專利名稱：用于分子生物學(xué)分析和診斷的自我可尋址自我裝配的微電子學(xué)系統(tǒng)及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)一種能有效地進(jìn)行和控制微觀形式的多步和復(fù)合反應(yīng)的自我尋址、自我裝配的微電子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、制作和使用。更具體地說(shuō)，這些反應(yīng)包括分子生物學(xué)反應(yīng)，如核酸分子雜交、核酸分子擴(kuò)增、樣品制備、抗體/抗原反應(yīng)、臨床診斷，和生物高分子合成。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)包含用于核酸和蛋白質(zhì)分子分析的多種技術(shù)，大部分這些技術(shù)形成了臨床診斷分析的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸分子雜交分析，限制酶切分析，基因序列分析，和核酸蛋白質(zhì)分子分離和純化(參見(jiàn)，如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，2nd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
大部分分子生物學(xué)技術(shù)包括在多種樣品間進(jìn)行大量的反應(yīng)。它們常是復(fù)雜和耗時(shí)的，而通常需要較高的精確度。多種技術(shù)因缺少靈敏度、特異性、或重現(xiàn)性而限制其的應(yīng)用。例如，因靈敏性和特異性的不足已極大地限制了核酸分子雜交的實(shí)際應(yīng)用。
核酸分子雜交分析通常包括在大量的非目標(biāo)核酸分子中用探針識(shí)別極少數(shù)特殊的目標(biāo)核酸分子(DNA和RNA)。為了保證高度的特異性，雜交試驗(yàn)常在通過(guò)溫度、鹽類、洗滌劑、溶劑、離液序列高的介質(zhì)和變性劑之間各種組合而獲得的高度嚴(yán)格條件下進(jìn)行。
多倍的樣品核酸分子雜交分析已以種種濾膜和固體載體的形式進(jìn)行(參見(jiàn)G.A.Beltz et al.，in酶學(xué)方法Vol.100，Part B，R.Wu.L.Grossmam，K.Moldave.Eds.，Academic Press，New York，19章，266-308頁(yè)，1985)。一種形式為“斑點(diǎn)印跡”雜交的形式，包括目標(biāo)DNA分子非共價(jià)粘附在一種濾膜上，隨后與放射性同位素標(biāo)記過(guò)的探針雜交?！鞍唿c(diǎn)印跡”雜交技術(shù)獲得了廣泛的應(yīng)用，并發(fā)展了多種改進(jìn)方法(參見(jiàn)M.L.M.Anderson和B.D.Young，in核酸分子雜交一實(shí)用方法B.D.Hames和S.J.Higgins，Eds.，IRLPress，Washington DC，第4章，73-111頁(yè)，1985)?！鞍唿c(diǎn)印跡”雜交技術(shù)已進(jìn)一步發(fā)展能進(jìn)行基因組突變復(fù)合分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，in EPA 0228075，July 8，1987)和重疊克隆的鑒別以及基因組圖譜的構(gòu)建(G.A.Evans，in USP#5,219,726，June 15，construction，1993)。
另一種被稱為“夾心”雜交的形式包括共價(jià)地粘附寡聚核苷酸探針于一種固體載體上然后用它們來(lái)捕獲和識(shí)別多種的核酸目標(biāo)分子。(M.Ranki et al.，Gene，21，pp.77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，in UK Patent Application GB2156074A，Oct 2，1985；T.M.Ranki和H.E.Soderlund in USP#4,563,419，January 7，1986A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，in PCT WO 86/03782，July 3，1986Y.Stabinsky，in USP#4,751,177，January 14，1988，T.H.Adams et al.，in PCT WO90/01564，F(xiàn)eb 22，1990；R.B.Wallace et al.，6 NucleicAcid Res.11，p.3543，1979；和B.J.Connor et al.，80 Proc.Natl.Acad.Sci.USA pp.278-282，1983)。這些形式多種改進(jìn)方法統(tǒng)稱為“反向斑點(diǎn)印跡”方法。
使用通用的核酸分子雜交形式和嚴(yán)格控制方法，仍然難以識(shí)別低考貝數(shù)(即，1-100,000)核酸目標(biāo)分子甚至使用靈敏度最高的標(biāo)記物質(zhì)(酶，熒光團(tuán)，同位素，等)和配套的識(shí)別系統(tǒng)(熒光計(jì)，魯米諾儀，光子計(jì)數(shù)器，閃爍計(jì)數(shù)儀，等)。
這個(gè)難點(diǎn)是由直接探針雜交法本身帶有的一些不足之處引起的。一種不足涉及雜交反應(yīng)的嚴(yán)格控制。雜交反應(yīng)為了獲得雜交的特異性通常在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。嚴(yán)格控制的方法基本地包括雜交反應(yīng)溫度，離子強(qiáng)度和變性劑的優(yōu)化和隨后的漂洗過(guò)程。不幸地，應(yīng)用這些嚴(yán)格的條件導(dǎo)致用于識(shí)別的探針/目標(biāo)分子雜交復(fù)合物的數(shù)量降低。
另一種問(wèn)題涉及存在于大多數(shù)樣品，尤其是人類基團(tuán)組DNA樣品中的高度復(fù)雜的DNA分子。當(dāng)一個(gè)樣品中含有極大量的與特定的目標(biāo)序列有緊密關(guān)系的序列時(shí)，即使最獨(dú)特的探針也會(huì)與非目標(biāo)序列形成大量的部分雜交。
第三個(gè)問(wèn)題涉及存在于探針與它的特殊目標(biāo)分子間的不合適的雜交動(dòng)力學(xué)。即使在最適合的條件下，大部分雜交反應(yīng)是在相當(dāng)?shù)蜐舛鹊奶结樅湍繕?biāo)分子間進(jìn)行。此外，探針常不得不與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)目標(biāo)核酸分子。
最常用雜交技術(shù)形式存在的第四種問(wèn)題是高水平的非特異性背景信號(hào)。這是由DNA探針與幾乎所有物質(zhì)親和性引起的。
上述這些問(wèn)題，單個(gè)或聯(lián)合出現(xiàn)導(dǎo)致在上述幾種形式的核酸分子雜交反應(yīng)中喪失靈敏度和/或特異性。這一點(diǎn)是不幸的因?yàn)樵跇O大多數(shù)基于核酸分子的臨床診斷分析中識(shí)別考貝數(shù)的核酸目標(biāo)分子是必不可少的。
鑒于識(shí)別低考貝數(shù)核酸目標(biāo)分子的難度，研究者們極大地依靠聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列(參見(jiàn)M.A.Innis et al.，PCR方案、方法和應(yīng)用的介紹，Academic Press，1990)。由PCR反應(yīng)產(chǎn)生的極大量目標(biāo)核酸序列促進(jìn)了隨后的直接核酸探針技術(shù)，盡管操作過(guò)程變長(zhǎng)麻煩和費(fèi)用增加。
與在用直接探針識(shí)別低考貝數(shù)目標(biāo)核酸分子中通常出現(xiàn)的難點(diǎn)完全不同的一種例外是原位雜交技術(shù)。這種技術(shù)使得低考貝數(shù)稀少的核酸序列能在單個(gè)細(xì)胞中被識(shí)別。在原位雜交形式中，目標(biāo)核酸分子自然地限制在一個(gè)細(xì)胞(～20-50μm2)或一個(gè)細(xì)胞核(～10μm2)范圍內(nèi)可達(dá)到相當(dāng)高的區(qū)域濃度。而且，探針目標(biāo)分子雜交信號(hào)被限制在微觀的形態(tài)上獨(dú)特的區(qū)域；這使得從人工的或非特異的信號(hào)中區(qū)分陽(yáng)性信號(hào)比在固體載體上的雜交反應(yīng)更加容易。
在某些方面模仿原位雜交反應(yīng)，一些在形成的微小復(fù)合器或模型裝置(如，DNA芯片)上進(jìn)行多倍的樣品核酸分子雜交分析的新技術(shù)正在發(fā)展起來(lái)。(參見(jiàn)M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp.757-758，1992)。這些方法通常把特殊的DNA序列結(jié)合在一種固體載體非常小的特定區(qū)域上，例如DNA芯片的微孔。這些雜交反應(yīng)的形式是傳統(tǒng)的“反向斑點(diǎn)印跡”和“夾心”雜交系統(tǒng)朝微觀范圍的改進(jìn)。
微觀形式雜交反應(yīng)可用來(lái)進(jìn)行“通過(guò)雜交測(cè)序”(SBH)(參見(jiàn)M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp.757-758，1992)。SBH通過(guò)使用所有可能的n-核苷酸寡聚體(n-mers)來(lái)確定在未知DNA樣品中的n-mers，隨后通過(guò)規(guī)則系統(tǒng)分析而線性化進(jìn)而確定DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yugoslav Patent Application #570/87，1987R.Drmanac et al.，4 Genomics，114，1989；Strezoska et al.，88Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10089，1991和R.Drmanac和R.B.Crkvenjakov，USP#5,202,231，April 13，1993)。
有兩種形式可進(jìn)行SBH。一種形式包括在一個(gè)載體上構(gòu)建一個(gè)所有可能的n-mers列陣，然后與目標(biāo)序列進(jìn)行雜交。這是反向斑點(diǎn)印跡雜交的一種改進(jìn)。另一種形式包括把目標(biāo)序列結(jié)合在一個(gè)載體上，隨后用所有可能的n-mers來(lái)探測(cè)。兩種形式具有直接探針雜交的基本問(wèn)題和與復(fù)合雜交有關(guān)的其它的難點(diǎn)。
在UK Patent Application GB 8810400，1988E.M.Southernet al.，13 Genomics 1008，1992.中，Southern提議使用“反向斑點(diǎn)印跡”雜交形式來(lái)分析或測(cè)定DNA序列。Southern使用PCR擴(kuò)增的基因組DNA確定了一個(gè)已知的單點(diǎn)突變。Southern也描述了一種用于SBH的在固體載體上合成一個(gè)寡聚核苷酸列陣的方法。然而，Southern沒(méi)有提出如何獲得列陣中每一個(gè)寡聚核苷酸的最適嚴(yán)格條件。
在364期Nature，pp.555-556，1993中，F(xiàn)odor et al.，使用一個(gè)在固體載體上的1,024 8-mer寡聚核苷酸列陣進(jìn)行了DNA序列測(cè)定。在這種情況下，目標(biāo)DNA是一條熒光標(biāo)記單鏈的12-mer寡聚核苷酸鏈僅含有A和C堿基。一種濃度為1皮摩爾(～6×1011分子)的12-mer目標(biāo)序列與列陣中8-mer寡聚體進(jìn)行雜交反應(yīng)是必需的。這結(jié)果表明了多個(gè)錯(cuò)配序列。象Southern一樣，F(xiàn)odor et al.，沒(méi)有提出直接探針雜交存在的問(wèn)題，例如復(fù)合雜交反應(yīng)的嚴(yán)格控制。這些問(wèn)題與需要大量的簡(jiǎn)單12-mer目標(biāo)分子一起表明對(duì)這種SBH形式的嚴(yán)重限制性。
同時(shí)地，Drmanac et al.，260 Science 1649-1652，1993，應(yīng)用上面討論的第二種形式測(cè)定了幾種短(116bp)的DNA序列。目標(biāo)DNA分子結(jié)合在膜載體上(“斑點(diǎn)印跡”形式)。每一張膜順序地與272標(biāo)記的10-mer和11-mer寡聚核苷酸進(jìn)行雜交。廣范圍的嚴(yán)格條件用來(lái)獲得對(duì)每一個(gè)n-mer探針特殊的雜交反應(yīng)；漂洗時(shí)間從5分鐘到隔夜不等，溫度從0℃到16℃不等。大多數(shù)探針需要在16℃漂洗3小時(shí)。每一張膜需要曝光2到18小時(shí)以便識(shí)別雜交信號(hào)。盡管是簡(jiǎn)單的目標(biāo)序列，還原的寡聚體探針和使用現(xiàn)有的最嚴(yán)格條件，總的假陽(yáng)性雜交率是5％。
Fodor et al.，251 Science 767-773，1991，使用照相平版印刷的技術(shù)在基質(zhì)上合成寡聚核苷酸。Pirrung et al.，在USP#5,143,854，Sept.1，1992中，介紹在硅基底上以列陣方式大規(guī)模照相平版印刷固相合成多肽。
在另一種基質(zhì)雜交方法中，Beattie et al.，在1992年圣地亞哥會(huì)議基因識(shí)別，Nov.1992，使用一種微型機(jī)器人系統(tǒng)在玻璃基底上把含有特殊DNA序列的微滴滴入單個(gè)的微型構(gòu)建的樣品孔內(nèi)。每一個(gè)孔內(nèi)雜交反應(yīng)的檢測(cè)是通過(guò)在每一單個(gè)微孔周圍帶有交流(AC)電場(chǎng)的微型電極測(cè)試固定裝置的反映而進(jìn)行的。
不管形式的不同，所有現(xiàn)今通用的微小規(guī)模DNA雜交和SBH方法都沒(méi)有克服與核酸雜交反應(yīng)相聯(lián)系的潛在困難。它們需要非常高濃度的相當(dāng)短的單鏈目標(biāo)序列或PCR擴(kuò)增DNA分子，和即使在最嚴(yán)格條件下也產(chǎn)生高水平的假陽(yáng)性雜交信號(hào)。在使用短的寡聚核苷酸序列的列陣復(fù)合形式這種情況下，對(duì)每一單個(gè)序列用任何傳統(tǒng)的方法優(yōu)化嚴(yán)格的條件是不可能的，因?yàn)橛糜谶@些形式的列陣或裝置不能改變或調(diào)整單個(gè)位置相對(duì)其它位置的溫度，離子強(qiáng)度，或變性劑。因此，一個(gè)共同的嚴(yán)格條件必須用于裝置上所有的序列。其結(jié)果是大量非特異性的和部分的雜交信號(hào)的產(chǎn)生這就嚴(yán)重地限制了這種裝置的應(yīng)用。這問(wèn)題隨著列陣中不同序列數(shù)目的增加，隨著序列長(zhǎng)度在10-mers以下或在20-mers以上時(shí)而成為更加復(fù)雜化。這是特別麻煩的對(duì)于SBH，它需要大量的短寡聚核苷酸探針。
不同大小、電荷，或結(jié)構(gòu)的核酸分子通常是用電泳技術(shù)分離，電泳技術(shù)可通過(guò)它們?cè)陔妶?chǎng)中不同的泳動(dòng)能力來(lái)區(qū)分不同的雜交分子。脈沖場(chǎng)電泳利用在一種介質(zhì)(如，凝膠)周圍復(fù)合電極的排列來(lái)分離那些用傳統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)不能分開(kāi)的非常大的DNA片段(參見(jiàn)R.Anand和E.M.Southern in核酸凝膠電泳-實(shí)用方法2 ed.，D.Rickwood和B.D.Hames Eds.，IRL Press，New York，pp.101-122，1990)。
Pace，USP#4,908,112，March 13，1990，描述利用顯微制造技術(shù)在硅基底上產(chǎn)生一種毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)。在此裝置內(nèi)，復(fù)合電極被結(jié)合入該系統(tǒng)中用于移動(dòng)分子通過(guò)分離介質(zhì)。
Soane和Soane，USP 5,126,022，June 30，1992，指明多個(gè)電極可用來(lái)控制混合物中帶電分子在管中通過(guò)凝膠分離介質(zhì)的線性移動(dòng)。所有電極必須裝入管中以便控制分離介質(zhì)中分子的移動(dòng)和位置。
Washizu，M.和Kurosawa，0.，在26 IEEE工業(yè)應(yīng)用學(xué)報(bào)6，pp.1165-1172，1990中介紹，應(yīng)用高頻交流電(AC)場(chǎng)按照在微型制作的電極間形成的電場(chǎng)線來(lái)排列DNA分子。然而，應(yīng)用直流電(DC)場(chǎng)則抑制了它們的功能。Washizu在25卷靜電學(xué)雜志109-123，1990中，描述了利用介電電泳操作細(xì)胞和生物分子的方法。細(xì)胞間能融合，生物分子可按微電極結(jié)構(gòu)間交流電壓產(chǎn)生的電場(chǎng)線排列。然而，介電電泳過(guò)程需要極高頻交流(1MHz)電壓和低電導(dǎo)率介質(zhì)。雖然這些技術(shù)能沿著交流(AC)電場(chǎng)線排列不同大小的DNA分子，但它們不能區(qū)別相同大小分子的雜交復(fù)合物。
從上述討論可知，已盡了很大的努力力求提供有效的技術(shù)進(jìn)行多步、復(fù)合的分子生物學(xué)反應(yīng)。然而，正因上述的原因，這些技術(shù)證明不夠完善。盡管對(duì)有效技術(shù)的需求已被充分認(rèn)識(shí)到，但滿意的解決方法仍至今未提出來(lái)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)、制造和使用能編程的、自我尋址的和自我裝配的微電子系統(tǒng)以及能有效地進(jìn)行控制的多步和復(fù)合的以微觀形式反應(yīng)的裝置。這些反應(yīng)包括，但不局限于，大多數(shù)分子生物學(xué)過(guò)程，例如核酸分子雜交，抗體/抗原反應(yīng)，和有關(guān)的臨床診斷。此外，申請(qǐng)專利的裝置能進(jìn)行多步組合的生物高分子合成，包括，但不局限于，在特定的微場(chǎng)所合成不同的寡聚核苷酸或多肽。
申請(qǐng)專利的裝置是采用微型平版印刷術(shù)和微機(jī)械加工技術(shù)制造的。這些裝置在其表面有一種可尋址的顯微場(chǎng)所的基質(zhì)；每一單獨(dú)的微場(chǎng)所能夠用電子學(xué)方法控制和引導(dǎo)特異的結(jié)合實(shí)體(如，核酸分子、抗體)轉(zhuǎn)移和粘附至其身上。所有的微場(chǎng)所能夠被它們特異的結(jié)合實(shí)體尋址。應(yīng)用這些裝置，這系統(tǒng)可在最小外界干預(yù)下自我組裝。
這被尋址的裝置可以控制和有效地進(jìn)行種種測(cè)定和反應(yīng)。分析物或反應(yīng)物通過(guò)自由場(chǎng)電泳可被轉(zhuǎn)移到任何特殊的微場(chǎng)所，在那里分析物或反應(yīng)物可有效地在所提的微場(chǎng)所濃縮并與特異的結(jié)合實(shí)體反應(yīng)。因?yàn)闈饪s效應(yīng)，識(shí)別特殊分析物或反應(yīng)物的靈敏度提高了，任何未結(jié)合的分析物或反應(yīng)物可通過(guò)反向微場(chǎng)所的極性而去除。這樣，該裝置也提高了測(cè)定和反應(yīng)的特異性。
裝置的積極特性對(duì)發(fā)生在每一個(gè)特殊的微場(chǎng)所的雜交反應(yīng)(或任何其它的親和反應(yīng))的所有方面提供獨(dú)立的電子學(xué)控制。這些裝置為影響雜交反應(yīng)提供了一種機(jī)理被稱為電子學(xué)嚴(yán)格控制(ESC)。對(duì)需要不同嚴(yán)格條件的DNA雜交反應(yīng)，ESC克服了傳統(tǒng)列陣技術(shù)固有的限制。這種發(fā)明的有效裝置可在每一個(gè)微場(chǎng)所電子學(xué)地產(chǎn)生“不同的嚴(yán)格條件”。這樣，所有的雜交反應(yīng)可在同一大批溶液中優(yōu)化地進(jìn)行。這些有效的裝置基本上不同于傳統(tǒng)的復(fù)合雜交列陣和DNA芯片。傳統(tǒng)的列陣法在每一位點(diǎn)有不同的探針或目標(biāo)DNA分子在列陣中所有位點(diǎn)具有相同的反應(yīng)或溫度、緩沖液、鹽濃度、和pH的嚴(yán)格條件。反應(yīng)或嚴(yán)格條件的任何變化影響列陣中所有位點(diǎn)。雖然復(fù)雜的照相平版印刷技術(shù)可用于制作列陣，或微電子傳感元件參與測(cè)定，傳統(tǒng)的裝置是被動(dòng)的不能控制或影響實(shí)際的雜交過(guò)程。本發(fā)明的有效裝置使得每一個(gè)微場(chǎng)所的功能如同完全獨(dú)立的測(cè)定或分析位點(diǎn)(即它們?cè)诿恳粓?chǎng)所形成如同一個(gè)“測(cè)定管”)。復(fù)合的雜交反應(yīng)可在最小的外界操作情況下進(jìn)行。此外，改變溫度交換緩沖液是不需要的，復(fù)合漂洗過(guò)程也就不需要。
因此，申請(qǐng)專利的裝置能在完全和精確的電子學(xué)控制下，優(yōu)選在完全微處理機(jī)控制下(即，由計(jì)算機(jī)控制)進(jìn)行多步和復(fù)合反應(yīng)。多步和復(fù)合反應(yīng)的速率、特異性、和靈敏度在權(quán)利要求裝置的每一個(gè)特殊微場(chǎng)所都極大地提高了。
這裝置在每一微場(chǎng)所通過(guò)使用輔助的光學(xué)(熒光、化學(xué)發(fā)光、或紫外分光)圖象識(shí)別系統(tǒng)也促進(jìn)雜交復(fù)合物的識(shí)別?？芍苯幼R(shí)別DNA的組合視電或電子傳感元件也可組裝入裝置內(nèi)。
如果需要，一個(gè)由特異結(jié)合實(shí)體尋址的主裝置能用電子學(xué)方法復(fù)制或復(fù)制出另一個(gè)基本裝置。
本發(fā)明可應(yīng)用與本發(fā)明目的一致的任何大小或形狀的微場(chǎng)所。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的微場(chǎng)所在亞-毫米范圍內(nèi)。
“特異結(jié)合實(shí)體”通常表示一種生物或合成的分子，其具有對(duì)另種分子，大分子或細(xì)胞通過(guò)共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合的特殊親和力。優(yōu)選地，一個(gè)特異的結(jié)合實(shí)體包括(或是自然的或通過(guò)修飾的)一個(gè)功能的化學(xué)基團(tuán)(伯胺、巰基、醛基等)，一段共有序列(核酸)，一個(gè)表位(抗體)，一個(gè)半抗原，或一個(gè)配基以便使其共價(jià)地反應(yīng)或非共價(jià)地結(jié)合到微場(chǎng)所表面的共有的功能基團(tuán)上。特異的結(jié)合實(shí)體包括但不僅局限于脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質(zhì)、多肽、凝集素、修飾過(guò)的多糖、細(xì)胞、合成的復(fù)合大分子，超功能的納米結(jié)構(gòu)、合成的高分子，修飾的/封閉的核苷酸/核苷，修飾的/封閉的氨基酸、熒光團(tuán)、生成團(tuán)、配基、螯合劑和半抗原。
通過(guò)“嚴(yán)格控制”來(lái)表示一種借助改變一些物理學(xué)參數(shù)，來(lái)區(qū)別特異的和非特異的結(jié)合相互作用的能力。在核酸分子雜交時(shí)，溫度控制是常用來(lái)提高嚴(yán)格性。雜交反應(yīng)是在或接近特殊雙鏈雜交對(duì)的解鏈溫度(Tm)下進(jìn)行。
因此，本發(fā)明第一和最重要的方面是一種帶有一個(gè)電子學(xué)編程和能自我尋址顯微場(chǎng)所的列陣的裝置。每一個(gè)顯微場(chǎng)所含有一個(gè)由基質(zhì)支持的基礎(chǔ)工作直流(DC)微電極。在每一個(gè)微場(chǎng)所的表面具有一層能自由轉(zhuǎn)移小相對(duì)離子的滲透層，和一個(gè)用于共價(jià)結(jié)合特定結(jié)合實(shí)體的粘附層。這些特別的設(shè)計(jì)特性提供了該裝置如下關(guān)鍵性的特性(1)允許可控制的具功能的DC電極被保持在微場(chǎng)所之下(2)允許保持電泳樣的移動(dòng)；和(3)區(qū)別發(fā)生在電極(金屬)表面間的電化學(xué)反應(yīng)和反向電解反應(yīng)以及親和或結(jié)合反應(yīng)。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)這些裝置中應(yīng)用的微電極的基本功能是提供結(jié)合的和反應(yīng)物的實(shí)體朝特定場(chǎng)所電泳推進(jìn)力。
“列陣”或“基質(zhì)”用來(lái)表示裝置上可尋址場(chǎng)所的一種排列。場(chǎng)所可按二維列陣，三維列陣，或其它基質(zhì)形式排列。場(chǎng)所的數(shù)目在從幾個(gè)到至少數(shù)十萬(wàn)個(gè)的范圍內(nèi)。每一個(gè)場(chǎng)所代表一個(gè)完全獨(dú)立的反應(yīng)點(diǎn)。
在第二方面，本發(fā)明特別描述了一種轉(zhuǎn)移結(jié)合實(shí)體到裝置上任何特殊微場(chǎng)所的方法。當(dāng)被活化后，微場(chǎng)所能影響自由場(chǎng)電泳轉(zhuǎn)移任何帶電功能化的特異結(jié)合實(shí)體到微場(chǎng)所本身處。一旦接觸到特定的微場(chǎng)所時(shí)，這功能化的特定結(jié)合實(shí)體立即變成共價(jià)結(jié)合到這個(gè)特定微場(chǎng)所表面的粘附層上。其它的微場(chǎng)所能同時(shí)通過(guò)保持它們處于帶電分子相反電勢(shì)而被保護(hù)。這個(gè)過(guò)程能迅速地重復(fù)，直至所有的微場(chǎng)所都被它們特異的結(jié)合實(shí)體尋址。
“帶電的具功能的特異結(jié)合實(shí)體”體用來(lái)表示一個(gè)特異的結(jié)合實(shí)體，它是化學(xué)上活潑的(即，能被共價(jià)結(jié)合到微場(chǎng)所上)和帶有凈電荷(正電或負(fù)電)。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種在裝置中任何特定的微場(chǎng)所濃縮分析物和反應(yīng)物并與其反應(yīng)的方法。在特異的結(jié)合實(shí)體結(jié)合以后，在每一個(gè)微場(chǎng)所的基礎(chǔ)微電極以直流(DC)模式起作用。這獨(dú)有的特性使得溶液中自由存在的相對(duì)稀釋帶電的分析物或反應(yīng)物被迅速轉(zhuǎn)移、濃縮，或在任何保持與分析物或反應(yīng)物分子帶相反電荷的特定的微場(chǎng)所以系列或平行的方式進(jìn)行反應(yīng)。特異的微場(chǎng)所可通過(guò)保持它們帶有與分析物或反應(yīng)物分子相同的電荷而被保護(hù)或防護(hù)。這種在選擇的微場(chǎng)所濃縮稀釋的分析物或反應(yīng)物分子的能力極大地加速了在這些微場(chǎng)所的反應(yīng)速率。
當(dāng)所需的反應(yīng)完成時(shí)，微電極電勢(shì)能被反轉(zhuǎn)，從而從微場(chǎng)所移去非特異的分析物或未反應(yīng)的分子。
特定的分析物或反應(yīng)產(chǎn)物可從任何微場(chǎng)所釋放出而轉(zhuǎn)移到其它場(chǎng)所進(jìn)行進(jìn)一步分析；或者在其它能尋址的場(chǎng)所貯存；或從該系統(tǒng)中全部移去。
在特定的微場(chǎng)所上隨后對(duì)分析物的分析，借助從這些場(chǎng)所排斥非特異實(shí)體的能力也極大地改進(jìn)。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明特別描述了一種改進(jìn)核酸分子雜交反應(yīng)嚴(yán)格控制的方法，該方法由下列步驟組成——在雜交反應(yīng)將發(fā)生的特定微場(chǎng)所快速濃縮稀釋了的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列；——在雜交反應(yīng)已發(fā)生的特定微場(chǎng)所快速移走非特異結(jié)合的目標(biāo)DNA序列；——從雜交反應(yīng)已發(fā)生的特定微場(chǎng)所快速移走競(jìng)爭(zhēng)的互補(bǔ)目標(biāo)DNA序列；——調(diào)整電子嚴(yán)格控制(ESC)以便移去部分雜交的DNA序列(多于一個(gè)堿基的錯(cuò)配序列)；
——調(diào)整ESC以使用8-mer到21-mer范圍內(nèi)的探針改進(jìn)單個(gè)錯(cuò)配序列雜交反應(yīng)的分辨率(例如，識(shí)別單點(diǎn)突變)；——應(yīng)用ESC有效地雜交寡聚核苷酸點(diǎn)突變探針盡管在傳統(tǒng)雜交過(guò)程使用的探針?lè)秶酝?例如，長(zhǎng)于21-mers和短于8-mers的探針)；——應(yīng)用獨(dú)立的ESC到發(fā)生在相同容積溶液中和相同溫度下的單個(gè)雜交反應(yīng)中；和——應(yīng)用ESC促進(jìn)未擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列雜交到捕獲寡聚核苷酸探針的列陣上。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明特別描述了一種在微場(chǎng)所組合合成生物高分子的方法。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明特別描述了一種復(fù)制主裝置的方法。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置它能電子學(xué)地進(jìn)行樣品制備和轉(zhuǎn)移目標(biāo)DNA到裝置的分析部分。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置它能電子學(xué)地輸送試劑和反應(yīng)物而最小限度地使用射流。
在第九個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置它能進(jìn)行分子生物學(xué)和DNA擴(kuò)增反應(yīng)(例如，限制性切割反應(yīng)；和DNA/RNA聚合酶和DNA連接酶目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)。)在第十個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置它能電子學(xué)地確定大小和識(shí)別限制性片段(例如，進(jìn)行電子學(xué)限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性和DNA指紋分析)。
在第十一個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置，它能進(jìn)行抗體-抗原和免疫診斷反應(yīng)。
在第十二個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置，它能進(jìn)行組合的合成寡聚核苷酸和多肽。
在第十三個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種裝置，它能選擇性地結(jié)合細(xì)胞，為雜交反應(yīng)加工細(xì)胞，從細(xì)胞中移去DNA，或在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行電子學(xué)的原位雜交。
在第十四個(gè)方面，本發(fā)明特別描述一種方法，該方法能識(shí)別和分析已發(fā)生在被尋址的微場(chǎng)所上的反應(yīng)，應(yīng)用自我尋址的微電子學(xué)裝置與聯(lián)合的光學(xué)、光電子學(xué)或電子學(xué)識(shí)別系統(tǒng)，或自我尋址的微電子學(xué)裝置與完整的光學(xué)、光電子學(xué)或電子學(xué)識(shí)別系統(tǒng)。
由于本發(fā)明的裝置是有效的可編程的電子學(xué)矩陣變換電路，首字母縮寫(xiě)詞“APEX”用來(lái)描述或指明這些裝置的固有特性。這AREX首字母縮寫(xiě)詞被用在顯微平版印刷技術(shù)生產(chǎn)的“芯片”和微機(jī)械加工生產(chǎn)的裝置中。
APEX微電子裝置和芯片的活潑的特性讓我們構(gòu)建新的機(jī)理用于進(jìn)行各種各樣的分子生物學(xué)反應(yīng)。這些包括獲得線性和指數(shù)的增加或擴(kuò)增目標(biāo)DNA和RNA分子的新方法。
本裝置提供電子學(xué)機(jī)理進(jìn)行(1)在相同緩沖液中室溫下有選擇性地變性DNA雜交子(例如，常在低于它們的解鏈溫度很多的溫度下進(jìn)行)；(2)在兩個(gè)或更多的微場(chǎng)所間快速朝后和向前轉(zhuǎn)移或移動(dòng)DNA；和(3)有選擇性地在所需要的微場(chǎng)所濃縮特定的反應(yīng)物，試劑，和酶分子。這些都含有新的物理學(xué)參數(shù)用于進(jìn)行分子生物學(xué)和目標(biāo)分子擴(kuò)增類型的反應(yīng)。
大量電子學(xué)控制的分子生物學(xué)反應(yīng)的實(shí)例已發(fā)展起來(lái)，這些包括(1)電子學(xué)直接的限制酶切特定的ds-DNA序列(2)電子學(xué)的限制性片段分析；(3)通過(guò)DNA聚合酶反應(yīng)的電子學(xué)的倍增目標(biāo)DNA分子；(4)通過(guò)DNA和RNA連接酶電子學(xué)的連接和倍增目標(biāo)DNA序列；和(5)通過(guò)RNA聚合酶電子學(xué)的倍增目標(biāo)DNA分子。這些實(shí)例是能在這APEX裝置上進(jìn)行的分子生物學(xué)反應(yīng)和過(guò)程類型的代表。
本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)將從下列詳細(xì)的發(fā)明描述和權(quán)利要求中明顯地知道。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是用微平版印刷技術(shù)組建的三個(gè)自我尋址的微場(chǎng)所截面圖。
圖2是單個(gè)微平版印刷組建的微場(chǎng)所截面圖，圖3一個(gè)自我尋址的64個(gè)微場(chǎng)所芯片的圖解的例子，它是實(shí)際上組建的，被寡聚核苷酸尋址的、和被測(cè)試的。
圖4表明特別的化學(xué)結(jié)合過(guò)程，它允許快速共價(jià)結(jié)合特異的寡聚核苷酸到微場(chǎng)所表面的粘附層上。
圖5是一個(gè)微加工的96個(gè)微場(chǎng)所的裝置的放大圖解。
圖6是一個(gè)微加工的裝置的截面圖。
圖7表明裝置用來(lái)電子學(xué)地濃縮分析物或反應(yīng)物分子在某個(gè)特定的微場(chǎng)所的機(jī)理。
圖8表明一個(gè)裝置與三個(gè)特定的寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體(SSO-A、SSO-B和SSO-C)的自我引導(dǎo)的裝配過(guò)程。
圖9表明一個(gè)電子學(xué)地控制的雜交過(guò)程與在微場(chǎng)所被濃縮的含有特定的DNA捕獲序列的樣品/目標(biāo)DNA分子。
圖10表明一個(gè)電子學(xué)地引導(dǎo)的系列雜交過(guò)程。
圖11表明為確定單個(gè)點(diǎn)突變的電子學(xué)嚴(yán)格控制(ESC)雜交過(guò)程。
圖12表明識(shí)別雜交了的DNA分子而不用標(biāo)記過(guò)的DNA探針的圖解，即，電子學(xué)地控制熒光染料識(shí)別過(guò)程。
圖13表明電子學(xué)地控制的裝置復(fù)制的圖解。
圖14表明電子學(xué)地引導(dǎo)組合合成寡聚核苷酸的圖解。
圖15表明一個(gè)圖解，關(guān)于進(jìn)行15-mer Ras 12點(diǎn)突變雜交反應(yīng)應(yīng)用電子學(xué)嚴(yán)格控制和傳統(tǒng)技術(shù)產(chǎn)生結(jié)果間的比較。
圖16表明電子學(xué)地控制限制片段切割DNA分子的圖解。
圖17表明電子學(xué)地控制應(yīng)用DNA聚合酶進(jìn)行DNA擴(kuò)增的圖解。
圖18表明一個(gè)APEX裝置的圖解，該裝置設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行樣品制備和DNA分析。
發(fā)明詳述本裝置和本發(fā)明有關(guān)的方法學(xué)允許分子生物學(xué)和診斷反應(yīng)在“完全電子控制”下進(jìn)行?！半娮涌刂啤痹诒景l(fā)明中的意思超過(guò)了這一術(shù)語(yǔ)傳統(tǒng)的涵義。大多數(shù)傳統(tǒng)的微電子裝置，儀器，和識(shí)別系統(tǒng)總是在一定程度上受電子學(xué)控制。本發(fā)明的微電子裝置不但在傳統(tǒng)電子控制下，而且更重要地它們也提供進(jìn)一步直接電子學(xué)控制進(jìn)行分子生物學(xué)和診斷反應(yīng)的物理學(xué)方面。本發(fā)明基本概念是一個(gè)帶能編程的和尋址的顯微場(chǎng)所的微電子裝置。每一個(gè)微場(chǎng)所具有為共價(jià)結(jié)合特異結(jié)合實(shí)體的一個(gè)衍生上表面(即，粘附層)，一個(gè)中間滲透層，和一個(gè)基礎(chǔ)直流(DC)微電極。在基本的微電子學(xué)結(jié)構(gòu)最初組建后，這裝置能自我引導(dǎo)每一個(gè)特殊的微場(chǎng)所與特異的結(jié)合實(shí)體的尋址。從這種意義上說(shuō)，這裝置它自已自我組裝。這自我尋址裝置隨后能有效地進(jìn)行在任何它的微場(chǎng)所上單個(gè)的多步和組合的反應(yīng)。裝置能進(jìn)行多路反應(yīng)，但有在與真正獨(dú)立測(cè)試點(diǎn)相同的地點(diǎn)發(fā)生的每一個(gè)反應(yīng)的重要優(yōu)點(diǎn)。裝置能夠電子學(xué)地引導(dǎo)和控制分析物和反應(yīng)物去或從裝置上任何微場(chǎng)所快速移動(dòng)和濃縮。裝置電子學(xué)地控制各種反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面的能力提供了大量新機(jī)理和重要的優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)。
本發(fā)明觀念和實(shí)施方案以三部分來(lái)描述。第一部分，“設(shè)計(jì)和組建基本裝置”描述設(shè)計(jì)基本基礎(chǔ)微電子裝置和應(yīng)用微平版印刷和微加工技術(shù)組建裝置。第二個(gè)部分，“裝置的自我引導(dǎo)尋址”，描述了裝置的自我尋址和自我裝配，特別是快速移動(dòng)和結(jié)合特異的結(jié)合實(shí)體到每一個(gè)微場(chǎng)所。第三個(gè)方面，“裝置的應(yīng)用”描述裝置如何提供各種多步，組合的，和多路反應(yīng)電子學(xué)控制。這部分也描述本裝置的各種用法和應(yīng)用。
I.設(shè)計(jì)和組裝基本裝置一個(gè)裝置為了進(jìn)行多步和多路反應(yīng)，它的電子元件必須在水溶液中能夠保持活潑工作狀態(tài)。為滿足這一要求，每一個(gè)微場(chǎng)所必須有一個(gè)基礎(chǔ)的能控制的和具功能的DC式微電極。然而，對(duì)于裝置的操作，特別是靈敏度(信噪比)這是重要的即結(jié)合和親和反應(yīng)不能受在活潑的DC電極表面發(fā)生的電解反應(yīng)影響。其它為設(shè)計(jì)和組建該裝置的考慮包括，但不局限于，材料的兼容性，特異的結(jié)合實(shí)體的特性和隨后的反應(yīng)物和分析物的特性，和微場(chǎng)所的數(shù)目。
“能控制的和具功能的DC式微電極”用來(lái)表明一個(gè)偏壓或正或負(fù)的微電極，以直流方式(或連續(xù)或脈沖)運(yùn)行的，能夠以可控方式影響或引起帶電特異結(jié)合實(shí)體，反應(yīng)物，或分析物去或從裝置上任何場(chǎng)所，或從樣品溶液的自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，分子的自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)，不是實(shí)際上取決于產(chǎn)生的電場(chǎng)，該電場(chǎng)被絕緣材料圍起或限制。傳統(tǒng)的電泳分離技術(shù)需要用絕緣(不導(dǎo)電)材料限制或圍繞電場(chǎng)線。在自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)情況下，帶電的分子從一個(gè)微場(chǎng)所移動(dòng)到任何其它微場(chǎng)所，或從大量溶液到特殊的微場(chǎng)所。因此，特有的排列或由絕緣材料的限制，不是本發(fā)明這方面必須的。
裝置可以設(shè)計(jì)成具有少至只有2個(gè)可尋址微場(chǎng)所，或有多至數(shù)十萬(wàn)個(gè)微場(chǎng)所。一般來(lái)說(shuō)，具大量微場(chǎng)所的復(fù)雜裝置是用微平版印刷技術(shù)制造的。制造的進(jìn)行是在硅或其它合適基質(zhì)材料，例如玻璃，二氧化硅，塑料，或陶器材料上。這些微電子“芯片”的設(shè)計(jì)可被認(rèn)為是大范圍的列陣或多路分析裝置。裝置具有少數(shù)的微場(chǎng)所或大場(chǎng)所可用微加工技術(shù)來(lái)制造。
可尋址的微場(chǎng)所可以是任何形狀，優(yōu)選圓形、方形、或長(zhǎng)方形?？蓪ぶ肺?chǎng)所的大小可為任何大小，優(yōu)選地范圍從亞-微米(～0.5μm)到幾厘米(cm)，從5μm到100μm是最優(yōu)選的尺寸范圍使用微平版印刷技術(shù)制造裝置，從100μm到10毫米是最優(yōu)選的尺寸范圍使用微機(jī)械加工技術(shù)來(lái)制造裝置。制造微場(chǎng)所小于微平版印刷方法的分辨能力將需要如下的技術(shù)例如電子束平版印刷，離子束平版印刷，或分子束外延。雖然顯微場(chǎng)所對(duì)分析和診斷類型反應(yīng)是需要的。而較大的可尋址場(chǎng)所或大場(chǎng)所(例如，大于5mm)對(duì)一些應(yīng)用例如，但不局限于，制備規(guī)模生物高分子合成，樣品制備，試劑的電子學(xué)分配是需要的。
在借助微平版印刷和/或微加工技術(shù)微場(chǎng)所已構(gòu)建后，化學(xué)修飾，聚合反應(yīng)，或甚至進(jìn)一步微平版印刷制造技術(shù)被用來(lái)建成特殊的粘附和滲透層。這些重要的層次把結(jié)合實(shí)體從電極的金屬表面隔離開(kāi)。這些重要的結(jié)構(gòu)允許在每一個(gè)微場(chǎng)所表面下的DC式微電極起如下的功能(1)影響或引起特異的(帶電)結(jié)合實(shí)體從一個(gè)微場(chǎng)所的表面自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)到另一個(gè)微場(chǎng)所的表面，或從大量溶液中移動(dòng)到特異的微場(chǎng)所(2)濃縮和共價(jià)結(jié)合特異的結(jié)合實(shí)體到一個(gè)特定微場(chǎng)所經(jīng)特殊修飾過(guò)的表面；(3)在結(jié)合特定結(jié)合實(shí)體后繼續(xù)以DC方式有效地起作用以便其它的反應(yīng)物和分析物能以可控制的方式被轉(zhuǎn)移到或從微場(chǎng)所轉(zhuǎn)移和(4)非反向地影響與電化學(xué)反應(yīng)和產(chǎn)物結(jié)合或親和反應(yīng)。
I(a)設(shè)計(jì)參數(shù)(微平版印刷)圖1表明應(yīng)用微平版印刷技術(shù)制造自我尋址微場(chǎng)所的基本設(shè)計(jì)。三個(gè)微場(chǎng)所(10)(ML-1，ML-2，ML-3)形成在已沉積在一個(gè)絕緣層/基礎(chǔ)材料上的金屬位點(diǎn)(12)的表面。這金屬位點(diǎn)(12)作為基礎(chǔ)微電極結(jié)構(gòu)(10)。絕緣材料把金屬位點(diǎn)彼此分隔開(kāi)。絕緣材料包括，但不局限于，二氧化硅、氮化硅、玻璃、防染劑、聚酰亞胺、橡膠、塑料或陶瓷材料。
圖2表示在由微平版印刷技術(shù)制造的金屬位點(diǎn)(12)上形成的單個(gè)微場(chǎng)所(10)的基本特點(diǎn)。可尋址的微場(chǎng)所是在金屬位點(diǎn)(12)上形成的，結(jié)合上一氧化層(20)，一滲透層(22)，一粘附層(24)，和一個(gè)結(jié)合實(shí)體層(26)。金屬氧化層提供共價(jià)結(jié)合滲透層的基礎(chǔ)。金屬氧化物和羥基基團(tuán)(單個(gè)或組合)，和其它表面涂蓋化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的材料可以提供共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)用于構(gòu)建或支撐滲透層。這不是絕對(duì)必須的即滲透層實(shí)際上是共價(jià)結(jié)合到金屬電極表面。滲透層的物理涂蓋代表了另一種方法，它也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
滲透層金屬表面和粘附/結(jié)合實(shí)體層提供了空間并允許溶劑分子，小相對(duì)離子，和電解反應(yīng)氣體自由地通過(guò)去和離金屬表面。這是可能的在滲透層內(nèi)包含有能降低電解反應(yīng)相反物理和化學(xué)的影響的物質(zhì)，包括，但不局限于，氧化還原反應(yīng)截留物質(zhì)，例如針對(duì)氫氣的鈀，和針對(duì)氧氣和過(guò)氧化物的含鐵復(fù)合物。對(duì)微平版印刷制造裝置和滲透層厚度能從大約1納米(nm)到100微米(μm)間，最優(yōu)選的厚度在2納米到10微米間。
粘附層為共價(jià)結(jié)合需要結(jié)合實(shí)體提供一個(gè)基架。對(duì)微平版印刷技術(shù)制造的裝置的粘附層厚度能從0.5nm到5μm，在1nm到500nm間是最優(yōu)選的。在一些情況下，滲透層和粘附層可用同一材料制成。能進(jìn)一步被活化用于結(jié)合需結(jié)合實(shí)體的特定滲透層材料也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
特異的結(jié)合實(shí)體是共價(jià)地結(jié)合到粘附層上，形成特異的結(jié)合實(shí)體層。理想地，特異的結(jié)合實(shí)體層通常是特異的結(jié)合單層。然而，在一些情況下結(jié)合實(shí)體層能有幾個(gè)或甚至多層的結(jié)合分子。
滲透和粘附層的特定設(shè)計(jì)和功能的方面是由特異的結(jié)合實(shí)體分子物理的(如，尺寸和形狀)和化學(xué)特性支配的。它們也由反應(yīng)物和分析物分子的物化性質(zhì)支配到一定程度，這些反應(yīng)物和分析物分子隨后移動(dòng)和結(jié)合到微場(chǎng)所上。例如，寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體可被結(jié)合到一種類型的微場(chǎng)所表面而不引起喪失DC式功能，即，基礎(chǔ)微電極仍能引起快速自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)其它與分析物分子到或離開(kāi)寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體結(jié)合的表面。然而，如果較大的球形蛋白結(jié)合實(shí)體(如，抗體)結(jié)合到相同類型的表面，它們可能使表面絕緣和引起降低或完全喪失DC式功能。粘附層合適的修飾將不得不進(jìn)行以便降低較大結(jié)合實(shí)體(如，大的球形蛋白)的數(shù)目或提供在表面結(jié)合實(shí)體間的空間。
微場(chǎng)所間的空間的確定是通過(guò)制造的難易程度，微場(chǎng)所間所需要的識(shí)別分辨率，和一個(gè)裝置上所需微場(chǎng)所的數(shù)量來(lái)進(jìn)行的。然而，在微場(chǎng)所間，或特定排列間或微場(chǎng)所的幾何形狀間的特殊的空間對(duì)裝置的功能正是必須的，即任何微場(chǎng)所(即，基礎(chǔ)微電極)的組合能在整個(gè)裝置范圍內(nèi)運(yùn)行。實(shí)際上無(wú)需包圍裝置或完全地用絕緣或不導(dǎo)電的屏障來(lái)限制微場(chǎng)所。這是因?yàn)閺?fù)雜的電子場(chǎng)型或不導(dǎo)電的邊界對(duì)于選擇性地移動(dòng)、分離、承托，或調(diào)整特殊分子在任何電極間介質(zhì)或空間中，是不需要的。裝置完成這個(gè)是通過(guò)結(jié)合特異的結(jié)合分子和隨后的分析物和反應(yīng)物到一個(gè)能尋址的微場(chǎng)所的表面。自由場(chǎng)電泳推進(jìn)力提供任何帶電分子在裝置任何或所有場(chǎng)所間；或從大量溶液到微場(chǎng)所快速和直接轉(zhuǎn)移。然而，必須指出裝置為了液體抑制和生物有害物的目的可被包圍起來(lái)。
隨著微場(chǎng)所的數(shù)目增加超過(guò)幾百，微場(chǎng)所基本回路的復(fù)雜性增加。在這種情況下微場(chǎng)所組式樣必須改變的空間距離成比例地增加，或多層回路能被制造到基本裝置內(nèi)。
除了已被特異的結(jié)合實(shí)體尋址的微場(chǎng)所外，一個(gè)裝置將含有起到其它的功能非分析的微場(chǎng)所和大場(chǎng)所。這些微場(chǎng)所或大場(chǎng)所可被用于貯存試劑，短暫地承托反應(yīng)物，分析物或細(xì)胞，或作為處理單位為多余的反應(yīng)物，分析物，或其它樣品中干擾成份(即，試劑分配和樣品制備系統(tǒng))。其它未被尋址的微場(chǎng)所可被用于與已被尋址的微場(chǎng)所組合影響或干擾在這些特殊的微場(chǎng)所發(fā)生的反應(yīng)。這些微場(chǎng)所加到裝置間和裝置內(nèi)的活性和控制。因此，微場(chǎng)所在兩個(gè)分開(kāi)的裝置間相互作用和轉(zhuǎn)移分子也是可能的。這為從一個(gè)貯存裝置中取結(jié)合實(shí)體或反應(yīng)物加樣到工作裝置上，為樣品制備和為裝置的復(fù)制或倍增提供了一個(gè)機(jī)理。
圖3表示了一個(gè)含有64可尋址微場(chǎng)所的矩陣類型裝置(30)。一個(gè)64微場(chǎng)所裝置是個(gè)方便的設(shè)計(jì)，它剛好吻合于標(biāo)準(zhǔn)微電子芯片包裝組成。這種裝置是在大約1.5cm×1.5cm的硅芯片基質(zhì)上制造的，在中心區(qū)域大約750μm×750μm含有64個(gè)微場(chǎng)所。每個(gè)微場(chǎng)所(32)大約是50μm的方形，在鄰近微場(chǎng)所間具50μm空間。每一獨(dú)立的基礎(chǔ)微電極連接回路通向金屬接觸墊(300μm2)的外周(10mm×10mm)。一個(gè)凸起的內(nèi)周可在帶有微場(chǎng)所區(qū)域和接觸墊之間形成，產(chǎn)生一個(gè)洞能裝大約2到10微升(μl)的樣品溶液。這芯片能被放入標(biāo)準(zhǔn)空鉛外殼中，和芯片接觸的墊(34)用線連到空鉛外殼引線上。含有多于1個(gè)芯片和附帶的外殼和外周組成的系統(tǒng)可用于設(shè)計(jì)成解決有關(guān)于臨床診斷的問(wèn)題，即，樣品材料的加入，液體轉(zhuǎn)移，和生物有害物質(zhì)的抑制。外殼包裝好的芯片然后可插入微處理機(jī)控制的DC電源和萬(wàn)用表儀器它能控制和操作該裝置。本發(fā)明期望裝置制造(尋址前)將根本地包括三種基本成份的組合，這些成份將基本地夾心在一起。結(jié)合實(shí)體結(jié)合的基本芯片裝置將處在中間位置，樣品或液體限制成份將在基本芯片裝置的上方退火；和一個(gè)微電子識(shí)別和廣泛控制器成份將在基本芯片裝置的底部退火。這種策略解決了有關(guān)于制造技術(shù)和材料可容性的大量問(wèn)題。
I(b).微平版印刷制造程序I(b)(1)制造步驟通常微平版印刷或光平版印刷技術(shù)能被用于制造復(fù)雜“芯片”類型裝置，這類裝置有大量小的微場(chǎng)所。雖然裝置的制造不需要復(fù)雜的光平版印刷技術(shù)，材料的選擇和電子學(xué)裝置有效地在水溶液中起作用的需求極需要特殊的考慮。
圖3中表示的64微場(chǎng)所裝置(30)可應(yīng)用相對(duì)簡(jiǎn)單的蒙片設(shè)計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)的微平版印刷技術(shù)制造。一般地，基本的基質(zhì)物質(zhì)是1到2厘米見(jiàn)方的硅片或芯片約0.5毫米厚。這硅芯片首先覆蓋1到2μm厚的二氧化硅(SiO2)絕緣層，它是由等離子體增強(qiáng)化學(xué)蒸汽沉積法(PECVD)制成。
在下一步，一個(gè)0.2到0.5μm金屬層(如，鋁)通過(guò)真空蒸發(fā)沉積而成。這也可能通過(guò)飛濺技術(shù)沉積金屬。除鋁以外，合適的金屬和材料用于回路的包括金、銀、錫、鈦、銅、鉑、鈀、聚硅、碳，和各種金屬的組合。用于保證完全粘附到絕緣基質(zhì)材料(SiO2)的特殊技術(shù)被用來(lái)粘附不同的金屬。不同的金屬和其它材料可被用作裝置不同的導(dǎo)電元件，例如，使用鋁用于周邊接觸墊，聚硅用于相互聯(lián)系的回路，和貴重金屬(金或鉑)用于微電極。
這芯片下一步覆蓋帶正電的光致抗蝕劑(Shipley，MicropositAZ 1350J)，用回路的式樣蒙片(光場(chǎng))修正，曝光和沖洗。光溶解的抗蝕劑被去除，曝光后鋁蝕刻掉?？刮g劑小島現(xiàn)被去除，留下鋁回路式樣在芯片上。這包括外周邊的金屬接觸墊，相連接電路(電線)和微電極中心列陣作為可尋址微場(chǎng)所下面的基礎(chǔ)。
應(yīng)用PECVD，這芯片首先覆蓋0.2到0.4微米的SiO2層，然后0.1到0.2微米氮化硅(Si3N4)層。芯片再涂蓋帶正電的光致抗蝕劑，為接觸墊和微電極場(chǎng)所蒙片修正，曝光，和沖洗。光溶解的抗蝕劑被去掉，SiO2和Si3N4層蝕刻掉，曝光鋁接觸墊和微電極。周圍的抗蝕劑小島隨后被去除，位于接觸墊和微電極間的相連接線路由SiO2和Si3N4層保持絕緣。
SiO2和Si3N4層為裝置的功能提供了重要的特性。第二個(gè)SiO2層提供更好接觸和促進(jìn)密封鋁電路。這也可能用抗蝕劑材料來(lái)絕緣和密封。這可防止微電極運(yùn)行中電解反應(yīng)引起的電路的逐漸損害。最后的Si3N4表層應(yīng)用是因?yàn)樗c隨后用于修飾粘附特異結(jié)合實(shí)體的微電極表面的試劑反應(yīng)性能低。
I(b)(2)滲透和粘附層形成的步驟在這步裝置上微電極場(chǎng)所已準(zhǔn)備可用特殊的滲透和粘附層來(lái)修飾。這是本發(fā)明一個(gè)重要的方面。目的是在微電極上構(gòu)建一個(gè)中間的滲透層并帶有選擇性的擴(kuò)散特性和一個(gè)具有最佳的結(jié)合特性粘附表層。
最佳地，粘附層每平方微米(μm2)中具有105到107個(gè)具功能的微場(chǎng)所可用于粘附特異的結(jié)合實(shí)體。特異的結(jié)合實(shí)體的粘附必須不覆蓋或絕緣表層以防止下面的微電極喪失功能。一個(gè)具功能的裝置需要實(shí)際金屬微電極表面的部分(～5％到25％)保持與溶劑(H2O)分子接觸，和允許發(fā)生相反離子(如，Na+和Cl-)和電解氣體(如，氧氣和氫氣)的擴(kuò)散。
中間的滲透層也設(shè)計(jì)成允許發(fā)生擴(kuò)散。此外，滲透層必須有孔限特性以便抑制或阻止較大的結(jié)合實(shí)體、反應(yīng)物，和分析物與微電極表面物理接觸。滲透層保持活潑的微電極表面物理學(xué)上性質(zhì)不同于微場(chǎng)所的結(jié)合實(shí)體層。
這種設(shè)計(jì)允許因電泳移動(dòng)需要的電解反應(yīng)在微電極表面發(fā)生，但避免對(duì)于結(jié)合實(shí)體，反應(yīng)物和分析物不利的電化學(xué)影響。
滲透層也可被設(shè)計(jì)成包括那些能清除在電解反應(yīng)中產(chǎn)生的不利的物質(zhì)(H2，O2，自由基團(tuán)等)的基質(zhì)。另一個(gè)滲透層的亞層可被設(shè)計(jì)用于這一目的。
許多種設(shè)計(jì)和技術(shù)可用于制造滲透層。常用的設(shè)計(jì)包括(1)“草坪法”，(2)“網(wǎng)眼法”，和(3)“多孔法”結(jié)構(gòu)。
草坪式滲透層包括金屬表層和線性分子或高分子垂直排列，以一個(gè)類似于厚草坪的方式。這些結(jié)構(gòu)可通過(guò)直接粘附線性或聚合和親水分子到金屬表面形成，其中在垂直分子間有最少量的交叉聯(lián)系。理想地這些親水線性分子是雙功能的，即在一端適合共價(jià)結(jié)合到金屬墊上，而另一端適合結(jié)合實(shí)體的共價(jià)結(jié)合。
網(wǎng)眼式滲透層包括聚合分子隨機(jī)排列形成網(wǎng)眼狀結(jié)構(gòu)，具有可由交叉聯(lián)系的程度確定的平均孔徑。這些結(jié)構(gòu)的形成可由含水凝膠類物質(zhì)例如，但不局限于，聚丙烯酰胺，瓊脂糖，和種種其它能聚合和交叉連結(jié)的生物和非生物物質(zhì)。。
孔式滲透層包括應(yīng)用能在金屬墊表面層的上面直接形成通道或孔的物質(zhì)，包括，但不局限于，聚碳酸酯、聚砜、或玻璃物質(zhì)。在所有的情況下滲透層必須物理地或化學(xué)地固定在金屬表面，并且必須含有功能基團(tuán)或能夠轉(zhuǎn)化成功能化的基團(tuán)用于粘附結(jié)合實(shí)體到它的表面。
一個(gè)用于產(chǎn)生草坪式結(jié)構(gòu)的優(yōu)選過(guò)程包括用氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)衍生金屬微電極表面。APS容易與在金屬和硅表面的氧化物和羥基基團(tuán)起反應(yīng)。APS提供一組合的滲透層和粘附層，并帶有能與隨后結(jié)合實(shí)體共價(jià)結(jié)合的伯胺基團(tuán)。就表面結(jié)合位點(diǎn)而言，APS在輕度氧化的鋁表面產(chǎn)生相當(dāng)高水平的活化功能(即，大量的伯胺基團(tuán))，在SiO2表面產(chǎn)生一個(gè)中間水平的活化功能，和在Si3N4表面產(chǎn)生非常有限的活化功能。
APS反應(yīng)的進(jìn)行是通過(guò)用10％APS溶于甲苯的溶液在50℃處理整個(gè)裝置(如，芯片)表面30分鐘。然后芯片依次在甲苯、乙醇中沖洗然后在50℃干燥1小時(shí)。微電極金屬表面用大量伯胺基團(tuán)而被活化(每平方微米105到106)。結(jié)合實(shí)體現(xiàn)在能被共價(jià)地結(jié)合到衍生了的微電極表面。這種“草坪式”滲透層的深度也可通過(guò)應(yīng)用聚氧乙烯雙(胺)，雙(聚氧乙烯雙(胺))，和其它聚乙烯醇或類似的化合物而增加。
APS過(guò)程對(duì)于寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體的結(jié)合很成功。圖4表示用于結(jié)合3′-末端醛基衍生了的寡聚核苷酸(40)到一個(gè)APS活化過(guò)的表面的機(jī)理(42)。雖然這代表一種方法，各種其它用于形成滲透和粘附層的方法是可能的。這些包括利用自我引導(dǎo)的尋址通過(guò)基礎(chǔ)電極本身進(jìn)行(1)借助電鍍到基礎(chǔ)微電極上形成第二種金屬層；(2)借助電聚合反應(yīng)到微電極場(chǎng)所形成滲透層；或(3)借助自由場(chǎng)電泳過(guò)程轉(zhuǎn)移活化的聚合物和試劑到微電極表面形成隨后的滲透和粘附層。
I(c)微加工的裝置的設(shè)計(jì)和制造這部分描述如何應(yīng)用微加工技術(shù)(如，鉆孔、銑，等)或非平版印刷技術(shù)來(lái)制造裝置。一般地說(shuō)，這些裝置比那些由微平版印刷技術(shù)制造的裝置有相對(duì)較大的微場(chǎng)所(＞100微米)。這些裝置能被用于分析應(yīng)用和制備型應(yīng)用，例如生物高分子合成，樣品制備，試劑分配，貯藏所，和廢物處理。大的尋址場(chǎng)所可被制造成三維形式(例如，管狀或圓柱狀)而攜帶大量的結(jié)合實(shí)體，這種裝置能應(yīng)用各種材料制造，包括，但不局限于，塑料、橡膠、硅、玻璃(例如，微槽的，微毛細(xì)管的，等)，或陶瓷。低熒光材料是較理想的應(yīng)用于分析應(yīng)用。在微加工的裝置情況下，使用標(biāo)準(zhǔn)的電路版印刷技術(shù)連接電路和較大的電極結(jié)構(gòu)能被印刷到材料上，而這種技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。
可尋址的微場(chǎng)所裝置能使用微加工技術(shù)被相當(dāng)?shù)厝菀椎刂圃?。圖5是一個(gè)代表性的96微場(chǎng)所裝置的圖解。這微場(chǎng)所裝置是從一個(gè)合適材料塊(2cm×4cm×1cm)制造的，借助鉆孔96個(gè)成比例空間的孔(直徑1mm)穿過(guò)這材料。一個(gè)電極電路塊(52)在一薄層的塑料材料塊上形成，它準(zhǔn)確地配合在微場(chǎng)所元件(54)頂部上方。電路板的背面含有(印刷電路)通向每個(gè)微場(chǎng)所(55)的單個(gè)電路。短的鉑電極結(jié)構(gòu)(～3-4mm)(62)被設(shè)計(jì)成向下擴(kuò)展進(jìn)入單個(gè)的微場(chǎng)所腔(57)。這印刷的電路線路用一層合適的防水絕緣材料覆蓋。這印刷的電路線路匯聚到一個(gè)孔內(nèi)，這允許連接到一個(gè)多路開(kāi)關(guān)控制器(56)和DC電源供應(yīng)器(58)。這裝置是部分地埋沒(méi)和操作在一個(gè)共同的緩沖液池(59)中。
雖然在由微加工和微平版印刷技術(shù)制造的裝置中微場(chǎng)所的原始功能都是相同的，但它們的設(shè)計(jì)是不同的。在由微平版印刷制造的裝置中，滲透和粘附層是在埋在下面的金屬微電極上直接形成的。在由微加工技術(shù)制造的裝置中，滲透層和粘附層是物理上從它們單個(gè)的金屬電極結(jié)構(gòu)(62)分離的借助單個(gè)的孔或池(57)中的緩沖液(見(jiàn)圖6)。在微加工的裝置中滲透和粘附層能通過(guò)使用功能性的親水凝膠，膜，或其它合適的多孔材料而形成。
一般地，組合的滲透和粘附層的厚度范圍從10μm到30mm。例如，一個(gè)修飾過(guò)的20％到35％的聚丙烯酰胺親水凝膠(帶0.1％聚賴氨酸)，能被用來(lái)部分填補(bǔ)(～0.5mm)裝置中每一個(gè)單個(gè)微場(chǎng)所腔。這些濃度的凝膠形成一個(gè)理想的滲透層其孔徑限度從2nm到10nm。聚賴氨酸組合入凝膠內(nèi)為隨后的結(jié)合特異的結(jié)合實(shí)體提供伯胺功能基團(tuán)。這種類型的凝膠滲透層允許電極有效地以DC模式起作用。當(dāng)電極被活化后，這凝膠滲透層允許小的相反離子通過(guò)這滲透層，但較大的特異結(jié)合實(shí)體分子在外表面被濃縮。這兒它們成為共價(jià)地結(jié)合到外層的伯胺上，而有效地成為粘附層。
用于形成滲透和粘附層另一種技術(shù)是把一種多孔膜材料組合入每一個(gè)微場(chǎng)所腔基部。膜的外表面然后被衍生化用化學(xué)的功能基團(tuán)形成粘附層。用于進(jìn)行本方法的適合的技術(shù)和材料是對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。
上面對(duì)于微平版印刷和微加工的裝置的設(shè)計(jì)和制造的描述必須不被認(rèn)為是對(duì)其它改變或類型的基本裝置的限制。多個(gè)改變型的裝置并帶有較大或較小量的可尋址的微場(chǎng)所或組合的裝置能用于不同的分析和制備應(yīng)用。改變型的裝置并帶有較大可尋址的場(chǎng)所能被設(shè)成用于制備生物高分子合成應(yīng)用，樣品制備，細(xì)胞分類系統(tǒng)，原位雜交，試劑分配，貯存系統(tǒng)，和廢物處理系統(tǒng)。
II.自我引導(dǎo)的尋址的裝置本發(fā)明的裝置能夠電子學(xué)地自我尋址每一個(gè)微場(chǎng)所與一個(gè)特異的結(jié)合實(shí)體。這裝置本身直接影響或引起移動(dòng)一個(gè)帶電特殊結(jié)合實(shí)體到一個(gè)特異的微場(chǎng)所。結(jié)合實(shí)體一般地是功能化的以便它們迅速地反應(yīng)和共價(jià)地結(jié)合到粘附層上。裝置自我裝配意謂著不需要外部過(guò)程，機(jī)械裝置或設(shè)備進(jìn)行物理地引導(dǎo)，定位，或放置一個(gè)特異的結(jié)合實(shí)體在一個(gè)特殊的微場(chǎng)所上。這自我尋址過(guò)程是既快又特異。能以連續(xù)或平行的方式進(jìn)行。
一個(gè)裝置能用特異的結(jié)合實(shí)體連續(xù)地被尋址通過(guò)保持被選擇的微場(chǎng)所以DC方式和與特異的結(jié)合實(shí)所帶電荷相反的電荷(電勢(shì))。如果一個(gè)結(jié)合實(shí)體有一個(gè)凈負(fù)電荷，那么這結(jié)合實(shí)體將轉(zhuǎn)移到的微場(chǎng)所必須帶正電荷。相反地，一個(gè)帶負(fù)電荷的微場(chǎng)所被用于轉(zhuǎn)移一個(gè)帶正電荷的結(jié)合實(shí)體。其它的選擇在連續(xù)的尋址過(guò)程中用于偏壓遺留的微場(chǎng)所包括偏壓所有在相反的電荷的其它微場(chǎng)所(與被尋址的微場(chǎng)所帶電荷相反)；在相反電荷偏壓微場(chǎng)所的一個(gè)有限基團(tuán)；或在相反電荷偏壓僅一個(gè)微場(chǎng)所(或其它的電極)。在一些情況下，這將是希望的即強(qiáng)烈地偏壓一個(gè)或更多的微場(chǎng)所在相反的電荷，然而其它組的微場(chǎng)所僅較弱地偏壓。這個(gè)過(guò)程允許以前尋址的微場(chǎng)所在尋址遺留的微場(chǎng)所過(guò)程中被保護(hù)起來(lái)。在結(jié)合實(shí)體不多于微場(chǎng)所上結(jié)合位點(diǎn)的情況下，可能只需要去活化一個(gè)其它微電極去影響自由場(chǎng)電泳式移動(dòng)到特異的微場(chǎng)所上。特異的結(jié)合實(shí)體能被快速地轉(zhuǎn)移通過(guò)大量溶液，和直接地濃縮在特定的微場(chǎng)所并在此處它們立即成為共價(jià)地結(jié)合到粘附層特定表面。轉(zhuǎn)移的速率取決于結(jié)合實(shí)體的大小和所帶的電荷，和在微場(chǎng)所間使用的電壓和電流水平。一般地，轉(zhuǎn)移速率能從數(shù)秒到數(shù)分鐘范圍。在一個(gè)特定的微場(chǎng)所(72)上的電子學(xué)地濃縮結(jié)合實(shí)體，反應(yīng)物，或分析物(70)能力顯示于圖7。在特異的結(jié)合實(shí)體尋址過(guò)程中所有其它微場(chǎng)所能被保護(hù)起來(lái)和保持不受影響。任何未反應(yīng)的結(jié)合實(shí)體被移去是通過(guò)轉(zhuǎn)換特殊微場(chǎng)所的極性，和電泳這實(shí)體到一個(gè)廢物場(chǎng)所。這循環(huán)被重復(fù)直到所有企望的微場(chǎng)所由它們特異的結(jié)合實(shí)體尋址。圖8表示用特異的寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體(82、84、86)尋址特殊的微場(chǎng)所(81、83、85)的連續(xù)過(guò)程。
為了尋址微場(chǎng)所的平行過(guò)程包含同時(shí)地活化多于一個(gè)微場(chǎng)所(一個(gè)特定組群)以便相同的特異結(jié)合實(shí)體被轉(zhuǎn)移，濃縮，和與多于一個(gè)特殊的微場(chǎng)所起反應(yīng)。隨后的平行過(guò)程與連續(xù)的過(guò)程是相似的。
III.裝置的應(yīng)用一旦裝置已經(jīng)用特定的結(jié)合實(shí)體自我尋址，各種分子生物學(xué)類型的多步和多路反應(yīng)和分析能在裝置上進(jìn)行。本發(fā)明的裝置能夠電子學(xué)地對(duì)大量重要反應(yīng)參數(shù)提供活力的和動(dòng)力學(xué)的控制。這種電子控制導(dǎo)致控制反應(yīng)的新的物理學(xué)的機(jī)械裝置，和反應(yīng)速率，特異性，和靈敏度重要的改進(jìn)。這些參數(shù)的改進(jìn)來(lái)自裝置電子學(xué)地控制和直接地影響(1)快速轉(zhuǎn)移反應(yīng)物或分析物到一個(gè)含結(jié)合的特異結(jié)合實(shí)體的特定的微場(chǎng)所；(2)反應(yīng)速率的增加是因?yàn)闈饪s反應(yīng)物或分析物與在特定微場(chǎng)所的表面上的特異的結(jié)合實(shí)體；(3)從微場(chǎng)所迅速和選擇性的移去未反應(yīng)的和非特異性結(jié)合的成份；和(4)為最適結(jié)合條件的嚴(yán)格性。
本發(fā)明自我尋址的裝置能夠迅速地進(jìn)行各種微形式的多步和/或多路反應(yīng)和過(guò)程它包括但不局限于——傳統(tǒng)形式的DNA和RNA雜交反應(yīng)過(guò)程和分析如，結(jié)合的目標(biāo)DNA/探針DNA，結(jié)合的探針DNA/目標(biāo)DNA，結(jié)合的捕獲DNA/目標(biāo)DNA/探針DNA；——多倍的或多路的雜交反應(yīng)以連續(xù)的和平行的方式——限制性片段和一般DNA/RNA片段大小分析；——分子生物學(xué)反應(yīng)，如，限制性酶反應(yīng)和分析，連接反應(yīng)，激酶反應(yīng)，和DNA/RNA擴(kuò)增；——抗體/抗原反應(yīng)包括大或小抗原和半抗原——診斷測(cè)定，如，雜交分析(包括原位雜交)，基因分析，指紋分析，和免疫診斷；——樣品制備，細(xì)胞分類，選擇和分析；——生物分子接合過(guò)程(即，共價(jià)和非共價(jià)標(biāo)記核酸、酶，蛋白，或抗體，用報(bào)告基團(tuán)，包括熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑，比色法，和同位素標(biāo)記)
——生物高分子合成，如，組合的合成寡聚核苷酸或多肽；——水溶合成的高分子的合成，如，碳水化合物或線狀的聚丙烯酸酯；和——大分子和納米結(jié)構(gòu)(納米大小顆粒和結(jié)構(gòu))的合成和制造。
III(a)核酸雜交核酸雜交被用作本發(fā)明主要的實(shí)例因?yàn)樗鼈冊(cè)谠\斷中的重要性，和因?yàn)樗鼈兪嵌喾N結(jié)合(親和)反應(yīng)難的類型中具特征性的一種。這是特別真實(shí)的當(dāng)它們以多路形式進(jìn)行，這兒每個(gè)單獨(dú)的雜交反應(yīng)需要不同的嚴(yán)格條件。
權(quán)利要求的裝置和方法允許核酸雜交以各種傳統(tǒng)的和新的方式進(jìn)行。裝置電子學(xué)地控制反應(yīng)參數(shù)的能力極大地促進(jìn)核酸雜交分析，特別是裝置對(duì)列陣上每一單獨(dú)微場(chǎng)所提供電子學(xué)的嚴(yán)格控制(ESC)的能力。本質(zhì)上，這允許每個(gè)單個(gè)雜交反應(yīng)在同一列陣上能進(jìn)行如同一個(gè)單個(gè)試管測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“核酸雜交”用來(lái)表示包括在所有天然的和合成形式以及衍生的核酸分子間的所有雜交反應(yīng)，包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，聚核苷酸，寡聚核苷酸。
傳統(tǒng)的雜交形式，例如“斑點(diǎn)印跡”雜交和“夾心法”雜交，能用權(quán)利要求的裝置以及大范圍列陣或矩陣形式進(jìn)行。
作為一實(shí)例，一臺(tái)用于DNA雜交分析的APEX裝置被設(shè)計(jì)，制造，和以如下方式使用。微場(chǎng)所的列陣首先用微平版印刷(或微加工)技術(shù)制造。在一個(gè)列陣上可尋址微場(chǎng)所的數(shù)目取決于最終的用途。裝置用一組特異寡聚核苷酸以連續(xù)的方式迅速地自我尋址。在這種情況下，特異的寡聚核苷酸是3′-末端醛基功能化的寡聚核苷酸在6-mers到100-mers的范圍內(nèi)，如需要的話較大的聚核苷酸能被結(jié)合。醛基功能的基團(tuán)允許共價(jià)結(jié)合到特定的微場(chǎng)所粘附表層(見(jiàn)圖4)。這個(gè)特異寡聚核苷酸組能可容易地應(yīng)用傳統(tǒng)的技術(shù)在一個(gè)傳統(tǒng)的DNA合成儀上合成。合成每一個(gè)特異寡聚核苷酸是從一個(gè)核糖核苷酸控制的多孔玻璃(CPG)載體上起始的。這樣，3′-末端含有一個(gè)核糖核苷酸，在合成和純化后它隨后容易地被經(jīng)高碘酸氧化轉(zhuǎn)變成一個(gè)末端的二醛衍生物。含有醛基的寡聚核苷酸(40)將很容易地通過(guò)席夫堿反應(yīng)過(guò)程與微場(chǎng)所表面的伯胺功能基團(tuán)起反應(yīng)。
裝置的用特異的寡聚核苷酸的電子學(xué)尋址圖解在圖8。第一個(gè)特異微場(chǎng)所(ML-1)(81)與它的特殊的序列寡聚核苷酸(SSO-1)(82)的尋址的完成是通過(guò)保持特定的微電極(ML-1)在一個(gè)正的DC電勢(shì)，同時(shí)所有其它微電極保持在一個(gè)負(fù)的電勢(shì)(圖8(A))。在水的緩沖液中醛基功能化特殊序列(SSO-1)自由場(chǎng)電泳到ML-1地址，在那里它濃縮(＞106倍)和快速地變成共價(jià)地結(jié)合到ML-1的表面(81)。所有其它微電極保持在負(fù)電，和處在受保護(hù)或掩蓋，不與SSO-1序列起反應(yīng)(82)。然后ML-1電勢(shì)相反到負(fù)(-)去電泳任何未反應(yīng)的SSO-1到一個(gè)廢棄系統(tǒng)。這周期被重復(fù)，SSO-1(84)……＞ML-2(83)，SSO-3(86)……＞ML-3(85)，SSO-n……＞ML-n直到所有期望的微場(chǎng)所被用它們特異DNA序列尋址(圖8(D))。
另一種用于尋址裝置的方法是從一個(gè)電子學(xué)的試劑提供裝置轉(zhuǎn)移特定的結(jié)合實(shí)體例如特異的寡聚核苷酸。這提供裝置必須保持大量結(jié)合實(shí)體或試劑和必須被用于加樣到分析裝置。結(jié)合實(shí)體必須在兩個(gè)裝置間電子學(xué)地轉(zhuǎn)移。這個(gè)系統(tǒng)消除了物理學(xué)操作的需求，例如微移液，并消除了在裝置內(nèi)或裝置間的復(fù)雜的流體輸送系統(tǒng)。
然而用于尋址裝置另一種方法是進(jìn)行組合的在特定的微場(chǎng)所合成特異的寡聚核苷酸。組合的合成在后面部分描述。
在裝置已被特異的DNA序列尋址后，這一點(diǎn)是重要的即在列陣裝置微場(chǎng)所下面的微電極保持作為獨(dú)立的工作直流(DC)電極。這是可能的，因?yàn)榻Y(jié)合到電極表面是在這種方式下進(jìn)行的即下面的微電極不被化學(xué)地或物理地絕緣。每一個(gè)微電極仍能產(chǎn)生強(qiáng)的直流電足夠向和從微場(chǎng)所表面上自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移其它帶電的DNA分子。因此，DNA列陣裝置提供完全電子學(xué)控制DNA雜交和任何其它隨后反應(yīng)的所有方面。
電子學(xué)地控制的雜交方法的一個(gè)實(shí)例表示在圖9。在這種情況下，每一個(gè)可尋址的微場(chǎng)所有一個(gè)特異的捕獲序列(90)。含有目標(biāo)DNA(92)的樣品溶液被用到裝置上。所有的微場(chǎng)所被活化并且樣品DNA在微場(chǎng)所被濃縮(圖9(B))。稀釋了的溶液中的目標(biāo)DNA分子在微場(chǎng)所被高度濃縮，允許迅速雜交到表面上的特異互補(bǔ)DNA序列上。反向微電極的電勢(shì)從微場(chǎng)所上排除所有未被雜交的DNA，而目標(biāo)DNA保持被雜交狀態(tài)(圖9(C))。以相同的類型，在隨后步驟中報(bào)告探針被雜交去識(shí)別雜交的復(fù)合體。
雜交過(guò)程的電子學(xué)控制通過(guò)提高總的雜交效率和通過(guò)從微場(chǎng)所區(qū)域移走非特異DNA極大地促進(jìn)隨后識(shí)別目標(biāo)DNA分子。這是期望的即在未擴(kuò)增的基因組DNA中10,000到100,000考貝數(shù)的目標(biāo)序列將可被識(shí)別。這種類型的雜交反應(yīng)能在幾分鐘甚至更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，在大大低于探針Tm的等溫條件下，和最少外界操作次數(shù)下(即，傳統(tǒng)的漂洗步驟完全被省掉)。
另一個(gè)DNA雜交測(cè)定的常用方式包括把目標(biāo)DNA固定在表面，隨后用特異的探針與這些目標(biāo)DNA分子雜交。這種形式能包括在復(fù)雜的場(chǎng)所的相同目標(biāo)DNA，或在特定的場(chǎng)所的不同的目標(biāo)DNA。圖10表示這一連續(xù)雜交形式一個(gè)改進(jìn)方式。在這種情況下微場(chǎng)所(101-107)被不同的捕獲DNA分子尋址。這些是以連續(xù)的形式與不同的序列特異寡聚核苷酸(108，109)雜交。微場(chǎng)所隨后被偏壓成正去轉(zhuǎn)移分子到其自身，然后偏壓成負(fù)去轉(zhuǎn)移分子到下一個(gè)微場(chǎng)所。在合適的電極電勢(shì)下，特異地雜交了的DNA探針將保留在那微場(chǎng)所，而未雜交的探針被轉(zhuǎn)移到下一個(gè)微場(chǎng)所。這序列特異寡聚核苷酸探針能被合適的報(bào)告基因如熒光團(tuán)所標(biāo)記。
權(quán)利要求的裝置能夠提供電子學(xué)的嚴(yán)格控制。嚴(yán)格控制對(duì)雜交特異性是必須的，對(duì)識(shí)別點(diǎn)突變單個(gè)堿基錯(cuò)配序列特別重要。圖11表示電子學(xué)嚴(yán)格控制如何能被用于單個(gè)堿基錯(cuò)配序列分析。電子學(xué)嚴(yán)格控制也能被應(yīng)用于多數(shù)堿基錯(cuò)配序列分析。在圖11(A)中完全地配合的DNA雜交子(110)是比錯(cuò)配DNA(112)雜交子略更加穩(wěn)定。通過(guò)偏壓微場(chǎng)所負(fù)電(圖11(B))和在一定時(shí)間傳送一固定量的電泳電力，這是可能的即變性或移走錯(cuò)配DNA雜交子而保持完全配合的DNA雜交子(圖11(C))。圖(15)比較應(yīng)用電子學(xué)嚴(yán)格控制所得的電子學(xué)雜交過(guò)程的結(jié)果與傳統(tǒng)的雜交過(guò)程的結(jié)果。雜交包括為了Ras12癌基因突變的15-mer G和A點(diǎn)突變探針。電子學(xué)雜交結(jié)果表明與傳統(tǒng)的過(guò)程比較極大地提高了單個(gè)堿基錯(cuò)配的雜交效率和有一個(gè)非常高的辨別率。
更準(zhǔn)確地說(shuō)，權(quán)利要求的裝置對(duì)每一個(gè)發(fā)生在裝置上的特異的雜交反應(yīng)提供獨(dú)立的嚴(yán)格條件。實(shí)際上每一個(gè)雜交是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)。
用傳統(tǒng)的或被動(dòng)的列陣形式，不可能對(duì)所有發(fā)生在相同的雜交溶液中的雜交反應(yīng)獲得最適合的嚴(yán)格性。然而，本發(fā)明主動(dòng)的列陣裝置能夠?qū)Σ煌?chǎng)所上的雜交提供不同的電子學(xué)嚴(yán)格性，甚至是那些在同一容積雜交溶液中。這屬性克服了對(duì)傳統(tǒng)矩陣或列陣雜交形式，通過(guò)雜交測(cè)序(SBH)形式，和其它多路分析的固有限制。
除提高雜交的特異性(即，辨別率)和靈敏度(例如單點(diǎn)突變識(shí)別)外，電子學(xué)嚴(yán)格性控制允許在正常尺寸范圍外的寡聚核苷酸能用于這些應(yīng)用。寡聚核苷酸序列范圍從8-mer到21-mer被認(rèn)為是用傳統(tǒng)的雜交方法進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)可接受的。在應(yīng)用傳統(tǒng)雜交方法現(xiàn)行的實(shí)踐中，寡聚核苷酸在10-mer到19-mer是最常用于這些傳統(tǒng)方法中，而傳統(tǒng)方法應(yīng)用溫度和鹽濃度達(dá)到嚴(yán)格性控制。寡聚核苷酸短于10-mers已被發(fā)現(xiàn)對(duì)多路雜交不合適序列短于8-mers因?yàn)槠涞碗s交效率甚至不能考慮使用。序列長(zhǎng)于21-mers不能應(yīng)用因?yàn)樗鼈冊(cè)谂浜虾湾e(cuò)配探針之間具有極差的辨別率。隨著序列長(zhǎng)度超過(guò)21-mer，區(qū)別配合和錯(cuò)配探針間的差異性的能力極大地下降了。
我們發(fā)現(xiàn)在APEX裝置上采用電子學(xué)嚴(yán)格控制進(jìn)行的雜交允許較短的(7-mer和更短的)和較長(zhǎng)的(22-mer和更長(zhǎng)的)寡聚核苷酸能被應(yīng)用并具非常高的辨別率。使用較短寡聚核苷酸序列(7-mer和更短)對(duì)利用雜交測(cè)序(SBH)具有優(yōu)點(diǎn)。較短長(zhǎng)度序列允許具有極少數(shù)寡聚核苷酸(8-mers＝65,535，7-mers＝16,384，6-mers＝4,096)的列陣能被使用于這種SBH應(yīng)用。使用較長(zhǎng)序列(22-mer和更長(zhǎng))與電子學(xué)嚴(yán)格控制使更靈敏和選擇性更強(qiáng)的點(diǎn)突變分析能進(jìn)行。使用較長(zhǎng)探針在具有高復(fù)雜性的DNA樣品中能提供更高的靈敏度，和更高的總雜交效率。
電子學(xué)雜交技術(shù)能被用于進(jìn)行原位雜交。原位代表一個(gè)基本地不同的雜交形式，不同點(diǎn)在于其中目標(biāo)DNA(or RNA)不從細(xì)胞中移走，而直接在細(xì)胞內(nèi)被識(shí)別。原位雜交方法一般是復(fù)雜和耗時(shí)的，識(shí)別短的目標(biāo)序列(即，單點(diǎn)突變)幾乎是不可能的。電子學(xué)控制原位雜交能在APEX裝置上進(jìn)行，該裝置直接地在裝置活性表面上吸附和處理細(xì)胞(見(jiàn)實(shí)例14有關(guān)樣品制備技術(shù))。然而，而不是從細(xì)胞中提取出DNA，這APEX裝置直接地在細(xì)胞內(nèi)電子學(xué)地雜交報(bào)告探針到DNA上。電子學(xué)嚴(yán)格控制被用于通過(guò)消除大量非特異性結(jié)合和促進(jìn)總雜交外效率增加選擇性和靈敏度。
對(duì)雜交提供電子學(xué)嚴(yán)格控制的能力也提供新的機(jī)理用于識(shí)別DNA雜交而不使用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記過(guò)的DNA探針。這提供了一種方法進(jìn)行更直接識(shí)別雜交過(guò)程它本身。一個(gè)熒光染料識(shí)別過(guò)程在圖12中圖解并在實(shí)例4和6中描述。直接識(shí)別DNA雜交子能通過(guò)使用DNA結(jié)合染料例如溴化乙錠獲得。這染料結(jié)合到雙鏈的和單鏈的DNA上但對(duì)前者親和性更大。在圖12(B)帶正電荷的染料(122)能轉(zhuǎn)移到負(fù)電偏壓的微場(chǎng)所上。染料結(jié)合到雜交的(120)和未雜交的(121)DNA序列上(圖12(C))。通過(guò)偏壓微場(chǎng)所帶正電和在一定時(shí)間內(nèi)輸送一定量的電力，結(jié)合在未雜交的微場(chǎng)所上的染料分子被選擇性地移走。一個(gè)合適量的電勢(shì)能被使用只要不相反地影響DNA雜交子。雜交子的DNA與結(jié)合的染料分子然后能使用聯(lián)合的或結(jié)合的光學(xué)系統(tǒng)熒光地識(shí)別出來(lái)。
如下重申本發(fā)明的裝置為核酸雜交反應(yīng)和分析提供的重要優(yōu)點(diǎn)(1)迅速轉(zhuǎn)移稀釋的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列到將發(fā)生雜交的特定的微場(chǎng)所上。這一過(guò)程能在5到120秒的時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生。
(2)在將發(fā)生雜交的特定的微場(chǎng)所濃縮稀釋的目標(biāo)DNA和/或探針DNA序列。濃縮效果能大大超過(guò)一百萬(wàn)倍(＞106)。
(3)從已發(fā)生雜交的特定的微場(chǎng)所迅速轉(zhuǎn)移非特異性結(jié)合的目標(biāo)DNA序列。這一過(guò)程能在5到120秒的時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生。
(4)從已發(fā)生雜交的特定的微場(chǎng)所迅速轉(zhuǎn)移競(jìng)爭(zhēng)的互補(bǔ)目標(biāo)DNA序列。這一過(guò)程能在5到120秒的時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生。
(6)在數(shù)分鐘時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量獨(dú)立雜交反應(yīng)的能力。
(7)在大大低于探針Tm的等溫條件下進(jìn)行雜交過(guò)程的能力，以及最少的外界操作或漂洗步驟。
(8)使用電子學(xué)嚴(yán)格控制(ESS)移走部分雜交的DNA序列。
(9)對(duì)在1000到100,000考貝數(shù)范圍內(nèi)的未擴(kuò)增的基因組目標(biāo)DNA序列進(jìn)行雜交分析的能力。
(10)使用ESC提高單個(gè)堿基錯(cuò)配雜交的分辨率(即，分辨能力)和靈敏度(點(diǎn)突變)。
(11)使用短于(7-mer和更短)長(zhǎng)(22-mer或更大)于那些被用于傳統(tǒng)雜交過(guò)程中者白單點(diǎn)突變探針的能力。
(12)在矩陣雜交中使用ESC提供單個(gè)嚴(yán)格控制。
(13)通過(guò)移去非特異性背景成份而改進(jìn)雜交反應(yīng)的識(shí)別能力。
(14)在固定細(xì)胞上進(jìn)行電子學(xué)原位雜交的能力。
(15)發(fā)展了一種分析方法，它去除了需要使用共價(jià)地標(biāo)記的報(bào)告探針或目標(biāo)DNA來(lái)識(shí)別雜交。
III(b)裝置的重復(fù)生產(chǎn)除了用特異的結(jié)合實(shí)體分別地尋址單個(gè)裝置外，也可能生產(chǎn)一種主控裝置，它能夠?yàn)槠渌b置復(fù)制特異的結(jié)合實(shí)體。這代表另一種生產(chǎn)或制造裝置的方法。復(fù)制裝置的過(guò)程圖解在圖13。一個(gè)含有已被特異的結(jié)合序列尋址的微場(chǎng)所的主控裝置與期望的互補(bǔ)DNA序列(130)雜交。這些互補(bǔ)序列被活化因此能夠共價(jià)地結(jié)合到粘附層的微場(chǎng)所上。
一個(gè)含有粘附層的未被尋址的姐妹裝置(132)與已雜交的主控裝置排成一線(圖13(B))。主控裝置的微場(chǎng)所被偏壓成負(fù)而姐妹裝置的微場(chǎng)所被偏壓成正。DNA雜交子被電子學(xué)地變性和被轉(zhuǎn)移到姐妹裝置上，在那兒被活化的DNA序列共價(jià)結(jié)合到微場(chǎng)所上(圖13(C))。這過(guò)程能以平行的或連續(xù)的方式進(jìn)行，這取決于裝置的表面結(jié)構(gòu)以便在微場(chǎng)所間的交叉結(jié)構(gòu)減少到最低。雜交子能通過(guò)使用一個(gè)足夠的負(fù)電勢(shì)或通過(guò)使用帶正電荷的離液劑或變性劑被變性。
III(c)元件裝置和集成的APEX系統(tǒng)大量分離的APEX裝置或芯片能被組合形成一個(gè)集成的APEX系統(tǒng)。因?yàn)锳PEX型裝置能進(jìn)行許多不同的功能，和反應(yīng)物能在裝置間借助自由場(chǎng)電泳被移動(dòng)，集成的系統(tǒng)能發(fā)展起來(lái)。例如，分離的APEX裝置或芯片具有(1)選擇性地結(jié)合和裂解細(xì)胞，(2)電子學(xué)地分配試劑，(3)進(jìn)行前期雜交，(4)用作廢棄處理單元，(5)為DNA片段提供貯存，和(6)進(jìn)行雜交分析可被組合形成一個(gè)樣品制備和雜交分析系統(tǒng)(見(jiàn)實(shí)例14和圖19)。這些集合的APEX微電子學(xué)系統(tǒng)是完善臨床分析儀或可編程的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的相等物(即，芯片上的實(shí)驗(yàn)室)。然而，它們超過(guò)了自動(dòng)化(機(jī)器人)或其它微分析裝置，因?yàn)樗鼈冃枰钌倭康纳淞骰蛭锢韺W(xué)操作樣品。試劑，和反應(yīng)物。另外集成的APEX系統(tǒng)類型將包括，但局限于那些能進(jìn)行原位雜交，細(xì)胞選擇和處理系統(tǒng)，和免疫診斷分析儀。
III(d)識(shí)別系統(tǒng)和報(bào)告基團(tuán)在結(jié)合反應(yīng)包括熒光標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)情況下，這是可能的即應(yīng)用落射熒光式顯微鏡識(shí)別系統(tǒng)在APEX裝置上分析結(jié)合反應(yīng)。該系統(tǒng)的總靈敏度取決于聯(lián)合的識(shí)別元件(冷卻充電耦合裝置(CCD)，增強(qiáng)充電耦合裝置(ICCD)，微通道平板識(shí)別器，或光子記數(shù)光電倍增管(PMT)系統(tǒng))。此外，靈敏的CCD芯片識(shí)別儀或雪崩光電二極管(APD)識(shí)別儀能被更直接地與APEX裝置聯(lián)合。這些系統(tǒng)能在一定程度上減少?gòu)?fù)雜的光學(xué)裝置的需求性。更先進(jìn)的系統(tǒng)將包括集成光電子或電子識(shí)別元件進(jìn)入APEX芯片。用這些系統(tǒng)進(jìn)行光學(xué)的和直接電子學(xué)的DNA識(shí)別是可能的。這一點(diǎn)是本發(fā)明期望的即最先進(jìn)的系統(tǒng)將最終包括夾心一個(gè)微電子識(shí)別儀和板上控制儀元件到基礎(chǔ)APEX芯片元件。電子學(xué)的和光學(xué)的(波導(dǎo))連接將被制成直接穿過(guò)APEX元件的底部。這個(gè)策略解決了有關(guān)制造技術(shù)，材料兼容性，和用于制造可處理的APEX元件的有效性成本的一系列問(wèn)題。
除了各種熒光染料和報(bào)告基團(tuán)能用于標(biāo)記DNA探針，目標(biāo)DNA，或抗體以外；其它類型的標(biāo)記或報(bào)告基團(tuán)也可被使用。這些包括化學(xué)發(fā)生標(biāo)記，非線性光學(xué)(頻率倍頻器)材料，生物素/親和素復(fù)合物和各種酶類。
III(e)組合的生物高分子合成本發(fā)明的裝置也能進(jìn)行組合的合成生物高分子例如寡聚核苷酸和多肽。這種過(guò)程允許自我引導(dǎo)的合成進(jìn)行無(wú)需任何外界引導(dǎo)、影響、或機(jī)械移動(dòng)。組合的合成的其它方法需要物理的遮蔽和復(fù)雜的光平版印刷過(guò)程，微機(jī)械自動(dòng)移樣系統(tǒng)用于試劑輸送，或復(fù)雜的元件的物理移動(dòng)以便在顯微場(chǎng)所進(jìn)行實(shí)際的合成。本發(fā)明描述的組合合成允許極大量的序列能在一個(gè)裝置上合成。組合合成的基本概念包含使用自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移到輸送器上，濃縮，和反應(yīng)單體連接試劑，或去封閉試劑在裝置的特異的可尋址的微場(chǎng)所上。利用裝置的固有能力去電子學(xué)地保護(hù)其它微場(chǎng)所避免附近試劑和反應(yīng)物的影響的概念。對(duì)此概念也重要的是鑒別在這些化學(xué)合成過(guò)程中選擇的步驟，在化學(xué)合成過(guò)程中一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)物具有一個(gè)凈正電或負(fù)電，或構(gòu)建用于這些過(guò)程的合適試劑。
組合的寡聚核苷酸合成的一種方法圖解在圖14。這方法開(kāi)始于一系列選擇性的可尋址的微場(chǎng)所(140)，其表面已被用封閉的伯胺(X-NH-)基團(tuán)(142)衍生過(guò)。這方法的起始步驟包含使用一種帶電的去封閉試劑(144)選擇性的去除一些微場(chǎng)所的封閉。在這種情況下，試劑必須帶正(+)電荷。這過(guò)程進(jìn)行通過(guò)使那些被去封閉的微場(chǎng)所帶負(fù)電勢(shì)，而那些仍被保護(hù)的微場(chǎng)所帶正電勢(shì)(圖14(B))。應(yīng)用正和負(fù)電勢(shì)到選擇的電極上引起帶電的試劑從一個(gè)試劑輸送位點(diǎn)移動(dòng)和在所期望的被去封閉的微場(chǎng)所濃縮，同時(shí)從其它微場(chǎng)所上清除試劑。
在第二步，第一個(gè)堿基，在這例子是胞嘧啶，化學(xué)連接到去封閉的微場(chǎng)所上是通過(guò)簡(jiǎn)單地暴露這系統(tǒng)于氨基磷酸酯試劑(X-C)(146)上而進(jìn)行的。該(C)核苷酸連接到去封閉的微場(chǎng)所表面，而不是任何封閉的電極表面(圖14(C)和(D))。在這點(diǎn)正常的磷酰胺化學(xué)是進(jìn)行著直到下一個(gè)去封閉步驟。
在第二個(gè)去封閉步驟(圖14(D))，那些準(zhǔn)備連接下一個(gè)堿基的電極位置被賦予負(fù)電，而那些保留被保護(hù)的被賦予正電。該系統(tǒng)現(xiàn)在接觸將被連接的下一個(gè)堿基，在這種情況下為(X-A)(148)、并獲得選擇的連接到去封閉的微場(chǎng)所上(圖14(E)和(F))。這連接和去封閉步驟交替重復(fù)，直到所有不同DNA序列在每一個(gè)可尋址的微場(chǎng)所表面合成完。
上述的實(shí)例代表了一種用于核酸的合成可能的方法。另一種方法包含一個(gè)完全水溶DNA合成。在這種情況下，帶電的水溶連接試劑，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDCA)，用于與水溶核苷酸衍生物進(jìn)行寡聚核苷酸的合成。這種方法比現(xiàn)在基于有機(jī)溶劑的方法應(yīng)有極大的優(yōu)越性，基于有機(jī)溶劑的方法需要廣泛地封閉堿基分子。水溶合成應(yīng)是低花費(fèi)的和取消了使用多個(gè)用于當(dāng)今基于有機(jī)溶劑的方法中的毒性的物質(zhì)。第三種方法，另一種水溶合成，包括應(yīng)用帶電的單體和酶類。
III(e)(1)用末端轉(zhuǎn)移酶的寡聚核苷酸合成本方法用于組合合成寡聚核苷酸包含使用核酸聚合酶。這方法應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶，5′-脫氧核糖核苷酸三磷酸的3′-單磷酸酯，和一種磷酸化酶。末端轉(zhuǎn)移酶被用于連接核苷酸。這3′-磷酸酯作為一種封閉基團(tuán)以防止在每一連接步驟中加上多于一個(gè)核苷酸。3′-磷酸化酶被用來(lái)去除3′-磷酸酯以供下一步的連接。
因?yàn)樗性噭┦撬芎蛶щ姷?，一般APEX技術(shù)能被用于這種組合合成過(guò)程的所有步驟。在這種方法中，一個(gè)APEX矩陣被使用，這矩陣具有A、T、G和C核苷酸通過(guò)它們的5′-羥基位點(diǎn)連接在裝置上合適數(shù)量的尋址的微場(chǎng)所上。用標(biāo)準(zhǔn)APEX尋址的技術(shù)連接最先的核苷酸。
連接反應(yīng)的第一個(gè)周期的開(kāi)始是通過(guò)偏壓正電所有那些在它們第二位點(diǎn)能夠連接一個(gè)A核苷酸的微場(chǎng)所，和偏壓負(fù)電含有末端轉(zhuǎn)移酶和脫氧腺苷三磷酸的3′-磷酸酯的二個(gè)電子學(xué)的試劑分配單元進(jìn)行的。試劑是被自由場(chǎng)電泳到合適的微場(chǎng)所和這A核苷酸通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶連接到矩陣上第一個(gè)核苷酸上。因?yàn)楹塑账崛姿崾窃谒鼈兊?′位與一個(gè)磷酸基團(tuán)酯化而成，末端轉(zhuǎn)移酶每一次僅增加一個(gè)核苷酸。
在核苷酸連接完成后，微場(chǎng)所被偏壓負(fù)電和廢棄處理系統(tǒng)偏壓正電以及酶和使用過(guò)的試劑被移走。這過(guò)程為第一個(gè)周期連接G、C和T核苷酸重復(fù)直到所有的微場(chǎng)所被連接上。
當(dāng)?shù)谝粋€(gè)整周期連接(A、T、G和C)過(guò)程完成所有的微場(chǎng)所被偏壓正電而試劑分配器與3′-磷酸化酶被偏壓負(fù)電。這3′-磷酸化酶被自由場(chǎng)電泳到微場(chǎng)所上并水解3′-磷酸酯。移去磷酸酯露出3′-羥基團(tuán)準(zhǔn)備為連接反應(yīng)的下一步周期。連接反應(yīng)被進(jìn)行直到所期望的寡聚核苷酸序列在APEX裝置上被合成出來(lái)。
除了DNA合成之外，一個(gè)類似方法可發(fā)展起來(lái)用于RNA的合成，多肽的合成，和其它復(fù)雜高分子的合成。
III(f)電子學(xué)地控制的分子生物學(xué)和擴(kuò)增反應(yīng)包括線性和指數(shù)的倍增或擴(kuò)增目標(biāo)DNA和RNA分子的各種分子生物學(xué)反應(yīng)能用APEX微電子學(xué)的裝置和芯片進(jìn)行。
限制性酶切反應(yīng)和DNA片段分析可在完全電子學(xué)的控制下進(jìn)行。用APEX裝置進(jìn)行核酸倍增或擴(kuò)增反應(yīng)是本質(zhì)不同于其它“DNA芯片”裝置它們是基本地被動(dòng)的微矩陣基質(zhì)用于傳統(tǒng)的擴(kuò)增過(guò)程(PCR，LCR等等)。用于擴(kuò)增的新機(jī)理直接來(lái)自于APEX裝置的主動(dòng)特性。主動(dòng)的裝置提供唯一的電子學(xué)的機(jī)理去；(1)在等溫反應(yīng)條件和大大低于它們Tm點(diǎn)(解鏈溫度)下選擇性地變性DNA雜交子(2)在二個(gè)或多個(gè)微場(chǎng)所間迅速地向后和向前轉(zhuǎn)移或移動(dòng)DNA和(3)在裝置任何期望的微場(chǎng)所上選擇性地濃縮DNA修飾酶，例如，但不局限于，限制性內(nèi)切酶，DNA或RNA聚合酶，和連接酶。在APEX裝置上能進(jìn)行的電子學(xué)控制的分子生物學(xué)和擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)例包括(1)電子學(xué)地引導(dǎo)限制性酶切ds-DNA序列；(2)通過(guò)DNA聚合酶電子學(xué)的倍增目標(biāo)DNA；(3)通過(guò)DNA和RNA連接酶電子學(xué)的連接和倍增目標(biāo)DNA序列，和(4)通過(guò)RNA聚合酶電子學(xué)的倍增目標(biāo)DNA。
III(g)電子學(xué)的限制性片段分析除了進(jìn)行限制性酶切ds-DNA外，APEX裝置和電子學(xué)技術(shù)能被用于分析和測(cè)定DNA片段的相對(duì)大小。這是可能的當(dāng)不同長(zhǎng)度的DNA片段能被雜交到在單個(gè)微場(chǎng)所上一個(gè)共同捕獲的序列上時(shí)。或者當(dāng)DNA長(zhǎng)度的DNA片段能被雜交到不同的捕獲序列上，而這些序列具有相同的雜交或結(jié)合能量的時(shí)候。在這些情況下，電子學(xué)的嚴(yán)格控制能被用來(lái)選擇性地使不同的DNA片段按照它們未-雜交或突出端序列的長(zhǎng)度去-雜交。具有較長(zhǎng)突出序列的片段上的電泳力使它們?cè)诰哂休^短的突出序列前被去雜交。因此，如果片段被標(biāo)記用于識(shí)別，和尋址到特定的微場(chǎng)所，它們的大小可被測(cè)定，通過(guò)電泳的電勢(shì)或電力水平需要來(lái)從這些微場(chǎng)所上去-雜交這些片段。這也是可能的去進(jìn)行電子學(xué)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的同等分析。
現(xiàn)在通過(guò)參考如下關(guān)于制造和應(yīng)用APEX裝置的無(wú)-限制性實(shí)施例本發(fā)明將被更詳細(xì)地描述。
在如下實(shí)施例中緩沖液、溶液和培養(yǎng)基的配方在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989.中被描述。
IV.實(shí)施例實(shí)施例1寡聚核苷酸的合成和修飾合成的DNA探針的制造是應(yīng)用常規(guī)的氨基磷酸酯化學(xué)在AppliedBiosystems自動(dòng)DNA合成儀上進(jìn)行。寡聚體被設(shè)計(jì)成含有5′-氨基或3′-核糖核苷末端。5′功能團(tuán)是通過(guò)使用ABI氨基連接2號(hào)試劑被結(jié)合入而3′功能團(tuán)是通過(guò)從RNA CPG載體上起始合成而引入。3′-核糖核苷酸末端通過(guò)高碘酸氧化方法能被轉(zhuǎn)化成一個(gè)二醛末端，它能與伯胺反應(yīng)形成席夫堿。
反應(yīng)條件如下在水中溶解20～30 O.D寡聚體達(dá)終濃度10D/μl。加入1體積0.1M醋酸鈉，pH5.2和1體積0.45M高碘酸鈉(在水中新配制)。攪拌保持反應(yīng)至少2小時(shí)在周圍溫度中，在黑暗中。把反應(yīng)混合液加樣到Sephadex G-10柱上(巴氏吸管，0.6×5.5cm)，柱子平衡用0.1M磷酸鈉，pH7.4緩沖液。收集200μl級(jí)分，將2μl等分試樣在薄層層析(TLC)上點(diǎn)樣并收集紫外(UV)吸收級(jí)分。
如下的寡聚體含有3′-核糖核苷末端(U)ET-12R 5′-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCUCP-1 5′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAUAT-A1 5′-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GAC TGC CTG UAT-A2 5′-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GUAT-A3 5′-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CUAT-A4 5′-GTC TCC TTC CTC TCC AGUAT-A5 5′-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GUAT-A6 5′-CTG GAG AAG AAG GAG ACUAT-A7 5′-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC UAT-A8 5′-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TUAT-A9 5′-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CUAT-A10 5′-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU
含有5′-胺基團(tuán)的寡聚體一般地與熒光團(tuán)反應(yīng)，例如Texas紅(TR，激發(fā)590nm，發(fā)射610nm)?；酋Ｂ仁欠浅；顫姷膶?duì)伯胺形成一個(gè)穩(wěn)定的氨磺酰鏈。
德克薩斯紅-DNA結(jié)合物形成過(guò)程如下德克薩斯紅磺酰氯(分子探針)被溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中達(dá)最終濃度為50mg/ml(80mM)。寡聚體溶解在0.4M碳酸氫鈉，pH9.0-9.1中達(dá)最終濃度為10.D./μl(對(duì)21-mer為5.4mM)。在一個(gè)微試管中，混合10μl寡聚體和20μl Te克薩斯紅。在黑暗中讓反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。用氨或羥胺中止反應(yīng)，凍干樣品并用PAGE純化(Sambrook et al.，1989，supra)。
如下的寡聚體含有5′-氨基末端ET-21A 5′-氨基-TGC GAG CTG CAG TCA GAC ATET-10AL 5′-氨基-GAG AGA CTC ATG AGC AGGET-11AL 5′-氨基-CCT GCT CAT GAG TCT CTCT-2 5′-氨基-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TRC-A1 5′-氨基-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGG TCC ACGTAGRC-A2 5′-氨基-CTC CAA ATT TGC TGA ACT CRC-A3 5′-氨基-GGA GAT GAG GAG TTC TAC GRC-A4 5′-氨基-CTG GAG AGG AAG GAG ACRC-A5 5′-氨基-CCA CGT AGA ACT GCT CAT CRC-A6 5′-氨基-GTC TCC TTC TTC TCC AGRC-A7 5′-氨基-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAARC-A8 5′-氨基-ATC TTC TAA ATC TGC GGA ARC-A9 5′-氨基-GTC TGA GAA CAG GCA AAC ARC-A10 5′-氨基-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G實(shí)施例2在一個(gè)微制造的試驗(yàn)裝置上的電子學(xué)地可尋址的微場(chǎng)所-聚賴氨酸方法微場(chǎng)所從微毛細(xì)管(0.2mm×5mm)制造。這微毛細(xì)管充滿18-26％聚丙烯酰胺含有0.1-1.0％聚賴氨酸讓其聚合。多余的毛細(xì)管被劃痕和去除防止在管中陷入的空氣泡以及使管的長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化。毛細(xì)管以它們共使用一個(gè)上緩沖液貯槽而具有單個(gè)低緩沖液貯槽的形式被安放。每一個(gè)低緩沖液貯槽含有一個(gè)鉑線電極。
在上貯槽中的微毛細(xì)管的頂表面被認(rèn)為是可尋址的微場(chǎng)所。這上和下貯槽被充滿0.1M磷酸鈉，pH7.4緩沖液并先電泳10分鐘在0.05mA電流使用BioRad 500/1000電源。大約2μl(0.1 O.D.)的高碘酸氧化的ET-12R捕獲序列被加入進(jìn)上貯槽將電源加上并在恒電流下電泳2-5分鐘。這ET-12R捕獲序列變成濃縮的和很快地共價(jià)結(jié)合到微場(chǎng)所表面的伯胺基團(tuán)上。極性隨后被反轉(zhuǎn)使得測(cè)試毛細(xì)管現(xiàn)在被偏壓負(fù)壓并電泳另外2-5分鐘。任何保留的未結(jié)合DNA序列被排斥而共價(jià)結(jié)合DNA保留在微場(chǎng)所。
上面緩沖液貯槽被吸出液體并用緩沖液沖洗。儀器被拆卸并且一個(gè)新參考試驗(yàn)裝置被安放。貯槽被重新充滿和熒光地標(biāo)記的完全DNA序列被加入，即，ET-10AL-TR。寡聚體在0.05mA恒流下被電泳地濃縮在正電荷偏壓的試驗(yàn)微場(chǎng)所達(dá)2-5分鐘。極性被反轉(zhuǎn)并且未結(jié)合的被完全移走。試驗(yàn)裝置被移走并用落射熒光顯微鏡檢查。一個(gè)為了非-特異性結(jié)合的陰性對(duì)照被如同上述用一個(gè)非-互補(bǔ)的DNA序列ET-21A-TR代替ET-10AL-TR進(jìn)行。
毛細(xì)管微場(chǎng)所表面的交叉部分用與Hamamatsu ICCD照像成像系統(tǒng)相配合的Jena落射熒光顯微鏡檢測(cè)。熒光分析結(jié)果表明互補(bǔ)ET-10AL-TR序列雜交到結(jié)合實(shí)體/捕獲序列和保持雜交狀態(tài)，甚至當(dāng)電勢(shì)被偏壓成負(fù)電時(shí)。ET-21A-TR非-受體序列當(dāng)電勢(shì)被反轉(zhuǎn)時(shí)不保持在試驗(yàn)裝置表面。
實(shí)施例3在微機(jī)械制造的試驗(yàn)裝置上的電子學(xué)地可尋址的微場(chǎng)所-丙烯酸琥珀酰亞胺法本實(shí)施例描述另一種共價(jià)結(jié)合寡聚核苷酸5′-末端的粘附化學(xué)。毛細(xì)管的制備除了1％丙烯酸琥珀酰亞胺(分子探針)代替聚賴氨酸外同上述。毛細(xì)管新鮮制備因?yàn)橛糜谂c伯胺基團(tuán)反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯是相對(duì)不穩(wěn)定的，尤其在pH8.0以上。毛細(xì)管的安放同上，貯槽充滿0.1M磷酸鈉，pH7.4。毛細(xì)管在0.05mA下預(yù)先電泳10分鐘。大約2μl ET-10AL(0.1 O.D.)并含有5′-氨基末端的樣品在電源接通下加入到上貯槽并電泳式移動(dòng)進(jìn)行2-5分鐘。極性被反轉(zhuǎn)以便試驗(yàn)裝置被偏壓成負(fù)電并電泳繼續(xù)2-5分鐘。未結(jié)合的DNA被排斥，然而共價(jià)結(jié)合的DNA保留在微場(chǎng)所。
上緩沖液貯槽被吸出液體并用緩沖液沖洗。參考試驗(yàn)裝置被取出而一個(gè)新的參考裝置被裝入。這貯槽重新充滿并加入熒光標(biāo)記的互補(bǔ)寡聚體ET-11AL-TR并電泳如同上。為非-特異結(jié)合的陰性對(duì)照被同上一樣實(shí)施，用一個(gè)非-互補(bǔ)DNA序列ET-21A-TR代替ET-11AL-TR。
每一個(gè)試驗(yàn)裝置的熒光分析表明互補(bǔ)ET-11AL-TR雜交到捕獲序列(ET-10AL)上，并保留雜交的甚至當(dāng)電勢(shì)變換成負(fù)的。非-互補(bǔ)的序列，ET-21A-TR，當(dāng)電勢(shì)被反轉(zhuǎn)時(shí)不被保留在微場(chǎng)所上。
實(shí)施例4電子學(xué)地控制的熒光DNA/染料識(shí)別方法有些染料例如溴化乙錠(EB)當(dāng)結(jié)合(嵌入)到雙-鏈DNA中時(shí)成為高度熒光的。然而當(dāng)結(jié)合入雙-鏈DNA時(shí)熒光和結(jié)合親和力較大，這染料對(duì)單-鏈DNA也有一定程度的親和力當(dāng)結(jié)合時(shí)產(chǎn)生低水平的熒光。如下的實(shí)施例表明一個(gè)電子學(xué)控制的DNA/染料識(shí)別方法怎樣能被產(chǎn)生出來(lái)。
微毛細(xì)管試驗(yàn)裝置的制備和雜交同實(shí)施例2和3中描述一樣。溴化乙錠(EB)加入到緩沖液中(～0.05mM EB終濃度)這試驗(yàn)裝置被偏壓成負(fù)以在雜交的和未雜交微場(chǎng)所上濃縮EB(帶正電荷)。試驗(yàn)裝置通過(guò)落射熒光顯微鏡在550nm激發(fā)和600nm發(fā)射處被觀察。雜交的和未雜交的微場(chǎng)所都從濃縮的EB上顯示強(qiáng)烈紅色熒光。
試驗(yàn)裝置被重新裝入并偏壓正恒電流在0.05mA達(dá)0.03伏一小時(shí)，去選擇性地移走EB。未雜交微場(chǎng)所的熒光減弱然而雜交的微場(chǎng)所保持非常高水平的EB熒光。這結(jié)果如下捕獲 目標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)ET-10AL ET-11AL(+)＞200ET-10AL ET-21A(-) 1熒光信號(hào)是應(yīng)用ICCD成像照像系統(tǒng)測(cè)定的并代表熒光密度峰。如果整個(gè)熒光信號(hào)區(qū)被積分的話信噪比應(yīng)大于1000倍。這示范了一種使用嵌入染料用于增加信噪比和DNA測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍的方法。
實(shí)施例5在金屬基質(zhì)上電子學(xué)可尋址場(chǎng)所鋁(Al)和金(AU)線(0.25mm Aldrich)與溶于甲苯中的10％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)反應(yīng)。APS試劑容易與金屬表面的氧化物和/或羥基團(tuán)反應(yīng)形成在氧化物和/或羥基團(tuán)與伯胺基團(tuán)間的共價(jià)鍵。無(wú)需對(duì)鋁任何前期處理。金線在5×SSC溶液中電解以形成氧化層?；蛘呓饘倬€能通過(guò)高氯酸浴被氧化。
APS反應(yīng)的實(shí)施如下線被切割成3英寸放入玻璃皿中。加入甲苯完全浸沒(méi)線并在一加熱板上加溫到50～60℃，加入APS到終濃度10％?；旌先芤豪^續(xù)反應(yīng)達(dá)30分鐘。用大量甲苯?jīng)_洗3次，然后用大量乙醇沖洗3次并在50℃烘箱中干燥。
APS處理過(guò)的線能與一種醛反應(yīng)形成席夫堿。結(jié)合實(shí)體ET-12R被高碘酸氧化如同在說(shuō)明書(shū)中其它地方描述的一樣。電極被放入含有去空氣水的貯槽中。加上電源在0.05mA恒流下保持約30秒。迅速加入活化了的ET-12R。加上電源，液體被抽吸掉，加入新鮮水隨后再被抽吸掉。試驗(yàn)(偏壓成正)和參考電極被放入含有熒光標(biāo)記的互補(bǔ)DNA，ET-10-TR的雜交緩沖液(HB，5×SSC，0.1％SDS)中。經(jīng)過(guò)2分鐘電極用漂洗緩沖液(1×SSC，0.1％SDS)漂洗3次每次1分鐘并用熒光法(激發(fā)590nm，發(fā)射610nm)來(lái)觀察。
結(jié)果表明ET-12R被特異性地結(jié)合到處理過(guò)的金屬表面上。試驗(yàn)電極是熒光的然而參考電極不是。非-特異性吸附DNA到金屬上被在雜交緩沖液中含有的SDS抑制。粘附到金基質(zhì)上通過(guò)電解和隨后的APS處理是有效的。得到的信號(hào)比由非-氧化的金觀察的信號(hào)有意義地強(qiáng)。更重要地，這實(shí)例表明金屬表明能被化學(xué)地活化和與結(jié)合實(shí)體衍生而不成為與溶液是絕緣的。這APS方法代表多個(gè)可用的形成DNA-金屬結(jié)合物的化學(xué)方法中的種。
實(shí)例6電子學(xué)控制的熒光染料識(shí)別方法-金屬線DNA鋁電極基質(zhì)的制備和雜交如例5中描述的。一個(gè)雜交的和一個(gè)未雜交的DNA-AL電極被用一根未衍生過(guò)的鋁線加工作為參考物。在溶液中加入溴化乙錠(EB)試驗(yàn)的DNA電極被偏壓成負(fù)以吸引染料。這溶液被抽吸掉并加入新鮮緩沖液。金屬表面在顯微鏡下檢查。
重新安裝裝置加上一個(gè)正電勢(shì)達(dá)一定量伏特一小時(shí)。緩沖液被抽吸掉，電極用落射熒光來(lái)觀察。這過(guò)程重復(fù)直到在雜交的和未雜交的金屬表面之間的熒光出現(xiàn)顯著的區(qū)別。
捕獲 目標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)化的信號(hào)ET-12R ET-10AL(+) ＞140ET-12R (-) 1未雜交金屬表面的熒光減弱而雜交的金屬表面保持熒光。熒光信號(hào)是用ICCD照像成像系統(tǒng)測(cè)定的其代表熒光密度峰如果整個(gè)熒光信號(hào)區(qū)被積分的話信噪比將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1000倍。這實(shí)施例表明一種用于增加信噪比和如此測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍的方法。應(yīng)用毛細(xì)管凝膠構(gòu)型獲得了類似的結(jié)果，表明電化學(xué)影響不在重大程度上影響測(cè)定的實(shí)施。
實(shí)施例7有功能的可編程電子學(xué)矩陣(APEX)——微機(jī)械制造6個(gè)可尋址的250μm毛細(xì)管場(chǎng)所的一個(gè)放射狀列陣是從塑料基質(zhì)材料微加工成的。該裝置具有一共同的上貯槽和分離的下貯槽以便每一個(gè)微場(chǎng)所是單個(gè)可尋址的。一個(gè)唯一的寡聚體序列結(jié)合實(shí)體被定位和結(jié)合到用以前描述的方法從高度交叉連接的聚丙烯酰胺制得的特異微場(chǎng)所上。試驗(yàn)微場(chǎng)所具有一正電勢(shì)而其它微場(chǎng)所具有負(fù)電勢(shì)以防止非-特異性相互作用。
列陣被漂洗然后與一個(gè)互補(bǔ)熒光標(biāo)記的DNA探針雜交。列陣被漂洗移走多余探針然后在落射熒光顯微鏡下觀察。只有特異性地尋址的微場(chǎng)所是熒光的。這過(guò)程在另一場(chǎng)所用另一結(jié)合實(shí)體重復(fù)進(jìn)行并用一個(gè)標(biāo)記了另外一個(gè)熒光團(tuán)的探針雜交以便證實(shí)。
DNA序列被特異地定位于預(yù)定的位置，與其它場(chǎng)所間的交叉可忽視。這使得制造在預(yù)定位置帶有幾個(gè)到數(shù)百個(gè)獨(dú)特的序列的微矩陣成為可能。
為了挑選合適的低熒光背景的塑料基質(zhì)，不同的塑料基質(zhì)被測(cè)試在600nm處的熒光特性。塑料用落射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)和熒光儀進(jìn)行測(cè)試。下表提供基質(zhì)目錄和用LS50B熒光儀測(cè)得的熒光讀數(shù)
實(shí)驗(yàn)表明黑色丙烯，ABS，和聚碳酸酯具有最低的熒光本底水平。實(shí)例8有功能的，可編程的電子學(xué)矩陣(APEX)——微平版印刷制造一個(gè)在一硅片上8×8矩陣(64位點(diǎn))的50平方微米的微場(chǎng)所(見(jiàn)圖3)被設(shè)計(jì)出，制造和用一個(gè)開(kāi)關(guān)盒包裝(詳見(jiàn)裝置制造部分)。數(shù)種材料和方法的改進(jìn)，如下描述，被用來(lái)增加APEX DNA芯片裝置的選擇性和有效性。
8a)頂端層的選擇APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)方法包含芯片整個(gè)表面的反應(yīng)。這起始功能化方法的選擇性取決于芯片表面各種材料的相對(duì)反應(yīng)性。為了減少功能化和隨后的DNA結(jié)合到微場(chǎng)所周圍區(qū)域，一種比SiO2或金屬氧化物具有低反應(yīng)性的材料是需要的?？构馕g劑和氮化硅被測(cè)試。不同的頂端層被用于二氧化硅芯片。芯片由落射熒光檢測(cè)然后APS處理接著共價(jià)結(jié)合高碘酸氧化的poly-A RNA序列(Sigma，M100,000)。這芯片與200nM德克薩斯紅標(biāo)記過(guò)的20-mer(T2-TR)在雜交緩沖液中在37℃雜交5分鐘。芯片用漂洗緩沖液漂洗3次并用1×SSC漂洗1次。芯片在590nm激發(fā)和610nm發(fā)射下進(jìn)行熒光檢查。
氮化硅被選中因?yàn)樗c二氧化硅比較具有較少的對(duì)APS的反應(yīng)性同時(shí)并不象所試的抗光蝕劑那樣具固有的熒光性。其它方法例如背景區(qū)域紫外燃燒也是可能的。
8b)APEX物理學(xué)的特性一個(gè)完成的矩陣芯片用探針測(cè)試平臺(tái)(微操作型號(hào)6000)配有B&L顯微鏡和CCD照相機(jī)進(jìn)行光學(xué)的檢查。芯片被測(cè)試在受試墊和外界接觸墊間的連續(xù)性。這測(cè)試是通過(guò)用連接著萬(wàn)用表的操作探測(cè)頭與墊接觸而進(jìn)行的。連續(xù)性保證了墊已被浸蝕到金屬表面。墊然后被檢查在電解環(huán)境中的穩(wěn)定性。金屬線被評(píng)價(jià)承擔(dān)1mA電流在正常干燥條件下。
一滴(1-5μl)緩沖液(1×SSC)被取到8×8矩陣上。表面張力使得液體在一處留下四周接觸的墊區(qū)域干燥。將一個(gè)探測(cè)頭接觸到一個(gè)接觸的墊而另一個(gè)探測(cè)頭與液體接觸。使用HP6625A電源和HP3458A數(shù)字萬(wàn)用表在50V最大電壓下電流遞增地增加到50nA。
最初的制造包含硅基質(zhì)，一個(gè)二氧化硅絕緣層，鋁沉積和模型化，和一個(gè)氮化硅頂端層。
第二個(gè)制造過(guò)程包括在鋁金屬和氮化硅層間的二氧化硅絕緣層。二氧化硅和鋁具有更多的兼容物理學(xué)特性和可形成一個(gè)更好的化學(xué)分界面以便提供一種比由原始制造方法制造的芯片更加穩(wěn)定和堅(jiān)強(qiáng)的芯片。
8c)DNA的結(jié)合一個(gè)8×8矩陣芯片被功能化用如同實(shí)例5中描述的APS試劑。這芯片然后用高碘酸氧化過(guò)的poly-A RNA(Sigma，平均M 100,000)處理。芯片用漂洗緩沖液(WB)漂洗以便移去多余的和未結(jié)合的RNA。這一步用捕獲序列覆蓋了整個(gè)芯片，然而在暴露的金屬表面比在氮化物覆蓋的區(qū)域有更高的密度。芯片用200nM T2-TR在雜交緩沖液(HB)中在37℃雜交5分鐘。然后用WB漂洗3次和用1×SSC漂洗1次，每次1分鐘，在周圍的溫度下。芯片在590nm激發(fā)和610nm發(fā)射下進(jìn)行熒光測(cè)試。
開(kāi)放的金屬區(qū)域是輕微熒光的并有50μm見(jiàn)方墊形狀(微場(chǎng)所)。低熒光密度和/或不規(guī)則的邊緣表示一些墊是不完全地開(kāi)放的。在這些情況下額外的等離子體浸蝕時(shí)間應(yīng)是需要的。
8d)電子學(xué)控制的雜交活性的雜交被實(shí)施通過(guò)使用從實(shí)例8c中的一個(gè)芯片和偏壓一個(gè)特定的微場(chǎng)所為正電。通過(guò)使用也能自動(dòng)地偏壓其余微場(chǎng)所為負(fù)電的開(kāi)關(guān)盒或通過(guò)使用在外界溶液中的一個(gè)電極來(lái)進(jìn)行。3微升緩沖液僅放置在矩陣墊(微場(chǎng)所)上。一個(gè)1～5nA的電流被加上達(dá)數(shù)秒鐘并加0.1皮摩爾的T2-TR到溶液中。液體被移走芯片被干燥然后在激發(fā)光590nm和發(fā)射光610nm下檢測(cè)德克薩斯紅的熒光。只有特定的被偏壓或正的微場(chǎng)所是熒光的。這一實(shí)驗(yàn)被重復(fù)多次，使用APEX芯片上其它特定的微場(chǎng)所。另外，在一個(gè)微場(chǎng)所上熒光的DNA通過(guò)偏壓原始場(chǎng)所負(fù)電和目的微場(chǎng)所正電而被電子學(xué)地去雜交和轉(zhuǎn)移定位到另一個(gè)微場(chǎng)所上。
8e)電子學(xué)控制的尋址和裝置制造8×8 APEX矩陣被用APS功能化如同前述。寡聚核苷酸結(jié)合實(shí)體CP-1被高碘酸氧化法活化。矩陣中4個(gè)微場(chǎng)所被偏壓成正電而其余的被偏壓成負(fù)電。2微升緩沖液放置在矩陣上并加上電流。結(jié)合實(shí)體CP-1被加入并在設(shè)計(jì)的場(chǎng)所濃縮。液體被移走，芯片用緩沖液簡(jiǎn)單沖洗然后2微升緩沖液加在芯片上。電流再次加上達(dá)數(shù)秒鐘并加入0.1皮摩爾的T2-TR。經(jīng)短暫時(shí)間后液體被移走而整個(gè)芯片用WB漂洗3次。干燥芯片并檢查熒光。
結(jié)果表明4個(gè)正電偏壓的微場(chǎng)所都是熒光的。這個(gè)實(shí)施例顯示應(yīng)用特定的結(jié)合實(shí)體的微場(chǎng)所的選擇的尋址，定位和共價(jià)結(jié)合粘附的序列到微場(chǎng)所，和互補(bǔ)的目標(biāo)序列特異性雜交到衍生的微場(chǎng)所上。
8f)基因的模式APEX芯片對(duì)HLA基因dQa多態(tài)性特異的帶有3′-核糖核苷末端的DNA結(jié)合實(shí)體被合成出。結(jié)合實(shí)體通過(guò)高碘酸氧化被活化如上所述。反向補(bǔ)體被合成帶有5′-氨基末端并與熒光團(tuán)，例如德克薩斯紅，羅丹明或Bodipy染料結(jié)合，如上所述。微場(chǎng)所通過(guò)APS處理被功能化帶有伯胺基團(tuán)，如上所述。
數(shù)微升溶液置于8×8矩陣之上。通過(guò)偏壓微場(chǎng)所正電一個(gè)特定的微場(chǎng)所被尋址；高碘酸氧化的DNA寡聚體以～0.1皮摩爾被加入，然后被轉(zhuǎn)移和共價(jià)地結(jié)合到那個(gè)場(chǎng)所上。極性被反轉(zhuǎn)未結(jié)合的結(jié)合實(shí)體分子被移走。在另一個(gè)尋址的微場(chǎng)所對(duì)另一種結(jié)合實(shí)體重復(fù)該過(guò)程直到所有特有的粘附結(jié)合實(shí)體被結(jié)合到芯片上。
然后將該芯片與單個(gè)熒光標(biāo)記互補(bǔ)序列雜交以便確定結(jié)合反應(yīng)的特異性以及立刻觀察所有被尋址的微場(chǎng)所。
在這芯片被電子學(xué)地變性去移走互補(bǔ)的寡聚體(在90℃ 0.05％SDS中10分鐘)的同一芯片上，被尋址的微場(chǎng)所被與未標(biāo)記的目標(biāo)DNA或基因組DNA雜交。識(shí)別是通過(guò)本說(shuō)明書(shū)上面已描述的熒光染料識(shí)別分析。
結(jié)果將表明微場(chǎng)所是用特定的結(jié)合實(shí)體特異性地尋址的。對(duì)負(fù)電偏壓的微場(chǎng)所非特異性的結(jié)合是微不足道的。裝置和聯(lián)合的結(jié)合實(shí)體的化學(xué)組成和性質(zhì)在變性條件下是穩(wěn)定的，因此使得尋址的和制造的裝置可重復(fù)使用。變性雜交子的電子學(xué)方法是增加電流和/或增加電流加上的時(shí)間。
實(shí)施例9電子學(xué)嚴(yán)格限制9A)用15-mer Ras-12探針(測(cè)定)單點(diǎn)突變裝置影響高水平的電子嚴(yán)格控制的能力是用15-mer探針來(lái)測(cè)定Ras-12癌基因型系統(tǒng)來(lái)表明的。在DNA雙螺旋中一單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配在雜交對(duì)中引起僅僅極微量的不穩(wěn)定與配合的雙螺旋相比較。這極微量的不穩(wěn)定引起這錯(cuò)配的雙螺旋在略較低于配合的雙螺旋的Tm下變性。當(dāng)配對(duì)子(配合和錯(cuò)配的)都在配合配對(duì)子最適嚴(yán)格性條件下雜交時(shí)，錯(cuò)配配對(duì)子雜交效率較低。錯(cuò)配的雜交信號(hào)將一定程度的低于配合雜交信號(hào)。用傳統(tǒng)的雜交方法，單點(diǎn)突變分析能用8-mer到21-mer范圍的探針進(jìn)行。10-mer到20-mer范圍的探針最常用。當(dāng)突變特異性探針變成短于8-mers或長(zhǎng)于20-mers時(shí)，可信地區(qū)分配合和錯(cuò)配變得非常地困難。這是因?yàn)樵谂浜虾湾e(cuò)配配對(duì)子之間的雜交信號(hào)上幾乎無(wú)區(qū)別。在點(diǎn)突變分析中應(yīng)用的雜交嚴(yán)格控制的傳統(tǒng)方法依賴于溫度和鹽濃度。我們已發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格控制也能受電泳電勢(shì)的影響。
在Ras-12的實(shí)例中，15-mer點(diǎn)突變特異探針被電子學(xué)地雜交到粘附在試驗(yàn)裝置微場(chǎng)所上30-mer目標(biāo)序列上。微場(chǎng)所上的極性被偏壓成負(fù)，所有雜交子被受到恒電流達(dá)一定時(shí)間，提供使錯(cuò)配變性而不影響完全配合的一定的電力水平。
如下序列被合成并在一套3種試驗(yàn)結(jié)構(gòu)上試驗(yàn)，每一種結(jié)構(gòu)帶有250μm表面微場(chǎng)所。下劃線的/黑體的堿基表明錯(cuò)配位點(diǎn)。
粘附的序列是Ras-G 5′-GGT GGT GGG CGC CGGCGG TGT GGG CAA GAU-3′-微場(chǎng)所Ras-T 5′-GGT GGT GGG CGC CGT CGG TGT GGG CAA GAU-3′-微場(chǎng)所報(bào)告探針序列(用德克薩斯紅標(biāo)記)是
Ras-13′-CC-GCG-GCC-GCC-ACA-C-5′-(TR)Ras-23′-CC-GCG-GCA-GCC-ACA-C-5′-(TR)Ras-33′-CC-GTG-GCA-GCC-ACA-C-5′-(TR)試驗(yàn)裝置如同在前說(shuō)明書(shū)中所述從微毛細(xì)管制成。粘附序列Ras-G和Ras-T被高碘酸氧化并共價(jià)結(jié)合到被尋址的微場(chǎng)所上。
Ras-G微場(chǎng)所然后與Ras-1，Ras-2或Ras-3雜交。Ras-1是完全配合Ras-G。Ras-2是單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A)。Ras-3是二個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A和G-T)。G-A錯(cuò)配對(duì)DNA雙螺旋產(chǎn)生最小的不穩(wěn)定性，因此是最困難與完全配合區(qū)分的。
首先進(jìn)行傳統(tǒng)的雜交并熒光地檢查微場(chǎng)所以便測(cè)定互補(bǔ)序列被雜交到什么程度。試驗(yàn)裝置(微毛細(xì)管)被重新安裝并隨后進(jìn)行電子學(xué)雜交。試驗(yàn)裝置都被受到相同的電子嚴(yán)格性通過(guò)偏壓它們?cè)谪?fù)電勢(shì)(恒電流)上而獲得直到這錯(cuò)配的雜交子被完全移走而不有意義地影響完全配合的雜交子。方法和結(jié)果如下傳統(tǒng)的雜交方法——在40℃在5×SSC中雜交15分鐘——在20℃在1×SSC中漂洗3次每次5分鐘——進(jìn)行熒光分析——觀察完全配合(Ras-G/Ras-1)和單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(Ras-G/Ras-2)的信號(hào)比約10比1電子學(xué)嚴(yán)格控制(ESC)方法——在20℃在5×SSC中雜交5分鐘——“無(wú)漂洗過(guò)程”——應(yīng)用在150伏(V)0.15微安(MA)的電子學(xué)嚴(yán)格性達(dá)4分鐘(20℃)——進(jìn)行熒光分析——觀察完全配合(Ras-G/Ras-1)和單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(Ras-G/Ras-2)的信號(hào)比＞100比1所有實(shí)驗(yàn)的全部結(jié)果被圖示在圖(15)。這些結(jié)果表明這不但可能用電泳電勢(shì)在DNA雜交反應(yīng)中達(dá)到嚴(yán)格控制，而且表明ESC比傳統(tǒng)雜交方法提供較高的雜交效率和更高的分辨率。此外，ESC能被應(yīng)用到每一單個(gè)微場(chǎng)所上，在同一容積溶液中提供獨(dú)立的嚴(yán)格控制。
(9B)應(yīng)用7-mers和22-mer探針進(jìn)行單點(diǎn)突變分析在單點(diǎn)突變分析中經(jīng)常使用的正常大小范圍以外的7-mer和22-mer探針，被制備出來(lái)去進(jìn)一步證明電子學(xué)雜交和ESC的優(yōu)越性。如下列出的點(diǎn)突變特異寡聚體探針能被配對(duì)而導(dǎo)致具有0、1或2個(gè)堿基錯(cuò)配的雜交子。互補(bǔ)寡聚體序列被結(jié)合到微場(chǎng)所上并如同上述一樣雜交。微場(chǎng)所上的極性被反轉(zhuǎn)(偏壓負(fù)電)雜交子受到恒電流達(dá)一指定時(shí)間，提供一個(gè)特定的電力水平以便變性錯(cuò)配而不移走完全配合。
Ras-G或Ras-GA寡聚體(如下所示)被結(jié)合到微場(chǎng)所上用作目標(biāo)序列。如下所示的22-mer和7-mer Ras特異寡聚體的系列被用德克薩斯紅熒光團(tuán)標(biāo)記如同本說(shuō)明書(shū)其它地方描述。“下劃線的和黑體”堿基表示錯(cuò)配和/或潛在的錯(cuò)配位點(diǎn)Ras-G 5′-GGT GGT GGG CGC CGGCGGTGT GGG CAA GAURas-GA 5′-氨基-GGT GGT GGG CGC CGGCGGTGT GGGCAA GARas-22C-TR (TR)-5′-TGC CCA CAC CGCCGG CGC CCA CRas-22A-TR (TR)-5′-TGC CCA CAC CGACGG CGC CCA CRas-TA (TR)-5′-TGC CCA CAC CGACGGTGC CCA C
Ras-7C(TR)-5′-ACACCG CRas-7A(TR)-5′-ACAACG C從微毛細(xì)管制造試驗(yàn)裝置如同本說(shuō)明書(shū)中上面描述的。寡聚體目標(biāo)序列Ras-G或Ras-GA被共價(jià)地合到微場(chǎng)所上。一個(gè)微場(chǎng)所然后與德克薩斯紅標(biāo)記的完全22-mer補(bǔ)體Ras-22C-TR雜交。第二個(gè)微場(chǎng)所與Ras-22A-TR即一個(gè)帶有一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A)的22-mer；或Ras-22-TA即帶有二個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配(G-A和G-T)的22-mer雜交。
如本說(shuō)明書(shū)上面所述，試驗(yàn)裝置被同時(shí)地以雙通道方式電泳即兩個(gè)微場(chǎng)所同時(shí)經(jīng)受相同的電流或電力水平。試驗(yàn)裝置首先用傳統(tǒng)方法雜交并且微場(chǎng)所被熒光檢測(cè)以確定已經(jīng)雜交的互補(bǔ)序列的數(shù)量。然后試驗(yàn)裝置被用于進(jìn)行電子雜交達(dá)一控制時(shí)間在恒定電流下直到錯(cuò)配的雜交子被移走而不有意義地影響完全配合的雜交子。Bio-Rad 1000/500電源裝置被典型地調(diào)到0.02到0.1mA而在恒流下電泳達(dá)0.02到0.04伏特一小時(shí)。裝置被拆開(kāi)并在配有硅增強(qiáng)的CAD照像機(jī)(Hamamatsu)的Jena顯微鏡下進(jìn)行落射熒光觀察。影像用Hamamatsu Argus 10影像處理機(jī)處理并用Sony影視打印機(jī)記錄。當(dāng)額外的電子控制是需要時(shí)毛細(xì)管被再次電泳。
單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的辨別如上所述用7-mers進(jìn)行。然而，鑒于它們較低的Tm，裝置在4-6℃的冷盒中電泳而不是在室溫下運(yùn)行。
結(jié)果表明當(dāng)用7-mers和22-mers時(shí)電子雜交和嚴(yán)格控制可以辨別單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配配合錯(cuò)配的比例是100∶1或更大。這個(gè)信噪比一般是優(yōu)于由任何使用溫度和離子強(qiáng)度控制嚴(yán)格條件的雜交方法報(bào)告的結(jié)果。
電子嚴(yán)格控制能夠從完全配合中區(qū)別一個(gè)堿基G-A錯(cuò)配，即使這G-A錯(cuò)配是最穩(wěn)定的錯(cuò)配因?yàn)镚的亞氨基質(zhì)子能參與和A的氫鍵從而穩(wěn)定雙螺旋。
能量的消耗計(jì)算和測(cè)量表明僅產(chǎn)生極少量溫度變化，這一點(diǎn)證明嚴(yán)格性不是由微場(chǎng)所的溫度變化引起的。微場(chǎng)所是被動(dòng)地雜交如上所述(不受到電子雜交)表明在配合和錯(cuò)配間無(wú)區(qū)別證明擴(kuò)散不是引起區(qū)別的原因。
這些實(shí)例也證實(shí)每個(gè)微場(chǎng)所能有單個(gè)的嚴(yán)格控制，因此克服了大范圍多重雜交技術(shù)其中被限制在單個(gè)共同的嚴(yán)格水平下所面臨的主要障礙。這也是可能的即電子嚴(yán)格能量水平與溫度解鏈(Tm)數(shù)據(jù)相互聯(lián)系而產(chǎn)生預(yù)言的電子解鏈(Em)曲線和方程式。
(9C)在高基因組背景下電子雜交實(shí)例的目標(biāo)DNA序列通常僅占一個(gè)基因組DNA樣品總DNA中非常小的一部分。通過(guò)在APEX裝置一個(gè)非常小的場(chǎng)所上濃縮總DNA，本發(fā)明在存在有過(guò)量異源DNA情況下提高目標(biāo)雜交效率。
在本實(shí)例中，具有5′-氨基的結(jié)合序列被結(jié)合到含有22％PAGE，1％琥珀酰亞胺丙烯酸酯的試驗(yàn)裝置上。毛細(xì)管由ET-23AL或ET-11AL捕獲序列衍生。目標(biāo)探針ET-12R用德克薩斯紅標(biāo)記。ET-12R-TR能分別地與試驗(yàn)序列ET-23AL而不是對(duì)照ET-11AL捕獲序列雜交。
異源基因組DNA，小牛胸腺DNA(CT DNA，Sigma)，被溶解在水中達(dá)終濃度為1mg/ml，超聲和加熱去變性DNA。樣品在含有1010考貝數(shù)的ET-12R-TR目標(biāo)和0、0.1μg、或1.0μg變性的CT DNA的0.5×TBE中制備終體積為100μl。這代表著相對(duì)于目標(biāo)DNA 0、1000或10000倍過(guò)量的CT DNA 。
試驗(yàn)裝置預(yù)電泳5分鐘在0.03mA下0.5×TBE中使用Bio-Rad1000/500電源裝置。裝置被以雙通道方式電泳以便試驗(yàn)和對(duì)照毛細(xì)管能在同一時(shí)間準(zhǔn)確的完全相同條件下電泳。加入樣品(100μl)毛細(xì)管被偏壓成正電勢(shì)而在0.03mA下吸引DNA達(dá)5分鐘。極性被反轉(zhuǎn)并使用相同的電力從試驗(yàn)裝置表面移走所有未雜交的ET-12R-TR目標(biāo)分子。緩沖液被吸掉，試驗(yàn)裝置用配有硅增強(qiáng)CAD照像機(jī)的Jena顯微鏡(Hamamatsu)進(jìn)行落射熒光觀察。影像用Hamamatsu Argus 10影像處理機(jī)處理并用Sony影視打印機(jī)記錄。
在存在和缺少每100μl 0.1μg CT DNA時(shí)沒(méi)有區(qū)別存在于直接雜交信號(hào)和信/噪比。信號(hào)強(qiáng)度是相同的信號(hào)是一致地分布在活性區(qū)域中。
在每100μl 1μg CT DNA的水平，信號(hào)大量地沿著毛細(xì)管周邊分布，提示捕獲序列被封閉或被飽和。這種假象通過(guò)在雜交步驟中擺動(dòng)極性容易被克服。這能脈沖總DNA朝向和離開(kāi)活性區(qū)域，允許目標(biāo)分子更加有效地和一致地雜交。
(9D)與電子控制雜交相對(duì)的被動(dòng)雜交因?yàn)殡娮涌刂齐s交的濃縮效應(yīng)電子控制雜交是更有效和更快于被動(dòng)雜交。
微毛細(xì)管試驗(yàn)裝置由ET-23AL和ET-11AL結(jié)合序列構(gòu)建分別作為試驗(yàn)和對(duì)照裝置。含有1×1010考貝數(shù)ET-12R-TR并有1μg CTDNA總體積為100μl的雜交溶液制備的。
被動(dòng)雜交一套試驗(yàn)和對(duì)照裝置被在50℃放入一個(gè)含有100μl雜交溶液的小試管中雜交15分鐘。樣品然后用1×SSC，0.1％SDS在45℃漂洗3次，每次5分鐘。
電子控制雜交試驗(yàn)裝置被放好并在0.06mA預(yù)電泳5分鐘。吸掉緩沖液加入100μl雜交溶液。試驗(yàn)裝置在0.06mA被偏壓成正達(dá)3分鐘。極性然后被反轉(zhuǎn)30秒，并再次反轉(zhuǎn)以便使試驗(yàn)裝置被再次偏壓成正達(dá)另外3分鐘。試驗(yàn)裝置被偏壓成負(fù)達(dá)3分鐘進(jìn)行電子漂洗。
雜交效率和程度用主動(dòng)形式獲得是有意義地好于用被動(dòng)形式獲得的。在主動(dòng)(電子的)形式中的直接信號(hào)是超過(guò)100倍高于在被動(dòng)形式中的信號(hào)。主動(dòng)形式的信/噪比比被動(dòng)形式的信號(hào)增加了10倍。主動(dòng)雜交測(cè)定可在10分鐘內(nèi)需要極少的人工操作下完成。被動(dòng)雜交形式需要約30分鐘需要大量試管和緩沖液的人工操作。
傳統(tǒng)的雜交方法使用2.5nM探針在3次Cot，達(dá)15分鐘，完成反應(yīng)的90％。在我們實(shí)驗(yàn)中使用濃度為0.17nM探針，被動(dòng)雜交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)正常下需要約4小時(shí)。
主動(dòng)雜交使能夠使用引起較低本底的較低的探針濃度。傳統(tǒng)的方法取決于擴(kuò)散因此必須使用較高探針濃度去推動(dòng)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。主動(dòng)的方法能夠濃縮樣品在一個(gè)非常小的體積內(nèi)從而產(chǎn)生非常高的區(qū)域探針濃度及隨后的非?？斓碾s交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
實(shí)施例10用熒光的DNA納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行雜交正常地，非擴(kuò)增型雜交測(cè)試的總靈敏度是由非特異性結(jié)合產(chǎn)生的本底限制。當(dāng)多倍的報(bào)告基團(tuán)，或多倍報(bào)告基團(tuán)帶有第二種復(fù)合物，被用來(lái)標(biāo)記DNA探針時(shí)這通常是一個(gè)主要問(wèn)題。因此，在報(bào)告標(biāo)記物實(shí)際的或固有的識(shí)別極限被達(dá)到之前測(cè)試的識(shí)別極限通常已達(dá)到。
使用電子控制雜交方法，我們已發(fā)現(xiàn)高度熒光的亞-微米或納米-范圍的顆?？膳c結(jié)合的DNA探針一起被用于超-靈敏的測(cè)試。我們已經(jīng)能夠使用自由場(chǎng)電泳來(lái)控制DNA-探針-熒光納米結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)。由于電子嚴(yán)格控制提供高水平的分辨力從未雜交結(jié)構(gòu)中區(qū)別雜交，DNA探針-熒光納米結(jié)構(gòu)能有意義地提高雜交靈敏度。電子嚴(yán)格控制允許我們應(yīng)用這些高度熒光納米結(jié)構(gòu)或其它多倍標(biāo)記的方案解決低考貝數(shù)(50到1000目標(biāo)分子)識(shí)別，而無(wú)需 擴(kuò)增。到如今，用傳統(tǒng)的雜交方法和步驟這是不可能的。
熒光納米顆粒，熒光球，可從分子探針I(yè)nc.獲得。這顆粒是由附有熒光染料的例如德克薩斯紅或熒光素羧甲基膠乳球組成。膠乳球能被獲得而帶有不同的功能基團(tuán)在其表面，例如胺和醛。大小從0.01到5μm直徑的顆粒是能獲得的。
1)熒光納米顆粒的特性納米顆粒，未修飾的，胺基修飾的，或醛基修飾的，具有一個(gè)凈正電荷。在電場(chǎng)中這些顆粒朝負(fù)電偏壓的微場(chǎng)所移動(dòng)。
2)DNA結(jié)合到熒光球上的化學(xué)胺基修飾過(guò)的顆粒能被結(jié)合到含有末端醛基的核酸上。這后者能通過(guò)帶有本說(shuō)明書(shū)前面介紹的高碘酸方法一系列氧化的3′-末端核苷的DNA探針被產(chǎn)生出。
顆粒以2％懸浮在蒸餾水中貯存。一滴25到50μl的0.02-1.0μm胺修飾過(guò)的紅色熒光的熒光球被離心沉淀并再懸浮在0.1M磷酸鈉，pH7.4中。過(guò)量的高碘酸氧化過(guò)的聚ribo-A被加入到懸浮液中。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行90分鐘。顆粒在1×SSC，0.1％SDS(0.15mMNaCl，0.015mM檸檬酸鈉，0.1％(w/v)SDS，pH7.0)中被漂洗并沉淀數(shù)次每人移走未結(jié)合和非特異性結(jié)合的聚ribo-A。
在緩沖液中的DNA-熒光球被放入一個(gè)直流電場(chǎng)中。被觀察到DNA-熒光球朝正電極移動(dòng)，表明它們的凈電荷現(xiàn)在是負(fù)。這是確定DNA結(jié)合反應(yīng)是否成功的一個(gè)簡(jiǎn)單和方便的方法。傳統(tǒng)的雜交方法需要使用放射性同位素標(biāo)記報(bào)告探針因?yàn)轭w粒的強(qiáng)熒光能遮掩任何雜交信號(hào)。
3)DNA結(jié)合到試驗(yàn)裝置上試驗(yàn)裝置用含有1％琥珀酰亞胺丙烯酸酯的高度交聯(lián)的聚丙烯酰胺進(jìn)行聚合，琥珀酰亞胺丙烯酸酯隨后能與5′-氨基末端的DNA探針起反應(yīng)。結(jié)合捕獲序列，寡聚體T，是通過(guò)與熒光標(biāo)記的互補(bǔ)探針CP-1-TR雜交而證實(shí)的。試驗(yàn)裝置表面是高度熒光的，表明該表面已被捕獲序列衍生了。
4)電子雜交和DNA-熒光球的識(shí)別雜交反應(yīng)的實(shí)施是在一種能安裝2個(gè)微毛細(xì)管試驗(yàn)裝置并共用一個(gè)上貯槽和獨(dú)立的下貯槽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行。反應(yīng)表面被暴露在共同的上貯槽中。
試驗(yàn)裝置被安放在這結(jié)構(gòu)中并預(yù)電泳15分鐘在0.5×TBE和0.05mA下。一個(gè)試驗(yàn)裝置有T2互補(bǔ)結(jié)合序列，而另一個(gè)具有ET-10AL非-互補(bǔ)結(jié)合序列。1μl DNA-熒光球被加入到上貯槽中。試驗(yàn)裝置在0.02mA被偏壓成正達(dá)5分鐘，以吸引DNA-熒光球(熒光納米顆粒)。試驗(yàn)裝置被檢查以確定顆粒在表面上。極性被反轉(zhuǎn)以便試驗(yàn)裝置現(xiàn)被偏壓成負(fù)和未雜交的DNA-熒光球必須被排斥。
在試驗(yàn)和對(duì)照裝置間沒(méi)有區(qū)別。經(jīng)反復(fù)試嘗顆粒能夠被移走而不管使用的電量。
5)被動(dòng)雜交和DNA-熒光球的識(shí)別未被任何理論或假設(shè)限制，我們相信顆粒的電子雜交物理地在試驗(yàn)裝置凝膠基質(zhì)的表面埋置或抓住顆粒。因此被動(dòng)地雜交到凝膠表面的結(jié)合序列上的DNA-熒光球須非常容易地由電子去-雜交移走。
新的試驗(yàn)裝置同上述一樣被安裝。0.05％的DNA-熒光球懸浮液被加入到上貯槽中并被動(dòng)地雜交5分鐘。吸掉緩沖液加入新鮮的1×TBE緩沖液。試驗(yàn)裝置現(xiàn)在被偏壓成負(fù)去排斥顆粒。試驗(yàn)裝置在0.02mA操作5分鐘，然后用熒光法檢查。
在進(jìn)行室溫下ECS 10分鐘后在試驗(yàn)和對(duì)照裝置間現(xiàn)在有一個(gè)有意義的區(qū)別。信號(hào)不是一致地分布在試驗(yàn)表面，而是濃縮在信號(hào)袋中。這暗示表面結(jié)合序列的可用性是有限的。使用較長(zhǎng)的具有疏水、親水，或混合特性的空間臂可使雜交有改進(jìn)。這種空間臂例如可用己二胺、琥珀酐，和本領(lǐng)域中熟知的各種其它空間基團(tuán)來(lái)構(gòu)建。
實(shí)例11特異的ds-DNA序列的電子引導(dǎo)的限制性酶切兩個(gè)實(shí)例被用來(lái)證實(shí)APEX裝置選擇性地進(jìn)行ds-DNA序列限制性內(nèi)切酶切的能力。M13mp18(具有一個(gè)Xba I限制性位點(diǎn))和M13mp8(不具有Xba I限制性位點(diǎn))載體被用于這些實(shí)例中。這些載體常被用于多個(gè)克隆DNA序列分析程序中。
第一個(gè)實(shí)例證實(shí)(1)電子雜交M13mp序列到試驗(yàn)裝置的特異微場(chǎng)所上，(2)自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移Xba I限制性酶到微場(chǎng)所上，和(3)在另一微場(chǎng)所上捕獲已切割的片段。這實(shí)例也證實(shí)裝置用特異結(jié)合實(shí)體(寡聚核苷酸捕獲序列，等)自我組裝自身能力。
這過(guò)程中的基本步驟圖解在圖(16)共價(jià)地結(jié)合寡聚核苷酸捕獲序列的四個(gè)特異的微場(chǎng)所(ML-1、ML-2、ML-3和ML-4)被用在這過(guò)程中。電子輸送系統(tǒng)被用于輸送試劑(寡聚核苷酸，限制性酶等等)和處理反應(yīng)物。
第一步包括轉(zhuǎn)移和共價(jià)結(jié)合M13-1寡聚核苷酸捕獲序列到ML-1和ML-2微場(chǎng)所上，以及轉(zhuǎn)移和結(jié)合M13-2寡聚核苷酸捕獲序列到ML-3和ML-4微場(chǎng)所上。由于核酸在pH＞4時(shí)是帶負(fù)電的，在pH5-9的緩沖液中電泳時(shí)它們總是朝帶正電的電極處移動(dòng)。
第二步包括在ML-1微場(chǎng)所上自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移和雜交M13mp18序列到M13-1捕獲序列，和在ML-2微場(chǎng)所上M13mp8序列到M13-1序列。
第三步包括轉(zhuǎn)移Xba I限制性酶到ML-1(M13mp18)微場(chǎng)所和ML-2(M13mp8)微場(chǎng)所上。Xba I切割ML-1上的M13mp18，而不切割ML-2上的M13mp8。被切割的片段從ML-1上被轉(zhuǎn)移和雜交到ML-3上的M13-2序列上。作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，在ML-2和ML-4之間也進(jìn)行自由場(chǎng)電泳。由于ML-2上的M13mp8序列未被酶切，在ML-4上無(wú)片段被識(shí)別到。
應(yīng)用在這實(shí)施例中的各種M13結(jié)合和探針序列如本說(shuō)明書(shū)上面所述一樣被制備。這些序列如下所示M13-C15′-CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG UM13-C25′-GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTG UMP18-40C 5′-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG-GGT ACC GMP8-40C 5′-TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGA TCC-CCGGGA ATT CMP18-R1 (TR)-5′-AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGCMP8-R2(F)-5′-ACA CAA CAT ACG AGC CGG AAG CAT
步驟1 結(jié)合M13捕獲序列一臺(tái)APEX試驗(yàn)裝置帶有胺基活化的高度交聯(lián)的(26％)聚丙烯酰胺表面或聚碳酸酯(5-10nm)多孔膜表面的200μm微場(chǎng)所被用在這步驟中。
M13-C1捕獲序列是含有3′-核糖核苷酸的31-mer的DNA寡聚核苷酸。M13-C1序列是與M13mp18和M13mp8單鏈(+)載體3′-末端互補(bǔ)的。M13-C1捕獲序列被設(shè)計(jì)成能雜交和牢固地結(jié)合所有未切割的M13載體。
M13-C2序列是一個(gè)含有3′-核糖核苷酸的31-mer寡聚核苷酸。M13-C2是與M13序列中含有Xba I限制性位點(diǎn)的克隆區(qū)域的上游部分互補(bǔ)。M13-C2捕獲序列被設(shè)計(jì)成能雜交和牢固地結(jié)合Xba I切割的M13片段。
M13-C1和M13-C2捕獲序列用paraded氧化而活化以便結(jié)合到APEX微場(chǎng)所的胺基衍生物上。3′-核糖核苷酸末端通過(guò)paraded氧化而轉(zhuǎn)化成一個(gè)末端二醛它能與伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成席夫堿。
反應(yīng)條件如下溶解10-20 O.D.的M13-C1或M13-C2寡聚體在水中達(dá)終濃度為10Dμl。加入1體積0.1M醋酸鈉，pH5.2和1體積0.45MSodium paraded(水中新鮮配制)。攪拌保持反應(yīng)在周圍溫度黑暗下達(dá)至少2小時(shí)。把反應(yīng)混合物加樣到平衡在0.1M磷酸鈉，pH7.4中的Sephadex G-10柱(巴氏吸管0.6×5.5cm)上。收集200μl級(jí)分，點(diǎn)樣2μl在薄層層析(TLC)上并收集紫外(UV)吸收級(jí)分。
四個(gè)APEX試驗(yàn)裝置的頂端表面被稱為可尋址的微場(chǎng)所ML-1、ML-2、ML-3和ML-4。
M13-C1被共價(jià)地結(jié)合到ML-1和ML-2微場(chǎng)所上通過(guò)如下的步驟用0.1M磷酸鈉，pH7.4緩沖液充滿上下貯槽并在0.05mA恒電流下預(yù)電泳5分鐘，使用Bio-Rad 500/1000電源。含有約0.1 O.D.單位的paraded氧化過(guò)的M13-C1寡聚核苷酸的電子輸送系統(tǒng)頂端被放入低貯槽。電子輸送系統(tǒng)是一個(gè)內(nèi)部帶有一個(gè)鉑電極的特殊地修飾過(guò)的塑料吸管頭。電子輸送系統(tǒng)在0.1mA下被偏壓為負(fù)(-)而微場(chǎng)所ML-1和ML-2被偏壓成正(+)。M13C-1在恒流下被電泳到ML-1和ML-2達(dá)2分鐘，在那兒它共價(jià)地結(jié)合到表面。極性被反轉(zhuǎn)，達(dá)約4分鐘，使得未反應(yīng)的M13C-1從ML-1和ML-2微場(chǎng)所上移走。
M13C-2序列是按上面描述的相同步驟結(jié)合到ML-3和ML-4微場(chǎng)所上。
步驟2-雜交M13載體，互補(bǔ)序列，和熒光報(bào)告探針由于限制性內(nèi)切核酸酶需要雙鏈DNA用于切割，位于單鏈M13mp18(從6240到6280)和M13mp8(從6230到6270)上的克隆/限制性位點(diǎn)區(qū)域必須與互補(bǔ)DNA序列雜交。電子雜交被用于分別地雜交一個(gè)40-mer互補(bǔ)片段(MP18-40C序列)到ML-1/M13C-1微場(chǎng)所上的M13mp18載體上；以及雜交一個(gè)40-mer互補(bǔ)片段(MP8-40C序列)到ML-2/M13C-1微場(chǎng)所上的M13mp8載體上。
電子雜交進(jìn)行通過(guò)負(fù)地偏壓含有0.05 O.D.單位的M13mp18的電子輸送系統(tǒng)，和正地偏壓ML-1/MP13C-1微場(chǎng)所在0.1mA達(dá)2分鐘。極性被反轉(zhuǎn)達(dá)4分鐘未雜交的M13mp18從微場(chǎng)所上被移走。同樣的過(guò)程被用于電子雜交M13mp8載體到ML-1/M13C-1微場(chǎng)所上。
M13mp18和M13mp8序列然后與二種不同的熒光報(bào)告探針電子雜交。在ML-1/M13C-1微場(chǎng)所上的M13mp18載體與一個(gè)24-mer德克薩斯紅標(biāo)記的報(bào)告探針(MP18-R1序列)電子雜交，該探針能雜交到克隆/限制性位點(diǎn)的5′-末端。M13mp8載體與一個(gè)24-mer熒光素標(biāo)記的報(bào)告探針(MP8-R2序列)電子雜交，該探針能雜交到克隆/限制性位點(diǎn)的5′-末端。
步驟3-應(yīng)用Xba I限制性酶限制性酶切M13mp18載體取決于它們的等電點(diǎn)(pI)，多個(gè)蛋白和酶在pH5-9范圍中能帶負(fù)電荷(pH＞pI)，中性(pH＝pI)，或帶正電荷(pH＜pI)。大量限制性內(nèi)切核酶酶的pI在6～7范圍內(nèi)。在pH大于pI時(shí)，這些酶將攜帶一個(gè)凈負(fù)電荷。因此，當(dāng)自由場(chǎng)電泳在緩沖液pH＞7中進(jìn)行時(shí)，這些酶將朝帶正電荷的微場(chǎng)所移動(dòng)。
在多個(gè)DNA修飾酶的情況下，類似限制性內(nèi)切核酶酶，總希望選擇一種緩沖溶液它能提供一種pH能平衡最適酶活力和相對(duì)快的電泳遷移。在一些情況下在pI上面和下面時(shí)都具有適當(dāng)?shù)拿富钚允强赡艿?。取決于選擇的pH，這些酶能朝正地或負(fù)地偏壓的微場(chǎng)所移動(dòng)。
在ML-1上Xba I酶切M13mp18載體按如下進(jìn)行。
Xba I內(nèi)切核酶酶應(yīng)用電子輸送系統(tǒng)首先被自由場(chǎng)電泳到ML-1/M13mp18微場(chǎng)所上。含有100單位Xba I pH7.6緩沖液的電子輸送系統(tǒng)被偏壓成負(fù)而ML-1/M13mp18微場(chǎng)所被偏壓成正在0.1mA達(dá)2分鐘。電流然后被減少到0.02mA達(dá)3分鐘。電子輸送系統(tǒng)去掉電源，而ML-1/M13mp18微場(chǎng)所被偏壓成負(fù)以及ML-3/M13C-2微場(chǎng)所被偏壓成正在0.1mA達(dá)5分鐘。ML-3/M13C-2微場(chǎng)所現(xiàn)在被偏壓成負(fù)而電子輸送系統(tǒng)接上電源并被偏壓成正在0.1mA達(dá)2分鐘以便從ML-3/M13C-2微場(chǎng)所上移走Xba I和未雜交的片段。
落射熒光顯微鏡觀察表明ML-1/M13mp18微場(chǎng)所上的紅色熒光信號(hào)消失而在ML-3/M13C-2微場(chǎng)所上出現(xiàn)紅色熒光信號(hào)，這證明Xba I酶切了M13mp18載體。相同的基本Xba I切割過(guò)程被重復(fù)用在ML-2/M13mp8微場(chǎng)所上，這作為一個(gè)陰性對(duì)照。由于M13mp8載體上沒(méi)有Xba I位點(diǎn)，酶切和產(chǎn)生片段是不可能的。因此ML-2/M13mp18微場(chǎng)所上保持它的綠色熒光信號(hào)，而在ML-4/M13C-2微場(chǎng)所上觀察不到熒光信號(hào)。
第二個(gè)實(shí)例包括應(yīng)用被共價(jià)地結(jié)合在裝置上可尋址微場(chǎng)所上的限制性酶進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)。這種情況，限制性內(nèi)切核酸酶被衍生并被自由場(chǎng)電泳到APEX裝置的可尋址微場(chǎng)所上在那兒它們共價(jià)地結(jié)合。用于衍生和共價(jià)結(jié)合限制性酶到固體支持物上的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。各種不同的限制性酶能被尋址到APEX裝置上。特異的酶切反應(yīng)可通過(guò)使用自由場(chǎng)電泳來(lái)濃縮ds-DNA載體或DNA樣品到已含有所需限制性內(nèi)切核酸酶的微場(chǎng)所上而被進(jìn)行。ds-DNA被酶切而片段然后被移到裝置的其它微場(chǎng)所上。當(dāng)所需或有用時(shí)其它DNA修飾酶能被結(jié)合到APEX裝置的可尋址微場(chǎng)所上。而且，不應(yīng)認(rèn)為本實(shí)施例限制于DNA修飾酶，因?yàn)榇蠖鄶?shù)其它酶能被結(jié)合到APEX裝置的可尋址微場(chǎng)所上。
實(shí)例12電子擴(kuò)增方法在用非常低目標(biāo)序列考貝數(shù)(如，HIV，腐敗性的血液侵染，等)進(jìn)行雜交分析的情況下，倍增或擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列能通過(guò)直接在APEX裝置上擴(kuò)增純化的目標(biāo)DNA和/或RNA使得靈敏度提高。擴(kuò)增也能降低對(duì)在雜交分析前極高產(chǎn)率制備步驟的需求。
APEX擴(kuò)增步驟提供完全電子控制的DNA移動(dòng)，變性、和合成反應(yīng)。最重要的是，DNA雜交子被電子地變性而不需要應(yīng)用高溫或無(wú)需耐熱聚合酶或其它熱穩(wěn)定性酶。
作為第一個(gè)實(shí)例，DNA合成能用DNA聚合酶(Klenow大片段)非常精確地獲得而不需要加熱循環(huán)。在這實(shí)例中，一條DNA鏈以讓其共價(jià)結(jié)合到一個(gè)微場(chǎng)所上的方式被擴(kuò)增。過(guò)程按如下進(jìn)行1)所知的目標(biāo)序列被電子雜交到被尋址的微場(chǎng)所上一個(gè)已知序列的捕獲探針上，2)通過(guò)DNA聚合酶和捕獲探針作引物進(jìn)行合成初生的互補(bǔ)鏈DNA(-)，3)新合成的DNA雜交子被電子變性，4)進(jìn)行目標(biāo)鏈DNA到未-伸長(zhǎng)的捕獲探針的退火和負(fù)鏈互補(bǔ)探針到初生的負(fù)鏈DNA的退火，5)通過(guò)DNA聚合酶進(jìn)行合成初生的目標(biāo)鏈DNA(+)并伴隨進(jìn)行同2)一樣的合成負(fù)鏈DNA，因此每次加倍正和負(fù)的數(shù)目這些步驟重復(fù)進(jìn)行，和6)通過(guò)雜交到特異地設(shè)計(jì)的互補(bǔ)探針上來(lái)進(jìn)行被擴(kuò)增目標(biāo)的大小選擇。完整的步驟。圖解在圖17，并詳細(xì)描述如下步驟1)結(jié)合目標(biāo)序列到捕獲探針上目標(biāo)序列被電泳地轉(zhuǎn)移到含有共價(jià)地結(jié)合的捕獲探針的微場(chǎng)所上(1)。目標(biāo)序列能在非目標(biāo)(基因組的)序列的背景中出現(xiàn)但在退火到捕獲探針前必須被變性。被開(kāi)始地捕獲的目標(biāo)序列可為各種長(zhǎng)度。
步驟2)合成對(duì)目標(biāo)互補(bǔ)的DNADNA聚合酶和dNTP′s被電泳地轉(zhuǎn)移到微場(chǎng)所1上。捕獲探針為DNA聚合酶提供3′-末端而被捕獲的目標(biāo)序列提供模板。足夠保持能夠合成所需試劑濃度的電流被應(yīng)用。電流可以是恒流或脈沖式的。這些參數(shù)能被操作去獲得不同范圍長(zhǎng)度的初生互補(bǔ)(-)鏈。
步驟3)電子變性新合成的鏈微場(chǎng)所1的極性被反轉(zhuǎn)并加電壓以分離兩條鏈。電壓量和使用的時(shí)間將取決于雜交DNA復(fù)合物的長(zhǎng)度和堿基組成。這些參數(shù)可從電子變性曲線中經(jīng)驗(yàn)地或計(jì)算而確定。
步驟4)引物(捕獲和互補(bǔ)探針)到DNA鏈上的退火寡聚體需要被退火到+和-DNA鏈上以提供DNA聚合酶的引物位點(diǎn)。對(duì)目標(biāo)或+鏈這是通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移+鏈到未-延長(zhǎng)的捕獲探針上完成的。只要未-延長(zhǎng)的捕獲探針是比已延長(zhǎng)的，共價(jià)地結(jié)合-鏈DNA過(guò)量這將要發(fā)生。現(xiàn)在+和-鏈都有引物結(jié)合著而作為DNA聚合酶催化合成的模板(見(jiàn)圖)。結(jié)合互補(bǔ)探針也可與非共價(jià)結(jié)合的-鏈DNA發(fā)生，然而這些雜交子將不被電子變性因此對(duì)總的擴(kuò)增不產(chǎn)生影響。
步驟5)合成DNA的兩條新鏈重復(fù)步驟2并由于+和-鏈?zhǔn)潜灰锝Y(jié)合的模板，序列特異DNA的量加倍。這些步驟每重復(fù)一次DNA量這種幾何級(jí)數(shù)的增加將發(fā)生。
步驟6)擴(kuò)增的目標(biāo)序列的大小選擇互補(bǔ)探針的核苷酸序列將決定被擴(kuò)增目標(biāo)DNA的大小和序列。因此，被擴(kuò)增DNA能通常被設(shè)計(jì)成增加隨后分析和/或操作的效率。
其它酶能被用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，包括，但不局限于，其它DNA聚合酶，T7或SP6 RNA聚合酶，反向轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，和聚核苷酸磷酸化酶，和組合使用其它核酸修飾酶(內(nèi)切酶，外切酶，等)。
實(shí)例13電子控制器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)所有裝置，是APEX芯片還是微機(jī)械裝置，將是可尋址矩陣的微場(chǎng)所(或大場(chǎng)所)的同類，計(jì)算機(jī)控制/數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)已被設(shè)計(jì)出提供獨(dú)立地應(yīng)用電子勢(shì)能到矩陣上任何墊上并測(cè)定在微場(chǎng)所-電解系統(tǒng)中流動(dòng)的結(jié)果電流。計(jì)算機(jī)控制/數(shù)據(jù)采集聯(lián)系的方法提供
a)代表微場(chǎng)所的矩陣。高水平和低水平的描述提供所有微場(chǎng)所的全景，提供了在最高水平解決微場(chǎng)所的障礙，和在低水平微場(chǎng)所的完全解決的障礙。
b)一個(gè)微場(chǎng)所的成功將躍出微場(chǎng)所的窗式顯示詳細(xì)描述微場(chǎng)所的特性，允許各種形態(tài)的用時(shí)間序列信號(hào)建立微場(chǎng)所的控制、電勢(shì)強(qiáng)度和符號(hào)，等，顯示控制序列覆蓋其它微場(chǎng)所的等。這系統(tǒng)出提供顯示數(shù)據(jù)和信號(hào)收集著為帶有統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)比較的微場(chǎng)所形成其它微場(chǎng)所。菜單為控制設(shè)計(jì)、觀察的實(shí)際控制信號(hào)和數(shù)據(jù)收集提供分析、文獻(xiàn)編集和檔案作用。
c)軟件提供整個(gè)開(kāi)關(guān)和數(shù)據(jù)收集通過(guò)硬件交界由從描述在b)中的矩陣控制軟件的輸入來(lái)控制。
d)一個(gè)分離的硬件和軟件系統(tǒng)提供影像收集和處理能力。這系統(tǒng)成像微場(chǎng)所矩陣和記錄在活性的微場(chǎng)所從DNA結(jié)合之間反應(yīng)的熒光信號(hào)以提供DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄。成像處理軟件提供定量處理這些圖像和提取定量測(cè)定結(jié)果的能力。這個(gè)軟件是完全與矩陣控制器/數(shù)據(jù)收集軟件有聯(lián)系以便提供一個(gè)組合系統(tǒng)它能記錄從成像數(shù)據(jù)來(lái)的所有APEX裝置控制/電解電流數(shù)據(jù)和測(cè)定結(jié)果，分析這些數(shù)據(jù)以便為伴隨關(guān)于這些結(jié)果的一致性和可靠性輔助信息的測(cè)定，和獲得所有數(shù)據(jù)和分析提供經(jīng)歸納的結(jié)果。
e)一個(gè)APEX控制器將組合所有這軟件加上一個(gè)頂端層它提供僅僅“測(cè)定”和“結(jié)果”顯示，加上一個(gè)按鍵如果需要的話通過(guò)c)接道a)，但通過(guò)c)到a)將被收集并在所有情況下被獲得。
f)用于發(fā)展項(xiàng)目的控制器初版應(yīng)用Macintosh Quadra 950作為宿主計(jì)算機(jī)并用National Iustruments boards與Quadra 950聯(lián)用以便提供上述的硬件聯(lián)系器。這些面版應(yīng)用可變的電勢(shì)到APEX微-場(chǎng)所上并測(cè)定在電解系統(tǒng)中流動(dòng)的結(jié)果電流。用在這控制器上的國(guó)家儀器面版(National Iustruments boards)是高分辨力多功能I/O面版，NB-MIO-16XL-18，模擬輸出面版，NB-AO-6，同步輸入/輸出面版，NB-TIO-10，阻閉式DMA和GPIB聯(lián)系面版，NB-DMA-2800，和模擬信號(hào)調(diào)節(jié)組件面版和熱電偶組件，和其它環(huán)境傳感器，5B系列，在Qudra中的NuBus面版和APEX裝置間的連接部分將是安裝在SCXI-1001機(jī)殼中的整個(gè)SCXI 16-通道SPDT繼電器元件面版。
實(shí)例14電子控制的樣品制備和雜交分析-一個(gè)組合的APEX系統(tǒng)樣品制備一般地包括選擇細(xì)胞，細(xì)胞材料的破碎(如，裂解)以及一系列的制備步驟和親和反應(yīng)。樣品制備對(duì)分子生物學(xué)反應(yīng)是重要的。例如，雜交分析常常被限制是因?yàn)樵跇悠分苽溥^(guò)程中的無(wú)效率而損失足夠量的實(shí)際目標(biāo)DNA序列。
用于電子控制的基本APEX概念能在DNA雜交測(cè)定中用于樣品制備。電子方法將允許樣品制備，細(xì)胞選擇和分析在APEX元件的一個(gè)主動(dòng)電子系統(tǒng)上進(jìn)行。樣品制備開(kāi)始于細(xì)胞篩選和裂解，并從樣品的細(xì)胞和體外的材料中粗的分離DNA。電子裝置能電子地處理樣品DNA并有效地轉(zhuǎn)移它到裝置的分析元件上，同時(shí)移走其它材料。這系統(tǒng)為有效的處理目標(biāo)DNA提供合適的測(cè)量因子。對(duì)人類基因組分析，電子樣品制備能包括一個(gè)高效的預(yù)雜交步驟通過(guò)此步驟大部分復(fù)雜的非特異性DNA能與目標(biāo)DNA分離開(kāi)。
一臺(tái)帶有樣品制備的組合裝置或完全的APEX裝置能取得相對(duì)粗糙的樣品(血液，唾液，尿液等)，并用最少的機(jī)械操作和射流來(lái)處理它，然后電子地輸送目標(biāo)DNA到裝置的分析元件上。這“主動(dòng)的電子處理”不同于自動(dòng)化或機(jī)械化處理，它們通常是人工處理和技術(shù)的機(jī)械化翻版。
一個(gè)為DNA樣品制備和分析的組合APEX系統(tǒng)能用多個(gè)全基于一般APEX概念的元件制造。這個(gè)系統(tǒng)的元件包括(1)一個(gè)電子細(xì)胞篩選單元(2)一個(gè)電子試劑分配單元(3)一個(gè)電子廢物處理單元(4)一個(gè)粗DNA篩選單元；(5)一個(gè)第二DNA或限制性片段篩選單元；(6)一個(gè)DNA片段貯存單元和(7)APEX分析單元(芯片)。這組合的APEX系統(tǒng)被圖解在圖18。
這種系統(tǒng)能在一個(gè)大硅片上制造。此外，單個(gè)元件能通過(guò)微平版印刷或微加工技術(shù)制造并被安排在(如，插入)一個(gè)特殊設(shè)計(jì)平板單元上。完全系統(tǒng)的元件被設(shè)計(jì)成它們活性的區(qū)域的大小取決于相關(guān)樣品中的材料量和大小(例如，細(xì)胞)。例如，細(xì)胞篩選器的活性部位一般地應(yīng)大于粗DNA篩選器活性區(qū)域，它依次應(yīng)大于限制性片段篩選器活性區(qū)域，它應(yīng)該是大于APEX分析芯片活性區(qū)域。
在實(shí)例中，細(xì)胞篩選器“活性區(qū)域”能是數(shù)平方厘米，而一個(gè)64微場(chǎng)所APEX分析元件的總“活性區(qū)域”能是少于一平方毫米，平板單元被設(shè)計(jì)成在一個(gè)密封的共同緩沖液貯槽中支持所有的元件單元。多至數(shù)百微升的合適樣品通過(guò)靠近細(xì)胞篩選器元件的加樣口被加入到系統(tǒng)中。細(xì)胞篩選元件是一種較大規(guī)模的APEX裝置它能對(duì)不同細(xì)胞類型具有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)篩選的親和性。這些親和性篩選能基于細(xì)胞表面電荷，半抗原，和抗原被建立。
作為實(shí)例，對(duì)全血樣品的親和性選擇能被用于篩選從紅血細(xì)胞中白血細(xì)胞(白血球，等)。高選擇性的過(guò)程能用于從材料血液樣品中選擇胎兒細(xì)胞。這也可能去提供傳染性微生物(酵母，真菌，細(xì)菌，和病毒)的親和性和選擇。當(dāng)被選擇的細(xì)胞保持結(jié)合在細(xì)胞篩選器元件上時(shí)；所有其它細(xì)胞和蛋白質(zhì)的材料被轉(zhuǎn)移到廢料處理單元上。在這點(diǎn)上細(xì)胞能被裂解通過(guò)自由場(chǎng)電泳式轉(zhuǎn)移帶電去污劑，和/或離液劑，和/或合適的裂解酶和蛋白酶(溶菌酶，蛋白酶K，胃蛋白酶，等)從電子試劑分配單元到細(xì)胞篩選器單元上的細(xì)胞上。合適的偏壓電子廢物處理系統(tǒng)能被用于移走一定的裂解廢物材料。正地偏壓粗DNA篩選器單元現(xiàn)在能被用來(lái)轉(zhuǎn)移粗核酸(DNA/RNA)材料到這元件上。
粗DNA篩選器是一種具有一般DNA親和力的APEX裝置。這種親和力能是一種帶正電的表面，或者含有一個(gè)共同的或重復(fù)的DNA序列的表面。例如，Alu重復(fù)捕獲序列能有效地捕獲從人類細(xì)胞提取的粗DNA。當(dāng)傳染性疾病分析是工作對(duì)象時(shí)一個(gè)普通的或一般的細(xì)菌或病毒序列能被使用。除了從DNA中移走體外的材料以外APEX系統(tǒng)也被設(shè)計(jì)成去降低樣品DNA的復(fù)雜度。這能被獲得通過(guò)使用限制性酶去選擇性地切割DNA在粗DNA選擇器單元上。限制性酶從試劑分配器單元上被轉(zhuǎn)移。被切割的限制性片段通過(guò)偏壓為正現(xiàn)在能被轉(zhuǎn)移到第二個(gè)DNA或限制性片段選擇器單元上。這個(gè)單元被設(shè)計(jì)成選擇性地結(jié)合DNA大片段，使用其表面的合適捕獲序列。
在這點(diǎn)上，被選擇的DNA片段能被轉(zhuǎn)移到APEX分析芯片以進(jìn)行雜交分析。這也可能轉(zhuǎn)移DNA片段到貯存單元或甚至該系統(tǒng)以外。上面的實(shí)施例僅代表樣品制備和成倍雜交分析一些可能的方案。元件的結(jié)合親和性編程能力和組合不同元件的可變性及功能允許進(jìn)行大量過(guò)程。
當(dāng)DNA被用作初始實(shí)例時(shí)，上述的裝置和方法也能用于處理和分析目標(biāo)DNA分子，蛋白質(zhì)，多糖，脂類和其它大分子。
所有參考文獻(xiàn)在此引入作為參考，包括在每篇文獻(xiàn)記錄的核酸序列和氨基酸序列。
其它實(shí)施方案在下面的權(quán)利要求書(shū)中。
序列目錄(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Michael J.HellerEugene TuGlen A.EvansRonald G.Sosnowski(ii)發(fā)明題目為分子生物學(xué)分析和診斷的自我-尋址自我-組裝的微電子系統(tǒng)和裝置(iii)序列數(shù)目45(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Lyon & Lyon(B)街道 611 West Sixth Street(C)城市 Los Angelrs(D)州名 加利福尼亞(E)國(guó)家 USA(F)郵編 90017(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型3.5″磁盤(pán)，1.44Mb內(nèi)存(B)計(jì)算機(jī) IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)IBM P.C.DOS(5.0版)(D)軟件Wordperfect(5.1版)(vi)現(xiàn)行申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)? 08/271,882(B)歸檔日期July 7，1994
(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)? 08/146,504(B)歸檔日期Nov.1，1993(viii)律師/代理人信息(A)姓名Murphy，David B.
(B)登記號(hào) 31,125(C)文獻(xiàn)/摘要號(hào)207/263(ix)電信信息(A)電話(213)489-1600(B)傳真(213)955-0440(C)電傳 67-3510(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 24(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué) 線形(ii)序列描述SEQ ID NO1GCT ACG CCC TGC TCA TGA GTC TCU 24(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO2AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAU 21(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 34(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO3CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GAC TGC CTG U 34(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 20(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO4GAG TTC AGC AAA TTT GGA GU 20(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO5CGT AGA ACT CCT CAT CTC CU 20(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 18(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO6GTC TCC TTC CTC TCC AGU 18(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 20(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO7GAT GAG CAG TTC TAC GTG GU20(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO8CTG GAG AAG AAG GAG ACU 18(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 22(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO9TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC U 22(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 20(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO10TTC CGC AGA TTT AGA AGA TU20(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO11TGT TTG CCT GTT CTC AGA CU 20(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 20(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO12CAG CGC TGT GAC AAA ACA TU20(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 20(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO13TGC GAG CTG CAG TCA GAC AT 20(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO14GAG AGA CTC ATG AGC AGG 18(2)關(guān)于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 18(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO15CCT CGT CAT GAG TCT CTC 18(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO16TTT TTT TTT TTT TTT TTT T 19(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO17CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGG TCC ACG TAG 33(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO18CTC CAA ATT TGC TGA ACT C19(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO20GGA GAT GAG GAG TTC TAC G19(2)關(guān)于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO21CTG GAG AGG AAG GAG AC 17(2)關(guān)于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO22CCA CGT AGA ACT GCT CAT C 19(2)關(guān)于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 17(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO23GTC TCC TTC TTC TCC AG 17(2)關(guān)于SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO24GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAA 21(2)關(guān)于SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO25ATC TTC TAA ATC TGC GGA A 19(2)關(guān)于SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 19(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO26GTC TGA GAA CAG GCA AAC A 19(2)關(guān)于SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO27ATG TTT TGT CAC AGC GAT G 19(2)關(guān)于SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 30(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO28GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAU30(2)關(guān)于SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 30(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO29GGT GGT GGG CGC CGT CGG TGT GGG CAA GAU30(2)關(guān)于SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO30CC GCG GCC GCC ACA C15(2)關(guān)于SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 15(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO31CC GCG GCA GCC ACA C15(2)關(guān)于SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 15(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO32CC TGT GCA GCC ACA C 15(2)關(guān)于SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO33GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAU30(2)關(guān)于SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 29(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO34GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GA 29(2)關(guān)于SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 22(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO35TGC CCA CAC CGC CGG CGC CCA C 22(2)關(guān)于SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO36TGC CCA CAC CGA CGG CGC CCA C 22(2)關(guān)于SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 ？(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO37TGC CCA CAC CAC CGA CGG TGC CCA C 22(2)關(guān)于SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 7(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO38ACA CCG C 7(2)關(guān)于SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO39ACA ACG C7(2)關(guān)于SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 31(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO40CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG U 31(2)關(guān)于SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 31(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO41GTA ATC ATG GTC ATA CGT GTT TCC TGT GTG U 31(2)關(guān)于SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO42GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG GGT ACC G40(2)關(guān)于SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 40(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO43TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGA TCC CCT GGA ATT C40(2)關(guān)于SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度 24(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO44AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGC 24(2)關(guān)于SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)序列描述SEQ ID NO45ACA CAA CAT ACG AGC AGC CGG AAG CAT 2權(quán)利要求
1.組裝結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟提供與一個(gè)第一特異結(jié)合實(shí)體連接的納米結(jié)構(gòu)；提供一個(gè)與支持物連接的第二特異結(jié)合實(shí)體，其中該第二特異結(jié)合實(shí)體與該第一特異結(jié)合實(shí)體具有互補(bǔ)親和性；及使該第一特異結(jié)合實(shí)體與該第二特異結(jié)合實(shí)體接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體中至少一種是DNA。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該第一特異結(jié)合實(shí)體與該第二特異結(jié)合實(shí)體雜交。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體中至少一種是RNA。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體中至少一種是抗體或半抗原。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體中至少一種是蛋白或肽。
7.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體中至少一種是凝集素或多糖。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體之間的互補(bǔ)親和力是一種非共價(jià)相互作用。
9.權(quán)利要求1的方法，其中該第一或第二特異結(jié)合實(shí)體之間的互補(bǔ)親和力是一種共價(jià)相互作用。
10.權(quán)利要求1的方法，其中該第二特異結(jié)合實(shí)體通過(guò)一層滲透層與支持物連接。
11.權(quán)利要求1的方法，其中該納米結(jié)構(gòu)是納米顆粒。
12.權(quán)利要求1的方法，其中該納米結(jié)構(gòu)是納米球。
13.權(quán)利要求1的方法，其中該支持物是電子學(xué)列陣。
14.權(quán)利要求13的方法，其中納米結(jié)構(gòu)在電子學(xué)嚴(yán)格限制的條件下，被導(dǎo)向至該第二特異結(jié)合實(shí)體。
15.權(quán)利要求1的方法，其中該納米結(jié)構(gòu)的大小是0.01-5微米。
全文摘要
設(shè)計(jì)和制造了一臺(tái)可自我尋址，自我組裝的微電子裝置，它能以顯微形式主動(dòng)地進(jìn)行和控制多步和多路的分子生物學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)包括核酸雜交，抗體/抗原反應(yīng)，診斷，和生物高分子合成。該裝置能借助微平版印刷和微加工技術(shù)而制造。該裝置能電子控制特異性結(jié)合實(shí)體的轉(zhuǎn)移和結(jié)合到特異性微場(chǎng)所上。特異性結(jié)合實(shí)體包括分子生物學(xué)分子例如核酸和多肽。該裝置能在被尋址的特異性微場(chǎng)所上逐次地控制分析物或反應(yīng)物的轉(zhuǎn)移和反應(yīng)。該裝置能濃縮分析物和反應(yīng)物，移走非特異性結(jié)合的分子，為DNA雜交反應(yīng)提供嚴(yán)格控制，和提高對(duì)分析物的識(shí)別力。該裝置能電子地被復(fù)制。
文檔編號(hào)H01L51/30GK1550556SQ20041003247
公開(kāi)日2004年12月1日 申請(qǐng)日期1995年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月7日
發(fā)明者M·J·赫勒, M J 赫勒, E·杜 申請(qǐng)人:內(nèi)諾金有限公司