器，病毒，分子片段，離子或原子。分析物可以是樣品中的單獨(dú)一種組分，也可以是具有一個(gè)或多個(gè)相同特性(例如分子量、等電點(diǎn)、離子電荷、疏水/親水相互作用等)并且具有結(jié)構(gòu)、化學(xué)、生物或功能關(guān)聯(lián)的一類組分。
可用本發(fā)明滯留層析法分辨的分析物的具體實(shí)例包括生物大分子，例如肽、蛋白質(zhì)、酶、聚核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、寡糖、多糖；上述生物大分子的片段，例如核酸片段、肽片段和蛋白質(zhì)片段；上述生物大分子的復(fù)合物，例如核酸復(fù)合物，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，受體-配體復(fù)合物，酶-底物、酶抑制劑，肽復(fù)合物，蛋白復(fù)合物，糖復(fù)合物和多糖復(fù)合物；生物小分子，例如氨基酸、核苷酸、核苷、單糖(sugar)、甾體、脂質(zhì)體、金屬離子、藥物、激素、酰胺、胺、羧酸、維生素和輔酶、醇、醛、酮、脂肪酸、卟啉、類胡蘿卜素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、磷酯和核苷二磷糖、合成小分子，例如藥學(xué)或治療上的有效藥物、單體、肽類似物、甾體類似物、抑制劑、誘變劑、致癌物、抗有絲分裂藥、抗生素、離子載體、抗代謝藥、氨基酸類似物、抗菌劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、表面活性劑、線粒體和葉綠體功能抑制劑、供電子體、運(yùn)載體和受體，合成的蛋白酶底物，磷酸酶底物，酯酶和脂酶的底物，和蛋白質(zhì)修飾劑；以及合成的聚合物、寡聚物和共聚物，例如聚烯、聚酰胺、聚(甲基)丙烯酸、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚羧酸酯、聚鹵乙烯、聚硅烷、POMA、PEG和以上兩者或兩者以上的共聚物。III.信息處理在特定洗脫條件下檢測(cè)被吸附劑結(jié)合的分析物提供了有關(guān)樣品中分析物及其化學(xué)特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結(jié)合特性。與吸附劑結(jié)合的分析物具有使得結(jié)合成為可能的特性。例如，在特定pH下是陽(yáng)離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結(jié)合。強(qiáng)陽(yáng)離子分子只有在很強(qiáng)的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。具有疏水區(qū)的分子將結(jié)合疏水性吸附劑，而具有親水區(qū)的分子將結(jié)合親水性吸附劑。同樣，相互作用的強(qiáng)度在一定程度上取決于分析物包含疏水區(qū)或親水區(qū)的程度。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結(jié)合某種吸附劑的確定不僅通過(guò)分析物的彼此分離和與不具有結(jié)合所需的相應(yīng)化學(xué)特性的分析物的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學(xué)特性的一類或單個(gè)分析物。采集有關(guān)分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細(xì)分辨混合物中的分析物，而且提供有關(guān)分析物的化學(xué)信息，這些信息本身就可以完成對(duì)他們的鑒定。這種數(shù)據(jù)被稱為“滯留數(shù)據(jù)”。
用可編程計(jì)算機(jī)分析滯留試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)是最簡(jiǎn)便的。計(jì)算機(jī)程序一般包括一個(gè)儲(chǔ)存編碼的可讀介質(zhì)。某計(jì)算機(jī)編碼進(jìn)入存儲(chǔ)，其中包含了基質(zhì)陣列上各特征點(diǎn)的位置，該處的吸附劑和用來(lái)洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某特定選擇性條件的一組特征。計(jì)算機(jī)還包括這樣的編碼，它們接受來(lái)自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)指示所測(cè)分析物的數(shù)量，可能包括所測(cè)各分析物的信號(hào)強(qiáng)度和測(cè)得的分子量。
計(jì)算機(jī)還具有處理數(shù)據(jù)的編碼。本發(fā)明構(gòu)思包含了多種處理數(shù)據(jù)的方法。實(shí)施例之一中，處理方法涉及形成一個(gè)分析物識(shí)別特征概況。例如，可將據(jù)分子量測(cè)得的特定分析物的滯留情況數(shù)據(jù)根據(jù)特定的結(jié)合特性(例如與陰離子吸附劑或疏水性吸附劑結(jié)合)分類。收集到的數(shù)據(jù)提供某特定分析物化學(xué)特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結(jié)構(gòu)。例如，在配位共價(jià)金屬螯合劑上滯留說(shuō)明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基。根據(jù)不同pH洗脫條件下在多種陽(yáng)離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數(shù)據(jù)所揭示的信息可以得出某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。這進(jìn)而反映出該蛋白質(zhì)內(nèi)離子氨基酸的大致數(shù)量。所以，計(jì)算機(jī)可能包含將結(jié)合信息轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)信息的編碼。而且，對(duì)分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識(shí)別特征，這可以由結(jié)合或質(zhì)量差異反映出來(lái)。
另一實(shí)施例中，在一組相同選擇性閾值下對(duì)兩種不同的細(xì)胞進(jìn)行滯留試驗(yàn)，并將兩次試驗(yàn)的滯留數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。滯留圖(即任一特征點(diǎn)信號(hào)的存在或強(qiáng)度)內(nèi)的差異顯示由兩細(xì)胞差異表達(dá)分析物。這可能包括，例如，形成一個(gè)顯示兩次滯留試驗(yàn)之間結(jié)合信號(hào)差異的差異圖，由該圖顯示在兩試驗(yàn)中，那些分析物被吸附劑保留增加或減少。
計(jì)算機(jī)還可能包含接收程序員輸入的指令的編碼。陣列內(nèi)特定、預(yù)定位置上分析物選擇性解吸的累進(jìn)和邏輯軌跡是可以預(yù)計(jì)并編程的。
計(jì)算機(jī)能夠?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成另一種格式供顯示。數(shù)據(jù)分析包括由收集到的數(shù)據(jù)確定(例如)與特征點(diǎn)位置有關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度，去除“界外值”(偏離預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布的數(shù)據(jù))，和由留下的數(shù)據(jù)計(jì)算分析物的相對(duì)結(jié)合親合力。
得出的數(shù)據(jù)可以各種格式顯示。一種格式中，信號(hào)強(qiáng)度顯示成分子量的函數(shù)圖。另一種格式又稱“凝膠格式”，其中，信號(hào)強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示，得出的外觀類似于凝膠上的條帶。另一格式中，達(dá)到一定閾值的信號(hào)顯示為分子量橫軸上的垂直線或條柱。于是，各條柱代表一種所測(cè)分析物。數(shù)據(jù)還可以顯示成根據(jù)結(jié)合特性和/或洗脫特性歸類的某分析物的信號(hào)強(qiáng)度圖。IV.滯留層析的應(yīng)用滯留層析涉及多種分離方法的組合，包括并行檢測(cè)和描述多種分析物。這些組合方法具有多種用途。這些用途包括但不限于發(fā)展靶分析物檢測(cè)法；發(fā)展蛋白質(zhì)純化策略；蛋白質(zhì)純化方法；從噬菌體展示文庫(kù)中鑒定出結(jié)合靶分析物的特定噬菌體，包括用互補(bǔ)噬菌體展示文庫(kù)鑒定靶表位；基于分析物理化特性的蛋白質(zhì)鑒定；基因表達(dá)監(jiān)測(cè)和差異蛋白質(zhì)展示；毒理學(xué)篩選；多種診斷標(biāo)記的同時(shí)檢測(cè)；藥物開(kāi)發(fā)；聚合蛋白組裝監(jiān)測(cè)和體外聚核苷酸翻譯檢測(cè)。
A.從一樣品中依次抽提分析物的方法滯留層析涉及在多種吸附/洗脫條件下分析某分析物的滯留情況。這種方法的一種改變是依次抽提。在依次抽提中，樣品并不是毫無(wú)關(guān)聯(lián)地與兩種不同的選擇性條件接觸。相反，樣品與第一選擇性條件接觸，從樣品中抽提出某些分析物到吸附劑上，并在洗脫劑中留下未吸附的分析物。然后，該洗脫劑與第二選擇性條件接觸。這進(jìn)一步從洗脫劑中抽提出各種分析物。通常，如果第一和第二次接觸中的洗脫劑具有不同的引力基礎(chǔ)(例如正常相和疏水性)，吸附劑將從洗脫劑中抽提出一組不同的分析物。第二洗脫劑然后接觸第三選擇性條件，并以此類推。在進(jìn)行依次抽提的實(shí)施例中，吸附劑被置于測(cè)試格底以便樣品在它上面混合。在吸附劑中加入某種洗脫劑，樣品中的分析物與吸附劑結(jié)合后，收集洗脫劑洗液。集得的洗液然后接觸第二吸附劑，并通過(guò)結(jié)合從樣品中抽提出分析物。
實(shí)施例之一中，依次抽提的目的是制備而不是分析。更具體地說(shuō)，目標(biāo)可能是為了抽提樣品中除所需分析物外的所有其它組分。此時(shí)，樣品量一般很少，例如一個(gè)直徑幾毫米位點(diǎn)上的幾微升。吸附劑的選擇目的是不吸附希望留在樣品中的分析物。數(shù)次重復(fù)后，最終集得的洗液中沒(méi)有不需要的分析物，而留有需要的供以后的分析，例如解吸譜法或傳統(tǒng)的層析法。
另一實(shí)施例中，用各種分析技術(shù)分析了沒(méi)有滯留的樣品本身中的分析物。甚至在一步滯留后，該方法允許對(duì)吸附于吸附劑的物質(zhì)和未吸附的分析物進(jìn)行檢測(cè)。
B.逐步分辨樣品中分析物的方法滯留層析的一個(gè)目的是從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。這對(duì)于臨床診斷、藥物開(kāi)發(fā)和功能性基因組來(lái)說(shuō)特別重要。這些領(lǐng)域可能涉及從生物樣品中鑒定出一種或多種分析物。本發(fā)明提供了一種鑒定改善某分析物分辨率的選擇性條件的方法。該方法涉及鑒定這樣一種分析物被保留的選擇性條件，以及在重復(fù)過(guò)程中，增加選擇性條件的結(jié)合特性或洗脫特性，從而提高分析物的分辨率。
一份復(fù)雜樣品與選擇性條件接觸的質(zhì)譜一般包括樣品中許多組分的信號(hào)。信號(hào)的復(fù)雜性會(huì)干擾分析物的準(zhǔn)確分辨。逐步分辨分析物的方法能夠鑒定出提高分析物分辨率的選擇性條件，從而可準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的分析物。如果分析物的信號(hào)更易于與其他組分的信號(hào)相區(qū)分，則該選擇性條件表現(xiàn)出與其他選擇性條件相比對(duì)某分析物“更高的分辨率”。這可能包括(例如)減少吸附于吸附劑的分析物數(shù)量，由此減少信號(hào)總數(shù)，或提高選擇性條件對(duì)該分析物的選擇性，由此比之他信號(hào)增強(qiáng)該分析物的信號(hào)。當(dāng)然，當(dāng)僅有分析物結(jié)合吸附劑時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中只產(chǎn)生分析物信號(hào)。
逐步分辨方法涉及一重復(fù)過(guò)程，在其中，更多的選擇性(結(jié)合或洗脫)特性依次加到已知保留分析物的一選擇性條件常數(shù)組中。第一步中，測(cè)試一系列選擇性條件以鑒定出保留靶分析物的那個(gè)。下一步中，挑選該選擇性條件的一種或多種選擇性特性作為以后試驗(yàn)中的常數(shù)組。
產(chǎn)生一組新的選擇性條件。組中各選擇性條件包括選在常數(shù)組中的特性和至少一個(gè)常數(shù)組中沒(méi)有的新條件。例如，常數(shù)組包括陰離子吸附劑和低鹽洗脫劑，新條件將包括洗脫劑pH改變。分別測(cè)試這些新變量提高分析物分辨率的能力，鑒定出提高分辨率的修飾選擇性條件。后一步中，在常數(shù)組中加入提高分辨率的新選擇性條件。
以同樣方法，通過(guò)產(chǎn)生包括常數(shù)組特性和一組新特性的新的選擇性條件組測(cè)試修飾常數(shù)組。這樣，在每一步，都挑選選擇性條件，使得分析物的分辨率與前一步的選擇性條件相比有所提高。
實(shí)施例對(duì)該方法進(jìn)行了詳細(xì)的描述。細(xì)胞樣品通常包含數(shù)以百千計(jì)的蛋白質(zhì)。人們可能希望準(zhǔn)確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，吸附劑可以是陰離子交換劑，陽(yáng)離子交換劑，正常相吸附劑和反相吸附劑。在各種吸附劑上測(cè)試的洗脫條件可以是不同的pH水平，不同的離子強(qiáng)度，不同的除垢劑條件和不同的疏水性條件。例如，對(duì)各種條件，可進(jìn)行4種不同洗脫條件的測(cè)試。這樣，在該實(shí)施例中，測(cè)試了16種洗脫劑條件吸附靶分析物的能力。
從該滯留圖可以挑選出至少一種靶分析物被保留的選擇性條件?？梢蕴暨x靶分析物發(fā)生最大結(jié)合的選擇性條件。但是，如果該選擇性條件對(duì)靶分析物的選擇性比其他選擇性條件更強(qiáng)，則宜選擇靶分析物吸附并非最大的條件。例如，假設(shè)滯留圖分析顯示，在中性pH附近，靶分析物被陰離子交換劑保留，但也弱吸附于親水性吸附劑。
從經(jīng)鑒定保留分析物的選擇性條件中挑選出一種可變吸附劑或洗脫劑，用于所有此后的選擇性條件。在此，它被說(shuō)成是加到“選擇性條件常數(shù)組”中。
在下一次重復(fù)中，測(cè)試靶分析物在第二組多選擇性條件下的結(jié)合能力。第二組中的各選擇性條件包括選擇性條件常數(shù)組的元素。但是，各選擇性還包括其他變量一加入選擇性條件的不同吸附劑或洗脫劑。這樣，限于使用至少一組常數(shù)，第二組選擇性條件經(jīng)選擇仍比第一組更多樣。提高多樣性的方法包括，例如，測(cè)試某洗脫條件更細(xì)的梯級(jí)或測(cè)試吸附劑的不同強(qiáng)度。還可以包括，例如，在選擇性條件加入其他選擇性特性。
繼續(xù)該實(shí)施例，可將陰離子交換劑加入常數(shù)組中?，F(xiàn)在，用改變更大的變量(例如洗脫劑或吸附劑)測(cè)試該條件。被測(cè)洗脫劑可包含比之第一次重復(fù)梯級(jí)更細(xì)的不同低pH緩沖劑。例如，第一次重復(fù)的被測(cè)緩沖液是pH3.0，pH5.0，pH7.0和pH9.0，顯示靶分析物在中性pH附近與陰離子交換劑結(jié)合。在第二次重復(fù)中，測(cè)試緩沖液可以是pH5.0，pH5.5，pH6.0，pH6.5，pH7.0，pH7.5和pH8.0。此外，這些緩沖液還可以各自改變成包含其他洗脫特性，例如離子強(qiáng)度，疏水性等。
分析該階段得到的第二滯留圖常能夠鑒定出比第一輪中鑒定出的選擇性條件分辨率更好的條件。同樣，選擇該選擇性條件的一個(gè)變量加入選擇性條件常數(shù)組，用于下一次重復(fù)的分析。
繼續(xù)該實(shí)施例，假設(shè)第二輪中分辨分析物最佳的選擇性條件使用的是pH6.5的緩沖液?，F(xiàn)在可將該洗脫劑加入常數(shù)組，其中包括陰離子交換樹(shù)脂和pH6.5的緩沖液。在下一輪重復(fù)中，選擇性條件包含這一常數(shù)組和另一變量。這一變量可能是例如在洗脫劑中加入新的組分，例如不同的離子強(qiáng)度；或者，可將另一種吸附劑加入混合物，例如與陰離子交換吸附劑混合的多種疏水性吸附劑；或者，可以改變陰離子交換樹(shù)脂的密度。同樣，從這一組中鑒定出提高分析物分辨率的選擇性條件。
該過(guò)程可重復(fù)至分析物被純化到完全均一。此時(shí)，選擇性條件具有對(duì)分析物的專一性?？梢钥闯觯黾用恳徊街斜粶y(cè)變量的數(shù)目可減少鑒定合適的選擇性條件所需的重復(fù)次數(shù)。
C.制備性純化分析物的方法另一方面，本發(fā)明提供純化分析物的方法。該方法利用了滯留層析快速鑒定吸附某分析物的引力基礎(chǔ)的能力。第一步涉及分析物與多種選擇性條件接觸和用滯留層析測(cè)定這些條件下的滯留。由此得出分析物的識(shí)別特征概況。用分析物被保留的選擇性條件形成制備性純化分析物的方法。
為了制備性純化分析物，可以在通過(guò)分析物結(jié)合過(guò)程所鑒定的吸附劑/洗脫劑條件中吸附和洗脫分析物。這樣，識(shí)別圖可能顯示分析物結(jié)合正常相吸附劑和金屬螯合劑。然后，分析物與含有結(jié)合分析物的正常相吸附劑的第一層析柱接觸。洗去不結(jié)合的物質(zhì)。用足夠嚴(yán)格的洗滌洗脫分析物。然后，洗脫劑與金屬螯合劑柱接觸以結(jié)合分析物。洗去不結(jié)合的物質(zhì)。然后，從金屬螯合劑柱上洗脫包括分析物在內(nèi)的被結(jié)合物質(zhì)。用這種方法分離出制備量的分析物。制備量的樣品至少為10μl，100μl，1ml或10ml。
逐步分辨分析物過(guò)程中得到的信息可用來(lái)設(shè)計(jì)大規(guī)模的蛋白質(zhì)純化層析(基于洗脫)。對(duì)靶分析物蛋白質(zhì)的吸附劑引力基礎(chǔ)，結(jié)合條件和洗脫條件(即選擇性條件)變成由滯留層析來(lái)確定。這一信息可節(jié)省目前所用的試差法設(shè)計(jì)純化方法所浪費(fèi)的大量時(shí)間、能量和昂貴的分析物。這一部分內(nèi)容還用市售的吸附劑進(jìn)行了大規(guī)模的純化。
D.特異性檢測(cè)分析物的探針的制備方法本發(fā)明提供用解吸質(zhì)譜法特異性檢測(cè)一種或多種分析物的探針和制備這些探針的方法。這類分析物分辨探針可用在診斷和分析方法中特異性檢測(cè)分析物。
制備分辨一種或多種分析物的探針的方法中，第一步是制作分析物在多種不同吸附劑/洗脫劑組合下的滯留圖。例如，可以用全部5種不同洗脫劑洗滌4種吸附劑來(lái)測(cè)定分析物的分辨情況。這為每種分析物提供了20組滯留數(shù)據(jù)。對(duì)所得滯留圖的分析將指明哪一種或哪一些選擇性條件分辨分析物最佳。更好的是，可以鑒定出準(zhǔn)確分辨所有分析物的一種選擇性條件。然后，選取一種或多種選擇性條件用在分辨探針中，使得每種分析物在至少一個(gè)吸附劑位點(diǎn)上被分辨。探針還可以包含不結(jié)合分析物的吸附劑。這一吸附劑位點(diǎn)被用作對(duì)照。挑選具有多個(gè)可定址位置吸附劑位點(diǎn)的探針，要求它們具有保留和分辨分析物的能力。此時(shí)，選擇能夠在單一洗脫條件下結(jié)合分析物的吸附劑。這是有用的，因?yàn)樵跈z測(cè)過(guò)程中可用一種洗脫劑洗滌整個(gè)探針。
得出的特定分析物的滯留圖可用來(lái)創(chuàng)制該分析物的定制吸附劑。例如，一種分析物被多種吸附劑保留顯示該分析物的一組引力基礎(chǔ)?？赏ㄟ^(guò)制備包括提供引力基礎(chǔ)的吸附劑要素的復(fù)合吸附劑來(lái)設(shè)計(jì)定制吸附劑。這樣的定制吸附劑對(duì)靶分析物很專一?？赡芤环N或數(shù)種定制吸附劑就足以產(chǎn)生分析物的識(shí)別圖。例如，若發(fā)現(xiàn)，在特定的洗脫條件下，分析物被結(jié)合具有一定程度疏水性、正電性和芳香性的物質(zhì)的吸附劑所保留，就可以通過(guò)設(shè)計(jì)或使用組合性合成法創(chuàng)制具有吸引全部上述三個(gè)特征的官能團(tuán)的定制吸附劑。檢測(cè)與這種吸附劑的結(jié)合就可鑒定出分析物。
這類探針可用來(lái)檢測(cè)樣品中的一種或多種分析物。樣品接觸選擇性條件，用解吸質(zhì)譜法檢測(cè)探針。因?yàn)樘结樂(lè)直娣治鑫?，分析物的存在可通過(guò)查看特征識(shí)別概況來(lái)測(cè)定。這類探針尤其適用于鑒定某患者樣品中的一組診斷標(biāo)記。
實(shí)施例之一中，設(shè)計(jì)排列來(lái)固定特定類型的蛋白質(zhì)，包括診斷標(biāo)記以及由功能所確定的分析物。例如，制備能特異性固定細(xì)胞表面蛋白，某種類型酶(如激酶)，轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞內(nèi)受體等的排列。該吸附劑可能對(duì)生物聚合物(例如抗體)有特異性。
實(shí)施例之一中，吸附劑是基因組件，例如展示一類蛋白的蛋白質(zhì)配體的噬菌體。此時(shí)，可用一類分子預(yù)篩選噬菌體展示文庫(kù)，去除與該類分子結(jié)合的噬菌體，然后用從中扣除的噬菌體作為吸附劑。
E.診斷探針和診斷方法診斷病理情況一般涉及檢測(cè)患者樣品中疾病的一種或多種分子標(biāo)記。某些病癥可以因存在一種診斷標(biāo)記而得以診斷。其它病癥的診斷可能涉及檢測(cè)多個(gè)診斷標(biāo)記。而且，檢測(cè)多個(gè)診斷標(biāo)記可提高診斷的可靠性。所以，本發(fā)明提供了用于解吸質(zhì)譜法的探針，它具有至少一種分辨病理情況的至少一種診斷標(biāo)記的吸附劑。
制備這類探針包括，首先，選擇待測(cè)標(biāo)記。這可以是任意疾病的標(biāo)記，例如癌癥，心臟病，自身免疫病，病毒感染，早老性癡呆(Alzheimer氏癥)或糖尿病。例如，前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)很能說(shuō)明是否前列腺癌。HIV感染可通過(guò)檢測(cè)數(shù)種HIV蛋白的抗體來(lái)診斷，例如p17、p24或p55之一和p31、p51或p66之一和gp41或gp120/160之一的抗體。腦髓液中檢測(cè)淀粉樣蛋白-β42和tau蛋白很能說(shuō)明是否早老性癡呆。而且，可用本發(fā)明方法檢測(cè)分析物在健康者和病者內(nèi)存在的差異來(lái)鑒定上述標(biāo)記。
下一步，產(chǎn)生保留一種或多種診斷標(biāo)記的吸附劑。較好的是，制備一種分辨所有分析物的吸附劑。這可以通過(guò)創(chuàng)建一個(gè)包含數(shù)種抗體的位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述抗體各自結(jié)合所需標(biāo)記之一?；蛘?，探針可具有多個(gè)吸附劑位點(diǎn)，各自能夠在一種選擇性條件下分辨至少一種分析物。實(shí)施例之一中，吸附劑是復(fù)合吸附劑，包含多種標(biāo)記的特異性配體。例如，吸附劑可包含特異性結(jié)合靶分析物的抗體、多肽配體或聚核苷酸。實(shí)施例之一中，抗體是篩選組合文庫(kù)鑒定得到的單鏈抗體?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明中所述的方法篩選噬菌體展示文庫(kù)來(lái)創(chuàng)制特定標(biāo)記的特異性單鏈抗體。
另一實(shí)施例中，吸附劑具有非有機(jī)生物分子組分，它們或者特異性保留靶分析物，或者以足夠的特異性保留分析物，供解吸質(zhì)譜法進(jìn)行準(zhǔn)確分辨。本發(fā)明也說(shuō)明了制備檢測(cè)特異性分析物的吸附劑的方法。
顯然，這類方法中的單個(gè)吸附劑位點(diǎn)不必是單一分析物特異性的，所以，不要求生物聚合物介導(dǎo)的靶分析物與吸附劑之間的特異性親合。在此之前的親合性檢測(cè)方法主要依賴于生物聚合物與靶分析物之間的特異性結(jié)合。這包括，例如抗體與蛋白質(zhì)，互補(bǔ)聚核苷酸之間或凝集素與糖的的特異性親合。這些特異性是必需的，因?yàn)槟切z測(cè)方法是間接的鑒定的不是靶分析物，而是通常結(jié)合于吸附劑的標(biāo)記。所以，吸附劑的特異性越高，雜質(zhì)結(jié)合吸附劑干擾特異性檢測(cè)的可能性就越小。但是，解吸譜法直接檢測(cè)分析物。所以，雜質(zhì)的存在不干擾特異性檢測(cè)，除非雜質(zhì)信號(hào)與靶信號(hào)重合。
診斷方法包括，首先，選擇待測(cè)的患者樣品。樣品可以是例如組織、血液、尿液、糞便或其他體液(淋巴液、腦髓液、關(guān)節(jié)內(nèi)滑液等)。然后，樣品與含有診斷吸附劑的基質(zhì)在允許診斷標(biāo)記滯留的條件下接觸。用合適的洗脫劑洗滌吸附劑。然后用解吸譜法(例如質(zhì)譜法)檢測(cè)(例如分辨)標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了特異性檢測(cè)診斷標(biāo)記的試劑盒，它具有(1)用在解吸譜法中的基質(zhì)，具有至少一個(gè)可定址位置內(nèi)的至少一種吸附劑，該吸附劑在至少一種包括吸附劑和洗脫劑的選擇性條件下分辨至少一種診斷標(biāo)記；和(2)洗脫劑或制備洗脫劑的說(shuō)明書。在樣品與吸附劑接觸并用洗脫劑洗滌后，即經(jīng)歷了選擇性條件后，分析物被充分純化或被特異性結(jié)合，供解吸譜法分辨。
F.鑒定蛋白質(zhì)的方法另一方面，本發(fā)明提供了一種協(xié)助鑒定蛋白質(zhì)的方法。該方法涉及用滯留層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分析物理化特征的匹配參數(shù)和檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定出具有匹配參數(shù)的蛋白質(zhì)。由基于滯留特性的信息得出理化特性的方法已在前文說(shuō)明過(guò)。數(shù)據(jù)庫(kù)一般提供各蛋白質(zhì)的氨基酸序列和/或編碼氨基酸序列的核苷酸序列。由這些信息可方便地得出諸如分子量、疏水性、pI、片段質(zhì)量等結(jié)構(gòu)特征。分析物蛋白質(zhì)將只與數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)子集的蛋白質(zhì)具有相同的特定結(jié)構(gòu)特征。所以，根據(jù)與分析物蛋白質(zhì)相同的結(jié)構(gòu)特征將蛋白質(zhì)分類，就能夠找到候選特征。這樣，就鑒定參比物一種或多種理化特性固有的準(zhǔn)確性、特異性程度或可靠性程度來(lái)看，數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)與參比物的所有特征不可能完全吻合。所以，可以設(shè)定匹配參數(shù)來(lái)鑒定例如蛋白分析物特征與數(shù)據(jù)庫(kù)中參比多肽特征的近似程度。
隨著鑒定基因組中基因的增多，蛋白分析物在數(shù)據(jù)庫(kù)中成為參比多肽的機(jī)會(huì)也隨之增加。所以，該方法能夠迅速分辨樣品中感興趣的蛋白質(zhì)，得到該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，然后用這種信息鑒定蛋白質(zhì)。
G.組裝多聚分子的方法吸附劑固定所需分子的能力可用來(lái)構(gòu)件多聚分子和評(píng)價(jià)影響其組建的化合物。多聚分子的一個(gè)單元與吸附劑結(jié)合。然后接觸含有多聚分子其他單元的樣品。接觸可以在多種條件下進(jìn)行以測(cè)定結(jié)合參數(shù)?？捎媒馕V法來(lái)監(jiān)測(cè)亞基與多聚物的結(jié)合。然后，可用相同的方法測(cè)試下一亞基的結(jié)合?？捎帽景l(fā)明所述的藥物篩選法來(lái)測(cè)試試劑干擾這種組裝的能力。所以，過(guò)程中某一階段的分析物在下一階段變成吸附劑。
H.進(jìn)行酶試驗(yàn)的方法本發(fā)明還提供了進(jìn)行酶試驗(yàn)的方法。酶試驗(yàn)通常包括在酶呈活性的條件下將待測(cè)樣品與酶底物接觸。任酶作用于底物后，檢測(cè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物。在定量試驗(yàn)中，測(cè)定的是產(chǎn)物量。通常將該量與對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出樣品中酶活的量。
本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中一種酶的方法，包括檢測(cè)酶活的量。該方法利用了這一事實(shí)，即，酶活性通常產(chǎn)生質(zhì)量與原底物不同的產(chǎn)物。在該方法中，制備含有結(jié)合底物的吸附劑的固相。一定量的底物與吸附劑結(jié)合。然后，吸附劑在一定條件下與樣品接觸一段時(shí)間，讓酶作用于底物。然后，用解吸譜法檢測(cè)被結(jié)合的物質(zhì)。檢測(cè)具有酶活產(chǎn)物分子量特征的分析物可說(shuō)明酶的存在。信號(hào)強(qiáng)度將與樣品中酶活量相關(guān)聯(lián)。
I.鑒定生物材料間差異表達(dá)的分析物的方法本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了鑒定在兩種或兩種以上樣品中差異表達(dá)的有機(jī)生物分子，特別是蛋白質(zhì)的方法?！安町惐磉_(dá)”指兩樣品間分析物量或質(zhì)上的差異。這些差異可能緣于蛋白質(zhì)表達(dá)的任一階段，即從轉(zhuǎn)錄到翻譯后修飾。該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組選擇性條件制備來(lái)自兩種生物樣品的分析物的識(shí)別概況圖。所用選擇性條件越多，樣品中分析物的分辨率越高，所以，可比較的分析物數(shù)量也越多。然后，比較識(shí)別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達(dá)的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。差異滯留還包括分析物質(zhì)的差異。例如，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的不同會(huì)造成識(shí)別圖的不同，檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為結(jié)合特性差異(例如，如果蛋白質(zhì)被糖基化則與凝集素結(jié)合將不同)或質(zhì)量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計(jì)算機(jī)進(jìn)行。
該方法特別適用于檢測(cè)兩種細(xì)胞差異表達(dá)的基因。兩種細(xì)胞可以是正常細(xì)胞和病理細(xì)胞例如癌細(xì)胞，或不同水平的細(xì)胞，或不同發(fā)育或分化階段的細(xì)胞，或細(xì)胞周期內(nèi)不同部分的細(xì)胞。但是，該方法也可用來(lái)檢測(cè)不同條件下的兩同種細(xì)胞。在這樣的方法中，一份生物樣品與測(cè)試試劑接觸，另一份不接觸。然后，比較兩者的滯留圖。根據(jù)滯留特性或質(zhì)量的不同，該方法可以顯示蛋白質(zhì)或其他生物分子表達(dá)的增加或減少，或發(fā)生了某種改變。
利用由滯留圖獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)理化特性信息，用本發(fā)明方法可測(cè)定蛋白質(zhì)的候選特征。
本方法適用于鑒定疾病的診斷標(biāo)記。與正常樣品或細(xì)胞相比，患者樣品或病理培養(yǎng)細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能就是診斷標(biāo)記。一般，最好將來(lái)自具有統(tǒng)計(jì)意義的患者群的樣品與正常樣品比較。這樣，可將信息集合起來(lái)鑒定出對(duì)于表現(xiàn)出疾病的所有個(gè)體或大多數(shù)個(gè)體來(lái)說(shuō)共同的診斷標(biāo)記。
I.通過(guò)分解代謝信號(hào)擴(kuò)增提高靈敏度將大蛋白分裂成小片段然后檢測(cè)這些小片段能夠顯著提高檢測(cè)大蛋白在復(fù)雜混合物中差異存在(例如，因?yàn)椴町惐磉_(dá))的靈敏度。靈敏度的提高有幾個(gè)原因。首先，當(dāng)樣品中所有蛋白都被(例如)酶解而片段化時(shí)，大蛋白可能產(chǎn)生更多片段而不是小蛋白。其次，解吸譜法的整體靈敏度在低分子量時(shí)高于高分子量時(shí)。第三，蛋白片段化增加了來(lái)自靶分析物的信號(hào)數(shù)量，因此提高了測(cè)得靶分析物的可能性。第四，蛋白片段化提高了捕獲可能性，因此提高了測(cè)得蛋白至少一種片段的可能性。第五，如果蛋白質(zhì)在兩種樣品中差異存在，那么通過(guò)增加來(lái)自該蛋白的信號(hào)數(shù)量，量的差異更可能被測(cè)得。
而且，該方法是反直觀的。通常，人們希望在分析前降低分析物混合物的復(fù)雜性。片段化卻提高了這種復(fù)雜性。
所以，在本發(fā)明實(shí)施例之一中，在檢測(cè)前將分析物轉(zhuǎn)化為低分子量片段提高了檢測(cè)靈敏度。片段化可以用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行。例如，可用內(nèi)切蛋白酶將蛋白分析物片段化。可用糖苷酶將糖分析物片段化?？捎脙?nèi)切核酸酶將核酸片段化。樣品的片段化可在用吸附劑固定之前或之后進(jìn)行。
J.鑒定受體的配體的方法生物系統(tǒng)的功能性路徑常涉及受體與配體間的相互作用。例如，轉(zhuǎn)錄激活中的結(jié)合常涉及在此之前配體與某轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。許多病理情況與受體與其配體間異常的相互作用有關(guān)。阻斷受體與配體間的相互作用常是藥物開(kāi)發(fā)的目的之一。但是，某受體的配體的特征經(jīng)常是未知的；受體是“孤兒”受體。
本發(fā)明提供了一種用滯留層析來(lái)鑒定受體的配體的方法。該方法涉及將受體固定于吸附劑。然后，可能含有該受體配體的樣品在適合受體與配體間結(jié)合的洗脫條件下與固定化受體接觸。然后，用解吸譜法檢測(cè)與受體結(jié)合的配體。該方法能夠利用解吸譜法的靈敏度來(lái)檢測(cè)固定于吸附劑的少量物質(zhì)。
將受體固定于吸附劑需要鑒定一種保留，最好是特異性結(jié)合受體的吸附劑。本發(fā)明已經(jīng)描述了鑒定特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的吸附劑的方法。在方法之一中，吸附劑含有該受體的特異性抗體。另一實(shí)施例中，受體是生產(chǎn)出的融合蛋白，具有一個(gè)特異性結(jié)合部分。例如，受體可與抗體的Fc部分融合。Fc部分可與蛋白A結(jié)合，后者可摻入吸附劑中。
由操作者考慮用來(lái)檢測(cè)是否存在某配體的樣品。例如，如果受體是核受體，則樣品可以是核提取物。如果受體是細(xì)胞質(zhì)受體，則樣品可以是細(xì)胞質(zhì)提取物。如果受體是細(xì)胞表面受體，則樣品可以是來(lái)自細(xì)胞所接觸表面的液體，例如用于上皮細(xì)胞表面受體的血清。
樣品一般與受體在生理?xiàng)l件下培育足夠的時(shí)間以允許結(jié)合，例如37℃數(shù)小時(shí)。然后，洗去不結(jié)合的物質(zhì)。該方法能夠迅速鑒定出常規(guī)技術(shù)需數(shù)月鑒定的配體。
滯留層析允許并行處理數(shù)個(gè)吸附劑位點(diǎn)上的樣品。所以，該方法可能涉及檢測(cè)多種樣品中是否存在某配體，以及在多種培育和洗脫條件下測(cè)試一種樣品。
通過(guò)測(cè)定鑒定到的配體的質(zhì)量和各種理化特性，用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息能夠正確鑒定配體。
本發(fā)明另一實(shí)施例中制備了一組探針，它們已經(jīng)接觸過(guò)并固定了某細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。這種探針本身可以用作第二探針來(lái)鑒定細(xì)胞中與固定化分子結(jié)合的分子。在由探針制備滯留圖后，探針再與測(cè)試物質(zhì)接觸，條件嚴(yán)謹(jǐn)性一般低于制備第二探針時(shí)的條件，分析可定址位置。新結(jié)合探針的分子即結(jié)合已固定分子的那些。
K.藥物開(kāi)發(fā)方法鑒定干擾受體與配體間結(jié)合的分子是藥物品開(kāi)發(fā)中的重要步驟。本發(fā)明提供了篩選化合物調(diào)節(jié)吸附劑與分析物(例如受體吸附劑和配體分析物)之間結(jié)合能力的方法，這是通過(guò)將吸附劑和分析物與測(cè)試化合物接觸，用解吸譜法檢測(cè)吸附劑與分析物之間的結(jié)合。
迅速篩選組合文庫(kù)以找出候選藥物要求能使靶分子受數(shù)以千計(jì)藥物的作用，并鑒定出干擾或促進(jìn)該作用的藥物。滯留層析能夠?qū)⑴潴w/受體對(duì)的成員之一固定到基質(zhì)上作為第二吸附劑。然后，在該成員接觸其伴侶和藥物后，可用解吸譜法測(cè)定伴侶是否結(jié)合以及結(jié)合程度。滯留層析篩選分子的優(yōu)點(diǎn)包括能夠通過(guò)吸附劑將受體特異性固定于基質(zhì)，能夠?qū)⑹荏w迅速布置在許多吸附劑位點(diǎn)以進(jìn)行并行處理，和因?yàn)橥ㄟ^(guò)解吸譜法讀結(jié)果而加速完成。
1.篩選試驗(yàn)該方法包括提供一種吸附劑；在有和沒(méi)有藥物存在下，在一種或多種選擇性條件下，將吸附劑與靶分析物接觸；測(cè)定有和沒(méi)有藥物存在下的結(jié)合量。結(jié)合量是用解吸譜法測(cè)定的(例如通過(guò)制作識(shí)別圖)。實(shí)驗(yàn)中有不加藥物的對(duì)照，或加有不同量或不同種藥物的對(duì)照，用外推法確定零點(diǎn)量。結(jié)合量上的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p＜0.05)說(shuō)明測(cè)試藥物調(diào)節(jié)結(jié)合。
該方法特別適用于篩選作為靶候選藥物的分析物(例如蛋白質(zhì))。在由血清或其他種類靶細(xì)胞形成蛋白滯留圖或識(shí)別圖后，藥物與滯留分析物陣列在它們的可定址位置上接觸。結(jié)合后，洗脫或洗去不結(jié)合的藥物。用解吸質(zhì)譜法直接鑒定特定選擇性條件下保留被結(jié)合藥物的那些分析物，因?yàn)樗幬锉旧肀憩F(xiàn)為滯留圖上的新組分(即，解吸藥物并直接檢測(cè))。該方法尤其適用于篩選候選藥物(包括活化劑和拮抗劑)結(jié)合分析物或調(diào)節(jié)一種或多種生物過(guò)程的能力。
2.受體與配體吸附劑與靶分析物不必發(fā)生特異性結(jié)合。但是，在特別有用的方法中，吸附劑和靶分析物是配體/受體對(duì)。
實(shí)施例之一中，配體/受體對(duì)是激素和細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體。吸附劑可以是完整細(xì)胞，或者，如果是細(xì)胞膜結(jié)合受體則可以是細(xì)胞膜?？捎玫鞍资荏w或其他靶候選藥物作用吸附劑篩選組合物藥物文庫(kù)?？蓪?shù)百種或數(shù)千種藥物作用于一種受體或可定址位置。在去除不結(jié)合或弱結(jié)合的候選藥物后，檢測(cè)結(jié)合的藥物并用解吸譜法鑒定。
另一實(shí)施例中，吸附劑是結(jié)合并修飾靶底物的酶。篩選藥物酶轉(zhuǎn)化分析物的能力。例如，可以檢測(cè)酶活，因?yàn)榉治鑫锏淖R(shí)別圖將因?yàn)槊富疃煌诋a(chǎn)物。差異滯留說(shuō)明藥物改變結(jié)合。
受體/配體可以多種方式滯留在基質(zhì)上。方法之一中，受體/配體被非特異性吸附劑直接滯留。另一方法中，吸附劑是受體/配體特異性的。例如，吸附劑可含有對(duì)受體/配體的特異性抗體。受體/配體可以是融合蛋白，其中的融合部分特異性結(jié)合吸附劑，例如，F(xiàn)c片段結(jié)合蛋白A。一方法中，表面具有特異性結(jié)合受體/配體的多肽的基因組件，例如噬菌體展示文庫(kù)中的一個(gè)噬菌體，與基質(zhì)結(jié)合。該配體被多肽捕獲。而且，吸附劑可以是已經(jīng)固定在基質(zhì)上的分析物，即，它可以是第二吸附劑、第三吸附劑等。
本發(fā)明提供了特別適用于評(píng)價(jià)藥物(或其他物質(zhì))結(jié)合靶分析物后直接和間接效果的方法。在由一種靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)得出的滯留圖上鑒定一種或多種分析物會(huì)因物質(zhì)(例如候選藥物)的以下作用而改變1)對(duì)結(jié)合靶分析物的蛋白質(zhì)本身的作用，2)對(duì)其他分析物(非藥物結(jié)合蛋白)的作用，或3)對(duì)基因表達(dá)的作用(正調(diào)或負(fù)調(diào))。是滯留層析的高分辨率和高信息性檢測(cè)出了這些改變即，藥物誘導(dǎo)了基因滯留圖或識(shí)別圖在有和沒(méi)有藥物時(shí)的差異，使得該方法成為用于蛋白質(zhì)、功能性基因組、藥物開(kāi)發(fā)、治療藥物檢測(cè)和臨床診斷最有效的方法之一。
3.測(cè)試藥物將有待篩選其調(diào)節(jié)凝血酶原(prothymosin)表達(dá)的能力的測(cè)試藥物給予受試動(dòng)物或體外培養(yǎng)的細(xì)胞。待檢藥物的選擇由醫(yī)師的處方?jīng)Q定。但是，考慮到藥物多樣性和給藥方便，優(yōu)選小分子作為測(cè)試藥物。
a.化學(xué)待測(cè)藥物可選自多種來(lái)源。例如，可得到分子的組合文庫(kù)用于篩選。用這類文庫(kù)可篩選數(shù)千分子的調(diào)控活性。一優(yōu)選實(shí)施例中，高處理量的篩選方法涉及提供一個(gè)包含大量潛在治療性化合物(候選化合物)的文庫(kù)。然后，如本發(fā)明所述，在一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)中篩選這樣的“組合化學(xué)文庫(kù)”，鑒定表現(xiàn)出所需特征活性的成員(特定種類或亞類的化學(xué)物質(zhì))。由此鑒定出的化合物可作為常規(guī)“引導(dǎo)”化合物，或其本身就可用作潛在或?qū)嶋H治療藥。
制備和篩選組合化學(xué)文庫(kù)是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。這類組合化學(xué)文庫(kù)包括但不限于肽文庫(kù)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,010,175，F(xiàn)urka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493，Houghton等(1991)Nature，35484-88)。肽合成絕不是本發(fā)明唯一考慮和準(zhǔn)備使用的方法。產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫(kù)的其它化學(xué)機(jī)制也可以使用。這些機(jī)制包括但不限于類肽(peptoid)(PCT公開(kāi)WO91/19735，1991年12月26日)，編碼的肽((PCT公開(kāi)WO93/20242，1993年10月14日)，隨機(jī)生物寡聚物(PCT公開(kāi)WO92/00091，1992年1月9日)，苯并二吖庚因(美國(guó)專利5,288,514)，乙內(nèi)酰脲、苯并二吖庚因和二肽之類diversomer(Hobbs等，(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913)，插烯類(vinylogous)多肽(Hagihara等，(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽類擬肽(Hirschmann等，(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，小化合物文庫(kù)的同類有機(jī)合成(Chen等，(1993)J.Amer.Chem.Soc.，1162661)，寡聚氨基甲酸酯(Cho等，(1993)Science2611303)，和/或磷酸肽酯(Campell等(1994)J.Org.Chem.59658)。一般參見(jiàn)，Gordon等，(1994)J.Med.Chem.371385，核酸文庫(kù)，肽核酸文庫(kù)(參見(jiàn)美國(guó)專利5,539,083)，抗體文庫(kù)(參見(jiàn)，Vaughn等，(1996)Nature Biotechnology，14(3)309-314)，和PCT/US96/10287)，糖文庫(kù)(參見(jiàn)，Liang等(1996)Science 2741520-1522，和美國(guó)專利5,593,853)，和小有機(jī)分子文庫(kù)(參見(jiàn)，苯并二吖庚因，Baum(1993)C&EN，Jan 18，p.33，異戊二烯化合物，美國(guó)專利5,569,588，噻唑烷酮(thiazolidinone)和間噻嗪烷酮(metathiazanone)，美國(guó)專利5,549,974，吡咯烷酮，美國(guó)專利5,525,735和5,519,134，嗎啉化合物，美國(guó)專利5,506,337，苯并二吖庚因，5,288,514，等)。
制備組合文庫(kù)的設(shè)備可以購(gòu)買(參見(jiàn)，375MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
L.產(chǎn)生特異性結(jié)合分析物的制劑的方法本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異性結(jié)合靶分析物的制劑(例如單鏈抗體)的方法。這些制劑可用作特異性診斷試劑在配體/受體相互作用研究中用于固定靶分析物。該方法特別適用于產(chǎn)生只可能分離到少量的針對(duì)靶分析物的物質(zhì)，通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)獲取它們是不可能或不可行的。該方法涉及提供附著有靶分析物的基質(zhì)；提供展示待篩選物質(zhì)的基因組件展示文庫(kù)；將文庫(kù)與靶分析物接觸，通過(guò)與靶分析物的反應(yīng)選擇性保留基因組件；和用解吸譜法檢測(cè)滯留的基因組件。
可以對(duì)復(fù)雜樣群中的大量候選吸附劑-分析物并行進(jìn)行以上步驟，沒(méi)有分開(kāi)選擇和檢測(cè)過(guò)程中的轉(zhuǎn)移損耗和混淆，這些步驟包括間接檢測(cè)方法中的離線擴(kuò)增和標(biāo)記。
1.提供基質(zhì)該方法的第一步是提供包含吸附劑的基質(zhì)，該吸附劑是待篩選文庫(kù)中某多肽的作用靶。實(shí)施例之一中，提供的基質(zhì)具有已經(jīng)附著的靶吸附劑。另一實(shí)施例中，基質(zhì)的提供是提供具有結(jié)合靶分析物的吸附劑的基質(zhì)，在使得分析物滯留的洗脫條件下將吸附劑與分析物接觸，將靶吸附劑用作展示文庫(kù)的目標(biāo)。實(shí)施例之一中，目標(biāo)在進(jìn)行比較的兩種細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)。例如，目標(biāo)可以來(lái)自差異表達(dá)的mRNA或者可以是差異表達(dá)的多肽。前文已經(jīng)說(shuō)明了用滯留層析鑒定這種差異表達(dá)的蛋白的方法。
差異表達(dá)的蛋白一旦得以鑒定，就可以形成準(zhǔn)確分辨分析物的選擇性條件。更好的是，分析物的滯留是特異性或唯一性的。前文中逐步分辨分析物的方法能夠鑒定出特異性結(jié)合復(fù)雜樣品中某靶分析物的選擇性條件。實(shí)施例之一中，結(jié)合的靶分子可能被修飾，例如被酶修飾。
或者，該方法可以從mRNA或EST階段開(kāi)始。這種方法中，用常規(guī)方法鑒定差異表達(dá)的mRNA或EST。然后，體外和在吸附劑上原位轉(zhuǎn)錄和翻譯這些分子以供固定。例如，制備具有許多吸附劑位點(diǎn)的用于解吸譜法的基質(zhì)?；|(zhì)上置一根試管，由它形成一格，吸附劑位于格底。在該格中加入用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯差異表達(dá)的mRNA的試劑(一般是cDNA的形式)。(有關(guān)方法參見(jiàn)，Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和Current Protocools in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等編輯，(Current Protocools是Green Publishing Association Inc.和John Wiley &Sons，Inc.的聯(lián)合企業(yè)))。mRNA或EST的翻譯產(chǎn)生了被吸附的多肽。移去試管，用洗脫劑洗滌吸附劑位點(diǎn)，鑒定保留多肽分析物的選擇性條件。
2.提供展示文庫(kù)第二步是提供展示文庫(kù)。展示文庫(kù)由在表面展示各種肽組合文庫(kù)(多肽)的基因組件組成。但較好的是單鏈抗體，因?yàn)樗鼈兡軌蛴糜谝院蟮拿庖咴囼?yàn)。
本領(lǐng)域已知多種展示文庫(kù)及其用途。展示方法的一個(gè)基本概念是建立待選多肽配體與編碼多肽的可回收聚核苷酸之間的物理聯(lián)系。這種物理聯(lián)系是由多聚分子復(fù)合物提供的，在這里是基因組件，例如噬菌體顆粒，它展示作為衣殼組成部分的多肽，衣殼內(nèi)包含編碼多肽的噬菌體基因組。建立多肽與其基因材料之間的物理聯(lián)系允許對(duì)帶有不同多肽的大量基因組件同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量篩選。展示的多肽對(duì)靶分子具有親合性的基因組件與靶分子結(jié)合，并通過(guò)與靶分子的親合性篩選富集這些基因組件?？筛鶕?jù)對(duì)應(yīng)的基因組來(lái)鑒定這些基因組件所展示的多肽的特征。用這些方法，然后可以用常規(guī)方法大量合成經(jīng)鑒定與所需分析物具有結(jié)合親合性的多肽。
展示文庫(kù)最常用的基因組件是噬菌體，尤其是絲狀噬菌體，特別是噬菌體M13、Fd和F1。大多數(shù)工作將編碼待展示多肽的文庫(kù)插入這些噬菌體的gIII或gVIII形成融合蛋白。參見(jiàn)Dower，WO91/19818；Devlin，WO91/18989；MacCafferty，WO92/01047(基因III)；Huse，WO92/06204；Kang，WO92/18619(基因VIII)。還可參見(jiàn)Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382(1990)；Devlin等，Science249，404-406(1990)，Scott & Smith，Science 249，386-388(1990)；Ladner等的U.S.5,223,409和Ladner等的U.S.5,571,698。這樣的融合蛋白具有一段通常來(lái)自分泌蛋白而不是噬菌體包被蛋白的信號(hào)序列，待展示多肽和基因III或基因VIII的蛋白或其片段。常將外源編碼序列插入基因III或基因VIII的N末端或附近，但也可以插入在其它插入位置。有些絲狀噬菌體載體經(jīng)基因工程改造而產(chǎn)生了基因III或基因VIII的第二拷貝。這類載體中，外源序列只插入在兩拷貝之一中。其它拷貝的表達(dá)有效地稀釋了噬菌體內(nèi)的融合蛋白，這對(duì)減少針對(duì)多肽(對(duì)噬菌體生長(zhǎng)有害)的選擇操作是有利的。在感染細(xì)菌的病毒(噬菌體)表面展示抗體片段可以產(chǎn)生具有多種親合性和動(dòng)力學(xué)特征的人sFv。
在另一種改變形式中，將外源多肽序列克隆入編碼噬菌體包被蛋白和噬菌體包裝序列但不能復(fù)制的噬菌粒中。將噬菌粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)輔助噬菌體感染進(jìn)行包裝。用噬菌粒的效果還在于稀釋了融合蛋白，該融合蛋白由包被蛋白和展示的帶有輔助噬菌體表達(dá)的包被蛋白的野生型拷貝的多肽形成。參見(jiàn)Garrard，WO92/09690。
可以類似的方法用真核病毒展示多肽。例如，Han等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，9747-9751(1995)中報(bào)道了與Moliney小鼠白血病病毒的gp70融合的人heregulin。孢子也可以用作可復(fù)制的基因組件。此時(shí)，多肽由孢子的外表面展示。例如，據(jù)報(bào)道可用枯草桿菌孢子。這些孢子的包被蛋白的序列參見(jiàn)Donovan等，J.Mol.Biol.196，1-10(1987)。
也可用細(xì)胞作為可復(fù)制基因組件。展示多肽被插入在編碼細(xì)胞表面蛋白的基因。細(xì)菌細(xì)胞包括鼠傷寒沙門氏菌，枯草桿菌，綠膿桿菌，霍亂弧菌，肺炎克雷伯氏桿菌，淋病奈瑟氏菌，腦膜炎奈瑟氏菌，結(jié)節(jié)狀類桿菌(Bacteroides nodosus)，牛莫拉氏菌，和優(yōu)選的大腸桿菌。有關(guān)外表面蛋白的細(xì)節(jié)參見(jiàn)Lander等，美國(guó)專利5,571,698和Georgiou等，NatureBiotechnology 1529-34(1997)和其中的參考文獻(xiàn)。例如，合適的有大腸桿菌的λ蛋白。
3.篩選展示文庫(kù)第三步是篩選展示文庫(kù)，鑒定特異性結(jié)合靶分子的配體。在適合多肽與靶分子特異性結(jié)合的洗脫條件下讓帶有靶分子的基質(zhì)與展示文庫(kù)接觸。具有靶分子識(shí)別物質(zhì)的基因組件與已經(jīng)附著在基質(zhì)上的靶分子結(jié)合。與洗脫條件接觸后去除了沒(méi)有結(jié)合的粒子，保留了結(jié)合的粒子。
在基質(zhì)上引入每mL含約1011噬斑形成單位的基因組件群(在這里是M13噬菌體)，基質(zhì)具有結(jié)合靶吸附劑(例如蛋白質(zhì))的可定址陣列。接觸后，選出對(duì)靶吸附劑(即選擇性閾值修飾劑或洗脫劑)來(lái)說(shuō)的最適選擇性條件，以便只選擇性保留全部噬菌體基因型中的一個(gè)小子集，最好少于5-10個(gè)。注意，通過(guò)接觸干擾除最具選擇性的分析物-靶吸附劑相互作用之外所有其他相互作用的洗脫劑，去除不結(jié)合靶吸附劑(即不與靶吸附劑結(jié)合的噬菌體)或結(jié)合松散的噬菌體。展示與靶吸附劑具有最高親合性的多肽的噬菌體被選擇性保留。
4.檢測(cè)含有特異性結(jié)合靶分子的物質(zhì)的基因組件第四步中，用解吸譜法檢測(cè)基因組件(M13噬菌體)與靶分子的結(jié)合。例如，M13噬菌體具有一種包被蛋白的數(shù)千拷貝。在解吸譜法中，用激光撞擊噬菌體，包被蛋白于是被釋放而可以被測(cè)得。這樣可以測(cè)定文庫(kù)是否包含具有靶分子結(jié)合物質(zhì)的噬菌體。為了獲得用于以后分析的基因組件，篩選步驟可在探針上多個(gè)不同位置同時(shí)進(jìn)行，或者，可使基質(zhì)足夠大使激光不至于釋放所有結(jié)合于表面的基因組件。該方法特別有效，因?yàn)樯倭渴删w與分析物結(jié)合也能被測(cè)得。
以M13為例，較好的檢測(cè)方法是用解吸譜法監(jiān)測(cè)作為“標(biāo)記”蛋白信號(hào)的基因gIII包被蛋白的出現(xiàn)。用這種方式，我們已經(jīng)測(cè)得了結(jié)合少至5個(gè)噬菌體顆粒(pfu)的“陽(yáng)性”靶吸附劑(噬菌體顆粒數(shù)量是根據(jù)已知稀釋度估算的)。其它噬菌體標(biāo)記依照優(yōu)先次序包括基因V，基因X和基因III(包括它們的融合產(chǎn)物)。
檢測(cè)了最高親合性吸附劑的位置(即接觸高選擇性條件后陣列內(nèi)保留噬菌體最少的位置)后，就可將結(jié)合的基因組件作為跳離點(diǎn)用于其它用途。
5.分離基因組件實(shí)施例之一中，該方法還涉及分離基因組件供以后分析。這種分析可能涉及復(fù)制基因組件和從中分離聚核苷酸?？捎贸Ｒ?guī)方法復(fù)制分離后的噬菌體。例如，可讓滯留的噬菌體與生物擴(kuò)增載體例如大腸桿菌接觸，加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基令基因組件生長(zhǎng)，以供以后分析?？蛇M(jìn)一步檢測(cè)單個(gè)集落結(jié)合滯留于基質(zhì)的分析物的能力。
6.編碼多肽的核苷酸序列的測(cè)序?qū)Y(jié)合基因組件中編碼多肽的核苷酸序列測(cè)序，提供了用于生產(chǎn)多肽的信息。測(cè)序包括從吸附劑上分離基因組件，復(fù)制，分離聚核苷酸和用現(xiàn)有方法測(cè)定核苷酸序列。另一方法中，將基質(zhì)與合適的物質(zhì)(例如會(huì)被基因組件感染的細(xì)胞)接觸可原位復(fù)制該基因組件。另一實(shí)施例中，測(cè)序原位進(jìn)行。該方法包括裂解基因組件，用已知方法(例如PCR)擴(kuò)增核苷酸序列?？赡苡袔讉€(gè)不同的基因組件與表面上不同的表位結(jié)合。此時(shí)，可以改變洗脫條件使得只有一種噬菌體與一種表位結(jié)合。
7.生產(chǎn)多肽有價(jià)值的下一步是生產(chǎn)多肽。分離后的多肽可用作吸附劑在診斷中特異性檢測(cè)靶分子或用于研究配體/受體相互作用。
方法之一中，生產(chǎn)多肽涉及首先進(jìn)行編碼多肽的核苷酸序列測(cè)序。氨基酸序列衍生自該核苷酸?？捎蒙鲜龇椒y(cè)序。序列是重組法或化學(xué)合成多肽的基礎(chǔ)。
另一方法中，多肽可通過(guò)復(fù)制基因組件來(lái)生產(chǎn)。這在基因組件包含多肽的多份拷貝時(shí)特別有效?；蚪M件可在原位分離或復(fù)制。
一種重組法生產(chǎn)多肽的方法可如下進(jìn)行。用所述的方法測(cè)序或分離編碼多肽的核苷酸序列。然后，將核苷酸序列包含在表達(dá)載體中。表達(dá)載體含有與編碼多肽的核苷酸序列操作性連接的調(diào)控序列。然后用本領(lǐng)域熟知的方法，用表達(dá)載體重組表達(dá)多肽。
已知，靶分子具有一個(gè)或多個(gè)表位。所以，該方法能夠生產(chǎn)對(duì)靶分子具有特異性的一種以上多肽。
然后可將靶特異性多肽作為探針的吸附劑用于臨床診斷或藥物開(kāi)發(fā)。即，因?yàn)檫@樣的探針表面具有特異性結(jié)合靶分子的多肽，它們可用來(lái)從復(fù)雜的混合物(例如生物樣品)中分離靶分子，和用解吸譜法檢測(cè)靶分子。而且，因?yàn)槎嚯呐c靶分子間的相互作用可能是生物特異性的，所以很可能所涉及的兩者間的親合性比用前述逐步分辨法獲得的吸附劑更高。
8.分離靶分子的肽表位在一種形式中，該方法允許分離靶分析物上的肽表位。該方法采用類“抗獨(dú)特型”法。概括地說(shuō)，用(例如)噬菌體展示文庫(kù)篩選靶分析物的表位。分離后的噬菌體含有例如識(shí)別分析物上表位的單鏈抗體。接著，用這些噬菌體篩選第二展示文庫(kù)。第二展示文庫(kù)中結(jié)合第一文庫(kù)中單鏈抗體的噬菌體含有展示的多肽，它們具有與單鏈抗體所識(shí)別的表位相似的結(jié)構(gòu)。
這種方法的實(shí)施例之一中，用編碼一種結(jié)合靶分析物的多肽的核苷酸序列產(chǎn)生M13噬菌體，多肽在其中展示為與基因VIII的融合體。這樣，該噬菌體的外表面上具有靶多肽的數(shù)百份拷貝。然后將該噬菌體固定在基質(zhì)上。固定可通過(guò)例如結(jié)合基因III的配體實(shí)現(xiàn)，或者可將基因III修飾成具有基質(zhì)表面配體的受體。然后，該噬菌體與第二展示文庫(kù)接觸。如前所述檢測(cè)文庫(kù)中結(jié)合固定噬菌體的基因組件并分離。較好的是，第二展示文庫(kù)具有某種質(zhì)量標(biāo)記，使得它們的基因VIII蛋白能夠與固定于基質(zhì)的噬菌體的基因VIII的相區(qū)別。這樣，某物質(zhì)是“靶分析物”還是吸附劑取決于是否用結(jié)合的吸附劑再結(jié)合其它物質(zhì)?？梢钥闯?，可以繼續(xù)將物質(zhì)與已固定的物質(zhì)結(jié)合，就象鑒定分離最終結(jié)合物質(zhì)的選擇性條件的方法一樣。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于說(shuō)明而非限定。
以下實(shí)施例中，使用的以下產(chǎn)品和術(shù)語(yǔ)。雞蛋白溶菌酶(1μl稀釋成10pmol/μl水溶液)，購(gòu)自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO?！叭搜濉敝?μl血清在pH7.0，0.5M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液中的1至5倍稀釋液。
本發(fā)明中，“mg”表示毫克；“ml”表示毫升；“μl”表示微升；“cm”表示厘米；“nm”表示納米；“M”表示摩爾濃度；“mM”表示毫摩爾濃度；“min”表示分鐘；“％”表示重量百分比，除非另作說(shuō)明；“NaCl”表示氯化鈉；“TFA”表示三氟乙酸。I.滯留層析方案以下方案是進(jìn)行滯留層析的實(shí)施例。
A.制作滯留圖的方案(用層析系列陣列)1.樣品處理將生物樣品稀釋在0.01％的Triton X100 HEPES溶液或磷酸鈉溶液中，pH7.2。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點(diǎn)樣在陰離子，正常相或TED-Cu(II)吸附劑陣列的一個(gè)位點(diǎn)上。如果是疏水性吸附劑陣列，事先用0.5μl含0.5％TFA的乙腈潤(rùn)濕各位點(diǎn)。在乙腈干燥前將樣品加到該位點(diǎn)。任樣品在位點(diǎn)上濃縮(幾乎變干)。
3.洗滌a.陰離子吸附劑陣列位點(diǎn)1，用pH7.2的20mM HEPES或磷酸鈉洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復(fù)以上步驟。位點(diǎn)2，用NaCl在20mM磷酸鈉中所成的0.2M、pH7.2溶液如上洗滌。位點(diǎn)3，用NaCl在20mM磷酸鈉中所成的1M、pH7.2溶液如上洗滌。位點(diǎn)4，用20mM、pH8.5 TrisHCl如上洗滌。位點(diǎn)5，用0.1M、pH4.5乙酸鈉如上洗滌。位點(diǎn)6，用Triton X100在20Mm HEPES或磷酸鈉中所成的0.05％、pH7.2溶液如上洗滌。位點(diǎn)7，用尿素在20Mm HEPES或磷酸鈉中所成的3M、pH7.2溶液如上洗滌。位點(diǎn)8，用10％的乙腈水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個(gè)陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留于各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
b.正常相吸附劑陣列位點(diǎn)1，用pH7的5mM HEPES洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復(fù)以上步驟。位點(diǎn)2，用20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)3，用20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)4，用0.1M乙酸鈉，pH4.0如上洗滌。位點(diǎn)5，用Triton X100在20Mm磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2如上洗滌。位點(diǎn)6，用尿素在20Mm磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)7，用1％TFA如上洗滌。位點(diǎn)8，用30％的異丙醇∶乙腈(1∶2)水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個(gè)陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留于各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
c.TED-Cu(II)吸附劑陣列位點(diǎn)1，用pH7.2，0.5M NaCl，20mM磷酸鈉洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復(fù)以上步驟。位點(diǎn)2，用咪唑在20mM磷酸鈉所成的20mM溶液，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)3，用咪唑在20mM磷酸鈉所成的100mM溶液，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)4，用0.1M乙酸鈉，0.5M NaCl，pH4.0如上洗滌。位點(diǎn)5，用Triton X100在20Mm磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)6，用尿素在20mM磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)7，用1％TFA如上洗滌。位點(diǎn)8，用10％的乙腈水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個(gè)陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留于各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
d.疏水性吸附劑陣列位點(diǎn)1，用乙腈在0.1％TFA中所成的5％溶液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復(fù)以上步驟。位點(diǎn)2，用乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液如上洗滌。位點(diǎn)3，用Triton X100在20mM磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點(diǎn)4，用尿素在20Mm磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。用水徹底洗滌整個(gè)陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留于各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
B.抗原-抗體試驗(yàn)；受體-配體試驗(yàn)的方案(用預(yù)先活化的吸附劑陣列)1.抗體在預(yù)先活化的吸附劑陣列上的固定將一預(yù)先活化的吸附劑陣列置于一潔凈的平整表面上。該陣列上各位點(diǎn)預(yù)先用0.5μl異丙醇潤(rùn)濕，然后將抗體或受體或?qū)φ拯c(diǎn)樣在各位點(diǎn)上(在異丙醇干燥前加1μl抗體/點(diǎn))。在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育(4℃或室溫培養(yǎng)2-18小時(shí))。用移液管去除各點(diǎn)上殘留的溶液。在整個(gè)芯片上各殘留活性位點(diǎn)位置加1ml pH7.4的1M乙醇胺PBS溶液進(jìn)行封閉，并在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育(室溫30分鐘)。用1％的Triton X-100 PBS溶液洗滌芯片兩次。在15ml塑料錐形試管中將芯片浸沒(méi)在9ml洗滌溶液中，在臺(tái)式(benchtop)攪拌儀上振搖至少15分鐘。用NaCl在0.1M乙酸鈉中所成的0.5溶液，pH4.0如前洗滌。用NaCl在0.1M TrisHCl中所成的0.5溶液，pH8.0如前洗滌。用PBS如前所述進(jìn)行漂洗。然后PBS覆蓋整個(gè)芯片，使用前于4℃保存。
2.抗原或配體的結(jié)合溫和抖去或粘去芯片上的PBS。在各點(diǎn)加以1-5μl樣品。對(duì)于抗原或配體濃度很低的樣品，將吸附劑陣列放入生物處理儀(bioprocessor)中。用200μl PBS兩次洗滌芯片上的各點(diǎn)和生物處理儀的各格。在各格加300μl樣品。用膠帶密封。振蕩孵育(4℃或室溫下1-18小時(shí))。
3.洗滌去除位點(diǎn)上的樣品，用2μl 0.1％的Triton X100 PBS溶液，pH7.2洗滌各格兩次。將第一份2μl洗滌溶液加到位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復(fù)以上步驟。然后用NaCl在0.1M HEPES中所成的0.5M溶液，pH7.4洗滌。用水徹底洗滌整個(gè)陣列。
4.滯留蛋白的分析自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留于各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。II.溶菌酶的識(shí)別特征概況我們用高信息分辨滯留層析得到溶菌酶的識(shí)別特征概況。所述的概況包括用6種吸附劑，各自在多種不同選擇性閾值修飾劑存在下分辨溶菌酶。結(jié)果得到40幅不同的譜圖，以不同方式描述了溶菌酶的理化特性。
A.用親水性吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到不銹鋼基質(zhì)上氧化硅層析系列吸附劑陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.2M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.4M溶液，pH7.0，(4)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(5)1％TFA，(6)10％乙腈水溶液，(7)20％乙腈水溶液，(8)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(9)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在吸附劑位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自Galactic Industries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5A顯示了正常相層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用pH7的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號(hào)強(qiáng)度保留在氧化硅吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)氯化鈉(0.2-0.4M)減少了溶菌酶的滯留。這表明，溶菌酶(堿性蛋白)與氧化硅吸附劑(在pH7時(shí)帶負(fù)電)的相互作用涉及離子交換機(jī)制。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至例如乙酸鈉溶液的pH4.5或1％TFA的pH 2以下，氧化硅吸附劑上的負(fù)電幾乎完全消除，不再有溶菌酶滯留。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)極性調(diào)節(jié)劑，有機(jī)溶劑(例如乙腈)或除垢劑(例如Tween20)或尿素，也削弱溶菌酶與氧化硅吸附劑之間的相互作用。這表明，其它作用機(jī)制包括親水性相互作用。
B.用疏水性吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的聚乙烯(C3疏水性)吸附劑包被的層析系列吸附劑陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)0.1％TFA，(2)乙腈在0.1％TFA中所成的10％溶液，(3)乙腈在0.1％TFA中所成的20％溶液，(4)乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液，(5)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(6)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5B顯示C3疏水性層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用0.1％TFA洗滌后，溶菌酶信號(hào)強(qiáng)度保留在C3疏水性吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)極性調(diào)節(jié)劑(例如乙腈)減少溶菌酶在C3疏水性吸附劑上的滯留。將溶菌酶從C3疏水性吸附劑上洗脫的乙腈濃度范圍是20-50％。在選擇性修飾劑中加進(jìn)除垢劑(Tween20)，或尿素沒(méi)顯著減少溶菌酶在C3疏水性吸附劑上的滯留。
C.用苯基疏水性吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的聚苯乙烯(苯基疏水性)吸附劑陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)0.1％TFA，(2)乙腈在0.1％TFA中所成的10％溶液，(3)乙腈在0.1％TFA中所成的20％溶液，(4)乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液，(5)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(6)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5C顯示疏水性苯基層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用0.1％TFA洗滌后，溶菌酶信號(hào)強(qiáng)度保留在疏水性苯基吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)極性調(diào)節(jié)劑(例如乙腈)減少溶菌酶滯留。將溶菌酶從C3疏水性吸附劑上洗脫的乙腈濃度范圍是20-50％，但是，比較20％乙腈洗滌條件下滯留在C3和苯基表面上的溶菌酶強(qiáng)度峰值時(shí)，溶菌酶與苯基吸附劑的相互作用較弱。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)除垢劑(Tween20)，或尿素也明顯減少溶菌酶在疏水性苯基吸附劑上的滯留。
D.用陰離子吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的陰離子吸附劑陣列(SO3-，即陰離子交換吸附劑)的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.2M溶液，pH7.0，(4)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.4M溶液，pH7.0，(5)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(6)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(7)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5D顯示陽(yáng)離子交換層析系列陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號(hào)強(qiáng)度保留在陰離子吸附劑上。隨著選擇性閾值修飾劑中氯化鈉濃度的升高(0.1-0.4M)，溶菌酶滯留減少。這表明，溶菌酶(堿性蛋白)與陰離子吸附劑的相互作用涉及離子交換機(jī)制。洗脫溶菌酶所需的氯化鈉濃度為0.4M。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至乙酸鈉緩沖液的pH4.5不影響溶菌酶在強(qiáng)陰離子吸附劑上的滯留。在選擇性閾值修飾劑中加進(jìn)極性調(diào)節(jié)劑(例如除垢劑Tween20，或尿素)削弱溶菌酶與陰離子吸附劑的相互作用。這表明，疏水性溶菌酶蛋白與陰離子吸附劑間的相互作用受洗脫劑極性的調(diào)節(jié)。
E.用陽(yáng)離子吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的陽(yáng)離子吸附劑(季胺)陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.2M溶液，pH7.0，(4)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.4M溶液，pH7.0，(5)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(6)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(7)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5E顯示陽(yáng)離子(陰離子交換)吸附劑層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。堿性溶菌酶在陽(yáng)離子吸附劑上的滯留很弱。改變選擇性閾值修飾劑對(duì)溶菌酶滯留的作用極小。
F.用固定化金屬離子吸附劑陣列的溶菌酶識(shí)別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的固定化金屬(亞氨基乙酸Cu)吸附劑陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的5mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，或(5)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖5F顯示固定化金屬層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號(hào)強(qiáng)度保留在固定化銅離子吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加入結(jié)合氨基酸的競(jìng)爭(zhēng)性親合配體(例如咪唑)消除了溶菌酶的滯留。這表明溶菌酶(在序列中僅有一個(gè)組氨酸殘基)與固定化銅離子吸附劑的相互作用涉及形成配位共價(jià)鍵的機(jī)制。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至乙酸鈉緩沖液的pH4.5也減少溶菌酶在固定化銅離子吸附劑上的滯留。據(jù)信這是因?yàn)槿芫干辖M氨酸的質(zhì)子化抑制配位共價(jià)相互作用。加除垢劑(Tween20)不影響此相互作用。加進(jìn)尿素完全消除溶菌酶在固定化銅吸附劑上的滯留。III.人血清中分析物的分辨我們用多種吸附劑和洗脫劑分辨人血清中的分析物。結(jié)果顯示，分析物被不同的吸附劑差異保留，滯留層析圖能夠在低分子量和高分子量時(shí)提供信息。
A.用固定化金屬離子吸附劑陣列的人血清蛋白識(shí)別概況將人血清蛋白加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上的固定化金屬離子(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)吸附劑陣列的不同位點(diǎn)。在一濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(diǎn)(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的5mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，或(5)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖6A和6B顯示低分子量和高分子量時(shí)，固定化金屬層析系列吸附劑陣列上的血清蛋白識(shí)別概況組分質(zhì)譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，血清蛋白滯留在固定化銅吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加入結(jié)合氨基酸的競(jìng)爭(zhēng)性親合配體(例如咪唑)，或除垢劑(例如Tween20)，或尿素，或?qū)⑦x擇性閾值修飾劑的pH降低至pH4.5不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中不同組分在相同吸附劑上的滯留。
G.用不同吸附劑的人血清蛋白識(shí)別概況將人血清加到以下不同吸附劑組成的吸附劑陣列的不同位點(diǎn)(1)C3疏水性，(2)苯基疏水性，(3)陰離子交換，(4)陽(yáng)離子交換，(5)固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)。
將各吸附劑涂在氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上。在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘后，用Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0作為選擇性閾值修飾劑洗滌各位點(diǎn)。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(購(gòu)自GalacticIndustries Corporation)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
圖7A和7B顯示層析系列吸附劑陣列內(nèi)不同吸附劑上血清蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。對(duì)不同的吸附劑(結(jié)合特征不同)使用同一種選擇性閾值修飾劑不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中不同組分在不同吸附劑上的滯留。IV.早產(chǎn)(preterm)嬰兒尿液中分析物的分辨我們用不同的吸附劑和洗脫劑分辨早產(chǎn)嬰兒尿液中的分析物。結(jié)果顯示，因?yàn)槲絼┎町惐Ａ舴治鑫?，使用不同的吸附劑具有很?qiáng)的分辨能力。它們還能夠鑒定出優(yōu)先保留特定分析物的吸附劑，這可以用于開(kāi)發(fā)純化方法。
A.用不同吸附劑和相同的洗脫劑(水)分辨早產(chǎn)嬰兒尿液中的分析物將早產(chǎn)嬰兒的尿液(2μl)加到用以下不同吸附劑包被的碳化PEEK聚合物基質(zhì)的不同位點(diǎn)(1)C8疏水性(辛基瓊脂糖，購(gòu)自Sigma)，(2)苯基疏水性(苯基瓊脂糖，購(gòu)自Sigma)，(3)陰離子交換(Q瓊脂糖，購(gòu)自Sigma)，(4)陽(yáng)離子交換(S瓊脂糖，購(gòu)自Sigma)，(5)固定化金屬(IDA-Cu，螯合瓊脂糖，購(gòu)自Pharmacia)，和(6)固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu瓊脂糖)在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘后，用水作為選擇性閾值修飾劑洗滌各吸附劑位點(diǎn)。每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用購(gòu)自Hewlett Packard的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和150cm飛行管分析陣列。用HP MALDI TOF軟件分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c進(jìn)行重疊展示。
圖8A和8B顯示在低分子量和高分子量時(shí)，層析系列不同吸附劑上早產(chǎn)嬰兒尿液蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。對(duì)不同吸附劑(結(jié)合特性不同)使用同一種洗脫劑(即水)不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中不同組分在不同吸附劑上的滯留。
B.用與基質(zhì)間接偶連的疏水性苯基吸附劑和三種不同洗脫劑分辨早產(chǎn)嬰兒尿液中的分析物將早產(chǎn)嬰兒的尿液(2μl)加到苯基疏水性吸附劑(苯基瓊脂糖，購(gòu)自Sigma)包被的碳化PEEK聚合物基質(zhì)的不同位點(diǎn)。在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘后，各吸附劑位點(diǎn)用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)之一洗滌(1)水(2)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的2M溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(3)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1％溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用用購(gòu)自Hewlett Packard的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和150cm飛行管分析陣列。用HP MALDI TOF軟件分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c進(jìn)行重疊展示。
圖9顯示層析系列疏水性苯基吸附劑上早產(chǎn)嬰兒尿液蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。對(duì)同一種吸附劑使用洗脫特性不同的不同洗脫劑不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中不同組分的滯留。當(dāng)以0.1％Tween20 PBS溶液作為洗脫劑時(shí)，組分之一被疏水性苯吸附劑選擇性保留(以*標(biāo)記)。V.兩種不同細(xì)胞的培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的鑒定本實(shí)施例說(shuō)明用吸附劑陣列層析系列鑒定由細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
兩種乳腺癌細(xì)胞系在常數(shù)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同的時(shí)間。在過(guò)濾濃縮后，各取1μl培養(yǎng)基加到氧化硅包被的不銹鋼基質(zhì)上固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)吸附劑陣列(Ciphergen Biosystems，Inc.，Palo Alto，CA)的不同位點(diǎn)。在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中室溫孵育15分鐘后，各吸附劑位點(diǎn)用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)之一洗滌(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的20mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，(5)尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0，或(6)1％TFA 。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點(diǎn)上吸進(jìn)吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復(fù)以上過(guò)程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點(diǎn)2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和60cm飛行管分析陣列。用計(jì)算機(jī)軟件分析數(shù)據(jù)，輸入GRAMS/32c(Galactic Industries Corporation)進(jìn)行重疊展示。
圖10A顯示固定化金屬(Cu)層析系列吸附劑陣列上細(xì)胞系1分泌蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。對(duì)同一吸附劑使用不同選擇性閾值的洗脫劑不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中不同組分的滯留。
圖10B顯示固定化金屬(Cu)層析系列吸附劑陣列上兩細(xì)胞系分泌蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。用同一洗脫劑，0.1％Tween20+尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0洗去未滯留的物質(zhì)。標(biāo)記為7532Da的峰是細(xì)胞系1分泌蛋白的主滯留峰，細(xì)胞系2不表達(dá)該蛋白。
圖10C顯示固定化金屬(Ni)層析系列吸附劑陣列上細(xì)胞系1分泌蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。用同一洗脫劑，0.1％Tween20+尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0，但用表面反應(yīng)能力不同的另一吸附劑(即固定化Ni而不是固定化Cu)，7532Da峰是細(xì)胞系1所有分泌蛋白中唯一滯留的蛋白。插入的圖顯示放大后的同一質(zhì)譜。3766 Da小峰是同一種蛋白帶雙電荷的形式。
圖10D顯示在胰蛋白酶原位消化前(下圖)和后(上圖)，固定化金屬(Ni)層析系列吸附劑陣列上細(xì)胞系1分泌蛋白識(shí)別概況的組分質(zhì)譜。用純蛋白產(chǎn)生的肽圖是該蛋白的指紋，可用于鑒定。VI.滯留層析與2D凝膠電泳的比較滯留層析的優(yōu)點(diǎn)之一是能夠以不同維度迅速分辨分析物，得到有關(guān)多種理化特性的高信息內(nèi)容。相反，2D凝膠電泳只提供2維度的分辨。
圖11顯示層析系列苯基疏水性吸附劑上的早產(chǎn)嬰兒尿液識(shí)別概況。用不同的洗脫劑和吸附劑得到多維度的信息。使用不同選擇性條件不同程度地加強(qiáng)或削弱復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物(例如早產(chǎn)嬰兒尿液)中不同組分的滯留，得到分析物的詳細(xì)分辨。
相反，圖12顯示早產(chǎn)嬰兒尿液中蛋白質(zhì)根據(jù)pI和分子量的兩維度分辨。與在滯留層析中用作吸附劑的6維度相比，凝膠提供有關(guān)兩個(gè)維度的信息。位點(diǎn)的分辨不及質(zhì)譜法，分子量很高和很低時(shí)的分辨率很有限。VII.從樣品中依次提取分析物可以通過(guò)樣品與選擇性條件的依次接觸然后收集未滯留的樣品從樣品中依次提取分析物。
在10％乙二醇50mM EDTA中制備嗜血桿菌(Hemophilus)敲除突變株裂解液。離心后，將上清液以1∶3稀釋在0.01％Triton X100的25mM HEPES，pH7.4溶液中。取一份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列陰離子部位的一個(gè)位置上。室溫孵育30分鐘后，將陰離子位置上滯留的樣品轉(zhuǎn)移到吸附劑陣列正常相部位的一個(gè)位置上。陰離子位置用2μl 0.01％Triton X100 25mM HEPES洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。將各洗液與最初加到正常相位點(diǎn)的樣品合并。
室溫孵育30分鐘后，將正常相位置上滯留的樣品轉(zhuǎn)移到吸附劑陣列Ni(II)部位的一個(gè)位點(diǎn)。該正常相位點(diǎn)用2μl磷酸鹽緩沖液洗滌2次。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。將各份洗液與最初加到Ni(II)位點(diǎn)的樣品合并。
樣品在Ni(II)位點(diǎn)上濃縮近干燥后，用2μl100mM咪唑磷酸鹽緩沖液溶液洗滌2次，回收未結(jié)合的分析物。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。將各份洗液轉(zhuǎn)移到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的一個(gè)位點(diǎn)。
樣品在脂肪族疏水性吸附劑位點(diǎn)上濃縮近干燥后，用2μl乙腈在0.1％三氟乙酸中所成5％溶液洗滌2次，去除未結(jié)合的分析物。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。
陰離子、正常相、Ni(II)和疏水性部位各位點(diǎn)用2μl水洗去殘留的緩沖液。在各位點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖19A-19D顯示吸附劑陣列上嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液的滯留圖。在吸附劑上，可觀察到質(zhì)量在3000至25000Da范圍內(nèi)的多個(gè)峰。注意，每種吸附劑表現(xiàn)出對(duì)樣品中不同分析物的不同保留作用。VIII.逐步分辨一種分析物給分辨一種分析物的選擇性條件增加新的結(jié)合或洗脫特性可以形成分辨分析物更好的的選擇性條件。在該實(shí)施例中，樣品與Cu(II)吸附劑結(jié)合，并與第一和第二洗脫劑接觸。第二洗脫劑與第一洗脫劑的區(qū)別在于增加了另一洗脫條件。每一種新加的條件都改善對(duì)分析物的分辨。
在10％乙二醇中制備的嗜血桿菌(Hemophilus)野生型穩(wěn)定期裂解液以1∶1稀釋在20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0中。離心后，取一份150μl上清液與生物處理儀中吸附劑陣列Cu(II)部位的各位點(diǎn)一起孵育。低溫混合30分鐘后，除去樣品。各位點(diǎn)用不同的裂解液洗滌。第一點(diǎn)用150μl 20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0洗滌。第二點(diǎn)用150μl Triton X100在20mM磷酸鈉中所成的0.05％溶液，0.15M氯化鈉，pH7.0洗滌。第三點(diǎn)，用150μl咪唑在20mM磷酸鈉中所成的100mM溶液，0.15M氯化鈉，pH7.0洗滌。每次洗滌包括洗滌溶液與各位點(diǎn)混合孵育5分鐘。重復(fù)洗滌2次。用水洗滌各位點(diǎn)，去除除垢劑和緩沖液。
從生物處理儀中取出吸附劑陣列。在各點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。圖20A-20C顯示在上述3種洗脫條件下洗滌后，嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液在吸附劑陣列Cu(II)部位的滯留圖。在2000-18000Da質(zhì)量范圍內(nèi)可觀察到多個(gè)峰。在圖20A滯留圖中，用“*”標(biāo)記的蛋白只是一個(gè)次要組分。當(dāng)選擇性條件因相同的緩沖液中增加一種除垢劑(TritonX100)而改變時(shí)(圖20B)，蛋白“*”的滯留比其他分析物都好，分辨得更好。當(dāng)選擇性條件因相同的緩沖液中增加一種親合性取代物而改變時(shí)(圖20C)，在滯留圖中，蛋白“*”與其它分析物高度區(qū)分。
這種逐步鑒定更好地分辨某種分析物的選擇性條件的策略可用來(lái)開(kāi)發(fā)從全嗜血桿菌裂解液中逐步純化該蛋白的方法。IX.分析物的差異表達(dá)標(biāo)記蛋白的開(kāi)發(fā)A.人血清每份0.5μl正常和疾病人血清用等體積20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.0稀釋。將各等份加在吸附劑陣列Cu(II)部位的不同位點(diǎn)上。4℃孵育1小時(shí)后，各位點(diǎn)用2μl 20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.0洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。最后用2μl水洗滌各點(diǎn)，去除殘留的緩沖液。在各點(diǎn)加一份0.3μlsinapinic酸在50％乙腈和0.5％三氟乙酸中所成的溶液。0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各部位上的滯留分析物。
在圖21D中，疾病血清中蛋白“*”的量顯著高于正常血清。結(jié)果顯示了一種開(kāi)發(fā)可用于臨床診斷的疾病標(biāo)記的方法。
B.鼠尿每份1μl正常、疾病或藥物治療過(guò)的鼠尿加在吸附劑陣列Cu(II)部位的不同位點(diǎn)上。室溫孵育10分鐘后，各點(diǎn)用2μl咪唑在20mM磷酸鈉所成的100mM溶液，0.15M NaCl，pH7.0洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。最后用2μl水洗滌各點(diǎn)，去除殘留的緩沖液。在各點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖1顯示了正常(對(duì)照)、疾病和藥物治療過(guò)的鼠的尿的滯留圖。發(fā)現(xiàn)有一種分析物在疾病鼠尿(中圖)中較多，該分析物在正常鼠尿(上圖)中沒(méi)有，在藥物治療的鼠的尿中少得多(下圖)?？捎迷摲治鑫镒鳛闈撛诘募膊?biāo)記。為了體現(xiàn)定量診斷試驗(yàn)的可行性，計(jì)算了滯留蛋白峰的面積，并顯示在表格中。在疾病和藥物治療過(guò)的鼠的尿之間可觀察到明顯的量差。為了補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定性使用了一個(gè)內(nèi)標(biāo)分析物。底下的分圖顯示了各鼠尿樣品校正后的疾病標(biāo)記峰面積(即標(biāo)記峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積)。在藥物治療后，疾病尿液中的標(biāo)記減少至少10倍。
C.人尿?qū)⒊Ｈ撕桶┌Y患者的尿液以1∶2稀釋在Triton X100在磷酸鹽緩沖液中所成的0.01％溶液中。每份1.5μl的正?；蚣膊∪四蚣釉谖絼╆嚵兄咀迨杷圆课坏牟煌稽c(diǎn)，這些位點(diǎn)預(yù)先用0.5μl異丙醇/乙腈(1∶2)0.1％三氟乙酸潤(rùn)濕。4℃孵育30分鐘后，各點(diǎn)用2μl乙二醇在10Mm TrisHCl中所成的50％溶液，0.05M NaCl，pH7.5洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。最后用2μl水洗滌各點(diǎn)，去除殘留的乙醇和緩沖液。在各點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinie酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖23A顯示了4名癌癥患者和1名常人的尿液的滯留圖。用乙二醇在Tris/NaCl緩沖液中所成50％溶液洗滌后，有多個(gè)滯留在吸附劑陣列疏水性部位的蛋白峰。為了鑒定出可能的疾病標(biāo)記，繪制了各患者以及與常人尿液之間的差異圖。差異圖中基線以上的各條柱代表分析物在患者尿液中存在更多。(圖23B-23D)?；颊卟町悎D模式的變動(dòng)反映了群體中的個(gè)體波動(dòng)性。但是，5000Da附近的一種分析物(以“*”標(biāo)記)和7500 Da附近的一簇分析物被發(fā)現(xiàn)在所有患者中總是較多，所以，這些可鑒定為潛在疾病標(biāo)記。X.從噬菌體展示文庫(kù)中捕捉噬菌體可用解吸譜法檢測(cè)吸附于蛋白芯片表面的病毒。用抗病毒外被蛋白的抗體作為吸附劑可以捕獲病毒。用作吸附劑的靶蛋白可以捕獲展示抗靶蛋白單鏈抗體的噬菌體。
A.吸附劑基質(zhì)檢測(cè)噬菌體展示的抗體的靈敏度在Triton X100在25mM HEPES所成0.01％溶液，pH7.4中，連續(xù)稀釋生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的M13噬菌體(1012粒/ml)。每份0.25μl的稀釋噬菌體懸浮液加到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的位點(diǎn)上。加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的CHCA酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析樣品。
在陣列上，可以高靈敏度地檢測(cè)到M13噬菌體基因VIII蛋白。圖24A-24E。當(dāng)噬菌體懸浮液稀釋10,000,000倍時(shí)可以獲得可測(cè)信號(hào)(信號(hào)/干擾≥2)。
B.用吸附劑陣列鑒定M13噬菌體將兔抗M13抗體(Strategene)固定在蛋白A Hyper D(BioSepra)上，用pH7.0的磷酸鹽緩沖液徹底洗滌。每份1-10μl M13噬菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸浮液(1012顆粒/ml)與每份1μl的固定化抗M13抗體4℃孵育通宵。用0.05％的Tween20 pH7.0磷酸鹽緩沖液溶液洗滌，然后用水洗去除垢劑和緩沖液，在sinanipic酸存在下，用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析每份捕獲的噬菌體。
抗M13抗體對(duì)照只顯示抗體信號(hào)(單一和雙電荷)。圖25A。當(dāng)M13噬菌體被抗體捕獲，最容易鑒定的噬菌體蛋白峰是基因VIII蛋白和與單鏈抗體融合的基因VIII蛋白。圖25B。因?yàn)楸痉椒ㄒ愿叨褥`敏度檢測(cè)到了M13噬菌體基因VIII蛋白，所以它可以用作捕捉噬菌體的靈敏檢測(cè)劑。
C.特異性捕捉展示單鏈抗體的M13噬菌體HIV-1 Tat蛋白(McKesson BioSerivces)與預(yù)先活化的基質(zhì)偶合。用乙醇胺封閉后，先后用0.005％的Tween20 pH7磷酸鹽緩沖液溶液，和0.1％BSApH7磷酸鹽緩沖液溶液洗滌。展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體系列稀釋液與Tat蛋白吸附劑陣列4℃孵育通宵。陰性對(duì)照，即不展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體系列稀釋液也與Tat蛋白吸附劑陣列同法孵育。依次用0.05％的Tween20磷酸鹽緩沖液溶液，1M的尿素pH7磷酸鹽緩沖液溶液洗滌陣列，最后用水洗去緩沖液和尿素。加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的CHCA酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析滯留的噬菌體。
可以觀察到展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體的特異性結(jié)合呈濃度依賴方式(實(shí)線)。圖26A-26D。非特異性M13噬菌體在吸附劑陣列上的非特異性結(jié)合極小(虛線)。這證明了一種檢測(cè)噬菌體的高靈敏度方法，所述的噬菌體包含編碼特異性識(shí)別靶分析物的單鏈抗體的基因。XI.篩選測(cè)定化合物是否抑制受體與配體間的結(jié)合本發(fā)明方法可用來(lái)測(cè)定某測(cè)試物質(zhì)是否調(diào)節(jié)配體與受體的結(jié)合。在該實(shí)施例中，我們證明滯留層析能夠檢測(cè)游離TGF-β受體對(duì)于TGF-β與結(jié)合的TGF-β受體(作為吸附劑)結(jié)合的抑制作用。
TGF-β重組受體-Fc融合蛋白(R&D，Minnesota)特異性地結(jié)合在蛋白G吸附劑陣列上。將TGF-β(R&D，Minnesota)以細(xì)胞條件培養(yǎng)基(2.5倍濃縮)連續(xù)稀釋，與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列4℃孵育通宵。另一組TGF-β以細(xì)胞條件培養(yǎng)基連續(xù)稀釋液在調(diào)節(jié)劑存在下與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列一起孵育。此處的調(diào)節(jié)劑是游離TGF-β受體。相同條件孵育后，先后用0.05％Triton X100的PBS溶液和3M尿素PBS溶液洗滌芯片。在各位點(diǎn)加每份0.3μlsinanipic酸，并用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析。
圖27A顯示1μg/ml TGF-β特異性結(jié)合受體-Fc蛋白G吸附劑陣列(實(shí)線)。細(xì)胞條件培養(yǎng)基中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)合。圖27B顯示100ng/ml TGF-β特異性結(jié)合受體-Fc蛋白G吸附劑陣列(實(shí)線)。當(dāng)TGF-β與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列在調(diào)節(jié)劑(游離TGF-β受體)存在下孵育時(shí)，100ng/ml TGF-β時(shí)的吸附完全消除(圖27A，虛線)，1μg/ml TGF-β時(shí)只有微量結(jié)合(圖27B，虛線)。在此，調(diào)節(jié)劑(同一受體)對(duì)配體具有高度特異性結(jié)合親合力，所以高效競(jìng)爭(zhēng)靶分析物的結(jié)合。在其它時(shí)候，有和沒(méi)有調(diào)節(jié)劑時(shí)結(jié)合于吸附劑的靶分析物之比體現(xiàn)調(diào)節(jié)劑的效率。XII.滯留層析的分辨能力本實(shí)施例證明滯留層析通過(guò)不同選擇性條件下的并行處理分辨樣品中蛋白質(zhì)的能力。
在10％乙二醇中制備嗜血桿菌流感裂解液。離心后，將上清液以1∶3稀釋在Triton X100在25mM HEPES中所成的0.01％溶液，pH7.4中。將每份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列陽(yáng)離子部位的一位點(diǎn)上。室溫孵育30分鐘后，用25mMHEPES，pH7.4洗滌位點(diǎn)。另一份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的一位點(diǎn)上。室溫孵育30分鐘后，用水洗滌位點(diǎn)。第三份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列Cu(II)部位的一位點(diǎn)上。室溫孵育30分鐘后，用0.05％的Triton X100pH7.4磷酸鹽緩沖液溶液洗滌。在各位點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各位點(diǎn)上滯留的分析物。
結(jié)果顯示在圖28-31中。滯留分析物總計(jì)約550。結(jié)果證明了一種組合性分離方法，包括并行分離和檢測(cè)多種分析物。XIII.依次組裝多聚結(jié)構(gòu)本實(shí)施例說(shuō)明在初始吸附劑上構(gòu)建第二吸附劑的方法。然后，第二吸附劑可以作為靶分析物的特異性吸附劑。
將GST融合受體稀釋于20mM Tris，100mM氯化鈉，0.4％NP40，pH7.2中，取一份0.5μl加到吸附劑陣列正常相部位的一位點(diǎn)上。任溶液在此位點(diǎn)上濃縮到接近干燥。位點(diǎn)用2μl 10mM Tris，50mM氯化鈉，pH7.2洗滌3次。每次洗滌將洗滌溶液吸進(jìn)吸出5次。各位點(diǎn)最后用水洗滌2次去除殘留緩沖液。在各位點(diǎn)加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析各位點(diǎn)上滯留的分析物。(圖32)。
將GST融合受體溶于20mM Tris，100mM氯化鈉，0.4％NP40，pH7.2，取一份0.5μl加到吸附劑陣列正常相部位的一位點(diǎn)上。將只含GST(沒(méi)有受體)蛋白的樣品加到另一個(gè)位點(diǎn)作為陰性對(duì)照。任溶液在此位點(diǎn)上濃縮到接近干燥。在各位點(diǎn)加0.5 mM Tris，50mM氯化鈉，pH7.2。室溫靜置10秒后去除溶液。
立即在各位點(diǎn)加1μl含有文庫(kù)(另有96種其它配體)中一種特異性配體溶液。吸附劑陣列在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中室溫孵育1小時(shí)。各點(diǎn)用2μl異丙醇∶乙腈(1∶2)的30％水溶液洗滌兩次。每次洗滌將洗滌溶液吸進(jìn)吸出10次。在各點(diǎn)加0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液。用用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析被受體捕獲的配體。
圖33A顯示另含96種其它配體的文庫(kù)中一種特異性配體與GST融合受體的結(jié)合，它被吸附劑陣列的正常相部位捕獲。圖33B顯示該陪同與同一陣列上作為陰性對(duì)照的純GST蛋白不結(jié)合。
本發(fā)明提供了滯留層析的新材料和新方法。雖然以上給出了具體的實(shí)施例，但這些是說(shuō)明性的而不是限制性的。根據(jù)以上說(shuō)明，許多修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。所以，本發(fā)明的范圍并不限于以上說(shuō)明，相反，它是參照后文權(quán)利要求限定的，并包括與之對(duì)等的全部范圍。
本申請(qǐng)對(duì)引用的全部出版物和專利文獻(xiàn)都按照它們各自的內(nèi)容進(jìn)行了同等程度的全面的參考。雖然在此引用的大量文獻(xiàn)，但是申請(qǐng)人不認(rèn)為任何一處參考是覆蓋本發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。
權(quán)利要求
1.一種鑒定受體的配體的方法，它包括a)提供包含吸附有受體的吸附劑的基質(zhì)；b)在允許受體配體結(jié)合的條件下，結(jié)合受體與含配體樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測(cè)被結(jié)合的配體。
2.一種檢測(cè)含有編碼特異性結(jié)合靶吸附劑的多肽的聚核苷酸的基因組件的方法，包括的步驟有a)提供含有靶吸附劑的基質(zhì)；b)提供展示文庫(kù)，其中包含多種不同的基因組件，各種不同的基因組件包含聚核苷酸，聚核苷酸具有一段編碼多肽的核苷酸序列，而且各種不同的基因組件具有展示所編碼的多肽的表面；c)基質(zhì)與展示文庫(kù)在允許多肽與靶吸附劑特異性結(jié)合的洗脫條件下接觸，包含多肽的基因組件因此滯留在基質(zhì)上；d)用解吸譜法檢測(cè)滯留在基質(zhì)上的基因組件。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的展示文庫(kù)是噬菌體文庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中提供含有吸附劑的基質(zhì)的步驟包括i)提供含有吸附劑的基質(zhì)，所述的吸附劑在一種洗脫條件下保留一種靶分析物；和ii)吸附劑與靶分析物在允許靶分析物被吸附劑保留的洗脫條件下接觸，靶分析物因此變成靶吸附劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括步驟(e)測(cè)定編碼多肽的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括步驟(e)分離滯留的基因組件。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括步驟(e)生產(chǎn)多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的基質(zhì)包含(1)結(jié)合錨定多肽的吸附劑和(2)至少一種具有展示錨定多肽的表面的靶基因組件和一種靶吸附劑多肽，靶基因組件含有聚核苷酸，聚核苷酸具有編碼靶吸附劑的核苷酸序列，其中的靶基因組件通過(guò)錨定多肽與吸附劑結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的基質(zhì)包括細(xì)胞或細(xì)胞膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的靶吸附劑包含在不同表型細(xì)胞間差異表達(dá)的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中的噬菌體是M13噬菌體。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中的靶分析物是靶多肽，其中的步驟ii)接觸吸附劑包括通過(guò)體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸，在吸附劑上原位生成靶多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中的測(cè)序步驟包括在基質(zhì)上原位擴(kuò)增聚核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中的生產(chǎn)步驟包括增殖滯留的展示多肽的基因組件。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，包括由表達(dá)載體表達(dá)多肽，表達(dá)載體含有與編碼多肽的核苷酸序列操作性連接的表達(dá)調(diào)控序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括生產(chǎn)含有含多肽吸附劑的基質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的至少一種靶基因組件選自一個(gè)靶展示文庫(kù)，在該文庫(kù)中篩選結(jié)合至少一種初始靶分析物的基因組件，其中的吸附劑包含初始靶分析物。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的多肽是單鏈抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的靶多肽是通過(guò)體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸原位產(chǎn)生的。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中的增殖步驟是在基質(zhì)上原位進(jìn)行的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中編碼靶多肽的聚核苷酸是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄原位產(chǎn)生的。
22.一種用于解吸譜法的基質(zhì)，它包含結(jié)合展示在基因組件表面的錨定多肽的吸附劑，其中基因組件的表面還展示靶多肽，其中的基因組件包含聚核苷酸，聚核苷酸具有編碼靶多肽的核苷酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的基質(zhì)，其中的基因組件是M13噬菌體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的基質(zhì)，其中的錨定多肽是與基因III蛋白的融合多肽，靶多肽是與基因VIII蛋白的融合多肽。
25.一種含有吸附劑的基質(zhì)，所述的吸附劑含有特異性結(jié)合靶分析物的多肽，所述多肽由權(quán)利要求33所述的方法鑒定。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的基質(zhì)，其中的多肽是單鏈抗體。
27.一種檢測(cè)聚核苷酸翻譯的方法，它包括a)提供用于解吸譜法的含有吸附劑的基質(zhì)；b)將基質(zhì)與編碼多肽的聚核苷酸并與體外翻譯聚核苷酸所需物質(zhì)接觸，由此產(chǎn)生多肽；c)基質(zhì)接觸洗脫劑，使得多肽被吸附劑保留；和d)用解吸譜法檢測(cè)滯留的多肽；多肽的檢測(cè)提供了檢測(cè)聚核苷酸的方法。
28.一種方法，包括的步驟有a)第一樣品與原吸附劑和洗脫劑接觸，使得第一分析物被吸附劑保留，用解吸譜法檢測(cè)被吸附的分析物，滯留的第一分析物因此變成第二吸附劑；b)第二樣品與第二吸附劑和洗脫劑接觸，使得第二分析物被第二吸附劑保留，用解吸譜法檢測(cè)被吸附的第二分析物，滯留的第二分析物因此變成第三吸附劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，還包括對(duì)下一份或多份樣品重復(fù)步驟(b)至少1次。
30.一種測(cè)定物質(zhì)是否調(diào)節(jié)靶分析物與吸附劑之間結(jié)合的篩選方法，包括的步驟有a)提供含有吸附劑的基質(zhì)，靶分析物在洗脫條件下與所述吸附劑結(jié)合；b)基質(zhì)與靶分析物和物質(zhì)在允許靶分析物與吸附劑結(jié)合的條件下接觸；c)用解吸譜法檢測(cè)靶分析物與吸附劑之間的結(jié)合量；d)確定測(cè)得的量是否與當(dāng)基質(zhì)與靶分析物在無(wú)物質(zhì)洗脫條件下接觸時(shí)的對(duì)照結(jié)合量不同；測(cè)得量與對(duì)照量之間的差異說(shuō)明物質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中的吸附劑包含特異性結(jié)合靶分析物的配體。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中的吸附劑包含具有展示多肽配體的表面的基因組件，所述的多肽配體特異性結(jié)合靶分析物。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，用于篩選制劑組合文庫(kù)，包括將文庫(kù)中的各種制劑分別與每一種吸附劑接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中的配體是酶，靶分析物是酶的底物或抑制劑，反之亦然。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中的配體是激素，靶分析物是該激素的細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體，反之亦然。
全文摘要
本發(fā)明提供了用滯留層析分辨樣品中分析物的方法。該方法涉及在多種選擇性條件下讓分析物吸附于基質(zhì)上,和用解吸譜法檢測(cè)滯留在基質(zhì)上的分析物。這些方法可用于生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué),包括臨床診斷和藥物開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)G06F19/00GK1266538SQ98808083
公開(kāi)日2000年9月13日 申請(qǐng)日期1998年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者T·W·赫琴斯, T·-T·耶 申請(qǐng)人:賽弗根生物系統(tǒng)股份有限公司