專利名稱：：磁性顆粒及其制備方法和使用方法磁性顆粒及其制備方法和使用方法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2006年9月5日提交的美國臨時(shí)申請60/824,493的優(yōu)先權(quán)和任何其它權(quán)益，該臨時(shí)申請的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：在三種常見的鐵氧化物Fe304、Fe203和FeO中；也被稱為磁鐵礦的Fe304具有最廣泛的商業(yè)應(yīng)用，包括生物醫(yī)學(xué)診斷和治療。；茲鐵礦的"鐵i茲流體，，是鐵氧化物顆粒沿磁場線自我排列的穩(wěn)定懸浮液，它們可以在電子、航空電子、機(jī)器人、機(jī)械加工和汽車工業(yè)中具有商業(yè)價(jià)值(K.Raj,R.Moskowitz,J.Magn.Mag.Mater.85,233(1990))。磁鐵礦分散液也已經(jīng)被用于印刷應(yīng)用(調(diào)色劑和油墨)(Suryanarayanan的美國專利4,991,191和Okana等人的美國專利5,648,170),以及液晶裝置的制造中，例如彩色顯示器、單色光開關(guān)和可調(diào)諧濾波器(Rosenweig等人的美國專利3,648,269;Romankiv等人的美國專利3,972,595;Hong等人的美國專利5,948,321和6,086,780)。磁鐵礦顆粒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括臨床診斷和治療、藥物傳送和磁共振成像(MRI)(Gunther等人的美國專利6,123,920;Esenaliev的美國專利6,165,440;Gray等人的美國專利6,167,313;和D.K.Kim等人，J.Magn.Mag.Mater.225,256(2001))。在生物醫(yī)學(xué)臨床和研究領(lǐng)域中，磁性顆粒的最廣泛應(yīng)用是用于生物醫(yī)學(xué)分離。通過幾種方法來制備商用納米顆粒，例如Fe"和Fe"鹽的堿共沉淀、直接化學(xué)還原、球磨、化學(xué)氣相沉積和等離子體氣相沉積(D.Huber，Small1,482(2005);R.Kalyanaraman等人，NanostructuredMaterials10,1379(1998))。一些所述方法能夠連續(xù)生產(chǎn)具有高度均勻性的干燥粉末形式的顆粒。這對于制造和商業(yè)化目的是非常理想的。然而，在溶劑中分散干燥粉末而同時(shí)保持它們的單分散性是非常具有挑戰(zhàn)性的。這經(jīng)常導(dǎo)致大量的材料損失以及樣品的不均勻性。通常不選擇爐子干燥的材料作為生物醫(yī)學(xué)磁性產(chǎn)品的原料。大多數(shù)通過化學(xué)方法制備的具有生物醫(yī)學(xué)價(jià)值的商用磁性顆粒由包裹聚苯乙烯、多糖或二氧化硅的鐵磁性磁赤鐵礦(Y-Fe203)和磁鐵礦的芯核混合物構(gòu)成。在鐵芯合成過程中或之后進(jìn)行包覆，然后，將抗體、抗生蛋白鏈菌素或生物素連接到它們的表面上(G.H.Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress(1996))?？梢允褂闷暇厶前茶F顆粒，因?yàn)樗x予膠體穩(wěn)定性并且作為不同蛋白質(zhì)偶合作用的優(yōu)異平臺。Molday的美國專利4,452,773公開了包4隻有水溶性多糖或具有支鏈官能團(tuán)的衍生物的穩(wěn)定的非團(tuán)聚磁鐵顆粒的生產(chǎn)。在Skold的美國專利申請2002/0000398中，通過使用被認(rèn)為與鐵芯共價(jià)連接的羧基葡聚糖、醛基葡聚糖和氨基葡聚糖衍生物，發(fā)展成為更穩(wěn)定的連接。在Skold專利申請中所討論的包覆層的具體類型是要求在葡聚糖衍生物和鐵表面之間發(fā)生直接鍵合的包覆層。用血清包覆顆粒的類似包覆層同樣已經(jīng)被描述過(Liberti等人的美國專利5,512,332和5,597,531),盡管Whitehead等人的美國專利4,554,088聲稱被吸附的蛋白質(zhì)的量低，并且在高于5(TC時(shí)在1M的氯化鈉中可去除。在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，這種環(huán)境并不是典型的，但是在Liberi等人的美國專利6，120，856中，添加加熱步驟將蛋白質(zhì)不可逆地4建合到顆粒上。在Khalafalla等人的美國專利3,764,540、Kelley的4,019,994、Wyman的4,855,079和Hong等人的6,086,780中，公開了用于生產(chǎn)具有穩(wěn)定包覆層的磁性材料的另一種方法，其中，通過將覆蓋有脂肪酸單層的共沉淀的磁鐵礦轉(zhuǎn)移到非極性溶劑中來獲得穩(wěn)定的磁鐵礦流體分散液(鐵磁流體)。這種方法不需要長的制備時(shí)間，并且適于磁性流體的規(guī)?；a(chǎn)。脂肪酸選擇也是很重要的，Wyman的美國專利4,855,079教導(dǎo)將不同脂肪酸例如油酸和肉豆蔻酸組合可以生產(chǎn)不同直徑的顆粒。通過阻止鄰近的磁性顆粒之間的緊密相互作用，油酸及其它脂肪酸起到有效的^t劑的作用。它們被認(rèn)為化學(xué)吸附在鐵表面上，使得疏水性側(cè)鏈從該表面上延伸出來。在一些情況下，脂肪酸鏈也可以在顆粒表面周圍折疊。無論如何，表面上存在表面活性劑在空間上阻止鄰近顆粒之間的緊密相互作用。從而通過阻止顆粒隨時(shí)間的團(tuán)聚作用來賦予膠體穩(wěn)定性，這是顆粒生長的主要機(jī)制。封端作用是所述包覆層的間接結(jié)果，但是用來顯著限制顆粒的尺寸。表面活性劑(脂肪酸)包覆的另一間接結(jié)果是提供防止鐵氧化的隨后保護(hù)。當(dāng)鐵表面暴露于空氣中時(shí)發(fā)生鐵顆粒的氧化，由于在顆粒表面上形成磁性失效層，鐵顆粒的氧化引起其磁性的損失。在Wakayama等人的美國專利4，608，186、4,624,797和4,626,370中，描述了解決這種問題即防止磁性顆粒氧化的嘗試。在Khalafalla等人的美國專利3764540中已經(jīng)描述了脂肪酸包覆層的具體應(yīng)用，其中發(fā)現(xiàn)脂肪酸包覆層完全滿足防止方鐵礦自燃氧化。一般認(rèn)為脂肪酸是有取向性的，使得羧基與顆粒表面相互作用，并且疏水性脂肪鏈從所述表面指向溶劑。對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，使用油酸覆蓋磁性顆粒的缺點(diǎn)之一是賦予顆粒顯著的疏水性以及缺少將蛋白質(zhì)和配體化學(xué)連接到顆粒表面上的的官能團(tuán)。非極性的長烷基鏈賦予了這兩種特性。磁性顆粒的許多生物學(xué)應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是在含水溶劑中進(jìn)行的，這將導(dǎo)致疏水性顆粒的大量團(tuán)聚。磁性顆粒的^f茲芯的性質(zhì)在選擇用于特殊應(yīng)用的顆粒中是重要的。最常見地，選擇鐵氧化物例如萬茲鐵礦和磁赤鐵礦作為磁芯，因?yàn)樗鼈冊谏锞彌_液和培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。然而，它們的磁化率不如未被氧化的金屬鐵的磁化率大(R.S.Tebble和DJ.Craik,MagneticMaterials,NewYork,"Wiley-Interscience，(1969))。鐵納米晶可以在比其氧化物的可能尺寸更大的尺寸下保持它們的超順磁性，并且因此具有較高的磁矩。然而，由于FeG在空氣和水中快速氧化成非磁性的氧氫化物，抵銷了較高的磁矩。通常，保持鐵在零價(jià)狀態(tài)下使得其應(yīng)用限制在基本上排除水和氧的條件下。近來，已經(jīng)引入石灰包覆層作為防止金屬鐵顆粒氧化和降解的方法。在惰性氣氛中進(jìn)行的電孤放電4支術(shù)可以在鐵芯的周圍獲得20-30nm石墨包覆層殼。在顆粒表面發(fā)生顯著氧化之前，碳包覆層可以將FeG的磁化率保持至少3個(gè)月。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中被包覆的顆粒用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸的磁性分離，通常的誤解是商用磁性顆?？梢栽陂g歇式磁系統(tǒng)或者在連續(xù)流過式磁系統(tǒng)中互換使用。Cornelia(K.Comelia等人，Cytometry45(4),285(2001))和Melnik(K.Melnik等人，Biotechnol.Prog.17(5)，907(2001))的研究顯示出較高磁矩的顆粒在連續(xù)流過式》茲系統(tǒng)中運(yùn)作，但是這些相同的顆粒則導(dǎo)致使用高梯度磁分離柱的商用間歇式磁系統(tǒng)聚集和堵塞。盡管尚不清楚所有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用都需要高磁矩的磁性顆粒，但是清晰易辨的物理性能有助于獲得可重現(xiàn)和可預(yù)測的臨床應(yīng)用結(jié)果，特別是癌細(xì)胞的臨床富集。目前安裝在磁能梯度內(nèi)的間歇式分離柱受到堵塞，從而損害了最終產(chǎn)物的完整性。因?yàn)殚g歇式系統(tǒng)的內(nèi)部幾何形狀，高磁性的細(xì)胞易于在分離柱中聚集。在間歇式分離柱的鋼球之間的磁梯度是最高的，細(xì)胞趨向于團(tuán)聚和粘結(jié)。因此，由于分離柱中的不可逆捕獲，可能損失了重要的細(xì)胞，即使當(dāng)分離柱不受磁影響時(shí)。相反，在流過式磁性細(xì)胞分選器中，弱磁性細(xì)胞趨向于不能遷移到順流中，從而被損失掉。在連續(xù)流過式系統(tǒng)中，降低初始進(jìn)料流速來提供足夠的時(shí)間使較弱磁性細(xì)胞遷移通過內(nèi)部分離柱。連續(xù)系統(tǒng)中的較低流速具有較大的缺點(diǎn)。較低的流速使處理時(shí)間減少并最終減少樣品體積，此外，來自未被標(biāo)記的細(xì)胞的污染增加。因此，在低流速模式下，回收率增加，但是犧牲了高純的樣品。因此，對于間歇式系統(tǒng)和流過式系統(tǒng)，具有適用于每種系統(tǒng)并且隨后可以優(yōu)化它們性能(回收率、純度、處理速率)的^茲性顆粒是有利的。因此，所需要的是，可溶于水溶液的高質(zhì)量磁性顆粒；以及制備和使用這種顆粒的方法。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供顆粒。所述顆粒包括至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的f茲芯顆粒和包覆層。所述包覆層包括至少一個(gè)疏水部和至少一個(gè)親水部，選擇所述疏水部以與所述疏水性保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的分散。根據(jù)其它實(shí)施方式，提供顆粒。所述顆粒包括至少一個(gè)具有碳保護(hù)層的磁芯顆粒和包覆層。所述包覆層包括至少一個(gè)胺部和至少一個(gè)親水部，選擇所述胺部以與所迷碳保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的^:。根據(jù)另外的實(shí)施方式，提供制備顆粒的方法。該方法包括在第一溶劑中懸浮至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒；在第二有機(jī)溶劑中溶解包括疏水部和親水部的包覆層前體；以及將第一溶劑中的所述至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒添加到第二溶劑中的所述包覆層前體中，使得形成至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層和包覆層的顆粒。所述包覆層前體的疏水部與所述疏水性保護(hù)層自締合。根據(jù)另外實(shí)施方式，提供制備顆粒的方法。該方法包括在有機(jī)溶劑中溶解包括胺部和親水部的包覆層前體；以及將至少一個(gè)具有碳保護(hù)層的^f茲芯顆粒添加到所述溶劑中的所述包覆層前體中，使得形成至少一個(gè)具有石友J呆護(hù)層和包覆層的顆粒。所述包覆層前體的胺部與所述碳保護(hù)層自締合。當(dāng)結(jié)合下面附圖閱讀時(shí)，可以很好理解如下的本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)描述，其中相同附圖標(biāo)記表示相同結(jié)構(gòu)圖l是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的顆粒的示意圖2顯示用根據(jù)發(fā)明實(shí)施方式顆粒標(biāo)記的CD45+單核細(xì)胞(MNC)和用美天旎MACS珠(MiltenyiMACSbeads)標(biāo)記的CD45+MNC的磁泳遷移率；圖3顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的顆粒的TEM圖像；和圖4說明在丙烯葡聚糖凝膠S-300(柱尺寸45x2.5cm)上色層分離的自締合磁性顆粒的代表性分離柱分布結(jié)果。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在通過不時(shí)參考本發(fā)明的具體實(shí)施方式來描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可以不同形式具體實(shí)施，不應(yīng)認(rèn)為限制于在此描述的實(shí)施方式。而是，提供這些實(shí)施方式使得公開內(nèi)容更為徹底和完整，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言完全在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非其它限定，在此使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與通常由本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的普通技術(shù)人員所理解的相同含義。在本發(fā)明說明書中使用的術(shù)語僅用于描述特殊實(shí)施方式，并不打算限制本發(fā)明。正如本發(fā)明說明書和附加的權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"a"、"an"和"the，，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另外清楚地說明。所有在此提及的出版物、專利申請、專利及其它參考都整體引入作為參考。9"可選擇的"或"可選擇地"意指隨后描述的情況或情形可能發(fā)生或可能不發(fā)生，說明書包括事件發(fā)生的情形和事件不發(fā)生的情形。在整個(gè)本發(fā)明申請中，使用各種術(shù)語例如"主要"、"其次"、"第一"、"第二，，等，這些術(shù)語是區(qū)別不同單元的常用措詞，這種術(shù)語并不限制不同單元如何使用。正如在此所使用的，術(shù)語"癌癥，，是指任何類型癌癥，包括但不限于卵巢癌、白血病、肺癌、結(jié)腸癌、CNS癌、黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供顆粒。所述顆粒包括至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒和包覆層。所述包覆層包括至少一個(gè)疏水部和至少一個(gè)親水部，選擇所述疏水部以與所述疏水性保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的分散?？梢允褂萌魏芜m合的磁芯顆粒。為了定義和描述本發(fā)明，術(shù)語"磁芯顆粒"應(yīng)當(dāng)理解為表示具有磁性、能磁化或具有順磁性的并且適于進(jìn)行》茲性分離的任何材料。所述磁芯顆粒可以具有任何適合的尺寸。例如，所述^茲芯顆粒可以為約5nm-約2jim。在另一實(shí)施例中，所述磁芯顆?？梢詾榧s20nm-約300nm。所述萬茲芯顆?？梢杂扇魏芜m合的f茲性材料構(gòu)成。例如，所述f茲芯顆粒可以選自鐵氧體，例如磁鐵礦、鋅鐵氧體或錳鐵氧體；金屬，例如鐵、鎳、鋁、鋇、鉍、鋅、鉻或鈷；金屬合金；鐵氧化物和二氧化鉻。在一些實(shí)施例中，所述磁芯顆粒由磁鐵礦(Fe304)構(gòu)成或由金屬鐵(FeQ)構(gòu)成。在其它實(shí)施例中，所述磁芯顆粒可以為其它的氧化鐵基顆粒材料，包括具有通常結(jié)構(gòu)MFe204的復(fù)合材料，其中M可以為Co、Ni、Cu、Zn、Mn、Cr、Ti、Ba、Mg或Pt。應(yīng)當(dāng)理解的是，對于具體的應(yīng)用可以選擇具體的磁芯顆粒。所述疏水性保護(hù)層可以包括任何適合的疏水性單元。在一些實(shí)施例中，選擇疏水性保護(hù)層以防止所述至少一個(gè)磁芯顆粒氧化。正如在此進(jìn)一步討論的，所述疏水性保護(hù)層參與至少部分所述包覆層的自締合。為了定義和描述本發(fā)明，術(shù)語"自締合"應(yīng)當(dāng)被理解為表示在一個(gè)或多個(gè)分子或部分分子之間的領(lǐng)域或者區(qū)域的自發(fā)但可預(yù)知的排列。一般認(rèn)為自締合主要由熱動力學(xué)力驅(qū)動。自締合的實(shí)例包括但不局限于將磷脂添加到水中之后自發(fā)形成雙分子層。磷脂是兩親分子，由連接極性含氮磁基、甘油部分或肌醇基團(tuán)的非極性脂肪酸鏈構(gòu)成。雙分子層由兩層排列的脂類構(gòu)成，使得它們的長鏈?zhǔn)杷晕捕讼嗷ッ鎸γ嬉酝ㄟ^各向異性的分子間力結(jié)合在一起形成油質(zhì)芯核，而它們的親水性首基面向薄膜任何一側(cè)的水溶液，并且參與氫鍵鍵合。這種特殊的自締合反應(yīng)主要由熵力驅(qū)動，使脂肪酸鏈與水隔離。適合的疏水性保護(hù)層的實(shí)例包括但不局限于飽和或不飽和的、共軛或非共軛的、取代或未被取代的有機(jī)酸或者具有約10-約22個(gè)碳原子的一元羧酸。在一些實(shí)施例中，所述疏水性保護(hù)層為至少一種脂肪酸。脂肪酸具有長的烴鏈，末端具有羧基，并且脂肪酸可以為飽和或不飽和的，具有順式或反式構(gòu)型的雙鍵。適合的脂肪酸的實(shí)例包括但不局限于己酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十四酸、亞麻酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、異硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、油酸和亞油酸。在其它實(shí)施例中，也可以使用分子間能夠交聯(lián)的改性脂肪酸衍生物。這種的實(shí)例包括化學(xué)反應(yīng)活性衍生物、光活性衍生物以及能夠通過自氧化交聯(lián)的衍生物。化學(xué)反應(yīng)活性物質(zhì)包括磺基-N-琥珀酰亞胺基衍生物、光活性衍生物例如含有活性疊氮基、二苯曱酮或雙吖丙咬基團(tuán)的脂肪酸。能夠自氧化的衍生物包括天然和合成的聚不飽和脂肪酸，其鏈長大于8個(gè)碳原子且具有2個(gè)以上的順式雙鍵，這些雙鍵最常見通過單亞曱基相互分開。也可以添加活性小分子以使不飽和雙鍵進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)Wyman的美國專利4，855,079教導(dǎo)當(dāng)尾端部分的長度(C)與磁性顆粒直徑(D)的比例小于約0.2時(shí)所述顆粒會團(tuán)聚。因此，一般認(rèn)為可以選擇特定的疏水性保護(hù)層以有助于形成適合尺寸的顆粒。例如，具有18個(gè)碳且長度為2.35nm的油酸將形成不超過約12.5nm的鐵顆粒芯核。預(yù)測具有14個(gè)碳且長度為1.83nm的肉豆蔻酸形成不超過約9.2nm的芯核直徑。有幾種方式可以使疏水性保護(hù)層與磁芯顆粒表面進(jìn)行鍵合。應(yīng)理解的是，所述鍵合取決于具體的金屬芯核顆粒和所選擇的疏水性保護(hù)層。例如，油酸和脂肪酸可以鍵合到鐵顆粒的表面?；诰哂杏退岚矊拥腇ePt顆粒的FTIR結(jié)果(N.Shukla等人，J.Magn.Mag.Mater.266,178-184(2003))，鐵和脂肪酸之間的表面鍵合包括單齒和雙齒羧酸鹽鍵合。因此，脂肪酸的羧基與鐵表面緊接，烴鏈從顆粒表面指向外。疏水性保護(hù)層可以充當(dāng)有效的阻擋層，以防止^f茲芯顆粒氧化，并且可以幫助顆粒保持分散狀態(tài)。然而，這種顆粒僅在有機(jī)溶劑中分歉，在含水緩沖液中形成明顯的團(tuán)聚。因此，使用包覆層以提供更適合的顆粒。ii在一些實(shí)施例中，單個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒與包覆層緊接。因此，所述顆粒包括單個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒和包覆層的親水部分，所述疏水性保護(hù)層與所述包覆層的疏水部自締合。在其它實(shí)施例中，所述顆粒包括多個(gè)磁芯顆粒，所述多個(gè)磁芯顆粒中的每個(gè)磁芯顆粒具有疏水性保護(hù)層，包覆層與具有疏水性保護(hù)層的所述多個(gè)磁芯顆粒中的一個(gè)以上的磁芯顆粒緊接。因此，在該實(shí)施例中，具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒的集合體被包覆層包裹。選擇包覆層的疏水部以使其與所述疏水性保護(hù)層自締合，可以使用任何適合的疏水部。例如，所述疏水部可以為疏水性單元，包括但不局限于飽和或不飽和的、共軛或非共軛的、被取代或未被取代的有機(jī)酸或者具有約10-約22個(gè)碳原子的一元羧酸。例如，可以使用多糖包括脂肪酸；可生物降解的聚合物例如^f旦不局限于聚乳酸(PLA)、聚己酸內(nèi)酯(PCL)和聚羥基丁酸戊酯(PHBV);可生物降解的聚合物復(fù)合材料和聚烯烴，包括但不局限于聚乙烯及其變體。適合的多糖的實(shí)例包括但不局限于葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、出芽短梗霉聚糖、纖維素、纖維二糖、菊粉、脫乙酰殼多糖、藻酸鹽和透明質(zhì)酸。在一些實(shí)施例中，糖類單元通過選自縮醛、半縮醛、縮酮、原酸酯、酰胺、酯、碳酸和氨基曱酸酯的鍵進(jìn)行連接。在其它實(shí)施例中，多糖可以具有2-2000個(gè)糖單元。在其它實(shí)施例中，也可使用分子間能夠交聯(lián)的改性脂肪酸衍生物。這些實(shí)施例包括化學(xué)反應(yīng)活性衍生物、光活性衍生物以及通過自氧化交聯(lián)的衍生物。化學(xué)反應(yīng)活性物質(zhì)包括磺基-N-琥珀酰亞胺衍生物；光活性衍生物例如含有活性疊氮基、二苯曱酮或雙吖丙咬基的脂肪酸。能夠自氧化的衍生物包括天然和合成的聚不飽和脂肪酸，其鏈長大于8個(gè)碳且具有2個(gè)以上的順式雙鍵，這些雙鍵最常見通過單個(gè)亞曱基相互分開。也可以添加活性小分子以使不飽和雙鍵進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以應(yīng)用光活性和化學(xué)活性的方法以在脂肪鏈之間產(chǎn)生直接共價(jià)鍵，從而在顆粒周圍形成持久的不能移動的包覆層。包覆層的疏水部和所述疏水性保護(hù)層自締合以在磁芯顆粒周圍形成疏水性區(qū)域。例如，包覆層的疏水部和所述疏水性保護(hù)層可以通過互相交錯(cuò)來自締合，并且可以通過交錯(cuò)的經(jīng)鏈之間的疏水性相互作用使疏水區(qū)域穩(wěn)定。在一些實(shí)施例中，當(dāng)發(fā)生自締合時(shí)，所述疏水性保護(hù)層的分子和/或鏈的尾端部分與疏水性包覆層部分相互締合，并且朝顆粒表面折疊，從而減少顆粒之間的距離。所述包覆層還具有被選擇用來促進(jìn)所述顆粒在含水體系中分散的親水部。所述包覆層的親水部和疏水部可以以任何其它適合的方式進(jìn)行共價(jià)鍵連或締合?？梢栽O(shè)置親水部，使得由親水區(qū)域包裹疏水區(qū)域。例如，不束縛于理論，與親水部連接的疏水部可以通過與所述疏水性保護(hù)層相互交錯(cuò)進(jìn)行自締合，使得產(chǎn)生將金屬芯核顆粒與所述親水部分隔的疏水層。因此，親水部成為包裹疏水區(qū)域和金屬芯核顆粒的最外層。圖1示意性說明具有油酸疏水性保護(hù)層的具體鐵顆粒和具有油酸疏水部和葡聚糖親水部的包覆層。葡聚糖親水部在疏水區(qū)域周圍形成層。也可以選擇親水部以作為配體或?qū)χ匾氖荏w具有親合力的其它單元的連接位置。在其它實(shí)施例中，重要的受體可以與親水部連接。例如，可以選擇親水部以作為以下配體或?qū)χ匾氖荏w具有親合力的其它單元的連接位置，所述配體或?qū)χ匾氖荏w具有親合力的其他單元包括但不限于蛋白質(zhì)、縮氨酸、多肽、核苷酸、多核苷酸、短鏈和長鏈有機(jī)分子以及被選擇對特定的受體具有親合力的無機(jī)分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)使用所述顆粒的特定體系選擇特定的配體和/或?qū)χ匾氖荏w具有親合力的其它單元。在一些實(shí)施例中，可使用烷基硅烷作為包覆層。選擇烷基硅烷使得它們具有至少一個(gè)飽和或不飽和的、被取代或未被取代的、共軛或未共軛的脂肪基團(tuán)，其包括具有充分疏水性和三維結(jié)構(gòu)的疏水部，使得允許它們與疏水性保護(hù)層自締合。烷基硅烷的硅部不與磁芯顆粒連接，烷氧基可以用來與相鄰基團(tuán)反應(yīng)。烷氧基包括親水部，通過堿性或酸性條件使烷氧基脫水可以使各個(gè)硅烷交聯(lián)以生成穩(wěn)定的包覆層。在一些實(shí)施例中，烷基硅烷可以具有鏈長為8-20個(gè)碳的脂肪基團(tuán)，并且鏈中不具有雙4建、具有一個(gè)雙鍵或者多個(gè)雙鍵。適合的烷基硅烷的實(shí)例包括但不局限于正辛基三乙氧基硅烷、十四烷基三曱氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙酰氧基硅烷、曱基十六烷基二乙酰氧基硅烷、曱基十六烷基二曱氧基硅烷、十八烷基三曱氧基硅烷、十八烷基三氯硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷和l，12-雙(三曱氧基曱硅烷基)十二烷。本發(fā)明的包覆層可以具有任何適合的厚度。例如，所述包覆層可以具有選擇的厚度，使得整個(gè)顆粒具有約20nm-約4.5nm尺寸。在其它實(shí)施例中，所述顆粒可以具有約200nm-約400nm的尺寸。應(yīng)理解的是，所述包覆層可以包括單層或多層。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，提供包括至少一個(gè)具有碳保護(hù)層的磁芯顆粒和包覆層的顆粒。所述包覆層包括至少一個(gè)胺部和至少一個(gè)親水部，選擇所述胺部以與所述碳保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的分散?？梢允褂萌魏芜m合的胺部。適合的胺包括那些在生理?xiàng)l件下是陽離子性的，或者能夠與碳包覆層形成靜電復(fù)合物的胺。這種胺包括但不局限于含有伯胺、仲胺、叔胺或者甚至季銨的支鏈多胺和直鏈多胺。應(yīng)理解的是，適合的胺可以是高度取代的胺，包括叔胺和季銨。適合的胺部的實(shí)施例包括但不局限于聚乙烯亞胺(PEI)、精胺(4艇)和亞精胺(3胺)。在一些實(shí)施例中，在親水部被氧化之后所述胺可以通過胺鍵或亞胺鍵連接。例如親水多糖可以被氧化成聚醛(席夫堿)。應(yīng)理解的是，所述包覆層的親水部可以如上述討論的，磁芯顆粒和整個(gè)顆粒的尺寸也可以如上述討論的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，可以通過任何適合的方法制得顆粒。在一些實(shí)施方式中，通過如下步驟來制得顆粒在第一溶劑中懸浮至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒；將包括疏水部和親水部的包覆層前體溶解在第二有機(jī)溶劑中；以及將第一溶劑中的所述至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒添加到第二溶劑中的包覆層前體中J吏得形成至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層和包覆層的顆粒，其中所述包覆層前體的疏水部與所述疏水性保護(hù)層自締合。在一些實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步包括在添加所述至少一個(gè)磁芯顆粒步驟之后去除第一溶劑和第二溶劑的步驟。例如，去除第一溶劑和第二溶劑的步驟可以包括將溶液加熱到足夠溫度以去除第一溶劑和第二溶劑中的至少一種溶劑的至少一部分。在一些實(shí)施例中，通過加熱僅可以去除第一溶劑或第二溶劑。在其它實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步包括通過滲析、柱色譜法、滲濾和攪拌單元裝置中的壓濾或它們的組合中的至少一種來去除第一溶劑和第二溶劑的高沸點(diǎn)殘余物的步驟?？梢允褂萌魏芜m合的第一溶劑和第二溶劑。例如，第一溶劑可以選自氯仿、曱醇、己烷以及它們的組合.。在其它實(shí)施例中，第二溶劑可以選自二曱基亞砜、二曱基曱酰胺(DMSO)、曱酰胺和N-曱基吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、四氬吹喃聚乙二醇醚(glycofUrol).、丙二醇、乙腈、油酸乙酯以及它們的組合。應(yīng)理解的是，第一溶劑和第二溶劑可以為任何適合的溶劑，根據(jù)具有疏水性保護(hù)層的具體磁芯顆粒和具體的包覆層前體進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，第一溶劑或第二溶劑可以為DMSO。DMSO用于自締合反應(yīng)，因?yàn)槠渑c非極性化合物和極性化合物的混溶性可以允許其使包覆層前體的疏水部和包覆層前體的親水部成為溶劑化物?？梢允褂没诒∧さ那邢蛄鲃舆^濾(TFF)單元通過滲濾來去除DMSO。為了使DMSO對膜濾器潛在破壞最小化，在TFF之前可以使該反應(yīng)液在0.5M的NaCl中稀釋10倍。在用0.5M的NaCl對DMSO進(jìn)行IO倍體積交換(去除99.9Q/。的DMSO)之后，可以進(jìn)行第二次滲濾以用50HEPESpH值為7.4、0.15M的NaCl對這種溶液進(jìn)行交換。此時(shí)顆粒^l交態(tài)狀，并且能夠在適合的溫度下儲存。還應(yīng)理解的是，可以使用任何適合的反應(yīng)條件和附加步驟。例如，在混合之后，包覆層前體溶液和磁芯顆粒可以進(jìn)行超聲處理。金屬芯顆粒可以以任何適合的方式制得，并且可以具有以任何適合方式提供的疏水性保護(hù)層。例如，通過改性的鐵鹽共沉淀法，可以經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)數(shù)克規(guī)模的鐵顆粒的生產(chǎn)，所述共沉淀法包括以摩爾比2:1混合六水合氯化鐵(FeCl3'6H20)和四水合氯化亞鐵(FeCl2'4H20),然后添加氫氧化銨(NH4OH)以快速沉淀膠體鐵顆粒。所獲得的顆粒隨后包裹在有機(jī)材料中，該有才幾材料阻止氧化、團(tuán)聚，并且作為包覆層自締合的基礎(chǔ)。Reimers等人的美國專利3,843,540教導(dǎo)在膠體鐵顆粒已經(jīng)形成之后添加脂肪酸以避免干擾沉淀反應(yīng)。這種添加應(yīng)盡快以阻止顆粒通過團(tuán)聚進(jìn)一步長大。脂肪酸的量并不重要，只要足以包覆鐵以防止團(tuán)聚。例如，在該實(shí)施例中，油酸的量可以為Fe304理論產(chǎn)率的30%-75%。包覆層前體可以以任何適合的方式制得。例如，可以使用任何適合的方法將適合的疏水部連接到適合的親水部。在一些實(shí)施例中，可以生成用脂肪酸鏈取代的疏水性葡聚糖，從而能夠與疏水性保護(hù)層自締合。例如，如Domb的美國專利7,001，891所描述的，油胺可以與葡聚糖共軛。葡聚糖聚合物上脂肪鏈取代的程度可以為約2-約20%。疏水性殘基一般通過酯、酰胺、亞胺、胺、尿烷或碳酸酯^l建與葡聚糖主鏈共軛，這取決于共軛組分上的可獲得的官能團(tuán)?？梢栽贕.H.Hermanson，BioconjugateTechniques,AcademicPress，(1996)中獲得用于這些偶合的方法。在一些實(shí)施例中，可以由脂肪酸例如己酸制備包覆層前體，或者使用活性酸例如酸酐或?；妊苌锘蚋m于含水介質(zhì)的活化劑例如二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)及其衍生物，油酸可以與親水部上的羥基或胺基鍵合?；蛘撸褂锰减Ｂ妊苌锿ㄟ^碳酸酯或尿烷鍵，可以共軛己基或油烯基醇或胺。在親水溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中親水部溶解在或者至少分散在具有大表面積的細(xì)顆粒中。用于這些制備的適合溶劑的實(shí)例包括但不局限于二曱基曱酰胺(DMF)、N-曱基吡咯烷酮、二曱亞砜(DMSO)以及它們與水的混合物。在它們偶合之后，可以對包覆層前體進(jìn)行清洗，去除未反應(yīng)的試劑，并且在真空中干燥。制備具體金屬顆粒的一個(gè)實(shí)施例是用疏水性葡聚糖包覆具有油酸疏水性保護(hù)層的鐵顆粒?？梢栽谒〕暡▋x中進(jìn)行用疏水性葡聚糖包覆鐵-油酸酯。在一個(gè)實(shí)施例中，油胺殘基取代度為約6°/。的疏水性葡聚糖溶解在二曱亞砜中，并且在8(TC下保溫30分鐘。通過離心分離去除未溶解的材料，然后過濾淡黃色液體，且返回到水浴中。將氯仿中的包覆油酸的鐵顆粒逐滴添加到以100W功率超聲處理的疏水性葡聚糖中。葡聚糖與鐵的比例為至少10:l(w/w)。之后在60。C下保溫至少30分鐘。在一個(gè)實(shí)施例中，十八烷基三乙氧基硅烷(GelestInc.,Morrisville，PA)與鐵-油酸酯組合，并且該混合物在70。C水浴超聲波儀中進(jìn)行超聲處理。加熱去除氯仿(沸點(diǎn)62。C)，這使鐵-油酸酯分布到十八烷基三乙氧基硅烷相中。與硅原子連接的18碳脂肪鏈與包覆鐵表面的疏水性油烯基鏈相互交錯(cuò)。隨后添加溶膠-凝膠組分；氫氧化銨、曱醇和表面活性劑，并且在60。C下反應(yīng)20分鐘。在磁性表架上收集該材料，在曱醇中清洗，如果有必要，使用丙烯葡聚糖凝膠S-300(SephacrylS-300)作為基質(zhì)通過尺寸排阻色譜法可以純化所述顆粒。在一些實(shí)施方式中，可以制備至少一個(gè)具有碳保護(hù)層和包覆層的磁芯顆粒?？梢匀缟鲜鲇懻摰墨@得適合的磁芯顆粒。這些顆?？梢跃哂幸匀魏芜m合方式提供的碳保護(hù)層。例如，^茲芯顆粒可以通過任何適合的方法來包覆碳保護(hù)層，包括但不限于球磨、激光燒蝕、化學(xué)氣相淀積和微波等離子體處理。碳保護(hù)層可以包括單層或多層碳。在一些實(shí)施例中，包覆碳的顆?？梢允袌錾腺徺I獲得。例如，包覆碳的FeG顆粒可以由商業(yè)來源獲得。一般認(rèn)為包覆碳的磁芯顆?？梢苑乐顾夂脱趸?。可以以任-f可適合的方式形成包4舌至少一個(gè)胺部和至少一個(gè)親水部的包覆層，選擇所述胺部以與所述碳保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促使所述顆粒在含水體系中的分散。例如，可以在溶劑中提供包覆層前體，可以將具有碳保護(hù)層的磁性顆粒添加到溶液中以形成顆粒。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在添加所述至少一個(gè)磁芯顆粒的步驟之后去除溶劑的步驟。例如，去除溶劑的步驟可以包括將溶液加熱至足夠的溫度以去除至少部分溶劑。在其它實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步包括通過滲析、柱色譜法、滲濾和攪拌單元裝置中的壓濾中的至少一種或它們的組合來去除溶劑的步驟?？梢砸匀魏芜m合的方式制得包覆層前體。例如，胺可以在親水部氧化之后通過胺鍵或亞胺鍵進(jìn)行連接。例如，親水性多糖可以被氧化成聚醛(席夫石咸)。此外，所述包覆層前體可以如上述討論的方式來制得。不希望被束縛，需要注意的是，堿性氮原子對碳納米管具有強(qiáng)的親合力(參見(l)Liu，J.;Casa飄t,M丄；Cox,M.;Walters,D.A.;Boul，P.;Lu,W.;Rimberg，A丄；Smith,K,A.;Colbert,D.T.;Smalley,R.E.Chem.Phys丄ett.1999,303,125-129、(2)Choi，K.H.;Bourgoin，J.P.;Auvray,S.;Esteve,D.;Duesberg，G.S.;Roth,S.;Burghard，M.Surf.Sci.2000，462,195-202、(3)Lewenstein，J.C;Burgin，T.P.;Ribayrol，A.;Nagahara，L.A.;Tsui,R.K.;NanoLett.2002,2，443曙446、(4)Sano,M.;Kamino，A.;Okamura,J.;Shinkai,S.，NanoLett.2002,2,531-533)。這涉及在供電子的胺基與碳納米管表面之間的供體-受體相互作用。在高度取代的具有適包覆碳的Fe0顆?？梢园灿邪ň垡蚁﹣啺凡糠趾推暇厶遣糠值陌矊忧绑w。在這種情況下，帶正電荷的聚乙烯亞胺部分向包覆碳的FeG顆粒的表面方向進(jìn)行取向，而極性葡聚糖部分在外部區(qū)域與溶劑分子相互作用。所述顆粒可以具有任何適合的配體或與所需連接的受體具有親合力的其它單元，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解到，可以使用各種體系來連接各種配體或與所希望的受體具有親合力的其它單元。適合的配體或與所希望的受體具有親合力的其它單元的實(shí)例包括但不局限于蛋白質(zhì)、縮氨酸、多肽、核苷酸、多核苷酸、短鏈和長鏈有機(jī)分子、以及選擇用于對特殊受體具有親合力的無機(jī)分子。例如，通過形成不穩(wěn)定的亞胺(席夫堿)，之后還原胺化成穩(wěn)定的仲胺4建，蛋白質(zhì)的胺和氨基改性的核酸的胺可以與被氧化的葡聚糖偶合。對葡聚糖進(jìn)行適度的高碘酸鈉處理，通過對鄰近的羥基或二醇進(jìn)行氧化而產(chǎn)生活性醛。在溫和條件下當(dāng)pH值為7-10時(shí)與蛋白質(zhì)之間形成亞胺鍵，然后通過用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉處理還原成穩(wěn)定的仲胺鍵，同時(shí)將任何未反應(yīng)的醛基還原成乙醇。將蛋白質(zhì)與顆粒偶合的另一方法是產(chǎn)生穩(wěn)定的腙鍵。首先將蛋白質(zhì)改性為含有酰肼化合物，然后與氧化的葡聚糖反應(yīng)。酰肼與醛明確地反應(yīng)形成腙鍵，然后該腙鍵可以與氰基硼氫化物反應(yīng)以還原雙一建。例如，使用己二酸二酰肼(Aldrich)或琥珀酰亞胺4-肼基煙酸酯丙酮腙(succinimidyl4-hydrazinonicotinateacetonehydrazone)(SANH;SoMinkInc)，可以將抗生蛋白鏈菌素與葡聚糖偶合。該反應(yīng)使用少于5倍的抗生蛋白鏈菌素，所獲得的蛋白質(zhì)密度與通過其它方法獲得的密度剛好同樣高?？梢允褂?3-氨基丙基)三乙氧基曱硅烷(APTS)來完成包覆二氧化硅的顆粒上的配體連接，以在顆粒表面上引入胺，而(3-巰基丙基)三乙氧基曱硅烷(MPTMS)將會引入SH基。然后，可以使用異基雙功能偶合劑(琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺曱基]環(huán)己烷-l-羧酸酯)將硫醇與胺連接。例如，顆粒表面上的胺已經(jīng)與抗生蛋白鏈菌素分子上的硫醇連接，并且顆粒表面上的硫醇與抗生蛋白鏈菌素的胺連接。由所述顆粒提供的高磁矩是分析和制備以及診斷、預(yù)測和治療技術(shù)所需要的，特別是需要高通量或快速診斷特征的那些技術(shù)。所述顆粒可以用于分離或富集無機(jī)分子和有機(jī)分子、病毒、細(xì)胞器官和細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，提供用于臨床或研究環(huán)境的組裝試劑盒。試劑盒可以用于生物或分子應(yīng)用。試劑盒可以包括裂解緩沖液(在需要從樣品制備中去除紅血球時(shí))、標(biāo)記表面部分的第一抗體/第一靶、與識別第一抗體/第一耙的第二抗體/第二耙共輒結(jié)合的顆粒、和/或直接與所述磁性顆粒共軛結(jié)合的第一抗體/第一靶。此外，在所迷試劑盒中可以包括生理緩沖液(其可以用于樣品清洗和再懸浮)以及各種磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)中的鞘載流體。緩沖液可以包括但不局限于添加的表面活性劑、抗絮凝劑、穩(wěn)定劑以及鐵磁流體。應(yīng)理解的是，所述顆?？梢杂糜诟鞣N應(yīng)用。所述顆粒可以用于生物醫(yī)學(xué)、生物工藝學(xué)、制藥學(xué)和化學(xué)工業(yè)，并且可以用于提純，包括但不限于細(xì)胞富集和選擇、核酸提純和親合分離。當(dāng)所述顆粒用于臨床設(shè)置時(shí)，可以用于診斷試驗(yàn)例如癌癥篩選、癌癥監(jiān)控、作為治療技術(shù)例如移植、糖尿病和干細(xì)胞治療的制備工具。本申請公開的實(shí)施方式還提供可以用于富集生物材料和有機(jī)或無機(jī)材料的方案和方法，這些生物材料和有機(jī)或無機(jī)材料可能以低水平或極低水平存在于復(fù)合物中。所述的顆粒和方法可以克服與先前研制的磁性顆粒的尺寸、單M性、表面積和磁特性相關(guān)的問題。這些顆?？梢栽诤芤褐邢♂尪鴽]有出現(xiàn)顯著的因此，它們可以提供磁性富集來自血液、病毒、細(xì)胞器官中的稀有細(xì)胞的改進(jìn)方法，以及進(jìn)一步分離或富集無機(jī)分子和有機(jī)分子例如蛋白質(zhì)和核酸的改進(jìn)方法。它們也可以用于各種其它的應(yīng)用。所述顆?？梢杂糜诘v:設(shè)計(jì)應(yīng)用于高通量磁性分離方案的步驟中，并且可以使磁性標(biāo)記的細(xì)胞的回收率最大化。通過參考用以說明而并非進(jìn)行限制的如下實(shí)施例，將會更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:合成疏水性葡聚糖在Domb的美國專利7，001，891中詳細(xì)描述了疏水性葡聚糖的合成。該專利教導(dǎo)通過包括酯鍵、亞胺鍵、胺鍵或碳酸酯鍵的反應(yīng)將疏水鏈共軛結(jié)合("枝接，，)到葡聚糖及其它多糖的方法。當(dāng)合成疏水性葡聚糖時(shí)，溶劑選擇是重要的，因?yàn)槿軇┍仨毞稚⒃虾妥罱K產(chǎn)物以及能夠使全部偶合反應(yīng)得以發(fā)生。也必須選擇取代度,取代度通常是葡聚糖的分子量和脂肪酸的鏈長的函數(shù)。通常，高分子量烷基鏈以低取代度進(jìn)行偶合以保持水溶性。低分子量鏈允許較高的取代度。根據(jù)本發(fā)明的葡聚糖脂肪族羧酸酯的取代度為0.05%-20%。正如與分子量有關(guān)的上述具體說明，取代度也是統(tǒng)計(jì)數(shù)值。實(shí)施例2:合成磁性鐵顆粒在一個(gè)實(shí)施方式中，通過混合二價(jià)鐵(Fe+2)溶液與三價(jià)鐵(Fe+3)的溶液，并向該溶液中添加氫氧化銨溶液來合成,茲性(Fe304)。將約1.51g的FeCl3'6H20和0.64g的FeCl2'4H20溶解于40ml的N2凈化的水中。將約0.1克的油酸或其它脂肪酸添加到在丙酮中，并且在65。C下并在N2保護(hù)下進(jìn)行反應(yīng)。在劇烈攪拌時(shí)，通過添加20ml的28%(v/v)NH40H,將該混合物滴定至pH值為9-10。將該反應(yīng)在pH值高于9.5下保持60分鐘，然后加熱到90。C保持1小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻到室溫，然后用乙酸進(jìn)行酸化。然后添加約3體積的甲醇，并且將磁性材料捕集在磁棒上。用50:50的丙酮:曱醇混合物徹底清洗該材料，并且收集在磁棒上。然后在水中清洗該材料幾次，以去除三價(jià)鐵的氫氧化物(FeOOH)，然后通過3次離心分離除去大的團(tuán)聚物(以600xg低速臨床離心機(jī)，5分鐘)。干燥該材^F，在25mL的氯仿中再懸浮，并且以4，500xg離心分離30分鐘。在這些條件下極少材料進(jìn)行沉淀，但是通常在管底部觀測到極細(xì)的顆粒。磁性顆粒不容易通過磁性捕獲從氯仿中進(jìn)行回收，然而如果保留在磁性表架中，磁性顆粒可以在12-16小時(shí)后回收。通過干重分析來測定，在過程結(jié)束時(shí)收集的純化^磁性顆粒的量為500-750mg。實(shí)施例3:用疏水性葡聚糖包覆鐵-油酸顆粒將實(shí)施例2中制備的鐵-油酸顆粒^t在己烷和氯仿中，而不是分散在含水緩沖液中。為了將這些顆粒轉(zhuǎn)移到含水相中，通過油酸酯-葡聚糖進(jìn)行自締合，從Fe的油酸酯側(cè)鏈和從葡聚糖的油脂酸側(cè)鏈進(jìn)行交錯(cuò)使得形成脂肪酸層，該脂肪酸層將親水性葡聚糖層與FeO鐵芯核隔離。包覆材料具有高磁性、可水分散的，并且易于進(jìn)行常規(guī)偶合作用以進(jìn)行配體連接?？梢允褂镁哂胁煌〈?油酸酯單元/糖類單元)的油酸酯-葡聚糖共軛結(jié)合物。也可以由不同的葡聚糖分子量、不同的多糖和不同的脂肪族分子來制備脂類多糖共軛結(jié)合物以滿足具體的需要?？梢栽诳扇芙釬e。的氯仿-曱醇(v/v比2:1)中進(jìn)行自締合反應(yīng)。也可在其它的溶劑例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-曱基吡咯烷酮、四氬呋喃聚乙二醇醚、丙二醇、乙腈或油酸乙酯中進(jìn)行自締合。許多這些試劑被FDA(FDAandCDER,GuidenceforIndustry:QC3TablesandList(2003)，參見http:〃www.fda.gov/cder/guidance/index.htm)認(rèn)定是2類(限制4吏用)或3類(低毒)溶劑。向5mL的二曱亞砜(DMSO)中添加約150mg的疏水性葡聚糖，將該混合物在65。C下保溫20分鐘。然后以4500rpm的速率離心分離20分鐘，隨后過濾透明上層清液。然后將過濾后的葡聚糖放置于在50。C下以IOOW才喿作的水浴超聲波儀中。通常在體積不超過0.5mL的氯仿中添加約15mg的鐵-油酸。將該混合物在50。C下保溫并伴隨超聲處理30分鐘。在此期間，升高的溫度使氯仿?lián)]發(fā)，這促進(jìn)了鐵-油酸酯轉(zhuǎn)移到二曱亞砜中。當(dāng)保溫結(jié)束時(shí)，通過真空除去殘留的氯仿蒸氣。向該反應(yīng)中添加約5體積的0.5M的NaCl，使用密理博培肯XL型(MilliporePelliconXL)盒式切向流動過濾裝置將該混合物滲濾整夜。然后將濾液以4500rpm的速率離心分離20分鐘，隨后使用裝配有500kDaMW的截止聚醚砜過濾器的攪拌單元壓濾(N2)透明上層清液。所獲得的材料保持懸浮狀態(tài)幾個(gè)星期，并且直徑為200-250nm。以至少75%的初始鐵顆粒分布到含水相中來判斷成功的自締合。該材料是單分散性的，且保持至少80%的其原始磁特性。通過原子吸附和感應(yīng)偶合等離子體-光學(xué)電子光語法進(jìn)行鐵定量分析，同時(shí)通過細(xì)胞跟蹤測速儀和磁場場流分離來測定^f茲特性。通過透射電鏡(TEM)對包覆的鐵顆粒進(jìn)行物理分析，其結(jié)果表明鐵(Fe304)芯核具有20-70nm的晶粒尺寸。動力學(xué)光散射(DLS)表明未進(jìn)行超聲處理的包覆葡聚糖的顆粒的平均流體動力學(xué)半徑是約為200-300nm直徑的團(tuán)聚體(參見圖3)。劇烈的探針超聲處理并不能減少所述的平均團(tuán)聚尺寸。通過傅里葉變換紅外光語(FTIR)證實(shí)了在鐵顆粒表面上存在油酸包覆層，該傅里葉變換紅外光譜在2800-3000cnT1區(qū)域顯示出油烯基的特有的對稱和不對稱CH2伸縮方式(Shukla等人，Supra)。在未包覆的顆粒上并不存在這些峰。在疏水性葡聚糖和疏水性鐵芯核之間的自締合反應(yīng)的證據(jù)包括在常規(guī)尺寸篩分分離柱上常見出現(xiàn)與峰值鐵含量反應(yīng)的峰值葡聚糖。圖4顯示了在丙烯葡聚糖凝膠S-300(分離柱尺寸45x2.5cm)上進(jìn)行色譜分析的自締合磁性顆粒的典型分離柱分布圖。在這些研究中，通過如Ludwig和Goldberg1061^.1163.35(1):卯.(1956)描述的蒽酮活性過程測量葡聚糖。通過感應(yīng)偶合等離子體光電鐠進(jìn)行鐵含量分析。洗提在孔隙體積中的顆粒，所述顆粒具有220-280nm的粒度分布。如果使用常規(guī)的葡聚糖(例如Dextran70,000)代替所述疏水性葡聚糖，則不會發(fā)生自締合，并且觀察到非常不均勻的團(tuán)聚體，其最小尺寸為2-4微米。此外，磁性收集并且徹底清洗的顆粒顯示出強(qiáng)的蒽酮活性。實(shí)施例4:用疏水性硅烷包覆鐵-油酸顆粒約lmL的包覆脂肪酸的鐵顆粒與lmL的辛基癸基三乙氧基硅烷或辛基癸基三甲氧基硅烷(Gelestlnc.，Morrisvme,PA)在50mL的菲肯試管(Falcontube)中混合，然后置于65。C水浴中。將該試管超聲處理約30分鐘，通過真空吸氣定期去除氯仿蒸氣。在單獨(dú)的燒杯中，通過將1.8g的十六烷基三曱基溴化銨、35.2g的環(huán)己烷、3.5mL的丁醇和0.88mL的33%氬氧化銨混合來生成穩(wěn)定的微乳液。將該混合物劇烈攪拌直到反應(yīng)液透明。然后將硅烷/鐵混合物逐滴添加到該微乳液中，同時(shí)快速攪拌反應(yīng)液。在20分鐘后，將該混合物倒入菲肯試管中，然后輕微搖動整夜。第二天，將該磁性材料進(jìn)行磁性收集，在100%乙醇中清洗幾次。用100mM的Tris、150mM的NaCl和0.05。/。的Tween-20(pH值為8.2)清洗該材料，并且在少量體積的相同緩沖液中再懸浮該材料，在S印hacryl-100上通過凝膠過濾色鐠進(jìn)行尺寸分離。在2.5x33cm的分離柱上應(yīng)用5mL的反應(yīng)混合物，用100mM的Tris、150mM的NaCl和0.05。/o的Tween-20(pH值為8.2)進(jìn)行洗提。在空隙體積部分中出現(xiàn)純化的磁性顆粒，并且通過干重分析測定，該磁性顆粒具有約10mg/mL的濃度。實(shí)施例5:配體連接氫封端的表面與烷氧基硅烷和氯硅烷進(jìn)行硅烷化是用于二氧化硅表面衍生的最為普通的方法。該反應(yīng)被認(rèn)為包括Si-H表面的化學(xué)氧化以形成Si-OH中間體。該硅烷化反應(yīng)被認(rèn)為通過硅-氬基團(tuán)的催化水解進(jìn)行，接著用烷基硅烷提取表面-OH。用于將官能團(tuán)引入到顆粒表面上以與抗體、小分子、生長因子、鑭系元素和量子點(diǎn)進(jìn)行共價(jià)連接的硅烷化試劑包括DETA(三曱氧基曱硅烷基丙基二亞乙基三胺)、MPTMS(巰基丙基三曱氧基硅烷)和APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)。對于包覆葡聚糖的材料不要求這種處理。對于通過施托貝合成方法(St6bersystheticprocess)所制得的材料(W.Stober等人，J.ColloidInterf.Sci.26,62(1968)),如果剛完成所述合成，則可以不需要對二氧化硅表面進(jìn)行氧化預(yù)處理。對于多孔的二氧化硅，在氧化預(yù)處理過程中，較弱的硅-硅一睫也是活性的，這導(dǎo)致在表面上形成過氧化層。解決這種問題的最簡單方法是使所述表面直接硅烷化，而不需要用氧化劑進(jìn)行預(yù)處理。盡管如此，多孔材料中的Si-Si鍵仍然易于氧化斷裂。除硅烷化試劑之外，也需要一些同基雙功能交聯(lián)劑或異基雙功能交聯(lián)劑以連接配體和所述顆粒。用于這種的異基雙功能試劑包括SMCC(琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺曱基]環(huán)己烷-l-羧酸酯)、SAED(硫代琥珀酰亞胺2-[7-氨基-4-曱基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-l，3'二硫代丙酸酯)和SATA(N-琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?。此外，可以使用各種聚乙二醇衍生物，包括PEG-順丁烯二酰亞胺、PEG-NHS、PEG-二曱基丙烯酸酯、異基雙功能PEG和不連續(xù)的PEG(含有2、4或6個(gè)PEG單元)。對于包覆葡聚糖的材料，可以使用肼/羰基反應(yīng)，這生成穩(wěn)定的腙鍵。在過去，利用腙鍵的偶合劑已經(jīng)難以使用，并且不易簡單合成。近來，化學(xué)試劑琥珀酰亞胺4-肼基煙酸酯丙酮腙(SANH)已經(jīng)可以從蘇羅林科有限公司(Solulinklnc，SanDiego，CA)市售獲得，它可以提供連接配體的簡單方式。在肼之后的化學(xué)過程是基于2-肼基吡咬基部分與苯曱醛的反應(yīng)以生產(chǎn)穩(wěn)定的雙芳香腙。在這個(gè)過程中，用SANH改性抗生蛋白鏈菌素或IgG，并且將抗生蛋白鏈菌素或IgG與醛改性的顆?；旌弦陨山橛陔曛虚g的共輒結(jié)合物。在反應(yīng)中剩余部分是水，不需要還原劑來穩(wěn)定腙。對該反應(yīng)進(jìn)行酸催化，然而直至pH值最高達(dá)到8.0才發(fā)生反應(yīng)。在與SANH^應(yīng)之后，抗體或抗生蛋白鏈菌素仍然保持它們主要的連接活性。表格l概括了與抗生蛋白鏈菌素偶合的磁性顆粒的蛋白質(zhì)分析。通常，每mL顆粒(約1-5%固體物)偶合2-5昭的抗生蛋白鏈菌素，總的偶合率為40-60%。由在溶膠-凝膠合成過程中直接添加抗生蛋白鏈菌素(5mg)獲得最高的抗生蛋白鏈菌素偶合率。在合成過程中添力口PEG-600(2%v/v)以穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性。表1.用抗生蛋白鏈菌素偶合的磁性顆粒的功能測試<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>琥珀酰亞胺6-肼基煙堿丙酮腙:(3-氨基丙基)三乙氧基曱硅烷；'(3-巰基丙基)-三乙氧基曱硅烷*使用0.5mg/mL抗生蛋白鏈菌素的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例6:生物分離應(yīng)用。在通過四核J茲性分選(QMS)從粗短刺狀血沉棕黃層分離出癌細(xì)月包之前，通過細(xì)胞跟蹤測速儀(CTV)方法分析被標(biāo)記細(xì)胞的遷移率測量，以確定QMS系統(tǒng)的操作參數(shù)。血沉棕黃層從俄亥俄州哥倫布美國紅十字會分社購得。通過密度梯度離心分離獲得單核細(xì)胞(MNC),并且快速用標(biāo)記的緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水，0.05%人血清白蛋白，2mM的EDTA)清洗。通過胰蛋白酶消化；來去除附著的卵巢癌細(xì)胞(四癌PA-1),并且用含血清的標(biāo)記緩沖液進(jìn)行清洗以使胰蛋白酶失活。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且以1個(gè)腫瘤細(xì)胞/10個(gè)總MNC細(xì)胞的濃度將腫瘤細(xì)胞摻入到MNC中。在完成摻入之后，開始標(biāo)記過程。每5xl07個(gè)細(xì)胞再懸浮在200pL的體積中，并且向再懸浮的細(xì)胞中添加100nL的抗-CD45生物素化的抗體。使用抗-CD45抗體標(biāo)記所有的MNC以從細(xì)胞懸浮液中去除它們，留有未標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，因此腫瘤細(xì)胞是沒有損失的。細(xì)胞懸浮液與第一抗-CD45抗體在4。C下保溫15分鐘，一旦保溫時(shí)間結(jié)束，添加2x染色體積的標(biāo)記緩沖液。以1500rpms離心分離6分鐘，并且以200pL/5xl(^個(gè)細(xì)胞的濃度再懸浮細(xì)胞顆粒。向再懸浮的顆粒中添加200jxL的與三組分顆粒連才妾的抗生蛋白鏈菌素。細(xì)胞和顆粒在4。C下保溫15分鐘。在保溫時(shí)間結(jié)束后，通過添加2x染色體積標(biāo)記緩沖液進(jìn)行清洗步驟，并且以1500rpm的速率離心分離6分鐘，來去除細(xì)胞和過量的顆粒。然后細(xì)胞顆粒在4mL的體積中^皮再懸浮，取出500(iL等份以分析標(biāo)記的細(xì)胞，獲得平均的磁泳遷移率，這控制QMS分離可以進(jìn)行的快或慢。圖2顯示出用CNW顆粒標(biāo)記的CD45+MNC和用美天旎MACS珠(MiltenyiMACSbead)標(biāo)記的CD45+MNC的磁泳遷移率。與用美天旎MACS珠顆粒標(biāo)記的相反，當(dāng)用在此制得的顆粒標(biāo)記時(shí)細(xì)胞移動更快。在由CTV分析獲得的平均遷移率之后，剩余的細(xì)胞在QMS系統(tǒng)中進(jìn)行分離。細(xì)胞被引入到供料注射器中，并且QMS以沉積方式運(yùn)行，使得在液流中獲得無磁性細(xì)胞或未標(biāo)記的細(xì)胞，而在QMS系統(tǒng)的溝道壁上收集磁性細(xì)胞或被標(biāo)記的細(xì)胞。在分離之后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且通過錐蟲藍(lán)拒染法測定生命力。當(dāng)濃度太低以致不能通過流動血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，生成細(xì)胞尖硬纖維(Cytospins)用于檢測和定量分析腫瘤細(xì)胞。平均的回收率非常好。腫瘤細(xì)胞摻入的量允許獲得1個(gè)腫瘤細(xì)胞/107全部細(xì)胞。被污染細(xì)胞的消耗的對數(shù)值3.21高于先前已經(jīng)公開的數(shù)值(P.deCremoux等人，ClinCancerRes6(8)，3117(2000)),同樣地，腫瘤細(xì)胞的74。/。平均回收率遠(yuǎn)超過使用常規(guī)商用試劑QMS富集獲得的典型50%平均回收率。實(shí)施例7:用聚乙烯亞胺(PEI)葡聚糖對包覆碳的鐵顆粒進(jìn)行包覆向5mL的二甲亞砜(DMS0)中添加約150mg的共軛精胺的葡聚糖，將該混合物在65。C下保溫20分鐘以溶解葡聚糖。然后以4，500rpm的速率離心分離20分鐘，隨后過濾透明上層清液。然后過濾的葡聚糖放置于65。C下且以100W操作的水浴超聲波儀中。添加約150mg的包覆碳的鐵(鐵芯核尺寸為5-55nm，具有20nm的碳包覆層)，通常通過在葡聚糖溶液的表面上噴灑粉末來添加。允許將該混合物在65。C下保溫且同時(shí)超聲處理18-24小時(shí)。向反應(yīng)中添加約5體積的0.5M的NaCl，并且使用密理博培肯XL型(MilliporePelliconXL)盒式切向流動過濾裝置混合物滲濾整夜。然后濾液以4500rpm離心分離20分鐘，隨后通過裝配有500kDaMW截止聚醚^風(fēng)過濾器的攪拌單元對透明上層清液進(jìn)行壓濾(N2)。以這種方式制備的材料在HEPES緩沖鹽水以及磷酸鹽緩沖鹽水中是可分散的。該材料在懸浮液中保持幾個(gè)星期，并且具有100-1000nm的直徑?？磥硭坪踉摬牧嫌啥鄠€(gè)包裹一層或多層PEI-葡聚糖的鐵芯核構(gòu)成。應(yīng)理解的是，以上公開的內(nèi)容及其它特征與功能或其可替換的實(shí)施方式中的幾種可以組合成許多其它的不同系統(tǒng)或應(yīng)用。還應(yīng)理解的是，由本領(lǐng)域4支術(shù)人員可作出各種目前料想不到或無法預(yù)測的替換方式、改變、變化或改進(jìn)，也包括在如下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種顆粒，包括至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒；和包覆層，其中所述包覆層包括至少一個(gè)疏水部和至少一個(gè)親水部，選擇所述疏水部以與所述疏水性保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的分散。2.如權(quán)利要求1所述的顆粒，其中，選擇所述疏水性保護(hù)層以防止所述至少一個(gè)^f茲芯顆粒氧化。3.如權(quán)利要求1所述的顆粒，包括具有與所述包覆層緊接的疏水性保護(hù)層的單個(gè)磁芯顆粒。4.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中所述顆粒包括多個(gè)磁芯顆粒；所述多個(gè)磁芯顆粒中的每個(gè)磁芯顆粒具有疏水性保護(hù)層；并且所述包覆層與具有疏水性保護(hù)層的所述多個(gè)磁芯顆粒中的一個(gè)以上顆粒緊接。5.如權(quán)利要求1所述的顆粒，其中，所述至少一個(gè)》茲芯顆粒具有約5nm-約2,的尺寸。6.如權(quán)利要求1所述的顆粒，其中，所述至少一個(gè)^f茲芯顆粒具有約20nm-約300nm的尺寸。7.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述顆粒具有約20nm-約4.5pm的尺寸。8.如權(quán)利要求1所述的顆粒，其中，所述顆粒具有約200nm-約400nm的尺寸。9.如權(quán)利要求1所述的顆粒，還包括與所述親水部連接的配體。10.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述磁芯選自鐵氧體、金屬、金屬合金、鐵氧化物、二氧化鉻以及它們的組合。11.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述疏水性保護(hù)層包括飽和或不飽和的、共軛或非共軛的、被取代或未被取代的有機(jī)酸或者具有約10-約22個(gè)碳原子的一元羧酸。12.如權(quán)利要求11所述的顆粒，其中，所述疏水性保護(hù)層包括至少一種脂肪酸，所述脂肪酸選自由己酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十四烷酸、亞麻酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、異硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、油酸、和亞油酸。13.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述至少一個(gè)疏水部包括飽和或不飽和的、共軛或非共軛的、被取代或未被取代的有機(jī)酸或具有約10-約22個(gè)碳原子的一元羧酸。14.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述包覆層的至少一個(gè)親水部選自多糖、可生物降解的聚合物、聚烯烴以及它們的組合。15.如權(quán)利要求14所述的顆粒，其中，所述疏水性保護(hù)層包括至少一種脂肪酸，并且所述包覆層的所述疏水部包括至少一種脂肪酸。16.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述包覆層的所述至少一個(gè)親水部包括至少一種葡聚糖。17.如權(quán)利要求l所述的顆粒，其中，所述包覆層包括具有至少一個(gè)飽和或不飽和的、被取代或未被取代的、共軛或非共軛的脂肪族基團(tuán)的烷基硅烷。18.—種顆粒，包括至少一個(gè)具有碳保護(hù)層的磁芯顆粒；和包覆層，其中所述包覆層包括至少一個(gè)胺部和至少一個(gè)親水部，選擇所述胺部以與所述碳保護(hù)層的至少一部分自締合，選擇所述親水部以促進(jìn)所述顆粒在含水體系中的M。19.用于制備顆粒的方法，包括在第一溶劑中懸浮至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒；在第二有機(jī)溶劑中溶解包括疏水部和親水部的包覆層前體；以及將第一溶劑中的所述至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層的磁芯顆粒添加到第二溶劑中的所述包覆層前體中，使得形成至少一個(gè)具有疏水性保護(hù)層和包覆層的顆粒，其中所述包覆層前體的疏水部與所述疏水性保護(hù)層自締合。20.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括在添加所述至少一個(gè)/f茲芯顆粒的步驟之后去除所述第一溶劑和所述第二溶劑的步驟。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，去除所述第一溶劑和所述第二溶劑的所述步驟包括將溶液加熱至足夠的溫度，以去除所述第一溶劑和所述第二溶劑中的至少一種溶劑的至少一部分。22.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括通過滲析、柱色譜法、滲濾以及攪拌單元裝置中的壓濾中的至少一種或者它們的組合來去除所述第一溶劑和所述第二溶劑中的高沸點(diǎn)殘余物的步驟。23.如權(quán)利要求19所述的制備顆粒的方法，其中，所述第一溶劑選自氯仿、曱醇、己烷以及它們的組合。24.如權(quán)利要求19所述的制備顆粒的方法，其中，所述第二溶劑選自二曱基亞砜、二曱基曱酰胺、曱酰胺和N-曱基吡咯烷酮的混合物、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、N-曱基吡咯烷酮、四氪吹喃聚乙二醇醚、丙二醇、乙腈、油酸乙酯以及它們的組合。25.用于制備顆粒的方法，包括在有機(jī)溶劑中溶解包括胺部和親水部的包覆層前體；將至少一個(gè)具有碳保護(hù)層的磁芯顆粒添加到所述溶劑中的包覆層前體中，使得形成至少一個(gè)具有碳保護(hù)層和包覆層的顆粒，其中，所述包覆層前體的胺部與所述碳保護(hù)層自締合。全文摘要提供顆粒、制備顆粒的方法、使用顆粒的方法以及含有顆粒的試劑盒。所述顆?？梢园ň哂斜Ｗo(hù)層的磁性顆粒和具有親水部和疏水部的包覆層。文檔編號H01F1/00GK101553889SQ200780037171公開日2009年10月7日申請日期2007年9月5日優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日發(fā)明者克里斯蒂·馬里·梅爾尼克,阿爾凡·蘭佩紹德申請人:哥倫布納米制品公司