專利名稱：水中易分散的超順磁納米粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在水中易分散的超順磁納米離子的制備方法，具體涉及一種利用聚合物螯合劑合成具有超順磁性的納米級(jí)氧化鐵粒子的方法。用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，納米磁性粒子在生物分離，核磁共振的造影成像，以及藥物控制釋放等方面的巨大應(yīng)用價(jià)值，得到了人們極大的重視。有關(guān)氧化鐵納米粒子的制備和應(yīng)用的研究越來(lái)越多，但氧化鐵納米顆粒由于其高的表面能，容易聚集，要保持納米量級(jí)的粒徑分布比較困難。國(guó)外專利技術(shù)采用表面修飾如葡聚糖分子的方法，比較成熟的產(chǎn)品有如CLIO，就是將溴乙酸和聚乙烯醇(PVA)的聚合物交聯(lián)于超順磁性納米粒子表面，再連接帶有氨基的化合物，如乙二胺，使表面有有活性基團(tuán)-NH2，已用于生物離體分析，細(xì)胞分離和MR照影劑。
美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030124194，專利名稱有活性基團(tuán)氨基的超順磁性納米粒子的生物連接和及其應(yīng)用?！睻nited States Patent Application，application number20030124194，application nameAmine functionalizedsuperparamagnetic nanoparticles for the synthesis of bioconjugates anduses therefore〕。但該方法反應(yīng)步驟較復(fù)雜，粒徑分布較寬，而且如果要應(yīng)用于體內(nèi)藥物靶向輸送或者其他，藥物的裝載方法十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法。該方法是在聚合物螯合劑中原位合成氧化鐵，由于支鏈聚合物本身的分散性，以及表面的羧基和羥基等親水性基團(tuán)，合成的超順磁性納米粒子不易聚集而且在多種處理?xiàng)l件下均保持穩(wěn)定。更重要的，通過(guò)表面的活性基團(tuán)可以有效地在超順磁性納米粒子表面，進(jìn)一步修飾連接各種生物活性分子?？蓱?yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分離、藥物輸送、醫(yī)學(xué)成像、以及治療等領(lǐng)域。
本發(fā)明所述的超順磁性納米粒子，是氧化鐵粒子和聚合物的復(fù)合粒子。帶有支鏈的聚合物分子，大大提高了磁性粒子的穩(wěn)定性、分散性、和水溶性。同時(shí)，聚合物上可以連接各種生物活性分子，并可以大量裝載藥物。本發(fā)明所描述的制備方法簡(jiǎn)單易行，而且成本低廉，應(yīng)用廣泛。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，首先將聚合物螯合劑和鐵離子混合，利用聚合物敖合劑表面的羧基和鐵粒子形成配位鍵結(jié)合，然后滴加堿，在滴加堿的情況下，羥基和鐵離子反應(yīng)生成氧化鐵，繼續(xù)滴加堿到pH9-10之間，通過(guò)聚合物螯合劑的位阻作用，氧化鐵顆粒停止繼續(xù)增大，合成出納米級(jí)超順磁性粒子，由于反應(yīng)是在原位上進(jìn)行，聚合物螫合劑包繞在粒子的表面，再通過(guò)加熱洗滌以及進(jìn)一步修飾，即得到功能化的超順磁性納米粒子。
在上述制備方法中，采用的聚合物螫合劑為羧酸與醇聚合而成的高分子混合聚合物，其中羧酸包括(C2～C18)脂肪二元酸和羥基羧酸中的至少一種，醇包括(C2～C18)脂肪二元醇和糖醇中的至少一種，其混合聚合物含有羧基和羥基，在水以及多種有機(jī)溶劑中具有良好的分散性。
在超順磁性納米粒子的制備中，可以是在合成氧化鐵的時(shí)候加入該聚合物螯合劑進(jìn)行原位合成；也可以是在合成氧化鐵時(shí)加入單體羧酸與醇，在合成氧化鐵后再把氧化鐵表面的單體羧酸與醇進(jìn)行聚合反應(yīng)；也可以是在合成氧化鐵后直接加入聚合物螯合劑。
所得到的超順磁性納米粒子，粒徑為5nm～500nm，在水溶液、以及可與水相混溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中有很好的分散性，表面含有聚合物活性基團(tuán)如羧基和羥基，在多次清洗，超濾濃縮或干燥后，再次分散，平均粒徑和粒徑分布大小無(wú)明顯變化；其中含有的氧化鐵納米顆粒，是Fe2O3，F(xiàn)e3O4，羰基鐵及其混合物，其單個(gè)原生顆粒粒徑不大于30nm，在納米粒子中以單個(gè)原生顆?；?-5個(gè)原生顆粒疏散集合的方式存在。
進(jìn)一步地，可在超順磁性納米粒子中裝載藥物。藥物可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的常用方法包裹于聚合物內(nèi)，或者是通過(guò)化學(xué)連接的方法結(jié)合在聚合物上。藥物可以是小分子化合物藥物、中藥有效成分、蛋白、多肽、核酸類藥物等。
同時(shí)，還可以在超順磁性納米粒子表面連接抗體、配體、細(xì)胞因子、多肽等具有靶向作用特性的生物分子。方法略為稱取干燥的超順磁性納米粒子，加入溶劑超聲波處理5～10分鐘，取部分混懸液，或者直接取制備好的超順磁性納米粒子混懸液適量，加入適量連接劑如N，N-羰基二咪啶(CDI)，碳二酰亞胺(EDC)，N-羥基丁二酰亞胺等，攪拌10分鐘～2小時(shí)。對(duì)聚合物上的活性基團(tuán)羧基進(jìn)行活化，然后分離出羧基已活化的氧化鐵，重新混懸。加入藥物或蛋白多肽溶液，攪拌1～24小時(shí)，分離，清洗若干次，即可。
本發(fā)明所制備的超順磁性納米粒子，可以作為生物醫(yī)學(xué)成像的造影劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)的特定生物分子的成像；也可以作為藥物的靶向輸送載體，在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)藥物定向輸送。
對(duì)制備好的超順磁性納米粒子進(jìn)行表征將制備的超順磁性納米粒子放置在105℃干燥箱中進(jìn)行干燥制備成粉末狀，進(jìn)行X射線衍射分析，與氧化鐵標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，證明為氧化鐵顆粒，并且從圖譜中估算氧化鐵晶體的粒徑約為9.2nm-18.2nm；該超順磁性納米粒子在水溶液中極易分散，用透射電子顯微鏡觀察，氧化鐵顆粒的分布均勻，粒徑約為14nm；用原子力顯微鏡在水溶液中進(jìn)行掃描，粒子分布均勻，分散性好。氧化鐵顆粒以單個(gè)顆粒或部分為2～3個(gè)單體聚集，存在于水中，粒徑測(cè)量為10nm；應(yīng)用動(dòng)態(tài)激光散射法(PCS)測(cè)量磁性粒子的粒徑分布(ZETASIZER 3000HSa，MALVERN)，納米粒子粒徑分布均勻，90％以上在30nm左右。作為對(duì)比，沒(méi)有聚合物螯合劑情況下制備的氧化鐵顆粒，則聚集嚴(yán)重，在水中易沉淀。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，本發(fā)明使用分枝狀的醇酸聚合物作為螯合劑，該聚合物帶有活性基團(tuán)，能夠螯合鐵離子，在合成時(shí)，鐵離子在該聚合物的包圍下原位合成，所以粒徑小和分布均勻，不易團(tuán)聚，制備后不需要在粒子表面添加或修飾活性基團(tuán)，而能保持粒子良好的穩(wěn)定性和水分散性。合成方法和工藝簡(jiǎn)單，易于產(chǎn)業(yè)化。進(jìn)一步地，合成的超順磁性納米粒子，既具有超順磁特性，又能夠轉(zhuǎn)載藥物，并通過(guò)聚合物支鏈上的活性基團(tuán)連接各種生物分子，在MRI分子影響造影、生物分子檢測(cè)、以及靶向藥物輸送等方面，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法的內(nèi)容提供以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的理解。
實(shí)施例1稱取2.13克中聚醇酸聚合物，加入5ml乙醇和45ml水，超聲10分鐘，加入0.743克FeCl3.6H2O和0.382克FeCl2.4H2O。超聲5分鐘，通入N2，滴加NaOH，磁力攪拌旋鈕旋至最大處約1800rpm，約75℃加熱，pH在線檢測(cè)，待pH在9～10.45之間約50分鐘，停止加入NaOH和加熱。離心分離后后用PCS測(cè)得平均粒徑為5nm左右。經(jīng)透射電鏡測(cè)量氧化鐵顆粒粒徑為3nm。在納米粒子中主要以單個(gè)原生顆粒方式存在。本方法合成的超順磁性納米粒子與其他方法相比，具有粒徑小，分布均勻的特點(diǎn)，無(wú)明顯聚集，在水中具有良好的可分散性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例2稱取4.8克高聚醇酸聚合物，加入20ml水，加入1.235克FeCl3.6H2O，通入N2，超聲30分鐘。稱取0.612克FeCl2.4H2O加入三通瓶中，超聲10分鐘。通入N2，電力攪拌1093rpm，滴加NaOH1～2滴/秒(3.149克NaOH+130ml水)，直到滴加到反應(yīng)液顏色變成黑色為止。繼續(xù)在75℃加熱30分鐘。待離心分離后，PCS測(cè)得平均粒徑為500nm左右，經(jīng)透射電鏡測(cè)量氧化鐵顆粒粒徑為30nm，在納米粒子中主要以5個(gè)原生顆粒疏散集合的方式存在。粒徑分布均勻，無(wú)明顯聚集，在水中具有良好的可分散性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例3稱取1.022克低聚醇酸聚合物，加入5ml乙醇和45ml水，超聲10分鐘，加入0.823克FeCl3.6H2O和0.392克FeCl2.4H2O。超聲5分鐘，通入N2，滴加NaOH，磁力攪拌旋鈕旋至最大處約1800rpm，約75℃加熱，pH在線檢測(cè)，待pH在9～10之間，停止加入NaOH并繼續(xù)加熱50-100分鐘，離心分離后，PCS測(cè)得平均粒徑為200nm左右，透射電鏡測(cè)量氧化鐵顆粒粒徑為18nm左右；在納米粒子中主要以2個(gè)原生顆粒疏散集合的方式存在。粒徑分布均勻，無(wú)明顯聚集，在水中具有良好的可分散性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例4在超順磁性納米粒子表面連接藥物石杉?jí)A甲取適量干燥的超順磁性納米粒子，制備四氫呋喃混懸液，加入適量N，N-羰基二咪啶(CDI)的四氫呋喃溶液，磁力攪拌60分鐘。然后分離出羧基已活化的氧化鐵，重新混溶于四氫呋喃，然后加入石杉?jí)A甲的四氫呋喃溶液，磁力攪拌過(guò)夜12小時(shí)。分離產(chǎn)物并用溶劑清洗約9次。將其溶于水中并稀釋若干倍，保存待測(cè)。紫外分光光譜和毛細(xì)管電泳檢測(cè)均表明石杉?jí)A甲已化學(xué)連接于超順磁性納米粒子表面。采用自制的超順磁性納米粒子連接時(shí)，由于納米粒子粒徑小，分布均勻，大大增加了和石杉?jí)A甲的接觸面積，提高了連接反應(yīng)的效率和連接產(chǎn)物的均勻性。同時(shí)，連接了石杉?jí)A甲的超順磁性納米粒子仍然具有良好的可分散性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例5在超順磁性納米粒子表面連接整合素α5βv特異性結(jié)合多肽GV3將100毫克的1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和500mgN-羥基丁二酰亞胺(NHS)溶于pH6。0的(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶液中，加入適量超順磁性納米粒子溶液，磁力攪拌60分鐘。然后分離出羧基已活化的氧化鐵，然后加入5毫克GV3的MES溶液，20攝氏度反應(yīng)2小時(shí)，分離產(chǎn)物。用緩沖液清洗5次，稀釋，在內(nèi)皮細(xì)胞模型中檢測(cè)有明顯的吸附增強(qiáng)作用。采用自制的超順磁性納米粒子進(jìn)行生物分子連接時(shí)，反應(yīng)條件溫和，有利于保持生物活性；反應(yīng)效率高，反應(yīng)均勻，連接產(chǎn)物仍具有良好的可分散性和穩(wěn)定性。同時(shí)，由于連接有多肽的超順磁性納米粒子仍在納米尺度，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)可大大增加靶向性多肽與細(xì)胞表面的接觸面積。效果明顯優(yōu)于目前采用的微米尺度的氧化鐵顆粒-多肽修飾物。
權(quán)利要求
1.一種水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征在于，首先將聚合物螯合劑和鐵離子混合，利用聚合物螯合劑表面的羧基和鐵粒子形成配位鍵結(jié)合，然后滴加堿，在滴加堿的情況下，羥基和鐵離子反應(yīng)生成氧化鐵，繼續(xù)滴加堿到pH9-10之間，通過(guò)聚合物螯合劑的位阻作用，氧化鐵顆粒停止繼續(xù)增大，合成出納米級(jí)超順磁性粒子，由于反應(yīng)是在原位上進(jìn)行，聚合物螯合劑包繞在粒子的表面，再通過(guò)加熱洗滌以及進(jìn)一步修飾，即得到功能化的超順磁性納米粒子。
2.如權(quán)利要求1所述的水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征是，采用的聚合物螯合劑為羧酸與醇聚合而成的高分子混合聚合物，其中羧酸包括C2～C18脂肪二元酸和羥基羧酸中的至少一種，醇包括C2～C18脂肪二元醇和糖醇中的至少一種，其混合聚合物含有羧基和羥基，在水以及多種有機(jī)溶劑中具有良好的分散性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征是，在合成氧化鐵的時(shí)候加入該聚合物螯合劑進(jìn)行原位合成，或者是在合成氧化鐵時(shí)加入單體羧酸與醇，在合成氧化鐵后再把氧化鐵表面的單體羧酸與醇進(jìn)行聚合反應(yīng)，或者是在合成氧化鐵后直接加入聚合物螯合劑。
4.如權(quán)利要求1所述的水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征是，所得到的超順磁性納米粒子，采用光子相關(guān)光度法測(cè)得的平均粒徑為5nm～500nm，在水性溶液、以及能與水混溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮中有很好的分散性，在多次清洗，超濾濃縮或干燥后，再次分散，平均粒徑和粒徑分布穩(wěn)定，表面含有聚合物活性基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求1或4所述的水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征是，所述超順磁性納米粒子中包含的氧化鐵顆粒，是Fe2O3，F(xiàn)e3O4，羰基鐵及其混合物，其單個(gè)原生氧化鐵顆粒用透射電鏡測(cè)得的粒徑限于或者等于30nm，在納米粒子中以單個(gè)原生顆?；?-5個(gè)原生顆粒疏散集合的方式存在。
6.如權(quán)利要求1或4所述的水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，其特征是，在超順磁性納米粒子中裝載藥物，藥物包裹于聚合物內(nèi)，或者是通過(guò)化學(xué)連接的方法結(jié)合在聚合物上，藥物是小分子化合物藥物、中藥有效成分、蛋白、多肽、核酸類生物工程藥物；或者在超順磁性納米粒子表面連接抗體、配體、細(xì)胞因子、多肽此類具有靶向作用特性的生物分子，方法為稱取干燥的超順磁性納米粒子，加入溶劑，超聲分散后取部分混懸液；或直接取分離純化后的超順磁性納米粒子溶液適量，加入適量連接劑如N，N-羰基二咪啶，1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，N-羥基丁二酰亞胺，對(duì)聚合物上的活性基團(tuán)羧基進(jìn)行活化，然后分離出羧基已被活化的超順磁性納米粒子，再加入藥物或蛋白多肽此類靶向分子溶液，待反應(yīng)結(jié)束后分離，清洗，即完成。
全文摘要
一種水中易分散的超順磁性納米粒子的制備方法，用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明首先將聚合物敖合劑和鐵離子混合，利用聚合物螯合劑表面的羧基和鐵粒子形成配位鍵結(jié)合，然后滴加堿，在滴加堿的情況下，羥基和鐵離子反應(yīng)生成氧化鐵，繼續(xù)滴加堿到pH9－10之間，通過(guò)聚合物敖合劑的位阻作用，氧化鐵顆粒停止繼續(xù)增大，合成出納米級(jí)超順磁性粒子，由于反應(yīng)是在原位上進(jìn)行，聚合物敖合劑包繞在粒子的表面，再通過(guò)加熱洗滌以及進(jìn)一步修飾，即得到功能化的超順磁性納米粒子。本發(fā)明大大提高了超順磁性納米粒子的穩(wěn)定性、分散性和水溶性，同時(shí)，聚合物上可以連接各種生物活性分子，并可以大量裝載藥物，本發(fā)明所描述的制備方法簡(jiǎn)單易行，而且成本低廉，應(yīng)用廣泛。
文檔編號(hào)H01F1/032GK1583575SQ20041002489
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者劉書朋, 魏曉慧, 徐宇虹 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)