對(duì)t細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法及由此制備的肽文庫的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明通過生物大數(shù)據(jù)探勘的方法進(jìn)行T細(xì)胞表位篩選、MHCII分子三維模型建構(gòu)、T細(xì)胞表位優(yōu)化設(shè)計(jì)，合理的設(shè)計(jì)基于表位的疫苗的肽組合文庫，在維持免疫結(jié)構(gòu)抗原表位的同時(shí)，模擬跨族群的T細(xì)胞表位個(gè)體變異特性，以覆蓋由于地域或種類差異及高度可變性免疫組織相容復(fù)合物的廣泛范圍，從而得到具有對(duì)口蹄疫病毒更有效的T細(xì)胞表位，并提供廣泛保護(hù)力的肽疫苗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，T細(xì)胞表位優(yōu)化具有相當(dāng)?shù)目尚行?，并預(yù)期可針對(duì)不同物種的不同病毒的各種疫苗進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。
【專利說明】
對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法及由此制備的化文庫的組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法，W及通過該方法制備的膚文庫的組合 物，尤其設(shè)及牛的基于表位的組合式口蹄疫疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫病毒(FMDV)屬于一種急性、高度傳染性的病毒，會(huì)感染馴養(yǎng)的偶蹄反當(dāng)動(dòng) 物，從而對(duì)易感動(dòng)物與動(dòng)物產(chǎn)品的國際自由貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響?？蒞通過直接屠宰染病 的動(dòng)物或是W定期接種疫苗的方式對(duì)FMDV加 W控制。其中，對(duì)于感染、恢復(fù)和口蹄疫易感動(dòng) 物進(jìn)行屠宰是公認(rèn)最優(yōu)選的方法。
[0003] 接種疫苗的方式是目前對(duì)于大多數(shù)口蹄疫流行地區(qū)的一種成熟且容易控制疫情 的方式，利用運(yùn)種方法除了具有成本效益外，也可達(dá)到醫(yī)療防疫的功效。特別是對(duì)于亞洲、 中東和拉下美洲等發(fā)展中或不發(fā)達(dá)國家，運(yùn)些國家口蹄疫的疫情發(fā)生頻率較高，其政府在 確保其動(dòng)物性食品的安全性與供給源不短缺的條件下，要求對(duì)易感染的馴養(yǎng)牲畜事先進(jìn)行 更多的常規(guī)FMDV疫苗接種。根據(jù)目前疫苗市場規(guī)模的統(tǒng)計(jì)，僅在中國，口蹄疫疫苗市場預(yù)計(jì) 從2015年至2020年可增加約26.3%的銷售金額，同時(shí)對(duì)于口蹄疫病毒，目前疫苗生產(chǎn)設(shè)施 方面也必須符合國際獸疫局(OIE)的要求。
[0004] 傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)通常在懸浮液或在單層細(xì)胞中培養(yǎng)、濃縮、部分純化病毒，并利用乙 締亞胺滅活病毒并與佐劑混合。由此制得的傳統(tǒng)滅活疫苗已被證明能有效預(yù)防口蹄疫，但 在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)過程中，因?yàn)椴煌耆磻?yīng)或活病毒污染等操作失誤，使得傳統(tǒng)疫苗的 生產(chǎn)過程存在發(fā)生污染與擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 口蹄疫疫苗的接種策略包括使用各流行病毒株分別接種，W防止不同血清型的病 毒株再度感染動(dòng)物?？谔阋卟《究煞譃橥痛箢惷庖哐逍停謩e為0、A、C、SAT1 (南非1型）、 SAT2、SAT3和Asia 1 (亞洲1型），上述屯大類免疫血清型還可細(xì)分為包括超過65種的亞型， 其中有許多抗原性變異已經(jīng)被確定。此外，在各個(gè)血清型中存在一些亞型，針對(duì)該血清型的 傳統(tǒng)疫苗無法提供針對(duì)個(gè)別亞型的充分保護(hù)，由此在目前單一傳統(tǒng)疫苗的接種情況之下難 W對(duì)口蹄疫進(jìn)行全面控制。因此，現(xiàn)階段在開發(fā)替代性的疫苗設(shè)計(jì)策略。例如已有合成疫苗 的報(bào)導(dǎo)，但距離廣范利用合成膚疫苗取代傳統(tǒng)疫苗，在口蹄疫病情流行的國家根除口蹄疫 的希望尚存距離。
[0006] 基于表位的疫苗（epitope-based vaccine,EV)是一種安全、廉價(jià)的疫苗生產(chǎn)策 略，利用運(yùn)種方式所生產(chǎn)的疫苗易于運(yùn)輸、儲(chǔ)存與接種，兼具許多其它的優(yōu)點(diǎn)，包括能夠誘 導(dǎo)廣泛的防護(hù)作用，快速的疫苗接種方式，W及提供長期的保護(hù)性免疫應(yīng)答。有報(bào)道稱基于 表位的疫苗的設(shè)計(jì)可成功地針對(duì)多種血清型和亞型?；诒砦坏囊呙缢媾R的主要挑戰(zhàn)在 于它們?cè)醋圆≡w廣泛變化的基因組，并且在被保護(hù)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中，對(duì)于多樣性表位 抗原的選擇，必須通過優(yōu)化的過程，才能確保在一個(gè)族群的動(dòng)物中都能產(chǎn)生強(qiáng)而有效的免 疫應(yīng)答。
[0007] 根據(jù)對(duì)基于表位的免疫的認(rèn)知，已經(jīng)開發(fā)了針對(duì)口蹄疫病毒的B和T細(xì)胞表位的合 成嵌合膚?？谔阋卟《镜脑缙谘芯看_定了 口蹄疫病毒衣殼蛋白VPl上的主要抗原性位點(diǎn)之 一，即暴露在表面的G-H環(huán)(氨基酸位置140至160)，其為主要的B細(xì)胞表位。而T細(xì)胞表位與 主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)分子(在牛中也被稱為牛白細(xì)胞抗原(BoLA))形成具有足夠親 和力的特異性結(jié)合，是引發(fā)特異于病原體的有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答所必需的。
[0008] 然而基于表位的疫苗的良好設(shè)計(jì)僅通過加入T細(xì)胞表位并不足夠，所選擇的膚應(yīng) 有效覆蓋整個(gè)物種的族群，并且該T細(xì)胞表位必須同時(shí)與牛上的各種血IC等位基因產(chǎn)生良好 的相互作用。鑒于此，必須進(jìn)一步闡明BoLA-DR基因的多態(tài)性對(duì)穩(wěn)定的膚與MHCII分子結(jié)合， W及T細(xì)胞受體對(duì)MHC結(jié)合膚的識(shí)別的影響。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)中有多種T抗原表位預(yù)測工具，但其均存在各自問題。
[0010] 第一種工具是抗原表位數(shù)據(jù)庫。
[0011] 關(guān)于抗原表位研究，目前已有超過20萬項(xiàng)實(shí)驗(yàn)資料發(fā)表。其中免疫表位數(shù)據(jù)庫 (Immune Epitope化化base,I邸B)耗時(shí)四年時(shí)間捜集九成W上的相關(guān)文獻(xiàn)，為該領(lǐng)域最具 代表性的數(shù)據(jù)庫之一 (Vita, Zarebski et al. 2010) JEDB將抗原表位依據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)證結(jié) 果，分類為B細(xì)胞抗原表位、T細(xì)胞抗原表位或可與MHC結(jié)合者，能辨識(shí)運(yùn)些抗原表位的物種 包括人類及豬、牛、羊、山羊等多種家畜。使用者可利用抗原表位結(jié)構(gòu)、來源物種、MH邱良制 性、宿主物種等捜索條件，從該數(shù)據(jù)庫查詢各抗原表位的序列、實(shí)驗(yàn)方法等詳細(xì)資料。I抓B 資料完全對(duì)外開放，因此該數(shù)據(jù)庫對(duì)于發(fā)展各物種與疾病的膚疫苗非常重要。
[001^ 美中不足的是，IEDB多半僅知曉抗原表位的M肥限制性為MHC I類或MHC II類，但 不知曉特定MHC等位基因是什么，缺少研發(fā)膚疫苗所需的運(yùn)項(xiàng)重要信息。此外，I抓則欠錄的 許多文獻(xiàn)多是針對(duì)特定病原的蛋白質(zhì)序列逐序合成并測試其抗原性，其中序列重復(fù)性極 高，對(duì)膚疫苗研發(fā)者而言，需再通過額外方式剔除運(yùn)些冗余的信息。
[0013] 第二種工具是抗原表位對(duì)多態(tài)性MHC分子的結(jié)合預(yù)測。
[0014] 如前所述，MHC分子的多態(tài)性殘基多出現(xiàn)于結(jié)合抗原表位的口袋處，口袋的化學(xué)與 容積特性隨基因型而異，并對(duì)抗原表位的殘基產(chǎn)生高度選擇性?？诖慕Y(jié)合特異性可利用 實(shí)驗(yàn)方式加 W驗(yàn)證，例如合成各種氨基酸序列所組成的膚并測試其結(jié)合能力，藉此獲得"口 袋分布表"（Sturniolo.Bono et al.l999)。
[001引目前口袋分布表資料最為齊全的是ProPred網(wǎng)絡(luò)工具（http:// WW. imtech.res. in/ra曲ava/propred/)。人類抗原呈遞細(xì)胞所表現(xiàn)的MHC II分子大于 90 %比例由HLA-DR等位基因組成，且HLA-DR等位基因目前已知有100種W上。ProPred提供 51種HLA-DR等位基因資料，該工具可用于計(jì)算任何氨基酸序列與運(yùn)些MHC分子結(jié)合的可能 性（Sin曲 and Ra曲ava 2001)。
[0016] ProPred的預(yù)測方式如下：從目標(biāo)膚序列取得W九個(gè)連續(xù)性氨基酸組成的所有可 能的膚框架，W運(yùn)些膚框架作為結(jié)合至MHC II上的結(jié)合核屯、，并依據(jù)口袋分布表對(duì)框架中 每個(gè)殘基給予分?jǐn)?shù)，換算得每個(gè)膚框架的總分。單一膚框架的總分大小與該段膚與MHC II 的結(jié)合能力成正相關(guān)（Sl:u;rniolo,Bono et al.l"9)。
[0017] 尤須注意的是，MHC II結(jié)合小溝的P1、P2、P3較不具多態(tài)性;且P5和P8位置的抗原 表位氨基酸側(cè)鏈朝向T細(xì)胞受體端(TCR)，運(yùn)兩個(gè)結(jié)合口袋對(duì)膚結(jié)合能力的影響較小。整體 而言，？4、？6、？7、？9的多態(tài)性對(duì)血1(：分子與膚結(jié)合的特異性扮演關(guān)鍵角色。？'〇?'6(1工具基于 運(yùn)項(xiàng)研究基礎(chǔ)，其計(jì)算膚結(jié)合能力的口袋分布表偏重?4、？6、？7、？9，且完全排除?5和?8的影 響性（Sl:u;rniolo,Bono et al. 1999)。
[0018] 透過口袋分布表的演算方式，雖可快速推算膚與特定M肥等位基因的結(jié)合能力，然 而免疫細(xì)胞進(jìn)行抗原呈遞時(shí)，T細(xì)胞受體端與抗原膚表位的交互作用，仍是無法忽視的重要 因素。因此如何一并納入考慮是未來研發(fā)膚疫苗待克服的難題。
[0019] 第=種工具是疏水性力矩計(jì)算。
[0020] T細(xì)胞抗原表位Wa螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合至MHC II小溝，且MHC II 口袋P1、P4、P6、P7、 P9偏好疏水性交互作用，故抗原表位a螺旋與MHC結(jié)合面多為疏水性殘基，而與T細(xì)胞受體結(jié) 合面則多為親水性殘基。換言之，抗原表位a螺旋的兩親性性質(zhì)，使其形成朝向MHC結(jié)合面的 平均疏水性力矩。故疫苗研發(fā)時(shí)，可W平均疏水性力矩作為評(píng)估T細(xì)胞抗原表位活性的重要 參考要素。
[0021 ] Hy化oM化1C是計(jì)算平均疏水性力矩的網(wǎng)絡(luò)工具。Hy化oMCa 1C可計(jì)算不同a螺旋構(gòu) 型，例如側(cè)鏈夾角100°、111°、120°、160°、170°、180°等角度的平均疏水性力矩。該網(wǎng)站也提 供不同疏水性數(shù)值供使用者選擇，包含CCS數(shù)值、學(xué)者Kyte與Doolitle所發(fā)表的數(shù)值、學(xué)者 Eisenberg所發(fā)表的數(shù)值化isenberg,Weiss et al.l982;Kyte and Doolittle 1982; Tossi 2002)O
[0022] 研究指出，T細(xì)胞抗原表位的a螺旋呈遞獨(dú)特的扭曲結(jié)構(gòu)使相鄰殘基間的側(cè)鏈夾角 呈遞130%側(cè)鏈也藉此與MHC產(chǎn)生充分的交互作用。計(jì)算T細(xì)胞抗原表位的平均疏水性力矩 無法使用Hy化oMCalc所提供的選項(xiàng)，膚疫苗研發(fā)者尚需自行研發(fā)相關(guān)工具。
[0023] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)中方法存在諸多缺陷，本發(fā)明試圖建立優(yōu)化候選膚的策略，通過生 物大數(shù)據(jù)探勘（in Silico)的方法進(jìn)行T細(xì)胞表位篩選、MHCII分子=維模型建構(gòu)、T細(xì)胞表 位優(yōu)化設(shè)計(jì)，合理的設(shè)計(jì)基于表位的疫苗的膚組合文庫，在維持免疫結(jié)構(gòu)抗原表位的同時(shí)， 模擬跨族群的T細(xì)胞表位個(gè)體變異特性，W覆蓋由于地域或種類差異及高度可變性免疫組 織相容復(fù)合物的廣泛范圍，從而得到具有對(duì)口蹄疫病毒更有效的T細(xì)胞表位，并提供廣泛保 護(hù)力的膚疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
[0025] 第一方面，本發(fā)明提供一種對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法，包括W下步驟：
[0026] 1)選擇目標(biāo)物種的適合的T細(xì)胞表位；
[0027] 2)對(duì)目標(biāo)物種的MHC-DR進(jìn)行同源建模；W及 [002引3)對(duì)所述T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化。
[0029] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟1)包括W下步驟：
[0030] a.選擇候選的目標(biāo)物種的T細(xì)胞表位；
[0031 ] b.評(píng)估T細(xì)胞表位結(jié)合粉。；W及
[0032] C.計(jì)算所述T細(xì)胞表位的疏水性力矩。
[0033] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟2)包括W下步驟：
[0034] a.獲取目標(biāo)物種的MHC-DR的等位基因序列；
[0035] b.挑選人HLA-DR結(jié)構(gòu)作為與T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、匹配的模板；
[0036] C.序列比對(duì)和建模；W及
[0037] d.模型評(píng)估。
[0038] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟3)包括W下步驟：
[0039] a.比較目標(biāo)物種M肥-DR的M肥-膚復(fù)合體的口袋容積，確定M肥口袋分布；
[0040] b. T細(xì)胞表位優(yōu)化；W及任選地 [0041 ] C.對(duì)T細(xì)胞表位優(yōu)化進(jìn)行評(píng)估。
[0042] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟b包括W下一或多個(gè)步驟：
[0043] i.在所述T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、的主要結(jié)合位置額外引入尺寸不同的氨基酸殘基的 復(fù)合取代W匹配不同的口袋；
[0044] ii.在所述T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、的次要結(jié)合位置額外引入附加殘基的復(fù)合取代W 增加結(jié)合度;或者
[0045] iii .延伸膚疫苗上T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、兩端的膚長度W增加結(jié)合度。
[0046] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，將所述T細(xì)胞表位的長度設(shè)定為10-20個(gè)氨基酸，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)氨基酸，例如在所述T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、序列的N末 端和C末端分別還可包括一或多個(gè)額外的氨基酸，例如在N末端為額外的4個(gè)氨基酸，例如 MDRF，或者在N末端為額外的8個(gè)氨基酸，例如VDFIMDRF，例如在C末端為額外的2個(gè)氨基酸， 例如HV。
[0047] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述目標(biāo)物種為人或偶蹄動(dòng)物，例如牛、豬、羊。
[0048] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述目標(biāo)物種為牛。
[0049] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、序列為VKIN化SPT。
[0050] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在所述牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、序列的第一位額外引 入氨基酸殘基F的復(fù)合取代，和/或在所述核屯、序列的第九位額外引入氨基酸殘基I的復(fù)合 取代。
[0051] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在所述牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、序列的第二位額外引 入氨基酸殘基R的復(fù)合取代。
[0052] 第二方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含具有通式A-L-B的膚文庫（libra巧），其中
[0053] A為包含T細(xì)胞表位的膚，所述T細(xì)胞表位經(jīng)本發(fā)明的上述方法得到；
[0054] B為包含B細(xì)胞表位的膚；
[0055] L為任選存在的接頭。
[0056] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞表位包含長度為9個(gè)氨基酸的序列X1-X2-X3- X4-X5-X6-X7-X8-X90
[0化7] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列為IN化SP。
[005引在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，&為V或F。
[0059] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，X9為T或I。
[0060] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，&為1(或R。
[0061] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，A的長度為10-20個(gè)氨基酸，例如10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20個(gè)氨基酸，例如在X廣X2-X3-X4-X日-X6-X7-X8-X9的N末端和C末端分別還可包 括一或多個(gè)額外的氨基酸，例如在N末端為額外的4個(gè)氨基酸，例如MDRF，或者在N末端為額 外的8個(gè)氨基酸，例如VDFIMDRF，例如在C末端為額外的2個(gè)氨基酸，例如HV。
[0062] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，B的氨基酸序列為 VYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAAR(XPTSFNYFAIK。
[0063] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，L為eK。
[0064] 本發(fā)明對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法，是W下=個(gè)方面的特定組合，即目標(biāo)物種 (尤其是牛)T細(xì)胞表位膚特性條件的選擇，建立目標(biāo)物種的MHC多樣性模型，利用目標(biāo)物種 的MHC多樣性模型進(jìn)行表位膚的優(yōu)化。W上=個(gè)方面是=位一體缺一不可的。其中，對(duì)于MHC 多樣性模型的建立，其具有研發(fā)上的獨(dú)特性，包括:建立模型實(shí)際計(jì)算袋口體積基因多型性 的關(guān)系，藉此建立復(fù)合取代的策略。而優(yōu)化方式又包括=個(gè)獨(dú)特環(huán)節(jié):核屯、序列第1與第9位 的復(fù)合取代策略，核屯、序列第2位的R取代策略，核屯、序列兩端延伸的策略。
[0065] 由此設(shè)計(jì)并制備的基于表位的疫苗的膚組合文庫一方面適于合成膚疫苗的工業(yè) 化生產(chǎn)，另一方面免疫原性增加，其通過覆蓋在給定目標(biāo)族群的基因的多型性，同時(shí)有利于 誘導(dǎo)在變體宿主免疫系統(tǒng)下演變的保護(hù)性免疫原性，從而提供廣泛保護(hù)力。
【附圖說明】
[0066] 圖1.牛的T細(xì)胞表位抗原的選擇和設(shè)計(jì)策略圖。圖IA示出牛T細(xì)胞表位的生物大數(shù) 據(jù)選擇和設(shè)計(jì)工作流程。設(shè)計(jì)策略分為S個(gè)階段，包括表位選擇，同源建?；痮mology mode 11 ing)和T細(xì)胞表位優(yōu)化設(shè)計(jì)。圖IB示出螺旋狀的膚在朝向MHCII的結(jié)合口袋的方向。 MHCII的口袋中與細(xì)胞表位抗原膚結(jié)合位點(diǎn)，圖示是W平面觀察的方式來呈現(xiàn)人類MHC 化LAKPDB代碼：1D5M)，W藍(lán)色顯示該分子的表面，與流感病毒膚的膚主鏈相互交互作用的 模式。膚的側(cè)鏈顯示為黃色，貼附在分子表面的周圍。在底部則W逆時(shí)針方向來顯示氨基酸 的結(jié)合口袋的號(hào)碼如下：1號(hào)位為鄉(xiāng)氨酸(V)，3號(hào)位為異亮氨酸（I)，6號(hào)位為亮氨酸化），9號(hào) 位為異亮氨酸（I)。圖1C. W螺旋輪來代表兩親性膚的結(jié)合核屯、，所顯示的序列來自人類MHC 的晶體結(jié)構(gòu)復(fù)合物中的表位，每個(gè)氨基酸殘基之間的轉(zhuǎn)動(dòng)角約130度。T細(xì)胞表位的氨基酸 殘基1、3、6、9的側(cè)鏈朝向在MHCII類結(jié)合裂口（cleft)底部顯現(xiàn)的相應(yīng)結(jié)合口袋。W紅（1、3、 6、9)、藍(lán)(4、5、7、8)、深藍(lán)(2)的彩色圓圈分別來指示疏水性、不帶電的極性、帶正電荷氨基 酸殘基。W箭頭來指示根據(jù)Eisenberg的方法所計(jì)算的疏水性力矩化7化〇地Obic moment) (單位為地)的大小和方向，疏水性力矩代表該在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中，氨基酸兩親性的a螺旋 結(jié)構(gòu)周期性的強(qiáng)度。
[0067] 圖2 . B〇LA-DRB3*0101膚結(jié)合位點(diǎn)中的口袋及口袋體積估算。圖2A. BOLA-DRB3* OlOl膚結(jié)合位點(diǎn)的俯視圖，該分子表面W灰色來顯示（由ViewerLite4.2繪制完成），細(xì)的線 條顯示周邊的氨基酸殘基。具有側(cè)鏈的膚W棒狀模型表示。圖2B.容納膚側(cè)鏈的口袋4的詳 細(xì)的周圍視圖，Pl、4、6、7和9根據(jù)其在膚上的距離進(jìn)行標(biāo)記。通過網(wǎng)格程序化cketPicker檢 測由B〇LA-DRB3*0101和潛在結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)的包覆結(jié)構(gòu)的形狀，W灰度較深的球體來顯示更 大的含蓋容積(buriedness)。網(wǎng)格探針表示緊貼蛋白表面之上，具有IA3網(wǎng)格尺寸的矩形 網(wǎng)格。
[006引圖3.130種牛的BoLA-DRBS等位基因的膚結(jié)合位的日袋體積與分布。圖3A.根據(jù) BOLA-DRB3 口袋的大小形狀進(jìn)行等位基因的分類，利用iro數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)作為最終確定的數(shù) 目，可分類為20大類BOLA-DRB3，W及同源立體結(jié)構(gòu)、與膚結(jié)合槽形成的口袋的體積。結(jié)合口 袋的大小通過網(wǎng)格技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，就其埋入的網(wǎng)格探針由化CketPicker來計(jì)算網(wǎng)格探針的 數(shù)目，一個(gè)網(wǎng)格探針定義為1 A3的立方體網(wǎng)格。結(jié)合口袋沿著沿著結(jié)合膚的方向編號(hào)，1、 4、6、7、9分別如X軸所示。在y軸上W水平線顯示網(wǎng)格探針的平均值。圖3B.圓餅圖顯示圖3A 中對(duì)應(yīng)的彩色點(diǎn)，其代表多態(tài)性殘基的頻率分布，呈現(xiàn)出iro數(shù)據(jù)庫所述的20類130B化A- DRB3等位基因的口袋特異性分布。頻率分布最高的S種W對(duì)應(yīng)的彩色和數(shù)字標(biāo)識(shí)，用于分 布鑒定。圖3C.Sturniolo et al.中所述氨基酸對(duì)各個(gè)BOLA-DRB3等位基因的相對(duì)親和力， 只顯示在圖3B中較高頻率的分布?？诖?中，分布1比較傾向于芳香族氨基酸，而分布2偏愛 脂肪族氨基酸。相對(duì)的結(jié)合值(Y軸)通過W下算法計(jì)算，用針對(duì)在由Sturniolo et al.中所 記載的相同膚的位置的丙氨酸得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)值（ICso)值對(duì)實(shí)驗(yàn)的ICso數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。兩 個(gè)口袋1和9主要存在兩種較大的分布差異，表現(xiàn)為在對(duì)應(yīng)膚結(jié)合位點(diǎn)引入兩種具有不同尺 寸側(cè)鏈的殘基，因此在抗原呈遞的多聚化膚設(shè)計(jì)策略中適合更多等位基因，W保護(hù)更多的 多態(tài)性物種。
[00例圖4.BOLA-DRB3結(jié)合口袋2位置的立體結(jié)構(gòu)與交互作用示意圖。在膚抗原上的保守 性氨基酸殘基與MHCII類形成相互作用的氨鍵。圖4A.與精氨酸(T細(xì)胞表位膚抗原的+2的位 置)相互作用（小于4 A的距離）的人類MHCII類和牛MHCII類的保守氨基酸殘基是化7、的7、 的8、08巧郵82。077的簇基氧與精氨酸的一個(gè)側(cè)鏈氮形成氨鍵。絲帶與棒為人類M肥的結(jié)構(gòu) (PDB代碼：1AQD)，實(shí)屯、棒為結(jié)合膚。點(diǎn)狀棒則表示采同源建模方式構(gòu)建，重疊在人類MHC結(jié) 構(gòu)上的B0LA-DRB3*0101的對(duì)應(yīng)殘基。圖4B.來自免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（IPD)的BOLA-DRB3中保 守氨基酸殘基出現(xiàn)頻率。保守氨基酸殘基來自參考等位基因 B0LA-DRB3*0101。
[0070] 圖5.本發(fā)明中針對(duì)口蹄疫病毒設(shè)計(jì)的基于表位的疫苗的VPlThcomb-FMDV-Ol的氨 基酸序列。細(xì)胞表位使用圖示VPl化comb位點(diǎn)的組合文庫。T細(xì)胞表位和VPl的G-H環(huán)區(qū)的B細(xì) 胞表位之間通過E-賴氨酸接頭相連。表面暴露的RGDS膚W下劃線突出顯示。Pl、P2和P9的 位置分別代表對(duì)應(yīng)于由ProPred Web服務(wù)器預(yù)測的MHCII結(jié)合口袋1、2、9的位置。
【具體實(shí)施方式】
[0071] 本發(fā)明并不限于本文所述的具體方法、方案、試劑等，因?yàn)檫\(yùn)些可W變化。本文所 用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案的目的而不是為了限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義， 本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0072] 在詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案之前，對(duì)理解本發(fā)明很重要的術(shù)語給出定 義。
[0073] 如本文所用，通過T細(xì)胞表位"優(yōu)化"得到對(duì)目標(biāo)病毒更有效的T細(xì)胞表位，并由此 提供具有廣泛保護(hù)力的膚疫苗。所述"優(yōu)化"具體是指對(duì)T細(xì)胞表位的氨基酸序列進(jìn)行修飾 或調(diào)整，從而在維持免疫結(jié)構(gòu)抗原表位的同時(shí)，模擬跨族群的T細(xì)胞表位個(gè)體變異特性，W 覆蓋由于地域或種類差異及高度可變性免疫組織相容復(fù)合物的廣泛范圍。示例性的修飾或 調(diào)整包括例如下文述及的復(fù)合取代、膚序列延伸等。
[0074] 如本文所用，"廣泛保護(hù)力"是指抗原膚具有和多種免疫組織兼容復(fù)合物結(jié)合的能 力，且可活化T輔助細(xì)胞活性及促進(jìn)B細(xì)胞生成抗原專一性抗體，達(dá)到預(yù)防病毒專一感染及 根除病毒癥狀。
[0075] 如本文所用，"結(jié)合核屯、序列"是指膚和免疫組織相容復(fù)合物結(jié)合的序列（由9個(gè)氨 基酸組成，WXi到姑表示）。
[0076] 如本文所用，"表位"又稱為抗原決定簇，它是一組來自蛋白質(zhì)抗原，并由免疫系 統(tǒng)，確切地講由例如抗體、B細(xì)胞、或T細(xì)胞特異性識(shí)別的抗原部分。
[0077] 如本文所用，"T細(xì)胞表位"是指是指W合理的效率結(jié)合MHC II類分子或能夠通過 在MHC II類上呈遞來刺激T細(xì)胞的特定膚序列。
[0078] 如本文所用，"B細(xì)胞表位"是指被B細(xì)胞識(shí)別的膚序列。用于與本發(fā)明的T細(xì)胞表位 組合的B細(xì)胞表位是具有中和作用的B細(xì)胞表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W通過本領(lǐng)域的常規(guī)技 術(shù)手段設(shè)計(jì)針對(duì)特定物種或病毒的B細(xì)胞表位。例如針對(duì)口蹄疫病毒的B細(xì)胞表位可參見 Pfaff,E.et al.Analysis of neutralizing epitopes on foot-and-mouth disease virus.J Virol 62,2033-2040(1988).W及I'aboga'O.et al.A large-scale evaluation of peptide v曰ccines 曰g曰inst foot-曰nd-mouth dise曰se:l曰ck of solid protection in cattle and isolation of escape mu1:ants.J Virol 71,2606-2614(1997)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可W通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
[0079] 如本文所用，"接頭"是指具有一定長度的氨基酸組成的多膚，其可W使所連接的 融合多膚中各部分充分展開，互不干擾。在本發(fā)明中，T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位任選通過接頭 從結(jié)構(gòu)上區(qū)分開來，從而在實(shí)際免疫作用下彼此分開。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本領(lǐng)域的 常規(guī)接頭均可用于本發(fā)明，包括但不限于，例如本發(fā)明所使用的eK，其在與相鄰氨基酸的簇 基形成共價(jià)鍵時(shí)使用的是賴氨酸E-碳上的氨基。
[0080] 如本文所用，"基于表位的疫苗"是指用抗原表位氨基酸序列制備的疫苗，包括合 成膚疫苗（synthetic peptide vaccine)、重組表位疫苗（recombinant epitope-based vaccine)及表位核酸疫苗。
[0081 ]如本文所用，"主要組織兼容性復(fù)合體"即"MHC"是在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的編 碼MHC分子的一個(gè)大的基因組區(qū)或基因家族，運(yùn)些血IC分子將被加工的蛋白質(zhì)的片段或表位 展示在細(xì)胞表面上。
[0082]在免疫系統(tǒng)中，MHC能與細(xì)胞內(nèi)的外來膚片段結(jié)合，并呈遞于細(xì)胞表面，供T細(xì)胞或 自然殺傷細(xì)胞辨識(shí)而啟動(dòng)免疫反應(yīng)。MHC-般可分為兩類:MHC I類及MHC II類，其中MHC I 類存在于所有有核的細(xì)胞表面上，主要呈遞細(xì)胞質(zhì)中的膚片段供殺傷T細(xì)胞辨識(shí);而MHC II 類主要存在于巨隧細(xì)胞或樹突細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上，將內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的外 源性膚片段呈遞給輔助型T細(xì)胞(Th)，啟動(dòng)化1相關(guān)的細(xì)胞免疫反應(yīng)或化2相關(guān)的體液免疫 反應(yīng)，包括B細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)抗體類型的轉(zhuǎn)換、促進(jìn)B細(xì)胞釋放抗體等。MHC I類及MHC II類 分子在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)過量，細(xì)胞一旦感染病原體，病原體在細(xì)胞內(nèi)的液胞中增殖，或病原體的 蛋白質(zhì)被B細(xì)胞所吞入時(shí)，運(yùn)些病原體蛋白質(zhì)所衍生的膚可輕易的遇到為數(shù)眾多、未與膚結(jié) 合的MHC II類分子并與之結(jié)合，T細(xì)胞便可認(rèn)識(shí)位于細(xì)胞表面組合形成的配體。
[00削 M肥I與MHC II均為異二聚體，其中MHC I由一條構(gòu)成Ql、a2及a3結(jié)構(gòu)域的跨膜重 鏈，加上的微球蛋白所構(gòu)成;MHC II則由兩條跨膜的a及0鏈所構(gòu)成，各別包含al、a2結(jié)構(gòu)域 及m、的結(jié)構(gòu)域。MHC I的膚結(jié)合小溝由al及a2結(jié)構(gòu)域所組成，而因結(jié)合小溝兩端有芳香族 氨基酸的阻擋，因此限制了與其結(jié)合的膚的長度，約為8至10個(gè)氨基酸。MHC II的膚結(jié)合小 溝則由Ol及m結(jié)構(gòu)域所組成，因兩端開放，因此可與長約20個(gè)氨基酸的膚結(jié)合。
[0084]人類主要組織兼容性復(fù)合體第II類由人類白細(xì)胞抗原化LA)HLA-DR、HLA-DM、HLA- DQ及HLA-DP所組成，其中僅有HLA-DR及HLA-DQ為細(xì)胞表面受體。HLA-DR的晶體結(jié)構(gòu)顯示其 結(jié)合小溝內(nèi)具有口袋可容納抗原膚的側(cè)鏈，因 HLA-DR具有高度的多態(tài)性，而多態(tài)性的氨基 酸經(jīng)常是構(gòu)成口袋的部分，因此不同等位基因間的口袋可能具有不同的物理及化學(xué)性質(zhì)， 而對(duì)于抗原膚側(cè)鏈的結(jié)合力產(chǎn)生不等的影響。
[0085] 豬免疫反應(yīng)及疫苗相關(guān)最重要的基因?yàn)樨i主要組織兼容性復(fù)合體，即豬白細(xì)胞抗 原（SLA)。而豬MHC II中，僅有與HLA-DR及HLA-DQ具有高度同源性的細(xì)胞表面受體SLA-DR及 SLA-DQ3，且SLA-DR具有較大程度表現(xiàn)。
[0086] 牛免疫反應(yīng)及疫苗相關(guān)最重要的基因?yàn)榕Ｖ饕M織兼容性復(fù)合體，即牛白細(xì)胞抗 原(BoLA)。而牛MHC II中，僅有與HLA-DR及HLA-DQ具有高度同源性的細(xì)胞表面受體BoLA-DR 及BOLA-DQ3，且BoLA-DR具有較大程度表現(xiàn)。
[0087] 人類與牛的DR多態(tài)性主要來自于構(gòu)成齡連的DRB基因，且兩物種間的氨基酸多態(tài)性 位置大部分皆相同，特別是在構(gòu)成結(jié)合小溝的特定位置。牛的DRA在al結(jié)構(gòu)域僅有兩個(gè)多態(tài) 性位置，然而大部分的物種在該結(jié)構(gòu)域不具多態(tài)性。與MHC II結(jié)合的膚通常長度不固定，但 其中有9個(gè)氨基酸的膚結(jié)合核屯、可對(duì)應(yīng)于MHC II的結(jié)合小溝與其口袋，而其第1及第9個(gè)位 置為抗原膚的典型錯(cuò)定位置。MHC II上的主要口袋有？1、？4、？6、？7及?9，對(duì)應(yīng)于膚結(jié)合核屯、 的相對(duì)殘基位置，其中Pl對(duì)于膚與MHC II的穩(wěn)定結(jié)合甚為重要。
[0088] 抗原膚W兩種類型的作用與結(jié)合小溝結(jié)合，一種為膚骨干與小溝周邊的保守殘基 所形成約12至15處的氨鍵;另一種為膚的側(cè)鏈與MHC II 口袋之間的結(jié)合力。S化rniolo等人 提出了利用構(gòu)成口袋的多樣性殘基進(jìn)行分類，將相同殘基組成的口袋歸類于具有相似物理 化學(xué)性質(zhì)及結(jié)合偏好的相同分布表(profile),并W實(shí)驗(yàn)建立多種分布表對(duì)于不同抗原殘 基的結(jié)合力數(shù)據(jù)資料。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Pl 口袋在多數(shù)的MHC II(如人類的HLA-DR或鼠科的I- E)中偏好脂肪族或芳香族殘基，并考慮基于此對(duì)抗原表位進(jìn)行優(yōu)化。
[0089] 另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，若抗原膚在P2位置為精氨酸，則能提升膚與化A中DRBl* 0101、01?81*0401^及01^1*1101的結(jié)合力;據(jù)晶體結(jié)構(gòu)顯示，其結(jié)合力應(yīng)來自于精氨酸側(cè)鏈 末端的氮原子與M肥結(jié)合小溝外緣的化過77的幾基氧所形成氨鍵。
[0090] 此外，在膚的結(jié)合核屯、序列之外所延伸的膚側(cè)翼殘基(PFR)也能與MHC分子上的保 守殘基形成氨鍵，并增加膚與MHC的結(jié)合。本發(fā)明包含T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、序列的抗原膚長 度W10-20個(gè)氨基酸為宜，對(duì)于核屯、序列N末端和C末端的氨基酸殘基種類沒有特殊要求，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可W基于合成膚中的工藝需求，選擇任意適合的氨基酸殘基。并且在N末端或 C末端各自的氨基酸殘基數(shù)量對(duì)于膚結(jié)合力并無明顯影響。
[0091] 如本文所用，"結(jié)合口袋"是指因其形狀而順利地與另一個(gè)化學(xué)實(shí)體相結(jié)合的分子 或分子復(fù)合物的區(qū)域。術(shù)語"口袋"包括但不限于裂縫、通道或位點(diǎn)。結(jié)合口袋的形狀可W在 結(jié)合化學(xué)實(shí)體前大體上預(yù)形成，可W在與化學(xué)實(shí)體結(jié)合的同時(shí)形成，或者可W通過另一個(gè) 化學(xué)實(shí)體與該分子的不同的結(jié)合口袋結(jié)合而形成，運(yùn)又導(dǎo)致該結(jié)合口袋形狀的改變。
[0092] 如本文所用，"主要結(jié)合位置"是指對(duì)抗原與MHC結(jié)合口袋結(jié)合能力影響較大的抗 原表位結(jié)合核屯、上的位點(diǎn)。例如在本發(fā)明中，Pl和P9 口袋對(duì)抗原和MHC的結(jié)合影響最大，可 視為主要結(jié)合位置。
[0093] 如本文所用，"次要結(jié)合位置"是指對(duì)抗原與MHC結(jié)合口袋結(jié)合能力影響較小的抗 原表位結(jié)合核屯、上的位點(diǎn)。例如在本發(fā)明中，P2 口袋對(duì)抗原和MHC的結(jié)合也有影響，但影響 較小，可視為次要結(jié)合位置。
[0094] 如本文所用，"復(fù)合取代"是指在原有天然序列仍然存在的情況下，額外引入針對(duì) 特定位點(diǎn)氨基酸殘基的取代，由此得到的膚是多種具有不同序列的膚文庫，所述膚文庫使 得抗原表位具有多重性。
[00M] W本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化的T抗原表位為例，在其9個(gè)氨基酸的天然核屯、序列的第1、2、9位 分別進(jìn)行"復(fù)合取代"意味著對(duì)第1、2、9位的氨基酸殘基分別進(jìn)行一種取代，由此得到的膚 在第1、2、9位的氨基酸殘基分別存在兩種可能，在進(jìn)行膚合成時(shí)，最終產(chǎn)生2X2X2 = 8種不 同的膚的文庫。原有天然序列仍包含在其中，并且與其他幾種膚基本上等比例存在。
[0096] 如本文所用，"多態(tài)性"是指MHC在不同個(gè)體之間的基因多型性。
[0097] 如本文所用，"混合辨識(shí)(promiscuous recognition)"是指由于MHC的多態(tài)性，多 種不同的MHC等位基因能夠辨識(shí)并與同一種膚結(jié)合。
[009引如本文所用，"疏水性力矩化7化0地Obic moment)"是W疏水作用的大小和方向?qū)?膚性質(zhì)的描述。每個(gè)氨基酸有其固定的物理性質(zhì)，膚疫苗與MHC結(jié)合作用的強(qiáng)弱除了取決于 Pl到P9對(duì)應(yīng)位置上各個(gè)關(guān)鍵性氨基酸的性質(zhì)之外，還取決于9個(gè)氨基酸的整體評(píng)估，即其總 和。"力矩"具有本領(lǐng)域通常的概念，其包含大小W及方向兩項(xiàng)內(nèi)容。W本發(fā)明選取的膚為 例，其疏水性力矩大小設(shè)定為大于3,并且方向朝向MHC的袋口方向，才有作用。
[0099] 基于本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)得到的基于表位的疫苗利用合成的方式來生產(chǎn)，具有顯著 節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)，并能夠通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，基于預(yù)測的表位膚庫進(jìn)行病毒基因組篩選。通過計(jì) 算機(jī)預(yù)測與模擬，并通過實(shí)際膚疫苗的合成執(zhí)行情況，W確定優(yōu)化的流程，可W達(dá)到畜牧生 產(chǎn)企業(yè)的規(guī)模。目前另有其它測試的物種，通過同樣的生物大數(shù)據(jù)探勘分析程序，建立獨(dú)立 的特定免疫應(yīng)答分子HLA的子集。
[0100] 另外，化學(xué)合成方式的疫苗生產(chǎn)除了可W避免在生產(chǎn)過程中的感染外，還具有生 產(chǎn)與構(gòu)建相對(duì)容易，生產(chǎn)的疫苗化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，是理想的疫苗生產(chǎn)方式之一。大多數(shù) 傳統(tǒng)的疫苗針對(duì)引起急性或是自限性感染的病毒，隨后持久免疫有效。迄今為止，合成疫苗 被認(rèn)為是次優(yōu)的生產(chǎn)方式，因?yàn)樗鼈兩倭藢?duì)于T細(xì)胞表位多樣性的考慮。本發(fā)明設(shè)計(jì)的基于 表位的組合疫苗的一個(gè)重要改進(jìn)是免疫原性的增加，其通過覆蓋在給定目標(biāo)族群的基因的 多型性，同時(shí)有利于誘導(dǎo)在變體宿主免疫系統(tǒng)下演變的保護(hù)性免疫原性。配置和血清學(xué)特 性之間的運(yùn)種相關(guān)性意味著運(yùn)樣的結(jié)構(gòu)分析對(duì)闡明基于表位的疫苗設(shè)計(jì)是有價(jià)值的，最終 可產(chǎn)生具有特定抗原特性的分子設(shè)計(jì)。
[0101] 隨著用于MHCII錯(cuò)定設(shè)計(jì)的組合膚庫的可用性的增加，對(duì)于牛MHCII類表位識(shí)別過 程的結(jié)構(gòu)性、分子性和生物學(xué)基礎(chǔ)的闡明，W及組合基于表位的疫苗的合理設(shè)計(jì)復(fù)雜性的 增加，會(huì)潛在導(dǎo)致理想的膚疫苗活性的提升，使得運(yùn)樣的方式更具生產(chǎn)成本優(yōu)勢，并且也可 W使通過撲殺控制口蹄疫的需求最小化。更一般地，設(shè)計(jì)的基于表位的疫苗可能提供疫苗 開發(fā)的潛在途徑，其不僅針對(duì)口蹄疫病毒，還可針對(duì)不同物種的許多其它病原體。
[0102] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn) 一步地詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解實(shí)施例和圖不應(yīng)理解為限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠清楚地 設(shè)想本文列出的原理的進(jìn)一步的修改。
[0103] 實(shí)施例；
[0104] 實(shí)施例1、T抗原表位的選擇
[0105] 口蹄疫病毒的衣殼蛋白VP1上突出的G-H環(huán)（包括暴露在表面的高度保守的精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)S膚)已被確定為口蹄疫病毒中和抗體(NA)針對(duì)的主要的B細(xì)胞 表位。然而，單獨(dú)施用G-H環(huán)合成膚導(dǎo)致有限的中和抗體誘導(dǎo)或無效的保護(hù)，主要的原因是 缺乏被牛和豬的MHC等位基因混合辨識(shí)的T細(xì)胞表位。
[0106] 為此，本發(fā)明設(shè)及牛T細(xì)胞表位的基于生物大數(shù)據(jù)的選擇和設(shè)計(jì)方法，其工作流程 如圖IA所示。設(shè)計(jì)策略分為=個(gè)階段，包括表位選擇、同源建模和T細(xì)胞表位優(yōu)化設(shè)計(jì)。
[0107] 首先進(jìn)行T細(xì)胞表位的選擇，包括W下步驟：
[01 08] 1)選擇候選的牛T細(xì)胞表位。該步驟在IEDB數(shù)據(jù)庫(WWW. ie化.org/)中進(jìn)行，利用 IEDB中的T細(xì)胞應(yīng)答與MHCII配體結(jié)合分析工具，預(yù)測與MHCII結(jié)合的T細(xì)胞表位，并通過 IEDB工具查詢符合算法的等位基因上的特異性。
[0109] 2)評(píng)估T細(xì)胞表位上的結(jié)合核屯、。該步驟利用ProPred分析工具進(jìn)行，其利用人類 51個(gè)分屬于九個(gè)血清學(xué)人類白細(xì)胞抗原化LA-DR)等位基因，分析所述T細(xì)胞表位的結(jié)合核 屯、與HLA-DR等位基因的結(jié)合力。經(jīng)預(yù)測與6種W上不同的HLA-DR等位基因結(jié)合的膚被認(rèn)為 是混合式(promiscuous)的膚。
[0110] 3)T細(xì)胞表位的疏水性力矩計(jì)算。利用EMBOSS分析工具，基于旋轉(zhuǎn)輪的方式根據(jù) Eisenberg的疏水性數(shù)值來計(jì)算兩性疏水性力矩的大小。挑選疏水性力矩與垂直線夾45度 角內(nèi)且平均疏水性力矩?cái)?shù)值大于0.3的抗原膚，作為適合本發(fā)明的目標(biāo)抗原膚。
[0111] 對(duì)選定的目標(biāo)VPlTh膚進(jìn)行調(diào)查，所述調(diào)查在一組來自牛群體的有效的抗原表位 的化細(xì)胞膚上進(jìn)行，W支持功能性表位疫苗的設(shè)計(jì)。表1示出的是經(jīng)篩選確定的最有可能的 一段抗原表位，即口蹄疫病毒VPl蛋白第32至50位氨基酸。使用一系列測定對(duì)VPlTh膚的免 疫原性特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，運(yùn)包含1個(gè)T細(xì)胞應(yīng)答、6個(gè)B細(xì)胞應(yīng)答和3個(gè)MHC配體結(jié)合測定，其在 IEDB數(shù)據(jù)庫中被分別記錄為表位ID 27470和31373。有效的MHCII結(jié)合的膚在螺旋的對(duì)側(cè)必 須具有含疏水和親水區(qū)的強(qiáng)螺旋結(jié)構(gòu)（圖1B)。
[0112] 表1.本發(fā)明中用于牛的基于表位的疫苗設(shè)計(jì)的所選代表性膚及其抗原性
[0113]
[0114] a.FMDV病毒衣殼蛋白VPl ,Genbank蛋白登錄號(hào):AHY00720。
[0115] b.根據(jù)Eisenbe巧的方法計(jì)算得到的兩性分子螺旋輪大于0.3疏水性力矩(mH)。
[0116] C.服務(wù)器可W預(yù)測膚與5巧巾HLA-DR等位基因的結(jié)合。
[0117] d.作為獨(dú)特的主標(biāo)識(shí)符的膚ID和來自不同類別測定的結(jié)果用于IEDB數(shù)據(jù)庫 (V. 2.13.1)中90 %比對(duì)同源性的線性表位檢索。
[011引e.通過ProPred網(wǎng)站服務(wù)器預(yù)測的長為9個(gè)氨基酸的混雜T細(xì)胞表位的核屯、（下劃 線)。
[0119] 通過螺旋輪分析計(jì)算確定VPllli的核屯、表位，其疏水性力矩為0.326(圖1C)。此外， 使用ProPred web服務(wù)可W分析等位基因群的覆蓋率，結(jié)果顯示，表1所示VPllli膚能結(jié)合12 種HLA-DR等位基因。值得注意的是，VPl化膚的兩個(gè)元分析已證實(shí)來自不同的線性表位序列 的T細(xì)胞的結(jié)合活性。
[0120] 實(shí)施例2、BoLA-DRB3同源建模
[0121] 牛BOLA-DRB3同源建模目的在于建立表位抗原膚VPllli和BOLA-DRB3分子的S維模 型，作為后續(xù)抗原膚優(yōu)化步驟的參考依據(jù)。所述同源建模包括W下步驟：
[0122] 1)獲取牛的BOLA-DRB3等位基因序列。該步驟在免疫多態(tài)數(shù)據(jù)庫（Immuno PoIymo巧hism Database，IPD)中進(jìn)行，結(jié)果包含13條a鏈和130條0鏈。
[0123] 2)模板篩選。從PDB(Protein Data Bank)數(shù)據(jù)庫中挑選人HLA-DR結(jié)構(gòu)（PDB代碼： 1D5M，a鏈和0鏈）作為模板，W便與來自口蹄疫病毒VPl蛋白的9個(gè)氨基酸的膚(PDB代碼： IZBAa鏈，如表1右欄下劃線所示)進(jìn)行匹配。前者可W理解為鎖孔，而后者可W理解為對(duì)應(yīng) 的鑰匙。
[0124] 3)序列比對(duì)和建模。利用MoldelledM模塊，對(duì)于程序設(shè)置為4 OA結(jié)構(gòu)差異之間 作為初始模型，并通過利用立方差的方式全面優(yōu)化模型。我們通過基于Lamarchian遺傳算 法的受體-配體對(duì)接模擬軟件，即AUT0D0CK(4.2版本)預(yù)測表位膚與大分子B0LA-DRB3蛋白 的結(jié)合自由能。
[01巧]4)模型評(píng)估。為了選擇較佳模型，使用SWISS-MOD化中的AWLEA和PROC肥CK，保持 默認(rèn)分析參數(shù)，分別評(píng)價(jià)局部模型質(zhì)量和立體化學(xué)包裝質(zhì)量。經(jīng)過評(píng)估后，具有較高的結(jié)合 能的模型被選擇為最佳的模擬模型。
[0126] 實(shí)施例3、T細(xì)胞表位優(yōu)化
[0127] 接下來進(jìn)行T細(xì)胞表位優(yōu)化，包括W下幾個(gè)步驟：
[012引1)比較B0LA-DRB3的MHC-膚復(fù)合體的口袋容積，確定M肥口袋分布。
[01巧]B0LA-DRB3基因座是高度多態(tài)性(polymorphic)的，并在牛異二聚體MHCII分子中 研究的最為透徹。運(yùn)些分子均由Q-鏈和e-鏈兩條蛋白鏈組成，BoLA-DRA編碼序列是單基因， BOLA-DRB3基因有超過130個(gè)已鑒定的等位基因。
[0130] MHCII膚結(jié)合溝具有各種化學(xué)性質(zhì)不同的結(jié)合口袋(簡稱為口袋1-9,即P1-9)。如 表2所示，來自B0LA-DRB3等位基因的結(jié)合口袋1、4、6、7和9上的大多數(shù)多態(tài)殘基是由與多個(gè) B0LA-DRB3序列匹配的0-鏈形成。牛MHCII-膚復(fù)合物的20種建模結(jié)構(gòu)有利于鑒定具有類似 的結(jié)構(gòu)特征和/或膚的特異性的等位基因，因?yàn)镸HCII等位基因變體通常結(jié)合不同組的表位 膚(表2)。
[0131] 表2.不依賴于口袋分布的BOLA-DRB3等位基因?qū)е聫V泛的DR結(jié)合裂口特異性。
[0132]
[0133]
[0134] #基于Sturniolo et al.的多態(tài)殘基位置，來自BoLA-DRB3等位基因的結(jié)合口袋1， 4,6,7和9主要由D祕(mì)鏈多態(tài)殘基形成，負(fù)責(zé)BOLA-DRB3-配體相互作用的殘基如上表所示。
[01巧]從IPD-MHC數(shù)據(jù)庫獲取的BOLA-DRB30鏈等位基因總共有130條序列，a鏈則選擇 B〇LA-DRB3*0101。將BOLA-DRB3序列與S維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行多重比對(duì)，使多態(tài)的適合殘基與給 定口袋關(guān)聯(lián)。然后，根據(jù)其多膚殘基組成對(duì)結(jié)合口袋進(jìn)行分類；由此，由相同的殘基構(gòu)成的 來自不同等位基因的口袋分布被視為是相同的。
[0136]表3是BOLA-DRB3的口袋分布，展示了 20條B01A-DRB3等位基因根據(jù)其分類，分配給 原來的130條BOLA-DRB3等位基因的口袋。在不同的等位基因上共享相同的多態(tài)殘基的口袋 表現(xiàn)出類似的口袋特異性分布。
[0137]表3.使用指定口袋構(gòu)建BoLA-DRB3病毒口袋分布矩陣 [OU引
[0'
[0140] t所選BOLA-DRB3等位基因表示運(yùn)些等位基因用于通過同源建模構(gòu)建3D結(jié)構(gòu)。
[0141] ：r根據(jù)表2中所示BoLA-DRBS裂口的模塊結(jié)構(gòu)組裝虛擬的BoLA-DRBS矩陣。口袋1，4， 6，7和9的分布來自IPD-M肥數(shù)據(jù)庫。對(duì)于相對(duì)的膚位置1，只有脂肪族(lie，Leu,Met，化1)和 芳香族(Phe，化P，Tyr)氨基酸可匹配由086殘基組成的BOLA-DRB3 口袋1。第1個(gè)數(shù)字代表該 等位基因在防6位置是否具有Gly( = 1)或化1( =2)或Met(-3)(參見表2)。第2個(gè)數(shù)字代表口 袋4分布的鑒定數(shù)字。第=、四、五個(gè)數(shù)字分布代表口袋6、7和9分布的鑒定數(shù)字。
[0142] 為了分析B0LA-DRB3的結(jié)合口袋分布和它們的結(jié)合口袋的幾何形狀之間的關(guān)系， 我們使用了化cketPicker算法，將潛在的結(jié)合口袋的形狀和含蓋容積(buriedness)轉(zhuǎn)換成 自相關(guān)向量。在立方網(wǎng)格內(nèi)的一格被定義IA3的體積(圖2)。
[0143] 各種BOLA-DRB3等位基因的結(jié)合口袋與鄰近的MHC殘基具有不同的靜電互補(bǔ)性和 大小。X射線晶體學(xué)研究表明，HLA-DR結(jié)合溝包括口袋和膚配體的特定氨基酸側(cè)鏈，其優(yōu)先 與溝中的MHCII分子相互作用。圖3A-3B呈現(xiàn)從20個(gè)代表性的B0LA-DRB3模型提取的幾組口 袋的平均口袋大小和含蓋容積。結(jié)合口袋由T細(xì)胞表位的氨基酸側(cè)鏈W依賴口袋的體積和 MHCII分子的含蓋容積的方式所占據(jù)。例如，20個(gè)所選模型中最大的口袋1來自成為未被占 用腔室的130個(gè)BOLA-DRB3等位基因，具有50-195 A3的大范圍的含蓋容積，其次是口袋9 (圖3A，3B)。通常，常規(guī)氨基酸含蓋側(cè)鏈的平均體積是66 A3(甘氨酸)和240A3(色氨酸）。 基于此，將Pl和P9處結(jié)合的氨基酸確定為優(yōu)選錯(cuò)定殘基，優(yōu)選對(duì)錯(cuò)定殘基進(jìn)行優(yōu)化，從而在 跨族群的基于表位的疫苗設(shè)計(jì)中改善T細(xì)胞表位和不同B0LA-DRB3等位基因中的MHCII分子 之間的相互作用。經(jīng)所述優(yōu)化的膚疫苗可W讓多數(shù)的牛都發(fā)生免疫應(yīng)答。此外，計(jì)算對(duì)應(yīng)氨 基酸與四個(gè)顯示更高頻率分布的獨(dú)立結(jié)合口袋(包括口袋4,6,7和9)的相對(duì)親和力，其代表 了大多數(shù)牛B0LA-DRB3膚的結(jié)合特異性（圖3C)。但由于太多處的優(yōu)化不適宜膚的合成，所W 本發(fā)明優(yōu)選并未在P4、6、7處進(jìn)行優(yōu)化。
[0144] 2)表位優(yōu)化（enhancement)。
[0145] 該步驟又包括W下幾個(gè)分步驟：
[0146] ①在表位結(jié)合核屯、的主要結(jié)合位置引入氨基酸殘基W匹配不同的口袋。
[0147] 結(jié)合口袋對(duì)于表位和MHCII分子之間的親合性是必需的，結(jié)合口袋的多態(tài)性最有 可能影響T細(xì)胞應(yīng)答?？傮w而言，通過取代天然序列中較弱的主要MHCII錯(cuò)定殘基，對(duì)T表位 膚的不同錯(cuò)定殘基進(jìn)行優(yōu)化修飾，W獲得最佳的膚疫苗。
[0148] Agudelo等人的報(bào)道指出，MHC和抗原膚結(jié)合的口袋特性會(huì)影響抗原膚結(jié)合的能 力，其中WPl 口袋對(duì)抗原膚和MHC的結(jié)合影響最大，其次為P9 口袋，而P4及P7隨后。
[0149] 基于上述分析也可知，B0LA-DRB3模型的Pl和P9含蓋容積差異較大，為了使最終的 基于表位的疫苗具有廣泛的覆蓋度，針對(duì)對(duì)結(jié)合能量貢獻(xiàn)顯著的Pl和P9對(duì)應(yīng)的錯(cuò)定殘基進(jìn) 行優(yōu)化，引入兩種具有不同尺寸側(cè)鏈的特定氨基酸殘基，即苯丙氨酸(F)和異亮氨酸（I)，W 匹配不同的牛MHCII等位基因的P1和P9，運(yùn)是組合的表位抗原膚在不同的牛MHCII等位基因 的Pl和P9的有效結(jié)合所需的（圖3C)。
[0150] ②在表位結(jié)合核屯、的次要結(jié)合位置引入附加殘基。
[0151] 結(jié)合膚中橫跨結(jié)合裂口的口袋2(P2)處的附加的錯(cuò)定殘基可增加結(jié)合度，使其抗 原膚疫苗更緊密結(jié)合MHCII分子。根據(jù)S維模型的分析，所接觸的MHCII分子上的殘基為化7 和077-082，如在圖4A中所展示，其與MHCII-膚復(fù)合物模型中的主鏈氧形成氨鍵。運(yùn)些針對(duì) P2錯(cuò)定位置的接觸殘基43957、化巧7^7巧8、化381和431182也分別確定了130個(gè)8〇1^\-0尺83 等位基因中80、94、86、121和130的高度頻率（圖4B)。在T細(xì)胞表位的結(jié)合核屯、錯(cuò)定位置P2的 次優(yōu)殘基的優(yōu)化可W增加牛MHCII分子的結(jié)合親和力。本發(fā)明中，在表位結(jié)合核屯、對(duì)應(yīng)P2的 次要結(jié)合位置引入附加殘基精氨酸。
[0152] ③延伸膚疫苗上T細(xì)胞表位結(jié)合核屯、區(qū)域兩端的膚長度。
[0153] MHCII膚結(jié)合溝對(duì)于T細(xì)胞表位結(jié)合的開放(open-ended)性質(zhì)可允許范圍廣泛的 膚長度。來自化ang等人的數(shù)據(jù)證明，15個(gè)氨基酸長度的T細(xì)胞表位是最常見的與BoLA等位 基因之間形成相互作用的長度。因此為穩(wěn)定地與MHCII分子相互作用，設(shè)計(jì)的抗原膚疫苗在 N-末端和C-末端分別延伸4個(gè)和2個(gè)氨基酸，W增加牛M肥II分子親和力。
[0154] 3)優(yōu)化表位評(píng)估。使用ProPred?和螺旋輪化e 1 i Ca 1 whee 1S)評(píng)估設(shè)計(jì)的膚。
[0155] 實(shí)施例4、表位疫苗膚的合成及驗(yàn)證
[0156] 針對(duì)原始膚VPlTh的組合膚庫，通過利用IEDB資料庫資源，W及對(duì)原先的VPnh的 膚鏈進(jìn)行實(shí)質(zhì)表位核屯、的識(shí)別與優(yōu)化，得到本發(fā)明優(yōu)選的基于表位的疫苗VPlThcomb(圖 5)，其為膚文庫。
[0157] 使用Applied Biosystems Peptide Synthesiser Model進(jìn)行VPlThcomb-FMDV-Ol 表位疫苗組合膚庫（圖5)的合成。所述表位疫苗通過在指定的氨基酸位置提供期望的氨基 酸混合物而制備。合成完畢的膚從固體支持物上裂解，并用90%=氣乙酸除去側(cè)鏈保護(hù)基。 通過基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和反相HPlX驗(yàn)證制備的合成膚組成正確。通過尺 寸排阻色譜對(duì)疫苗的組合膚進(jìn)行驗(yàn)證，W確保90%的積分面積的超過質(zhì)量闊值極限值;并 通過Edman降解法進(jìn)行N-末端氨基酸分析。
[0158] 實(shí)施例5、基于表位的疫苗對(duì)于口蹄疫病毒的效價(jià)
[0159] 直接在接種疫苗的動(dòng)物中進(jìn)行疫苗效力評(píng)估，進(jìn)行PDso值測試來評(píng)估由Offi參考實(shí) 驗(yàn)室描述的基于表位的疫苗的效力。5-6個(gè)月大的牛被分為Iml全劑量、1/3劑量和1/9劑量 S組。每只動(dòng)物通過耳邊注射接種一次基于表位的疫苗，所述基于表位的疫苗與Montanide ISA 51佐劑的比例為1:1(體積/體積）。此外，兩只牛接種作為陰性對(duì)照的無菌PBS緩沖液。 所有的牛在免疫接種28天后，用10000BID50(50%牛傳染性劑量）的血清型Asia 1/0通過皮 下注射進(jìn)行攻擊。
[0160] 所有的實(shí)驗(yàn)牛（約6個(gè)月大的荷斯坦公牛)從經(jīng)過認(rèn)證的供應(yīng)商處獲得。在整個(gè)研 究期間每天監(jiān)測動(dòng)物，包括體溫、嘴的癥狀，并連續(xù)喂食十天，計(jì)算牛PD50(50%保護(hù)劑量） 值。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒有動(dòng)物死亡或因病重?zé)o法完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，并且在完成疫苗評(píng)估前未對(duì) 任何動(dòng)物進(jìn)行安樂死。攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)束后10天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死。通過Reed-MUENCH方法計(jì) 算牛PDso值。所有設(shè)及使用牛組織樣本和接種方案的實(shí)驗(yàn)經(jīng)生物樣本委員會(huì)的機(jī)構(gòu)審查批 準(zhǔn)。
[0161] 結(jié)果證實(shí)，單劑量接種的VPlThcomb膚疫苗在后S周，針對(duì)口蹄疫病毒血清型Asia 1和0的效價(jià)分別達(dá)到12.51和8.06的PD50(表4)。國際規(guī)定緊急疫苗通常需要具有PDso為6的 最小效力，而預(yù)防用途的疫苗通常需要具有PDso為3的最小效力。本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究說 明，在lOOOOBIDso劑量的攻擊下，VPl化comb膚疫苗對(duì)口蹄疫病毒更為有效，其中對(duì)血清型 Asia 1比對(duì)血清型0更有效。說明通過優(yōu)化設(shè)計(jì)的基于表位的疫苗的效價(jià)確實(shí)有了大幅的 提局（表4)。
[0162] 表4.評(píng)價(jià)本發(fā)明基于表位的疫苗在牛中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和保護(hù)
[01631
[0164] a.接種后28天，通過在舌頭上表面皮內(nèi)注射0.2ml含有10,000BID50( 50 %牛感染劑 量)的FMDV對(duì)接種動(dòng)物和2只未接種牛的對(duì)照組進(jìn)行攻擊。
[0165] b.經(jīng)臨床檢測，觀察期間（攻擊后10天）四蹄均未見損傷的牛確定為獲得保護(hù)。保 護(hù)率（％ )=無損傷牛數(shù)量/牛的總數(shù)。
[0166] C.通過Reed-Muench方法計(jì)算口蹄疫疫苗效力測試PD5q(50%保護(hù)劑量）。
[0167] 實(shí)施例6、口蹄疫病毒特異性病毒的中和測試(VNT)
[0168] 根據(jù)OIE協(xié)會(huì)手冊(cè)（第2.1.5章）中描述的程序進(jìn)行口蹄疫病毒的病毒中和測試 (VNT)。簡言之，在牛脖子上的肌肉層中進(jìn)行肌內(nèi)接種，分別在疫苗接種后的第7、14、21、28 天收集牛血清。來自測試動(dòng)物的血清均在56°C滅活30分鐘。來自10只6個(gè)月大的牛的血清在 96孔平底板中于37°C添加 I X IO4TCI化oAsia I型(6個(gè))和O型（4個(gè)）口蹄疫病毒(表5)，溫育 90分鐘。溫育后，將50iil位于DMBl培養(yǎng)基(含有5%胎牛血清）中的3 X IO4B皿21細(xì)胞懸浮液 加入到每個(gè)板中，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。然后在顯微鏡下觀察病毒的細(xì)胞病變效 應(yīng)。效價(jià)用孔內(nèi)50%的細(xì)胞得到保護(hù)時(shí)血清/病毒混合物中存在的血清的最終稀釋度表示。 陽性標(biāo)準(zhǔn)血清是其預(yù)期效價(jià)的兩倍W內(nèi)。
[0169] 表5.接種后針對(duì)Asia 1/0 FMDV的FMDV特異性中和抗體應(yīng)答。
[0170]
[0171] a. 50iil單位體積病毒懸液中的攻擊劑量應(yīng)包含約IOOTCI化0(50%組織培養(yǎng)感染 量），在頸部經(jīng)肌內(nèi)注射。
[0172] b.FMDV特異性抗體效價(jià)W接種lOOmg/ml的膚疫苗并攻擊28天后的牛的病毒中和 測試中的血清稀釋度表示。
[0173] C.化V:接種后天數(shù)
[0174] d.免疫接種后28天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊，并對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行臨床檢查，如果腳上未出 現(xiàn)損傷，則確定為獲得保護(hù)。通常，血清/病毒混合物中1/45或更高的最終血清稀釋的效價(jià) 視為陽性。低于1/16的效價(jià)被視為陰性。基于國際商貿(mào)的單個(gè)動(dòng)物認(rèn)證，1/16至1/32的效價(jià) 被視為存疑，并需對(duì)血清樣品做進(jìn)一步測試。
[0175] 結(jié)果表明，針對(duì)兩種病毒株的特異性抗體水平在接種后28天仍可維持高達(dá)1/45的 稀釋度。整個(gè)實(shí)驗(yàn)也僅有兩只受試動(dòng)物(#13549和#13539)在表位疫苗注射的長時(shí)間后并未 檢測出特異性抗體水平，可W看到在血清型Asia 1攻擊后28天的稀釋度為1/32(表5)。然 而，對(duì)于口蹄疫病毒在接種牛之間傳播的量化，接種后7至28天，針對(duì)Asia 1的大多數(shù)VNT效 價(jià)比針對(duì)0的效價(jià)低，但單次表位疫苗接種足W防止血清型Asia 1和0病毒在牛群中的傳播 (表 4)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對(duì)T細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化的方法，包括以下步驟： 1) 選擇目標(biāo)物種的適合的Τ細(xì)胞表位； 2) 對(duì)目標(biāo)物種的MHC-DR進(jìn)行同源建模；以及 3) 對(duì)所述Τ細(xì)胞表位進(jìn)行優(yōu)化。2. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)包括以下步驟： a. 選擇候選的目標(biāo)物種的Τ細(xì)胞表位； b. 評(píng)估T細(xì)胞表位結(jié)合核心；以及 c. 計(jì)算所述T細(xì)胞表位的疏水性力矩。3. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟2)包括以下步驟： a. 獲取目標(biāo)物種的MHC-DR的等位基因序列； b. 挑選人HLA-DR結(jié)構(gòu)作為與T細(xì)胞表位結(jié)合核心匹配的模板； c. 序列比對(duì)和建模；以及 d. 模型評(píng)估。4. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟3)包括以下步驟： a. 比較目標(biāo)物種MHC-DR的MHC-肽復(fù)合體的口袋容積，確定MHC 口袋分布； b. T細(xì)胞表位優(yōu)化；以及任選地 c. 對(duì)T細(xì)胞表位優(yōu)化進(jìn)行評(píng)估。5. 權(quán)利要求4的方法，其中步驟b包括以下一或多個(gè)步驟： i. 在所述T細(xì)胞表位結(jié)合核心的主要結(jié)合位置額外引入尺寸不同的氨基酸殘基的復(fù)合 取代以匹配不同的口袋； ii. 在所述T細(xì)胞表位結(jié)合核心的次要結(jié)合位置額外引入附加殘基的復(fù)合取代以增加 結(jié)合度;或者 iii. 延伸肽疫苗上T細(xì)胞表位結(jié)合核心兩端的肽長度以增加結(jié)合度。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中將所述T細(xì)胞表位的長度設(shè)定為10-20個(gè)氨基酸，例 如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)氨基酸，例如在所述1'細(xì)胞表位結(jié)合核心序列的~ 末端和C末端分別還可包括一或多個(gè)額外的氨基酸，例如在N末端為額外的4個(gè)氨基酸，例如 MDRF，或者在N末端為額外的8個(gè)氨基酸，例如VDFMDRF，例如在C末端為額外的2個(gè)氨基酸， 例如HV。7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)物種為人或偶蹄動(dòng)物，例如牛、豬、羊。8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)物種為牛。9. 權(quán)利要求8的方法，其中牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核心序列為VKINSLSPT。10. 權(quán)利要求9的方法，其中在所述牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核心序列的第一位額外引入氨 基酸殘基F的復(fù)合取代，和/或在所述核心序列的第九位額外引入氨基酸殘基I的復(fù)合取代。11. 權(quán)利要求9或10的方法，其中在所述牛的T細(xì)胞表位結(jié)合核心序列的第二位額外引 入氨基酸殘基R的復(fù)合取代。12. -種組合物，包含具有通式A-L-B的肽文庫，其中 A為包含T細(xì)胞表位的肽，所述T細(xì)胞表位經(jīng)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法得到； B為包含B細(xì)胞表位的肽； L為任選存在的接頭。13. 權(quán)利要求12的組合物，其中所述T細(xì)胞表位包含長度為9個(gè)氨基酸的序列Xi-Xrfs- X4_X5_X6_X7_X8_X9 〇14. 權(quán)利要求13的組合物，其中X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列為INSLSP。15. 權(quán)利要求13或14的組合物，其中X:為V或F。16. 權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的組合物，其中X9為T或I。17. 權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)的組合物，其中Χ2為Κ或R。18. 權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)的組合物，其中Α的長度為10-20個(gè)氨基酸，例如10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20 個(gè)氨基酸，例如在 Xi-XrXs-XfXs-Xs-XY-Xs-Xg的 N 末端和 C 末端分 別還可包括一或多個(gè)額外的氨基酸，例如在N末端為額外的4個(gè)氨基酸，例如MDRF，或者在N 末端為額外的8個(gè)氨基酸，例如VDF頂DRF，例如在C末端為額外的2個(gè)氨基酸，例如HV。19. 權(quán)利要求1 2 - 1 8任一項(xiàng)的組合物，其中B的氨基酸序列為 VYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYFAIK〇20. 權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)的組合物，其中L為εΚ。
【文檔編號(hào)】C40B40/10GK106021974SQ201610333274
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】劉玉凡, 王政清
【申請(qǐng)人】中牧智合（北京）生物技術(shù)有限公司