用于現(xiàn)場護(hù)理診斷使用的生物涂覆型壓電生物傳感器平臺的制作方法
【專利摘要】生物傳感器組件（芯片）是基于直接生物涂覆方法的，所述直接生物涂覆方法引起了錨定物質(zhì)在壓電活性晶體表面上的牢固且穩(wěn)定的非共價結(jié)合，所述錨定物質(zhì)例如有抗生物素蛋白或具有特異性結(jié)合搭配物的其他蛋白質(zhì)或寡核苷酸或聚核苷酸。構(gòu)想了在生物分析法中的特定應(yīng)用。錨定物質(zhì)的穩(wěn)定單層形成了反應(yīng)性層，其可用于結(jié)合用以捕捉和檢測生物流體樣品中的分析物的捕捉試劑，例如生物素化抗體。一些實施例是針對一種在特定的聲波板模式生物傳感器上施加有前述生物涂層的生物傳感器，其中在晶體的生物涂覆膜的相對側(cè)上存在交叉指型轉(zhuǎn)換器（IDT）。其他實施例涉及合并所述生物涂層的多陣列裝置，用于檢測所述裝置上的多種分析物。應(yīng)用包括用于檢測感染的現(xiàn)場護(hù)理診斷。
【專利說明】用于現(xiàn)場護(hù)理診斷使用的生物涂覆型壓電生物傳感器平臺
[0001]本申請案是作為艾維納分子技術(shù)有限責(zé)任公司(Aviana MolecularTechnologies, LLC)(一家美國公司，它是除美國之外的所有國家的指定的 申請人:)、美國公民 Lisa Laury-Kleintop、臺灣公民 Hsu-Cheng Ou 以及美國公民 Herman Rutner (他們僅是美國的指定的 申請人:)名下的PCT國際專利申請案在2012年8月27日遞交的，并且要求2011年8月26日遞交的美國臨時專利申請案序列號61/527，716的優(yōu)先權(quán)，該申請案在此以全文引用的方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明大體上涉及用于分析含有目標(biāo)分析物的測試樣品的裝置和方法，所述目標(biāo)分析物包括蛋白質(zhì)和核酸。本發(fā)明使用集成芯片作為具有生物涂層的敏感生物傳感器，所述生物涂層具有不可逆地將抗生物素蛋白或另一種蛋白/核苷酸結(jié)合到壓電材料(例如晶體)表面上的能力。所得到的平臺技術(shù)適用于多種生物傳感器的研發(fā)。在更特定的實施例中，所述生物涂層是直接涂覆到壓電材料表面上的而不存在介入涂層。在另一特定實施例中，本發(fā)明涉及一種聲波板模式生物傳感器，其中在與承載生物涂覆膜的側(cè)面相反的表面上存在交叉指型轉(zhuǎn)換器(IDT)，避免了晶體上的保護(hù)性涂層和波導(dǎo)的需求。
【背景技術(shù)】
[0003]利用敏感的、特異性的和快速的檢測技術(shù)的低成本、大量生產(chǎn)的現(xiàn)場護(hù)理(POC)生物傳感器對全球的人類和獸醫(yī)保健具有潛在地巨大的流行病學(xué)影響。及時地檢測和治療影響人類和動物的通常占流行病比例的感染性疾病，尤其是急性的感染性疾病的合適的裝置將最大程度的使社會需求受益。合適的POC裝置應(yīng)必須是以較低成本和較大數(shù)量制造的，以允許對潛在暴露個人的較大群體進(jìn)行監(jiān)測。這些傳感器需要是足夠穩(wěn)固的，以便在不利的條件下使用，例如熱帶和亞熱帶氣候，并且還需要能夠在資源豐富和資源有限的環(huán)境中由非實驗室培訓(xùn)人員簡單地使用。此外，此類裝置應(yīng)該是單次使用、低成本以及一次性的，從而不會成為疾病的傳播體。當(dāng)前方法水平的POC裝置(如橫向流動裝置)并不滿足此需求，這是因為結(jié)果的靈敏度較低和/或可變性較高，以及其他缺陷。另一方面，非常敏感的診斷工具(例如核苷酸檢測)需要復(fù)雜的分離和處理，使得這些診斷裝置難以用于現(xiàn)場環(huán)境?；趯嶒炇业南到y(tǒng)是精確的(敏感的和特異性的)，但是它們不易于運(yùn)輸?shù)幕蛩俣嚷?，并且它們需要專門培訓(xùn)過的人員進(jìn)行操作。本發(fā)明描述了一種產(chǎn)生高度敏感的生物傳感器的方法，所述生物傳感器可以在許多環(huán)境下用作POC裝置。這些生物傳感器在已知的(以及創(chuàng)新的)聲波傳感器上提供了一種可擴(kuò)展的生物涂層，使得在多種非生物環(huán)境中使用的傳感器可供在非實驗室(例如現(xiàn)場)環(huán)境的POC裝置中使用。
[0004]眾所周知，在壓電晶體中產(chǎn)生的聲波當(dāng)施加到裝置時是極其敏感的，由于質(zhì)量和/或粘度的改變，導(dǎo)致在所述質(zhì)量的應(yīng)用之前和之后的此類聲波的頻率和/或相位或幅度的改變，這可以電子地進(jìn)行測量并且與所述質(zhì)量的存在相關(guān)。因此，它們被用作非常敏感的化學(xué)或氣體傳感器，所述化學(xué)或氣體傳感器能夠檢測十億分率的質(zhì)量變化或非常小的溫度變化或氣體濃度的變化。然而，由壓電活性材料(例如晶體)制成的作為生物傳感器的這些裝置的使用僅獲得了有限的成功，這要么是因為所施加的生物流體抑制了所產(chǎn)生的波，要么是因為所施加的膜是難以始終如一地以大規(guī)模制造的，從而將它們限制于資源豐富的復(fù)雜環(huán)境中，例如研究實驗室。
[0005]使這些聲波傳感器具有作為生物傳感器的功能的嘗試已經(jīng)導(dǎo)致了冗長的或不一致的結(jié)果，并且難以對方法進(jìn)行放大。此外，這些涂覆方法還必須考慮到附著到這些晶體上的用于傳輸聲波的電氣導(dǎo)電單元，并且具體來說必須不會干擾波的傳輸。(類似地，晶體結(jié)構(gòu)必須是與波傳輸相容的。)另外，所述生物涂覆方法必須不會使聲波衰減或毀壞。鑒于這些多種局限性，生物涂層方面的發(fā)展一直以來都使用一種類似的方法，即，將化學(xué)試劑附著到晶體表面，而晶體表面還可以結(jié)合例如抗體等生物活性劑。有兩種方法通常用于沉積第一功能涂層:一種方法涉及涂覆真空濺射的金的薄層，所述涂層可以與異雙官能硫醇或衍生的二硫化物(例如羧甲基-聚乙二醇-硫醇，5000,萊桑生物(Laysan Bio))上的硫官能團(tuán)反應(yīng)，并且另一種方法涉及采用合適的市售異雙官能硅烷(例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷(G0PS)、3-巰基丙基三乙氧基硅烷(MPTS))對壓電式傳感器表面上的羥基進(jìn)行直接官能化，以與硅烷形成共價的一價或二價硅酸鹽鍵。另一種抗生物素蛋白附著方法涉及首先將脂質(zhì)(化學(xué)年報(Annals of Chem.),第69卷:4808-4813)和水凝膠沉積到表面聲波傳感器上(澳大利亞專利07473551)，隨后進(jìn)行抗生物素蛋白的沉積。
[0006]這些方法通常是耗費(fèi)時間的并且用于涂覆的方法是復(fù)雜的。它們需要與異雙官能硅烷試劑進(jìn)行長期的液相接觸。這些硅烷通常是作為非反應(yīng)性溶劑(如甲苯、2-丙醇)中或含水溶劑等中的溶液形式提供的，以沉積單層或多層。然而，出于若干原因，此過程是難以控制的。首先，所述硅烷中的一些，例如三甲氧基硅烷，是非常容易發(fā)生反應(yīng)的；而其他的硅烷，如三乙氧基硅烷，反應(yīng)性稍弱但是在水解下不太穩(wěn)定。另一原因是因為硅烷的反應(yīng)性、它們所擁有的若干可鍵聯(lián)基團(tuán)以及它們傾向于與額外的硅烷分子發(fā)生反應(yīng)并且鍵聯(lián)，所以難以獲得單層的硅烷沉積物，而這以難以控制和維持均一性的方式改變了被涂覆的襯底的透射特性。即使是痕量水的存在也會額外地使過程控制變得復(fù)雜，因為硅烷通過形成反應(yīng)性的硅醇或硅二醇而變得更加容易交聯(lián)。通常使用的APTES尤其容易形成多層。異雙官能硅烷GOPS具有環(huán)氧基團(tuán)或環(huán)氧乙烷基團(tuán)，主要取決于pH值，所述基團(tuán)選擇性地與硫醇、胺和羥基發(fā)生反應(yīng)，例如，在大約7的pH值下與硫醇發(fā)生反應(yīng)，在大約9的pH值下與氨基發(fā)生反應(yīng)，并且在大于10的pH值下與羥基發(fā)生反應(yīng)。它可以用于與抗體上的一個或多個胺基直接偶聯(lián)，或者與固定化抗生物素蛋白(例如中性抗生物素蛋白(neutravidin))上的大約一半的氨基直接偶聯(lián)。但是這些流程涉及濕法化學(xué)和共價鍵，它們使涂覆方法復(fù)雜化并造成延遲并且增大了副反應(yīng)的可能性，而這會干擾所得到的裝置的精確性。(GT Hermanson,生物偶聯(lián)技術(shù)(Bioconjugate Techniques), 1996,第 142 頁)。
[0007]總體來說，用于在壓電材料上沉積中間和最終的蛋白層的現(xiàn)有技術(shù)SAM方法需要連續(xù)的步驟，包括在含水溶劑或惰性非質(zhì)子媒介中與多種試劑一起培育、中間沖洗、PH值變化和最終暴露于結(jié)合蛋白以完成所希望的功能性SAM親和性生物傳感器。這些逐步過程可能會耗費(fèi)數(shù)小時或者甚至數(shù)天，并且可能產(chǎn)生功能上可變的、昂貴的且因此在POC生物傳感器應(yīng)用中無法接受的SAM生物傳感器。所屬領(lǐng)域中的這些方法顯然不適于在低成本下的以及在可擴(kuò)展的高通量模式的潛在地具有數(shù)百萬的一次性使用的生物傳感器中(其中方法變化或者失敗將是非常不希望的)的均一生物傳感器的持續(xù)的且有成本效益的生產(chǎn)。
[0008]本發(fā)明部分地描述了一種方法，該方法允許蛋白質(zhì)(例如，不僅是抗生物素蛋白，而且還有具有必需的可鍵聯(lián)基團(tuán)的其他生物材料(核酸、其他蛋白質(zhì)))直接結(jié)合在晶體表面上，從而帶來了用于制造均一且可信賴的生物傳感器的穩(wěn)定且可擴(kuò)展的方法。本發(fā)明進(jìn)一步合并使用了兩種類型的傳感器，即，體波和水平剪切表面聲波，并且可以在多種壓電活性的晶體材料上使用。使用此直接涂層，本發(fā)明已經(jīng)克服了上述的許多困難。
[0009]雖然用于形成聲波引導(dǎo)的壓電材料是眾所周知的并且包括鈮酸鋰、鉭酸鋰、石英和若干其他物質(zhì)，但是每一者在平臺裝置的開發(fā)中都提供了獨特的優(yōu)勢和劣勢。因此，希望的是任何涂覆方法都可以適用于全部的壓電材料襯底，以便提供用于檢測自然界中的造成感染和感染后果的各式各樣的多種介質(zhì)的最大潛在變化，所述介質(zhì)包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、核苷酸、寄生蟲、真菌等等，并且值得注意的是其單獨組分以及例如病原體片段等較大的粒子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]描述了一種聲波生物傳感器系統(tǒng)，其合并了沉積在壓電介質(zhì)(晶體)的傳感器表面上的生物膜。所述生物膜包括一種存在特異性結(jié)合搭配物的生物活性錨定物質(zhì)的涂層，所述生物活性錨定物質(zhì)例如是抗生物素蛋白(而且還可以使用具有特異性結(jié)合搭配物的其他蛋白質(zhì)(例如配體)和核酸(例如寡核苷酸和聚核苷酸))，所述涂層形成了直接位于晶體表面上的穩(wěn)定單層。所述方法適用于按比例增大，從而使用自動化或半自動化技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模制造。
[0011]因此，本發(fā)明是針對一種生物傳感器及其制造和使用方法，所述生物傳感器包括在壓電表面上直接涂覆有錨定層(例如抗生物素蛋白膜)的壓電介質(zhì)。在抗生物素蛋白涂層的情況下，為了檢測生物樣品中的目標(biāo)分析物，將生物素化的捕捉試劑結(jié)合到生物膜。在其他錨定物質(zhì)的情況下，捕捉試劑必須是由針對錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物衍生的。將含有目標(biāo)分析物的生物樣品與生物膜接觸放置。捕捉試劑特異性地識別目標(biāo)分析物并且結(jié)合到目標(biāo)分析物。結(jié)合被檢測為橫越傳感器表面的聲波的擾動(頻率、相位和/或幅度的改變)。這種擾動隨后被轉(zhuǎn)化為電子信號以用于進(jìn)一步的分析，即，與目標(biāo)分析物的存在的相關(guān)性以及任選地其量化。
[0012]在另一方面中，所述生物傳感器基底可以由二氧化硅、氧化鋯、二氧化鈦等的中間襯底層來修飾，這不是通過昂貴的且冗長的熱真空濺射方法來常規(guī)地完成的，而是通過硅酸鹽、鈦酸鹽、鋯酸鹽等的共價結(jié)合的簡單兩步方法完成的，方法是在受控的條件下用裸露的壓電芯片基底表面接觸適當(dāng)介質(zhì)中的對應(yīng)的鹽，隨后借助于酸處理步驟將結(jié)合的襯底層轉(zhuǎn)化為二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋯等的層，由此取決于鹽濃度和接觸時間，形成具有可控厚度的均一的二級氧化物層，其中此種中間氧化物層(或多層)可以隨后由穩(wěn)定結(jié)合的錨定層(例如，抗生物素蛋白)來涂覆，所述錨定層適用于與特異性捕捉試劑(例如，針對特異性分析物目標(biāo)的抗體)反應(yīng)，所述特異性捕捉試劑是通過與錨定材料(例如，生物素基團(tuán))的特異性結(jié)合搭配物而被適當(dāng)?shù)匦揎椀摹?br> [0013]在包括硅酸鹽、鈦酸鹽、鋯酸鹽等的中間涂層的生物傳感器的又一方面中，可以任選地將最佳濃度和PH值下的涂層溶液與對堿穩(wěn)定的抗生物素蛋白混合并且使其干燥，由此將鹽結(jié)合到基底層并且同時部分地在玻璃狀的結(jié)合鹽膜中包埋抗生物素蛋白，這在酸處理之后將結(jié)合的鹽膜轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定地包封抗生物素蛋白的多孔氧化物層，所述抗生物素蛋白仍然具有可用于結(jié)合生物素化捕捉試劑的大量的暴露的生物素位點。
[0014]在另外的其他方面，本發(fā)明是針對一種涂覆生物傳感器的方法，所述生物傳感器適用于使用聲波在生物樣品中檢測一種或多種分析物，所述生物傳感器包括具有附著到其上的錨定層(例如，抗生物素蛋白層)的壓電材料，所述方法包括將抗生物素蛋白沉積到壓電材料的一個表面的一部分上，所述部分適于接收生物樣品，和通過包括用本文中所揭示的方法進(jìn)行涂覆的步驟，直接或間接地將所述附著的抗生物素蛋白固定到所述壓電表面部分上。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步包括用于快速POC診斷的系統(tǒng)中的新穎壓電生物傳感器裝置和平臺的使用。因此，本發(fā)明的生物傳感器提供了一種作為POC診斷工具的敏感的、便宜的且簡單的方法和相關(guān)裝置的依據(jù)。本發(fā)明允許一種在現(xiàn)有的制造設(shè)施或傳送帶上使用新穎的快速涂覆方法的簡單制造方法，產(chǎn)生了新穎的單次使用的、潛在地一次性的生物傳感器，所述生物傳感器可以用作臨床診斷中的有成本效益的替代性現(xiàn)場護(hù)理(P0C)。此類生物傳感器可以提供所需的靈敏度，可以在需要時快速地進(jìn)行部署，并且因此將是在發(fā)達(dá)世界以及資源有限國家中均有用的。具體來說，這些POC生物傳感器在涉及以下內(nèi)容的領(lǐng)域中可以是尤其有益的:檢測、抑制和治療影響人類和動物的急性感染性疾病，以及檢測在患病和健康病人的診斷和監(jiān)護(hù)中有用的特異性生物化學(xué)標(biāo)記。
[0016]一種聲波生物傳感器組件，其包括壓電晶體，所述壓電晶體包括直接結(jié)合到壓電材料的表面的錨定物質(zhì)層，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成。
[0017]一種用包括錨定物質(zhì)的生物膜涂覆壓電材料的表面的方法，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成，所述方法包括:
[0018]a.處理壓電材料的晶體表面以增大晶體表面的表面能；
[0019]b.將錨定物質(zhì)層施加到晶體表面；
[0020]c.在晶體表面上形成化學(xué)吸附型錨定層。
[0021]一種用包括錨定物質(zhì)的生物膜涂覆壓電材料表面的方法，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成，所述方法包括:
[0022]a.向壓電材料的晶體表面施加硅酸鹽、鋯酸鹽或鈦酸鹽的溶液并且與酸反應(yīng)以分別形成二氧化硅、氧化鋯或二氧化鈦的中間層；
[0023]b.將錨定物質(zhì)層施加到中間層，以在晶體表面上形成錨定層。
[0024]一種聲波生物傳感器，其包括:
[0025]a.壓電晶體，所述壓電晶體包括直接結(jié)合到壓電晶體的表面的錨定物質(zhì)層，所述層中的錨定物質(zhì)還結(jié)合到捕捉試劑，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成并且特異性地識別在生物流體中存在的分析物；
[0026]b.聲波發(fā)生器，所述聲波發(fā)生器產(chǎn)生波，其中捕捉試劑與分析物之間的反應(yīng)引起了聲波特性的可檢測的改變。
[0027]—種用于確定生物流體樣品中的分析物的存在或數(shù)量的方法，所述方法包括:
[0028]用包括捕捉試劑的組合物接觸前述生物傳感器組件,所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成并且還特異性地識別分析物；
[0029]使得捕捉試劑結(jié)合到錨定物質(zhì)，形成捕捉試劑層；
[0030]用生物流體樣品接觸結(jié)合的捕捉試劑；
[0031]和跨越壓電表面產(chǎn)生聲波；和
[0032]測量由分析物結(jié)合到捕捉試劑層引起的波的幅度、相位或頻率的任何改變。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:鈮酸鋰晶體上的中性抗生物素蛋白涂層的原子力顯微法(AFM).AFM圖像分析使用實例I中描述的方法示出了大約3nm到4nm的中性抗生物素蛋白涂層。圖(a)示出了未結(jié)合中性抗生物素蛋白的芯片的實時形貌特征曲線。圖(b)示出了具有Iym的納米凹痕區(qū)域的中性抗生物素蛋白涂覆表面的10 μ m的掃描。圖(c)是在壓痕具有大約3.229nm的深度之后結(jié)合到芯片的抗生物素蛋白的形貌特征曲線。
[0034]圖2:具有添加的抗登革熱抗體的鈮酸鋰晶體上的中性抗生物素蛋白涂層的原子力顯微法.中性抗生物素蛋白通過抗登革熱抗體的添加結(jié)合到鈮酸鋰芯片。圖(a)示出了在中性抗生物素蛋白中用Ab表面制成的納米凹痕區(qū)域的10 μ m的掃描，方法是掃描芯片的Iym的區(qū)域。圖(b)示出了圖(a)的4.6μπι的放大部分。圖(c)是示出了深度為0.269nm(或6-9nm的深度)的形貌特征曲線。
[0035]圖3:用于確認(rèn)鈮酸鋰芯片的表面上的抗生物素蛋白的FITC標(biāo)記的生物素珠粒.示出了在鈮酸鋰芯片的表面上不具有(a)或具有(b)抗生物素蛋白的生物素珠粒(英杰公司)的熒光圖像(200x)。(a)中的箭頭表示珠粒與晶體的非特異性結(jié)合。(b)中的箭頭表示珠粒與晶體上的抗生物素蛋白涂層的結(jié)合。
[0036]圖4:抗生物素蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性.在超過一個月的周期內(nèi)確定結(jié)合到鈮酸鋰的抗生物素蛋白的光學(xué)密度(0.D.)?？股锼氐鞍淄扛残酒瑑Υ嬖?°C下并且每周對其進(jìn)行測試。對于第I周、第2周和第4周來說，所述結(jié)合保持大致相同(在第3周的衰退被視作是無效的并且這是由于錯誤的試劑造成的)。
[0037]圖5:結(jié)合到鈮酸鋰的抗生物素蛋白.使用所描述的方法將抗生物素蛋白結(jié)合到涂覆在鈮酸鋰上的Si02。圖A示出了結(jié)合到涂覆在鈮酸鋰上的二氧化硅的抗生物素蛋白的光學(xué)密度(0.D.)。對490nm下的具有或不具有抗生物素蛋白的生物素HRP的吸收值進(jìn)行比較。所述曲線示出了具有1.4的0.D讀數(shù)差異的抗生物素蛋白的良好結(jié)合。圖B比較了與涂覆在鈮酸鋰上的二氧化硅結(jié)合的中性抗生物素蛋白與抗生物素蛋白。
[0038]圖6:結(jié)合到沙眼衣原體的原質(zhì)小體(EB)的AMT芯片的熒光顯微鏡圖像.用DAPI斑點(圖B的箭頭)示出了已經(jīng)結(jié)合EB的AMT芯片的熒光圖像以及與沒有衣原體材料的陰性對照(部分A)相比的FITC標(biāo)記的抗沙眼衣原體Ab (圖C的箭頭)的熒光圖像。DAPI和FITC標(biāo)記的存在證實了結(jié)合的材料是細(xì)胞的(DAPI)并且是衣原體(FITC)。
[0039]圖7:衣原體和抗衣原體抗體的頻率偏移.在向IO5個EB添加0.25 μ g/ml生物素化抗EB LPS之后，在根據(jù)本發(fā)明的流程用抗生物素蛋白制備的芯片上示出了偏離穩(wěn)定基線的頻率偏移。
[0040]圖8:在添加登革熱病毒時的頻率偏移.在根據(jù)本發(fā)明的流程用抗生物素蛋白和4 μ g/ml的2型抗登革熱制備的芯片上示出了偏離穩(wěn)定基線的頻率偏移。在添加8 μ g/ml的登革熱病毒時，基線頻率發(fā)生了改變。
[0041]圖9:在將抗體單獨添加到僅結(jié)合中性抗生物素蛋白的芯片時的頻率偏移.當(dāng)1:200稀釋度的生物素化抗沙眼衣原體(MOMP)被添加到具有結(jié)合抗生物素蛋白的芯片時在箭頭I和箭頭2之間示出了 4.5MHz的頻率偏移。
[0042]圖10:聲波板模式(APM)的理論模型.一種適用于本發(fā)明的APM的理論模型(APM被指定為Q-TBWF)。感測區(qū)域?qū)?yīng)于流體腔室，而生物樣品放置在壓電襯底的頂部。波是在底部產(chǎn)生的并且移動穿過所述壓電介質(zhì)以檢測結(jié)合到頂部表面的分析物(經(jīng)由直接附著到表面的抗生物素蛋白分子)。IDT是位于底部表面的(未圖示)。在遇到過量的捕獲的分析物之后，所述波的頻率將發(fā)生改變。
[0043]圖11:集成式多陣列裝置的示意圖.示出了具有APM模式的單個延遲線結(jié)構(gòu)的裝置的示意性設(shè)計。在所述APM模式中，電子元件(例如，IDT)是施加到與生物元件和流體元件發(fā)生接觸的一側(cè)的相對側(cè)上的襯底上的。圖A是具有單個延遲線結(jié)構(gòu)的裝置的頂部透視圖。圖B是具有三個延遲管(多通道芯片)的頂面透視圖。
【具體實施方式】
[0044]定義
[0045]以下術(shù)語應(yīng)具有下文中賦予它們的含義。
[0046]“錨定物質(zhì)”表示結(jié)合到⑴壓電晶體(用于“直接”結(jié)合)或者結(jié)合到其上的中間涂層以及(ii)結(jié)合到“捕捉試劑”(如同下文所定義的)這兩者的涂層材料。所述術(shù)語包括抗生物素蛋白，一種通過其結(jié)合生物素的能力在功能上定義的蛋白質(zhì)家族的成員，生物素充當(dāng)它們的特異性結(jié)合搭配物(例如，抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白)，以及寡核苷酸和聚核苷酸以及具有特異性結(jié)合搭配物的蛋白質(zhì)，所述搭配物可以用于修飾捕捉試劑并且因此使得捕捉試劑結(jié)合到錨定物涂覆的壓電材料。還包括天然存在的碳水化合物結(jié)合性凝集素，所述凝集素結(jié)合到碳水化合物基團(tuán)，例如，在抗體和抗體片段(例如，F(xiàn)e片段)上。使用捕捉試劑作為錨定物通常并不是優(yōu)選的，這是因為改變捕捉試劑的構(gòu)象或者甚至部分使捕捉試劑變性的風(fēng)險將影響測試的精確性。寡核苷酸和聚核苷酸可以通過離子或偶極子位點結(jié)合到壓電材料，要么是直接的要么是通過施加的中間銀涂層，例如通過離子交換方法。它們的特異性結(jié)合搭配物是互補(bǔ)的核苷酸分子并且那些可以用于修飾捕捉試劑。
[0047]“捕捉試劑”意思是特異性地結(jié)合到生物樣品中的分析物的一種物質(zhì)，因此它可以用于通過從生物樣品捕捉分析物而對其進(jìn)行識別和/或定量。所述術(shù)語包括抗體、適體和其片段(沒有限制)。捕捉試劑將結(jié)合到經(jīng)過或未經(jīng)過鍵聯(lián)基團(tuán)修飾的錨定物質(zhì)，所述鍵聯(lián)基團(tuán)是錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物(例如，生物素化或互補(bǔ)核酸)。換句話說，捕捉試劑是或者包括錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物并且同時特異性地識別一種分析物。
[0048]在應(yīng)用于錨定物質(zhì)與壓電表面的結(jié)合時，“直接”或“直接地”意思是無需在壓電晶體上涂覆中間涂層即可結(jié)合到壓電晶體。壓電表面可以被修飾，例如通過應(yīng)用等離子體、紫外輻射，或通過銀離子的離子交換沉積，其取代了所述表面上的金屬離子但是并不在壓電表面上在表面金屬離子上沉積額外的中間材料層。排除了中間涂層，例如由硅烷處理、或形成共價鍵的任何其他反應(yīng)、或金、銀或銅層沉積所產(chǎn)生的那些涂層。
[0049]先前在現(xiàn)有技術(shù)中采用的生物膜不適合并且不適用于制造低成本、一次性使用的生物傳感器，尤其是在篩查潛在地較大群體需要較大量的情況下。典型的實例包括硅烷(美國專利公開案號2011/0053139)或水凝膠(美國專利公開案號2006/0024813)的使用。本發(fā)明描述了一種新穎類型的生物膜，一種用于將其施加到襯底的方法，和此生物膜在合并若干聲波模式中的任一者的生物傳感器中的使用，以及這些生物傳感器在診斷POC和生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。所述生物膜的應(yīng)用包括涂層蛋白質(zhì)，所述涂層蛋白質(zhì)可以作為穩(wěn)定的單層與結(jié)合搭配物直接偶聯(lián)到晶體表面上，這是易于按比例增大以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的。所述襯底生物膜可以適用于若干聲波模式并且可以在多陣列微傳感器中使用，用于并行地進(jìn)行若干測試。此外，所述涂層可以施加于多種壓電材料，例如，鈮酸鋰、鉭酸鋰和石英微晶體等等。聲波是由穿過壓電襯底或者在壓電襯底上傳播的波的模式來描述的。取決于材料和邊界條件，許多組合都是可能的。用于每個傳感器的交叉指型轉(zhuǎn)換器(IDT)提供了電活化場，輸入轉(zhuǎn)換器提供了在晶體中傳播波的電輸入，所述波是基于晶體切割和轉(zhuǎn)換器的放置。通過輸出轉(zhuǎn)換器讀取導(dǎo)致波的改變的任何晶體改變，并且將其輸送到處理器以進(jìn)行分析。
[0050]本發(fā)明進(jìn)一步描述了 一種用于聲波板模式的新穎應(yīng)用。
[0051]1.生物涂覆方法
[0052]本發(fā)明描述了一種新穎的生物涂覆方法，所述方法適用于所有類型的聲波以及在聲波傳感器的制造中使用的所有類型的壓電材料。一個實施例包括它們在主體模式下的使用，其中在與沉積生物膜的地方相對的壓電材料表面上安置IDT。合適的聲波可以包括所有主體模式、聲波板模式以及水平剪切板模式。在另一實施例中，相關(guān)的生物涂層可以用作表面和水平剪切模式的聲波導(dǎo)，其根據(jù)在相對的壓電表面上具有IDT和生物涂層的要求進(jìn)行分配。
[0053]A.肓接涂覆:所述涂覆涉及簡單且快速的涂覆化學(xué)法，其是在幾秒或幾分鐘而非幾小時內(nèi)執(zhí)行的；使用可擴(kuò)展的、持續(xù)的以及線內(nèi)的方法制造的；易于以最少的操作人員干預(yù)實現(xiàn)自動化；產(chǎn)生較少數(shù)目的廢品；并且產(chǎn)生少量的有害廢物。此涂覆方法直接在壓電表面上沉積錨定物質(zhì),而無需中間材料層。
[0054]抗生物素蛋白是來源于蛋白的蛋白質(zhì)，例如，從禽類、爬行類和兩棲類物種中獲得，并且已經(jīng)被用于多種生物化學(xué)反應(yīng)中。抗生物素蛋白家族包括中性抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素以及抗生物素蛋白，所有的這些蛋白質(zhì)都是通過它們以高親和力和特異性結(jié)合生物素的能力在功能上定義的?？股锼氐鞍走€可以包括細(xì)菌抗生物素蛋白，例如抗生蛋白鏈菌素，以及修飾過的抗生物素蛋白，如中性抗生物素蛋白(來自賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific)的去糖基化抗生物素蛋白-www.thermo scientific, com)。它們是較小的寡聚蛋白質(zhì)，每個包括四個(或兩個)相同的亞單位，每個亞單位具有針對生物素的單個結(jié)合位點。當(dāng)結(jié)合到本發(fā)明中的生物傳感器的表面時，兩個位點是面對壓電材料表面的，并且因此是不可用于生物素結(jié)合的。剩余的兩個位點是背對壓電材料的并且是可用于生物素結(jié)合的?？股锼氐鞍讓ι锼氐慕Y(jié)合親和力，雖然是非共價的，但是是非常高的，以致可以將其視作不可逆的。抗生物素蛋白的解離常數(shù)(Kd)大約是10_15M，使其成為已知的最強(qiáng)非共價鍵之一。在其四聚物形式中，抗生物素蛋白的大小被估計為在66到69kDa之間。所述分子量的10%是歸因于由四個到五個甘露糖以及三個N-乙酰葡糖胺殘基組成的碳水化合物含量?？股锼氐鞍椎奶妓衔锊糠趾性诮Y(jié)構(gòu)和組成上類似的至少三個獨特的寡糖結(jié)構(gòu)類型。
[0055]生物素，也被稱為d-生物素或者維生素H、維生素B7和輔酶R，是抗生物素蛋白的一種特異性結(jié)合搭配物。它是可以從包括西格瑪-奧德里奇公司(Sigma Aldrich)在內(nèi)的多個供應(yīng)商處購得的。
[0056]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以在本文中討論的條件下將錨定物質(zhì)(例如，抗生物素蛋白)直接涂覆到壓電材料(包括所有的活性壓電材料)上。使用此方法，優(yōu)選地在單層中，錨定物質(zhì)成功地直接附著到壓電晶體表面并且形成了較強(qiáng)的且穩(wěn)定的非共價鍵。如圖1的圖B和圖C所示，在一個實施例中，抗生物素蛋白在鈮酸鋰芯片上形成了大約3到4納米的單層。使用原子力顯微法(AFM)，單個的大部分均一的單層被確定為預(yù)期用于“薄煎餅型”化學(xué)吸附的抗生物素蛋白。AFM測量涉及在PBS中并且隨后在蒸餾水中進(jìn)行兩個小時的徹底洗滌，并且隨后對經(jīng)過中性抗生物素蛋白涂覆的芯片成像。圖A示出了芯片上未結(jié)合中性抗生物素蛋白的空白芯片的實時形貌特征曲線。圖B是經(jīng)過抗生物素蛋白涂覆的芯片上的具有I μπι納米凹痕部分的一個區(qū)域的10 μ m掃描。Z值被定義為從芯片表面上抗生物素蛋白的頂部到最高峰的距離。如同從圖C中的形貌特征曲線所確定的，對于在結(jié)合到晶體的抗生物素蛋白中形成的典型的壓痕，深度是3.229nm。壓痕的深度被確定為在3到4nm的范圍內(nèi)。典型的中性抗生物素蛋白的大小為大約5.6x5x4nm (生物物理雜志(Biophys J.),2008年4 月 I 日；94(7):2706-2715 ;2008 年 I 月公布在網(wǎng)上，10.1529/biophysj.107.119271，使用聲波傳感器的表面結(jié)合DNA的大小和形狀的定量測定(A Quantitative Determinationof Size and Shape of Surface-bound DNA Using an Acoustic Wave Sensor),托托斯(Tsortos)等人，PMCID:PMC2267124)。為了評估中性抗生物素蛋白層的深度，在一個點上制造壓痕并且再次掃描。壓痕方法允許對結(jié)合到表面的抗生物素蛋白的深度進(jìn)行計算。單層高度是從壓痕的頂部到壓痕的底部測量的。在未涂覆的芯片中，壓痕并不會造成任何深度改變。這些掃描都是在10微米的空間內(nèi)進(jìn)行的。
[0057]圖2描繪了將生物素化的抗登革熱抗體合并到經(jīng)過中性抗生物素蛋白涂覆的鈮酸鋰晶體上。使用本發(fā)明的方法將抗生物素蛋白結(jié)合到鈮酸鋰芯片，隨后在室溫下施加含4 μ g/mL的生物素化抗登革熱抗體的0.05%BSA-PBS歷時30分鐘。在PBS中徹底洗滌2小時和隨后用蒸餾水沖洗之后，將芯片浸沒到蒸餾水中并且使用AFM成像。圖A示出了在結(jié)合有抗體的抗生物素蛋白中形成的納米凹痕區(qū)域的10 μ m掃描。圖B是圖A的4.6 μ m放大部分。如同在圖C的形貌特征曲線中所示的，顯示壓痕為6-9nm的深度。深度為9.269nm。深度是從芯片上抗生物素蛋白的頂部到“孔”的底部或芯片自身的頂部來測量的。鑒于抗體的尺寸是14.2nmX8.5nmX3.8nm，壓痕的深度顯示抗體結(jié)合到抗生物素蛋白。
[0058]不受限于特定理論，人們相信，此結(jié)合的強(qiáng)度是由下文論述的暴露條件引起的，從而導(dǎo)致了錨定物質(zhì)(例如，抗生物素蛋白)與晶體表面的較強(qiáng)的非共價結(jié)合。此結(jié)合可能是通過抗生物素蛋白上的反應(yīng)性氨基酸(例如，與晶體表面形成鍵的精氨酸、半胱氨酸和賴氨酸)的一些側(cè)鏈而發(fā)生的?？梢耘c壓電表面形成鍵的其他側(cè)鏈?zhǔn)窃诓粠щ姷暮蛶щ姷臉O性氨基酸上的(例如，不帶電的絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、酪氨酸；帶電的天冬胺酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸)。當(dāng)寡核苷酸或聚核苷酸被用作錨定物質(zhì)時，它們通過離子或偶極子位點結(jié)合，并且一旦固定，它們就結(jié)合到捕捉試劑上，所述捕捉試劑可以是互補(bǔ)的寡核苷酸或聚核苷酸或者可以由互補(bǔ)的寡核苷酸或聚核苷酸修飾。實際上，如果分析物是核酸，那么捕捉試劑可以是在一個部分上結(jié)合錨定試劑并且在另一部分上結(jié)合分析物的雜合型寡核苷酸或聚核苷酸。
[0059]在涂覆之前，等離子體處理通過產(chǎn)生高反應(yīng)性的物質(zhì)幾乎移除了晶體表面上所有的有機(jī)污染物。存在兩種機(jī)制被認(rèn)為有助于使錨定物質(zhì)附著到晶體表面:等離子體處理誘發(fā)更高的表面能，其允許施加的流體/液體得到更好的潤濕，從而引起晶體與錨定物質(zhì)之間更好的接觸，以及在表面上引入例如胺、羧基和羥基等官能團(tuán)，因此經(jīng)由結(jié)合提供了界面粘附。無論哪種機(jī)制，晶體表面上的錨定物的涂覆在一些實施例中不需要中間涂層，并且在任何情況下都不需要共價鍵，而共價鍵是需要濕法化學(xué)的。由此形成的鍵被認(rèn)為是由于化學(xué)吸附引起的，化學(xué)吸附是比物理吸附更加牢固的附著形式。
[0060]進(jìn)一步認(rèn)為所得到的錨定物質(zhì)上的反應(yīng)性基團(tuán)與晶體上的反應(yīng)性物質(zhì)之間潛在的結(jié)合是都有可能涉及多點相互作用的，每個都是較弱的，但是共同地合作以按指數(shù)律成比例的增大到較強(qiáng)的結(jié)合，方法是通過也可以在DNA鏈中的堿基對的較弱的結(jié)合中看到的“拉鏈”或“維可牢”效果，這種結(jié)合是難以破壞的，除非是在極端的熱量條件下。這些條件將不適用于生物傳感器，因為需要保護(hù)在此反應(yīng)中使用的抗體，防止其發(fā)生不利于測試精確度的變性和/或構(gòu)象改變。
[0061 ] 在一些實施例中，在用例如抗生物素蛋白等錨定物質(zhì)涂覆傳感器之前，執(zhí)行以下步驟。使用常規(guī)的顯微光刻法，由壓電晶片制成單獨的芯片。通過將IDT側(cè)安裝在筒式殼體的下部部分內(nèi)，IDT可以緊固在涂覆芯片的相對側(cè)上。通過使用例如等離子體處理來清潔所述表面，晶體表面上所有的有機(jī)物質(zhì)首先必須得到很好的清潔，所述等離子體處理可以包括例如暴露于大氣等離子體產(chǎn)生的噴射流(等離子體處理公司(Plasma Treat C0.))?；蛘呋虼送猓部梢詰?yīng)用紫外輻射臭氧處理。通過噴霧或接觸傳遞(例如，通過類似于打印的方法，例如，噴墨或滾筒應(yīng)用)，在合適的溶劑中施加錨定層(通常5到10秒)、即抗生物素蛋白，以形成薄且均一的液體膜或微點模式。應(yīng)該對膜中的錨定物質(zhì)的量進(jìn)行計算以形成單層。當(dāng)然，精確的量將取決于錨定物質(zhì)的選擇并且取決于其對于壓電表面的親和性。錨定物質(zhì)的通常適用范圍是0.01mg/ml到5mg/ml ;在一些實施例中已發(fā)現(xiàn)0.01到2mg/ml是可以工作的范圍；而在一些實施例中進(jìn)一步將范圍縮小到0.01mg/ml到1.0mg/ml。下一個步驟包括用熱空氣流快速干燥，形成了穩(wěn)定的抗生物素蛋白層以作為第一粘合劑層。在所得到的傳感器可以進(jìn)一步由特異性地識別特定分析物的任何希望的捕捉試劑修飾或者可以與已經(jīng)暴露于并且結(jié)合到分析物的捕捉試劑反應(yīng)的意義上，所得到的傳感器是通用的。在這種通用狀態(tài)下，可以對它進(jìn)行密封(優(yōu)選地在N2氣氛下)和儲存直到需要為止。
[0062]一個實施例包括含有中性抗生物素蛋白的試劑組成:水中的0.05到5mg/ml，作為每0.5xlcm壓電材料表面具有小于10 μ I流體(大約3_10 μ I流體/0.5cm2并且優(yōu)選地為5-10 μ I)的薄層施加。使用常規(guī)的生物素化試劑和相關(guān)方法(英杰公司(Invitrogen))制備生物素化的捕捉試劑。取代程度通常是每個捕捉試劑3到5個生物素，捕捉試劑通常是IgG，但是核酸或任何其他蛋白捕捉試劑在原則上都是可以使用的。針對在實例中定義的不同目標(biāo)抗原的捕捉中所需的特定需求來優(yōu)化涂層緩沖液的濃度，但這種操作是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的。
[0063]用于生物素化的捕捉試劑的涂層緩沖液的一個實例:0.0lM PBS緩沖液，其還可含有糖(例如1-10%海藻糖或蔗糖)和5-10%純化甘油。糖和甘油充當(dāng)防腐劑和囊封劑。添加疊氮化鈉(0.01到0.05%)作為抗微生物劑，但是代替地可以使用另外的此類試劑。
[0064]圖3示出了當(dāng)在熒光顯微鏡上成像時生物素化的熒光膠乳珠粒(FITC加載的，
1.lym，來自英杰公司)的特異性結(jié)合的確認(rèn)。在所述確認(rèn)中，使用如上文所描述的方法將
0.25mg/ml的抗生物素蛋白結(jié)合到鈮酸鋰。在用PBS和去離子水徹底洗滌之后，將每μ L含有10，000個珠粒的I μ m體積的被FITC標(biāo)記的生物素珠粒(英杰公司)添加到芯片并且在室溫下培育30分鐘。在用水進(jìn)行另一次洗滌之后，在熒光顯微鏡(200x)下對芯片成像。圖A中的箭頭是非特異性結(jié)合的跡線(參見箭頭)，而圖B中的箭頭表示珠粒的特異性結(jié)合。結(jié)合珠粒在用含有吐溫20的緩沖液輕柔洗滌時對高達(dá)若干pN的流體動力學(xué)或流動應(yīng)力具有抗性，因此它們足夠穩(wěn)定地結(jié)合到鈮酸鹽表面上的多個固定抗生物素蛋白上，以用于本發(fā)明的傳感器的多種用途。
[0065]生物傳感器的抗生物素蛋白涂層的穩(wěn)定性是出人意料的并且是歸因于與物理吸附相比更加牢固的化學(xué)吸附過程。已發(fā)現(xiàn)物理吸附結(jié)合是易于通過緩沖液和試劑去除的，并且容易發(fā)生熱損傷，尤其是當(dāng)儲存在50°C以上的高溫下時。因此，化學(xué)吸附過程當(dāng)與捕捉試劑組合使用時提供了 一種改進(jìn)的低成本通用生物傳感器，用于捕捉和檢測特異性目標(biāo)實體。
[0066]因此，如本發(fā)明所描述的涂覆方法能夠快速地形成錨定物質(zhì)的熱穩(wěn)定單層，由此使用簡單的低成本方法提供可儲存的通用生物傳感器芯片，其與同樣具有生物素化抗體的現(xiàn)有生物傳感器相比具有潛在更好的長期穩(wěn)定性。當(dāng)使用這種方法制成的經(jīng)過抗生物素蛋白涂覆的芯片在原子力顯微鏡下檢測時，觀察到單個的基本上均一的3-4納米的單層。參見圖2A。
[0067]本發(fā)明進(jìn)一步考慮以可控制的表面密度完成形成涂層的單層，其中表面密度被定義為作為完整單層的毯狀物占據(jù)生物傳感器表面的分子的數(shù)目。分子停放區(qū)域是以每個分子的納米平方數(shù)給出的。因此，當(dāng)生物傳感器的總表面積已知時，可以確定已知表面積的完整生物傳感器表面上的沉積分子的數(shù)目，并且可以對涂層溶液中的錨定物質(zhì)的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)以產(chǎn)生希望的單層。固定的或未固定的單層或亞單層與多層相比是優(yōu)選的，多層在洗滌期間或在它們的含有捕捉試劑的層中具有較小的穩(wěn)定性。這在使用含有例如吐溫20或皂苷等表面活性劑的洗滌流體時是尤其相關(guān)的。
[0068]B.經(jīng)過涂覆的生物傳感器的穩(wěn)定性:一旦施加，穩(wěn)定的錨定層任選地進(jìn)一步通過使用可逆的交聯(lián)劑(例如甲醛蒸氣)進(jìn)行交聯(lián)而得到穩(wěn)定，然而也可以使用其他同型雙官能交聯(lián)劑，例如乙二醛或戊二醛。通過暴露于磷酸鹽緩沖液(10%)最多24小時或如同在標(biāo)準(zhǔn)組織化學(xué)中所進(jìn)行的采用甲醇、異丙醇或丙酮的短暫溶劑固定來實現(xiàn)交聯(lián)。通過遵循供應(yīng)商的說明書中所陳述的建議時間和濃度避免了過度交聯(lián)，因此抗生物素蛋白上的2個或3個剩余的暴露的生物素結(jié)合位點不會受到影響。任選地，可以通過事先暴露于可逆結(jié)合的脫硫生物素(西格瑪公司)而防止結(jié)合位點被破壞，所述可逆結(jié)合的脫硫生物素隨后易于被生物素或生物素化的捕捉試劑取代。這之后也可以在最高70°C的溫度下進(jìn)行幾分鐘的熱固定，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些錨定物質(zhì)(例如，抗生蛋白鏈菌素)在最高80°C下的溶液中是穩(wěn)定的(邦氏實驗室(Bang’s Labs))。
[0069]當(dāng)直接涂覆在芯片時，抗生物素蛋白能夠以所需的靈敏度結(jié)合任何生物素化試齊U，這與單層類似并且優(yōu)于不太穩(wěn)定的多層。當(dāng)在與本文所述的濃度相比以更高的抗生物素蛋白濃度形成時或如US20110053139 (通過引用的方式并入)中所述用硅烷層形成時，所述方法很可能不按與本發(fā)明的方法相同的親和性結(jié)合抗生物素蛋白，并且傾向于在生物傳感器的使用期間洗脫。然而，本發(fā)明的直接涂覆方法提供了充足的生物素結(jié)合位點，以允許特異性試劑與涂層的穩(wěn)定附著，這種穩(wěn)定性即使是在與仍然可用的生物素結(jié)合位點中的一者或兩者反應(yīng)的較大的生物素化抗體的結(jié)合之后仍然持續(xù)。這些特征即使是在洗滌期間或升溫之后暴露于來自流體力的流體動力學(xué)應(yīng)力時也得到了維持。
[0070]如圖4中所示，不同類型的抗生物素蛋白可以用于涂層中并且也是非常穩(wěn)定的。圖4示出了結(jié)合到鈮酸鋰的抗生物素蛋白在4°C下儲存一個月的時間內(nèi)的光學(xué)密度。所述芯片是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的。在用PBS充分洗滌之后，將芯片浸沒于無菌PBS中儲存并且在4°C下放置最多一個月。每周一次，使用鄰苯基二胺二鹽酸鹽片劑(西格瑪公司)用生物素辣根過氧化酶分析法對陽性對照(+抗生物素蛋白)和陰性對照(-抗生物素蛋白)芯片進(jìn)行測試。在添加底物和終止反應(yīng)溶液(硫酸2.5m)之后，用Bio-Tek Synergy HT酶標(biāo)儀讀取圖4中的0.D.。0.D.顯示抗生物素蛋白與芯片的結(jié)合與最初結(jié)合時一樣普遍。
[0071]在固定狀態(tài)下，通用抗生物素蛋白生物傳感器(也稱作生物傳感器組件)的極好的熱穩(wěn)定性在將用于無法輕易獲得冷凍機(jī)儲存的熱帶氣候的任何POC測試中都是非常重要的。因此，所述通用抗生物素蛋白生物傳感器并不需要保護(hù)性涂層，但是它需要保持密封，優(yōu)選地在氮氣氛中。通過PAFRA TM方法(US5，098，893和EP0223221)在單次使用的現(xiàn)成樣本處理管內(nèi)部實現(xiàn)了目標(biāo)特異性抗體制劑在穩(wěn)定玻璃態(tài)下的穩(wěn)定化，所述PAFRA TM方法已經(jīng)成功地用于不穩(wěn)定酶的室溫儲存。舉例來說，可以使用含有例如糖和甘油等防腐劑的涂層緩沖液。
[0072]C.間接涂覆方法除了直接涂覆晶體表面之外，本文所述的方法還可以用于將抗生物素蛋白涂覆在用于涂覆晶體表面的其他材料上，包括現(xiàn)有技術(shù)的預(yù)涂層(但不限于此)。更為廣泛的應(yīng)用也是可能的:例如，直接制造當(dāng)前在多個步驟中制造的經(jīng)過抗生物素蛋白涂覆的磁性或膠乳粒子或橫向流動膜。硅酸鈉或二氧化硅通常用于涂覆表面，以作為波導(dǎo)保護(hù)水平剪切波。本發(fā)明的抗生物素蛋白結(jié)合方法很好地結(jié)合到二氧化硅或玻璃態(tài)表面上，因此它可以疊加在波導(dǎo)表面上。此外，所述方法可以應(yīng)用于在不可逆的玻璃態(tài)層中捕捉抗生物素蛋白，所述玻璃態(tài)層用酸轉(zhuǎn)化為二氧化硅-Nav層，獲得了如在US2011/0053139中所教示的結(jié)合和二氧化硅導(dǎo)引層。在其他實施例中，涂覆在晶體表面上的金屬離子，例如銀(其結(jié)合所述表面并且使所述表面變黑)、銅、金或鐵，可以提供用于本文揭示的方法的間接涂覆的襯底。銀鹽或金鹽也可以結(jié)合并且形成表面結(jié)合硫醇和二硫化物的蛋白質(zhì)(如IgG)，和抗生物素蛋白。
[0073]通過用硅酸鈉溶液接觸鈮酸鋰晶體將抗生物素蛋白涂覆在沉積在壓電材料表面上的二氧化硅(SiO2)涂層上，抗生物素蛋白隨后結(jié)合到如上文所描述的用于直接結(jié)合的二氧化硅涂層上。
[0074]如圖5所示，抗生物素蛋白確實結(jié)合到Si02上，以使用本文所述的方法涂覆鈮酸鋰。在徹底PBS洗滌和阻斷步驟之后，將生物素HRP添加到芯片中并且在室溫下培育45分鐘。添加底物以誘導(dǎo)HRP酶的變色20分鐘，之后添加終止溶液。在圖5的圖A中，在490nm下讀取吸收度(0.D.)。結(jié)合到二氧化硅的抗生物素蛋白的0.D.在左列示出，而沒有抗生物素蛋白的二氧化硅則在右列示出。從陽性值(1.6)中減去陰性值(0.2)，0.D.的讀數(shù)仍然是1.4，這被視作是抗生物素蛋白的良好結(jié)合。(圖5的圖B比較了抗生物素蛋白的結(jié)合與中性抗生物素蛋白的結(jié)合?？股锼氐鞍缀椭行钥股锼氐鞍锥季哂写笾孪嗤?.D.。然而，此實驗中的抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白是直接涂覆在壓電表面上的。圖B呈現(xiàn)了在扣除陰性測量值之后的兩個陽性抗生物素蛋白測量值的平均值。)
[0075]D.將分析物結(jié)合到涂覆的生物傳感器
[0076]在一些實施例中，晶體表面上結(jié)合的抗生物素蛋白需要活化以結(jié)合所關(guān)注的分析物。活化包括例如抗體等生物素化粘合劑，其對于所關(guān)注的分析物抗原具有特異性?？贵w或其他試劑在附著到經(jīng)過抗生物素蛋白涂覆的芯片之前進(jìn)行生物素化?？贵w可以在附著到抗生物素蛋白底物之后或之前結(jié)合到其分析物抗原上。分析物生物素化抗體復(fù)合物可以在傳感器之外形成并且隨后所述復(fù)合物可以與傳感器接觸，由此抗體上的生物素將結(jié)合到經(jīng)過抗生物素蛋白涂覆的芯片。這兩種方法中的哪一種是優(yōu)選的取決于分析物并且取決于樣品處理。這兩種方法都是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。再次使用AFM，對于具有結(jié)合到芯片表面上的抗生物素蛋白的特定抗體的表面涂層的分析確定了 6到9nm的深度，表明所述抗體確實結(jié)合到抗生物素蛋白層。(參見圖2)
[0077]施加抗原特異性的生物素化捕捉試劑以形成第二層，所述第二層由非干燥介質(zhì)中的結(jié)合且過量的自由的生物素化試劑組成，所述介質(zhì)也含有本領(lǐng)域中已知的蛋白穩(wěn)定劑，例如(但不限于)蔗糖、海藻糖、甘油等等。多種試劑可以是生物素化的，其中最常使用的是生物素化抗體，其特異性地識別所關(guān)注的分析物?？梢酝ㄟ^化學(xué)或酶促方式對蛋白捕捉試劑進(jìn)行生物素化?；瘜W(xué)生物素化利用多種已知的偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)以產(chǎn)生胺、羧酸酯、巰基和碳水化合物的非特異性生物素化。還應(yīng)理解N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-偶聯(lián)賦予了蛋白中的任何伯胺的生物素化。利用細(xì)菌生物素連接酶的酶生物素化引起了特定序列內(nèi)的特異性賴氨酸的生物素化。大多數(shù)化學(xué)生物素化試劑是由經(jīng)由鍵聯(lián)基團(tuán)連接到生物素的戊酸側(cè)鏈的反應(yīng)性基團(tuán)組成。酶生物素化最通常是通過在所關(guān)注的蛋白質(zhì)的N端、C端或內(nèi)部環(huán)處將所述蛋白質(zhì)鍵聯(lián)到15個氨基酸肽(被稱為AviTag或受體肽(AP))來進(jìn)行的。這些生物素化技術(shù)是已知的。
[0078]捕捉試劑可以是抗體或適體或由以下各項中的任何一者形成的其他特異性配體或受體:生物素化的寡核苷酸、核苷酸、核酸(Pon，Richard T.(1991)，“用于自動化合成5'-生物素化寡核苷酸的長鏈生物素亞磷酰胺試劑(A long chain biotinphosphoramidite reagent for the automated synthesis of5 ' -biotinylatedoligonucleotides)”，四面體通訊(Tetrahedron Letters) 32 (14): 1715-8)、蛋白質(zhì)、妝和包括IgA、IgG、IgM、IgE的抗體、酶類、酶輔因子、酶抑制劑、膜受體、激酶、蛋白質(zhì)A、聚尿苷酸、聚腺苷酸、聚賴氨酸受體、多糖、螯合劑、碳水化合物、糖。
[0079]一旦結(jié)合，捕捉試劑就短暫地暴露于熱空氣中以實現(xiàn)來自所施加流體的水的部分移除，形成保護(hù)性的且穩(wěn)定的凝膠，所述凝膠將確?？贵w等結(jié)合蛋白質(zhì)粘合劑在非干燥凝膠層中的長期穩(wěn)定性，這允許第二抗原特異性粘合劑層的基本上完整的隨時間而變的形成。這些玻璃狀層任選地經(jīng)過脫水，用于在套筒的袋的內(nèi)部的二氧化硅干燥劑顆?；蚍肿雍Y的存在下儲存。套筒的上部腔室經(jīng)過密封以形成流體隔室。隨后在塑料的儲存袋內(nèi)部對具有腔室的套筒進(jìn)行密封，優(yōu)選地是在N2氣氛中。
[0080]錨定物質(zhì)(抗生物素蛋白)與生物素化捕捉試劑之間的結(jié)合導(dǎo)致在芯片上形成第二捕捉試劑層。在使用之前，在分析過程期間保護(hù)性凝膠層中的任何殘余的未結(jié)合的生物素化捕捉試劑和其他組分可以通過用分析緩沖液或甚至用樣本流體進(jìn)行簡單沖洗而輕易地移除。如圖6和圖7所示，已經(jīng)證實這些傳感器檢測到了抗原。當(dāng)捕捉試劑是抗體時，它可以按范圍在0.025到25 μ g/ml的含量(舉例來說且不限于)來施加。
[0081 ] E.使用生物傳感器的分析物的結(jié)合和疾病檢測
[0082]根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以很容易地批量生產(chǎn)，以便在配備含有特異性地結(jié)合到所關(guān)注的分析物的捕捉試劑的適合的正確生物膜涂層時，檢測多種試劑和生物化學(xué)標(biāo)記?？梢岳么思墒缴飩鞲衅鞯膽?yīng)用的實例包括人類和獸醫(yī)診斷學(xué)。分析物被定義為作為傳染物或者在傳染物中發(fā)現(xiàn)或者由傳染物產(chǎn)生并且可以用于檢測的任何物質(zhì)，包括但不限于寡核苷酸、核酸、蛋白質(zhì)、肽、病原體片段、裂解病原體和包括IgA、IgG、IgM、IgE在內(nèi)的抗體、酶、酶輔因子、酶抑制劑、毒素、膜受體、激酶、蛋白質(zhì)A、聚尿苷酸、聚腺苷酸、聚賴氨酸、多糖和螯合劑。先前已經(jīng)描述了抗原-抗體相互作用的檢測(美國專利案號4，236，893、4，242，096和4，314，821，所有這些明確地通過引用的方式并入本文中)。另外，本發(fā)明的范圍還涵蓋在全細(xì)胞(包括原核(例如病原性細(xì)菌)和真核細(xì)胞，包括哺乳動物腫瘤細(xì)胞)、病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病毒等)、真菌、寄生蟲和孢子(包括傳染物的表型變化，例如血清變型或血清型)的檢測方面的應(yīng)用。
[0083]F.壓電材料的類型
[0084]多種壓電材料適合用于本發(fā)明中而不會受到限制。還包括(但不限于)所有大小的拋光晶片，所述晶片是按不同晶體取向市售的，其尤其適用于在表面聲波(SAW)或體聲波(BAW)模式下的表面聲波的傳播。雖然晶體兩側(cè)都拋光是優(yōu)選的，但是在一些應(yīng)用中單側(cè)拋光材料也是適用的。所有的各種晶體取向都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。蘭克賽(Iangasite)晶體也是合適的。實例是鈮酸鉛鎂/鈦酸鉛(PMN-PT)、鋯鈮酸鉛/鈦酸鉛(PZN-PT)、鈮酸鋰(LiNb03)、具有摻雜物的鈮酸鋰、四硼酸鋰(Li2B407)、鉭酸鋰和石英(但不限于此)。鈦酸鋇(BaTiO3)也是用于室溫應(yīng)用的壓電晶體的非鉛來源。
[0085]可以用于本發(fā)明的其他晶體的實例包括以下各項:塊磷鋁礦(泄漏的SAW)、正磷酸鎵(瑞利(rayleigh))、鈮酸鉀(SAW和BAW候選)、鋯鈦酸鋇、氧化硼酸鑭鈣(可能用于未來的SAW)、蘭克賽晶體(如硅酸鑭鎵)；陶瓷，例如鈣鈦礦型陶瓷結(jié)構(gòu)(KNb03、Ba2NaNb5O5,SrTiO3> Pb2KNb5O15、鐵酸鉍、NaxWO)、鋯鈦酸鉛(用于諧振器或轉(zhuǎn)換器)、硫化鎘(通常的光電阻傳感器)、氧化鋅(由于OH基團(tuán)的反應(yīng)性可以作為膜施加)、砷化鎵、氧化鉍和氧化鍺(光學(xué)器件/絕緣體)、氮化鋁(作為壓電膜)，以及聚偏二氟乙烯(PVDF膜)。
[0086]此外，可以使用多晶體元件。具體來說，它們將適用于出于多種目的在多個方向上傳播波。并且，壓電膜可以以夾層形式結(jié)合到非壓電材料，且因此此類構(gòu)造不是排除于本發(fā)明之外的先驗結(jié)果。
[0087]2.聲波傳感器
[0088]對于壓電晶體諧振器，聲波在晶體的主體內(nèi)行進(jìn)(即，主體模式)或在晶體的表面上行進(jìn)，已發(fā)現(xiàn)這兩者都有若干種形式。體聲波(“BAW”)穿過晶體介質(zhì)行進(jìn)，并且通常使用的BAW裝置是厚度剪切模式(TSM)、聲波板模式(APM)以及水平剪切板模式(SH-APM)。通常使用的SAW裝置包括水平剪切表面聲波(SH-SAW)、表面橫波(STW)以及洛夫波(LW)。在生物傳感器中，這些波不應(yīng)是衰減的，或它們喪失以所需的靈敏度檢測生物流體中的分析物的能力。無論波的類型如何，在不顯著地衰減波的情況下保持質(zhì)量變化的聯(lián)系是傳感器開發(fā)中的一個重要問題。在本發(fā)明中，雖然考慮到所有這些波模式，但是最終的模式選擇需要是對生物質(zhì)量變化極度敏感的，而不會在與流體接觸時使所述波衰減。為了實現(xiàn)此目標(biāo)，傳感器的配置也很重要。因此，本發(fā)明的傳感器的結(jié)構(gòu)以及與每個傳感器一起使用的波的性質(zhì)得到了優(yōu)化。
[0089]由于體波穿過晶體材料行進(jìn)，因此它們被認(rèn)為是不太敏感的生物傳感器。體波靈敏度需要以簡單且一致的生物涂層(例如通過本發(fā)明提供的)來保持，因為當(dāng)進(jìn)一步從產(chǎn)生的體波中移除質(zhì)量結(jié)合并且質(zhì)量與波頻率之間的相關(guān)性喪失或減弱時，會喪失靈敏度。因此，體波可以與根據(jù)本發(fā)明的錨定物質(zhì)涂層一起使用。
[0090]此外，所述生物涂層必須是易于施加的并且在裝置到裝置之間是一致的，否則的話裝置之間的可變性將使它們難以在治療是基于診斷且診斷精確度是取決于裝置靈敏度(而特異性主要取決于捕捉試劑)的衛(wèi)生保健環(huán)境中使用。此外，所選擇的生物涂層必須一致地且可再現(xiàn)地結(jié)合捕捉試劑，否則的話可變性將導(dǎo)致遺漏的或不精確的診斷(如同在包括硅烷、水凝膠或聚合物涂層的現(xiàn)有技術(shù)裝置的情況中，所述現(xiàn)有技術(shù)裝置無法一致地提供均一涂層且不以一致的強(qiáng)度結(jié)合蛋白質(zhì))。
[0091]雖然表面產(chǎn)生的波對質(zhì)量變化更加敏感，但是例如STW等常規(guī)的SAW裝置通常是用于生物流體的較差的選擇，因為它們以相當(dāng)深的深度穿透到生物流體中，由此減弱了所述波。SH-SAW提供了更好的生物傳感器，因為波是水平地極化的，然而它們需要通過波導(dǎo)進(jìn)行保護(hù)。
[0092]本發(fā)明克服了圍繞多種類型的表面聲波作為生物傳感器的使用的許多問題。這是通過使用新穎的壓電生物傳感器配置而完成的，所述壓電生物傳感器配置在一些實施例中利用了所描述的聲波板模式(APM)波，但是在其他實施例中可以采用替代性的波形式，例如本文所描述的SH-SHEAR。獲得了用于在含水的流體中分析生物樣品的快速且有成本效益的系統(tǒng)。在一些實施例中，這部分地是通過在與流體接觸的壓電介質(zhì)的表面(或部分)與兩個(2) IDT元件所接觸的壓電晶體的相對表面或孤立部分之間提供流體不可滲透的屏障而實現(xiàn)的。所述屏障可以呈防漏腔室的形式，其中流體得到限制。當(dāng)使用所述裝置時，壓電介質(zhì)的所述部分將與流體樣品接觸，形成所述腔室的一個壁。獲得了適用于檢測含水生物流體中的目標(biāo)實體的簡單的集成式生物傳感器。
[0093]這種新穎的生物傳感器還包括生物膜芯片，所述芯片可以帶有根據(jù)本發(fā)明的新穎的直接涂層，或者可以帶有與如上文所描述的中間層疊加的間接涂層。因此，本發(fā)明的具體實施例是一種集成芯片，其中生物膜和專用APM模式壓電生物傳感器形成了用于POC診斷裝置的平臺的分析組件并且其中根據(jù)本發(fā)明對分析組件進(jìn)行了描述。
[0094]在一些實施例中，本發(fā)明在生物涂覆方法中合并了新穎的化學(xué)反應(yīng)并且改進(jìn)了壓電式傳感器以產(chǎn)生利用聲波板模式波的新穎的壓電生物傳感器配置，所述波是從位于表面上的IDT處產(chǎn)生的，并且對在目標(biāo)實體的分子檢測中使用的捕捉試劑進(jìn)行了側(cè)接。APM是分開的或屏蔽的以免受沿IDT的平面作為瑞利波行進(jìn)的橫向波的干擾。在其他具體實施例中，本發(fā)明合并了一種生物傳感器設(shè)計，其具有屏蔽電氣組件(如IDT)和位于含有感測表面的流體腔室的任一側(cè)上的絕緣膜的電氣連接。所述感測表面含有非絕緣區(qū)域，其特異性地涂覆有一層或多層固定試劑，包括被設(shè)計用于捕捉流體樣品中的目標(biāo)實體的目標(biāo)特異性捕捉試劑。通過附著到感測表面上的流體隔室的尺寸確定生物流體樣品的體積。通過敏感的商業(yè)信號分析儀檢測(例如網(wǎng)絡(luò)分析儀，例如由安捷倫公司(Agilent)制造的那些)由結(jié)合的目標(biāo)實體產(chǎn)生的APM信號的波擾動。
[0095]本發(fā)明改進(jìn)了在商業(yè)或?qū)嶒炆飩鞲衅髦惺褂玫默F(xiàn)有技術(shù)，方法是在壓電生物傳感器中合并了 APM，由此APM能夠以較高的靈敏度響應(yīng)于壓電表面的相對側(cè)上的頻率改變，而無需層導(dǎo)引或波導(dǎo)。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了捕捉層的使用，如同在美國公開申請案號2011/0136262中討論的(所述申請案以引用的方式并入)，以及在傳染物、其片段，以及生物樣品中的衍生的毒素或蛋白質(zhì)的快速檢測中采用用于目標(biāo)事件的多路復(fù)用分析的微通道的其他內(nèi)容。
[0096]本發(fā)明的一些生物傳感器實施例可以在某些方面類似于常規(guī)的基于SH-SAW的傳感器。因此，舉例來說，在一些實施例中，本發(fā)明的生物傳感器還使用可以是例如基于鈮酸鹽、石英、二氧化硅或鉭酸鹽的壓電表面(作為本文中提供的其他材料中的一種選擇)；位于相同壓電表面上的成組輸入和輸出IDT，作為通常由覆蓋大量的依次沉積的底層形成的目標(biāo)特異性粘合劑層；來自流體樣本的目標(biāo)分子的捕捉；以及由于結(jié)合質(zhì)量的波的本質(zhì)的變化的結(jié)合目標(biāo)的檢測?；谶@些現(xiàn)有技術(shù)傳感器的本發(fā)明的生物傳感器采用了如下文所描述的施加錨定涂層的非常簡單的方法。
[0097]然而，其他實施例的不同之處在于在現(xiàn)有技術(shù)中報道的與SAW生物傳感器不同的額外的重要方面，方法是利用結(jié)合目標(biāo)所位于的沿著壓電表面的裸露的或非絕緣區(qū)域，而聲波是在相對側(cè)上產(chǎn)生的并且穿越了晶體的物質(zhì)。除了使用瑞利波來檢測所述表面上的分子之外，使用APM (主體或板模式波)來感測相對側(cè)上的液相中附著的分子。不同于瑞利波，APM能夠在液體中操作并且檢測相對表面上的變化。根據(jù)實驗結(jié)果，APM具有在IF范圍內(nèi)的高Q因子(大于1000)。更高的因子產(chǎn)生更高的靈敏度和更多的頻率變化。
[0098]因此，本發(fā)明的一些實施例采用了 APM模式。圖10示出了用于瑞利波的理論模型和用于本發(fā)明中的應(yīng)用的128° YX切割或Z切割LiNbO3襯底上的APM。感測區(qū)域?qū)?yīng)于流體腔室，而待測試的生物樣品放置在壓電襯底的頂部。所述波是在底部產(chǎn)生的并且移動穿過壓電介質(zhì)以檢測結(jié)合到頂部表面的分析物(經(jīng)由直接附著到表面上的抗生物素蛋白分子)，在遇到額外量的捕獲分析物之后，波的頻率將發(fā)生改變。雖然已經(jīng)在圖10中描述了128° YX切割或Z切割，但是在本發(fā)明中也可以考慮其他切割，可以對這些切割進(jìn)行優(yōu)化以通過常規(guī)實驗提供相同或大約相同的靈敏度。合并了用于APM的ZX切割的另一實施例如Andie, J.C 等人，傳感器和致動器(Sensors and Actuators) B24-25 (1995) 129-133 選擇性聲波板模式 DNA 傳感器(Selective acoustic plate mode DNA sensor)” 所描述。
[0099]在另一實施例中，使用SAW波來檢測結(jié)合在128° YX切割LiNbO3襯底的相對側(cè)上的分子。所結(jié)合的分子質(zhì)量干擾了 SAW并且改變了它們的反射?？梢园炊喾N方法測量頻率的變化，例如，測量諧波的中心頻率中的位移。
[0100]在圖11的圖A和圖11的圖B中示意性地描繪了用于所述生物傳感器的兩個實施例。圖A示出了具有接觸點(I)的生物傳感器套筒或殼體(10)。能夠產(chǎn)生APM波的例如LiNbO3等壓電襯底是一些適當(dāng)?shù)倪x擇，其中優(yōu)選的材料在一些實施例中是128° YX切割或Z切割鈮酸鋰(LiNb03)。所述生物芯片還包括交叉指型轉(zhuǎn)換器(IDT)作為IDT波發(fā)生器(2)和IDT波接收器(3)以及功能化的裸露晶體的功能化表面的絕緣區(qū)域中的其他電氣組件。絕緣體可以例如由已知的聚合性絕緣膜組成。含有目標(biāo)實體或分析物的生物流體樣品在穿過可選的濾波器出)的初步過濾之后穿過入口端口(5)進(jìn)入流體腔室(4)。捕捉試劑(7)附著到功能化的表面的非絕緣區(qū)域上?？乖?8)與受體(7)的結(jié)合在來自遍及流體腔室的IDT波發(fā)生器(2)的APM波的流動中產(chǎn)生了擾動，通過相對側(cè)上的IDT波接收器(3)，這種擾動作為修飾過的APM波得到檢測(修飾反映在其頻率中)。流體入口端口上的流體過濾器
(6)是任選地需要的，以排 除由于較大的非目標(biāo)微粒的潛在的非特異性結(jié)合(NSB)。流體隨后穿過出口端口(9)離開所述腔室。IDT是位于相對表面上的事實可以在圖10中進(jìn)行說明，圖10雖然是理論上的，但是示出了所述配置。
[0101]圖11的圖B描繪了根據(jù)本發(fā)明的具有多個以下通道的涂覆生物傳感器:分析物通道15、陽性對照通道16和參考通道17。圖11中的元件(1-6)對應(yīng)于圖10中的(1_6)。
(7)是出口端口，(8)是輸出連接器，(9)是輸入連接器，10是晶體襯底。
[0102]3.多陣列裝置
[0103]本發(fā)明的另一實施例是單個的、一次性套筒系統(tǒng)的制造，所述系統(tǒng)涵蓋了利用多種波模式和增強(qiáng)的單個傳感器或多個傳感器。每個套筒以最少量合并了傳感器以及用于包封所述傳感器且處理流體套筒內(nèi)的流體的系統(tǒng)。傳感器的利用可以通過與讀取器系統(tǒng)直接有線接觸或者通過無線模式。
[0104]在最簡單的實施例中，每個傳感器都合并有應(yīng)用于壓電襯底的電子元件和/或生物元件。圖11的圖A描繪了具有在聲波板模式(APM模式)中使用的單個延遲線結(jié)構(gòu)的傳感器的一個實施例。在所述APM模式中，電子元件是相對于生物元件和流體元件發(fā)生接觸的一側(cè)施加在襯底的相對側(cè)上的。在其他波模式(例如SAW或SH-SAW)中，這些元件可以與生物元件和流體元件一樣放置在襯底的相同側(cè)上，其中添加或不添加波導(dǎo)。能夠產(chǎn)生APM波的壓電襯底是涵蓋在此實施例的范圍內(nèi)的。一個實例是一種材料，即，128° YX切割或Z切割鈮酸鋰(LiNbO3)15其他實施例合并了 SH-SHEAR波。所述波導(dǎo)通常由聚合物組成，但是也可以通過聚合物的組合或金屬的組合或單獨的金屬制成。延遲線合并有接觸點(I)和交叉指型轉(zhuǎn)換器(2)和(3)。如果使用無線系統(tǒng)來詢問電路的話，那么可能不需要接觸點(I)。交叉指型轉(zhuǎn)換器(IDT)是按匹配對(或多個匹配對)實施的，其中每組包括IDT波發(fā)生器(2)和IDT波接收器(3)。在一些實施例中，發(fā)生器和接收器可以是相同的?？紤]合并的其他元件包括(但不限于)反射器、放大器、額外的接地、吸收器或由已知的聚合性絕緣膜組成的絕緣體的使用。
[0105]在圖11的圖A中示出了傳感器的非電子元件。所述流體套筒含有流體腔室(4)、入口端口(5)和可選的串聯(lián)過濾器(6)。在穿過可選的串聯(lián)過濾器(6)進(jìn)行過濾之后，含有目標(biāo)實體或分析物的生物流體樣品穿過入口端口(5)進(jìn)入流體腔室(4)。流體腔室(4)可以與電子元件位于相同側(cè)上(如同在SH-SAW模式的情況下)或者相對側(cè)上(對于用作APM模式傳感器)。當(dāng)生物流體樣品與襯底接觸時流體腔室(4)是預(yù)定義的區(qū)域(具有或不具有生物膜或其他修飾)。捕捉試劑(7)附著到壓電襯底表面的一個區(qū)域(如同通過流體腔室(4)的可能是或可能不是絕緣的區(qū)域定義的)?？乖?8)與受體(7)的結(jié)合對遍及流體腔室的來自IDT波發(fā)生器(2)的APM波的流動造成了擾動，這種擾動通過相對側(cè)上的IDT波接收器(3)被檢測為修飾過的APM波(修飾反映在其頻率、幅度、相位或其他衍生信息中)。流體入口端口上的流體過濾器(6)是可選的，但是可能是必需的，從而排除潛在的非特異性結(jié)合劑(NSB)，其是來源于更大的非目標(biāo)微粒的。流體隨后穿過出口端口(9)離開所述腔室到達(dá)廢棄物容器。
[0106]圖11的圖B描繪了具有并行配置的三個延遲線的APM模式傳感器的一個實施例:活化的延遲線、陽性對照延遲線和參考延遲線。此結(jié)構(gòu)可以擴(kuò)展為包括額外的延遲線或多個傳感器以配置多陣列的單個的、一次性系統(tǒng)，以診斷單個感染性元素或條件，量化感染或疾病的程度或區(qū)別密切相關(guān)的疾病、具有類似癥狀的疾病或頻繁地同時發(fā)生的感染，例如，性傳播的疾病組。具有多個延遲線的傳感器或多個傳感器還可以放置在并排的、錯開的或徑向的配置中。
[0107]實例1:用于涂覆帶有中性抗生物素蛋白和生物素化抗體的生物傳感器芯片的手動方法:
[0108]所有的這些方法實際上已經(jīng)執(zhí)行過了。
[0109]a.無需固定的涂覆:在施加抗生物素蛋白之前在大氣壓下用等離子體產(chǎn)生裝置(例如等離子體處理公司，美國伊利諾斯州埃爾金市(Plasma Treat USA, Elgin, IL))清潔和活化LiNbO3表面大約1-10秒，抗生物素蛋白的施加是通過以0.5mg/ml的抗生物素蛋白濃度在PBS中的含有50%的甘油的溶液中油墨噴射抗生物素蛋白實現(xiàn)的，隨后使用來自熱風(fēng)槍的溫空氣在大約50°C下進(jìn)行短暫的干燥或在室溫下進(jìn)行大約30分鐘的干燥，以將抗生物素蛋白結(jié)合到表面，現(xiàn)在生物傳感器準(zhǔn)備好進(jìn)行使用或包裝。
[0110]任選地，中性抗生物素蛋白的沉積之后是固定步驟。
[0111]b.采用熱固定的涂覆:如實例Ia中所描述的通過油墨噴射來施加中性抗生物素蛋白?？梢酝ㄟ^用紅外加熱燈在最多30分鐘內(nèi)加熱到大約30-50°C將中性抗生物素蛋白固定到壓電襯底上。
[0112]c.采用溶劑固定的涂覆:在實例Ia中制作的且由熱風(fēng)槍干燥的生物傳感器的涂覆區(qū)域；隨后暴露于用100%的異丙醇或丙酮飽和的空氣流中大約15秒，所述空氣流是通過在這些溶劑中鼓泡制成的，隨后短暫的暴露于氮氣流中。
[0113]d.采用蒸汽的涂覆:如同實例Ia中的固定的中性抗生物素蛋白的固定是通過加熱干燥以及隨后暴露于用甲醛飽和的空氣流中，所述空氣流是通過在10%的甲醛溶液中對空氣鼓泡制成的，并且旨在使中性抗生物素蛋白層干燥大約15秒，隨后用氮氣干燥大約15秒。
[0114]e.將生物素化的抗體附著到芯片上的抗生物素蛋白涂層:所選定的針對特定分析物的抗體是使用市售的試劑盒(例如，英諾華生物科學(xué)(Innova Bioscience)或飛世爾科學(xué)(Fisher Scientific))生物素化的。使用0.05%的BSA/PBS緩沖液將生物素化抗體稀釋到希望的濃度?；谠谥圃焐痰恼f明書中提供的抗體的已知的親和性，在室溫下在抗生物素蛋白固定的芯片上將此抗體制備物培育15-60分鐘。
[0115]實例2:自動化涂覆方法
[0116]a.用于中性抗生物素蛋白生物傳感器的自動化直接涂覆模式:
[0117]一些實施例的聯(lián)機(jī)生產(chǎn)涉及在附著到生物傳感器殼體的下部部分的壓電晶體上的中性抗生物素蛋白涂層的沉積，所述殼體隨后被安裝在傳送帶上。在等離子體處理之后，傳感器移動到中性抗生物素蛋白噴墨站并且由含有0.0l到5.0mg/ml或0.01-2.0mg/ml或每0.5平方厘米區(qū)域0.01-1.0mg/mlby重量的中性抗生物素蛋白的5_10 μ I流體涂覆。通過短暫地暴露于來自熱風(fēng)槍的熱量(大約50°C )，所述流體得到蒸發(fā)并且中性抗生物素蛋白固定在生物傳感器上。隨后蓋上殼體的上蓋以形成生物傳感器套筒的防漏流體腔室。
[0118]b.用于涂覆具有生物素化抗體的中性抗生物素蛋白的自動化涂覆模式:
[0119]使用如同上文在2a中描述的類似的噴墨方法，在室溫下在pH值為7.4的、1_10%海藻糖、1-5%甘油、0.05%疊氮化鈉的0.0lM PBS-Ο.1%BSA的非干燥的穩(wěn)定凝膠基質(zhì)中涂覆稀釋到適當(dāng)稀釋度的生物素化抗體，隨后用來自熱風(fēng)槍的溫空氣部分蒸發(fā)大約I分鐘。在隨后的塑料袋中的儲存期間，生物傳感器上的凝膠涂層被留在表面上以用固定的中性抗生物素蛋白完成與生物素化抗體的反應(yīng)。
[0120]c.用于涂覆帶有生物素化寡核苷酸的抗生物素蛋白的自動涂覆模式:
[0121]執(zhí)行實例2b的方法，但是代替地在凝膠基質(zhì)中稀釋生物素化寡核苷酸。
[0122]d.組裝和包裝:在步驟a、b或c的涂覆方法之后，套筒外殼的上部部分進(jìn)行附著以形成流體腔室，所述流體腔室完全與芯片的背側(cè)上的電子組件分離。
[0123]此實例的自動化涂覆方法也可以在常規(guī)類型的傳感器(S卩，那些具有中間涂層的)上實踐，并且在中間的氧化物涂層已經(jīng)用根據(jù)本發(fā)明的實施例的簡單的兩步方法施加的傳感器上實踐。
[0124]實例3:生物傳感器上的檢測到的沙眼衣原體
[0125]實驗是用沙眼衣原體進(jìn)行的，沙眼衣原體是一種專性的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，其會在女性和男性中引起性傳播疾病。在實例I中描述了用于涂覆抗生物素蛋白和抗體的流程。所使用的抗體是針對沙眼衣原體(阿布凱姆(Abcam))的主要外膜(MOMP)的單克隆抗體，所述抗體是生物素化的并且在0.25 μ g/ml下使用。沙眼衣原體是從麥克羅比公司(Microbia)獲得的，并且在每毫升IO5個的濃度下懸浮于PBS/緩沖液中；在一個類似實驗中，單克隆抗體是針對沙眼衣原體原質(zhì)小體脂多糖(梅迪克斯公司(Medix))產(chǎn)生的。在室溫下將生物素化的抗EB LPS的105EB+0.25 μ g/mL的原質(zhì)小體(EB)等分試樣培育30分鐘并且隨后添加到所述芯片。圖6和圖7描繪了用這些特異性感染性抗原進(jìn)行的實驗的結(jié)果。圖6是采用帶有結(jié)合到抗體的沙眼衣原體原質(zhì)小體的AMT芯片的熒光顯微鏡切片的一系列黑色和白色蹤跡，所述抗體結(jié)合到中性抗生物素蛋白。部分A描繪了陰性對照(具有單獨抗生物素蛋白并且不具有抗體的芯片)的圖像，用于部分B的顯色劑是核酸DAPI并且用于部分C的是FITC標(biāo)記的抗-抗沙眼抗體。此實驗確認(rèn)了芯片上的細(xì)胞材料的存在，這示出了抗原是結(jié)合到固定抗體的，而所述抗體又結(jié)合到抗生物素蛋白錨定物。
[0126]圖7是隨時間變化的頻率的曲線圖，并且示出了隨著衣原體與抗衣原體的結(jié)合的頻率偏移。如實例I中所描述的芯片是用抗生物素蛋白制備的并且是在如上文所描述的套筒中組裝的。執(zhí)行兩個I小時(Ix)的PBS基線測量以確保芯片的穩(wěn)定性。頻率的逐漸的傾斜是由于流體中的溫度改變。它將最終在30分鐘之后穩(wěn)定下來(未圖示)。在室溫下將抗體-抗原混合物培育30分鐘，并且隨后在第三區(qū)段中添加到芯片持續(xù)I小時。第四區(qū)段是在用PBS徹底洗滌芯片之后的讀數(shù)。從基線I中減去最終洗滌獲得了一個頻率偏移，產(chǎn)生了 223.66Hz的值并且示出EB結(jié)合到所述芯片。[0127]所述傳感器使用了在圖11中示意性描述的配置，但是具有單個通道并且是使用丙烯酸的多個層以及粘著劑的若干層和透明薄片組裝的，以形成圍繞所述傳感器的形式配適的套筒，其中在傳感器的接觸點的底部并且在頂部上、入口和出口端口上進(jìn)行曝光。所述實驗是使用安捷倫HP8753E信號分析儀進(jìn)行的。在此實驗中，在基線緩沖液施用和之后的抗體施用以及隨后的最終衣原體抗原施用之間觀察到了 800MHz的頻率偏移。盡管存在最終的洗滌，但是頻率偏移仍然保持，這指示出抗原是造成聲波板模式傳感器的頻率改變的原因。
[0128]實例4:生物傳感器上檢測到的登革熱病毒
[0129]用于涂覆抗生物素蛋白和抗體的流程是在實例I中描述的。圖8描繪了當(dāng)懸浮在PBS緩沖液中時針對用登革熱病毒進(jìn)行的實驗的頻率偏移。登革熱病毒是一種引起登革熱發(fā)燒的黃病毒，其每年大約影響一億人。它是通過城市居住的蚊子埃及伊蚊(Aedipusegyptii)傳播的。四種血清型是已知的，雖然在任何一個時間點處僅有一種血清型造成感染。血清型可以在若干年內(nèi)發(fā)生改變。血清型2是當(dāng)前已知的最常見血清型。針對登革熱病毒的實驗采用了 0.05%BSA-PBS中的4 μ g/ml的對抗血清型2抗體(凡爾登公司(Feldan))的單克隆包膜蛋白，在室溫下培育30分鐘。執(zhí)行PBS洗滌以移除過量抗體。登革熱類型2抗原是從Microbix獲得的。病毒以市售原料的標(biāo)準(zhǔn)濃度(IX) PBS/緩沖液(每毫升IO4個或8μ g/ml)懸浮(這類似于急性感染條件下的人類病毒血癥的程度)。聲波板模式傳感器和波發(fā)生器與實例3中的相同。在基線緩沖液(對照)與抗體制備物的應(yīng)用和附著之后的傳感器以及之后的登革熱病毒抗原的應(yīng)用之間觀察到500MHZ的頻率偏移。盡管存在最終的洗滌，但是頻率偏移仍然保持，這指示出抗原是造成聲波板模式傳感器的頻率改變的原因。結(jié)果在圖8中示出，圖8是峰頻率與時間的曲線圖并且表明了頻率偏移。執(zhí)行兩個PBS (Ix)基線測量以確保芯片的穩(wěn)定性，每個小時執(zhí)行一個。在第三區(qū)段中將登革熱病毒添加到所述芯片I小時。第四區(qū)段是在用額外的PBS徹底洗滌芯片之后的讀數(shù)。從基線I中減去最終洗滌確定了一個頻率偏移，以獲得278.62Hz的值，示出了病毒結(jié)合到所述芯片。
[0130]實例5:蛋白質(zhì)檢測
[0131]圖9是頻率與時間的曲線并且描繪了在芯片暴露于抗體之前和之后看到的頻率偏移。在實例I中描述了用于涂覆此抗體的方法。所述傳感器與實例3中的相同。箭頭I示出了當(dāng)只有抗生物素蛋白已經(jīng)結(jié)合到傳感器時從傳感器接收到的頻率。箭頭2示出了在施加抗體之后從所述傳感器接收到的頻率。所述抗體是一種針對生物素化的沙眼衣原體的原質(zhì)小體的多株抗體并且是在1:200的稀釋度下使用的(馬薩諸塞州劍橋市的阿布凱姆(Abeam, Cambridge, Massachusetts)_AV20387)?？梢钥吹?100MHZ 的改變，變換是由于將抗體添加到芯片而發(fā)生的。
[0132]除非另有定義，否則本文中所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語均具有如一般技術(shù)者通常了解的相同含義。
[0133]氺氺氺氺氺氺
[0134]所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員只需使用常規(guī)實驗即可識別或能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實施例的許多等效物。此類等效物是意圖由上文的權(quán)利要求書涵蓋的。
[0135]本文中所引用的所有專利和其他文獻(xiàn)都通過全文引用的方式并入。
【權(quán)利要求】
1.一種聲波生物傳感器組件，其包括壓電晶體，所述壓電晶體包括直接結(jié)合到壓電材料的表面的錨定物質(zhì)層，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其中所述錨定物質(zhì)是抗生物素蛋白，優(yōu)選地是抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其中所述錨定物質(zhì)層是單層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其中所述壓電材料選自由以下組成的群組:蘭格奈特(Ianganite)晶體、鈮酸鉛鎂、鈦酸鉛、鋯鈮酸鉛、鈦酸鉛、鈮酸鋰、具有摻雜物的鈮酸鋰、四硼酸鋰、鉭酸鋰、石英、鈦酸鋇、塊磷鋁礦、正磷酸鎵、鈮酸鉀、鋯鈦酸鋇、氧化硼酸鑭鈣、蘭克賽(Iangasite)晶體、硅酸鑭鎵、鈣鈦礦型陶瓷結(jié)構(gòu)、鐵酸鉍、鋯鈦酸鉛、硫化鎘、氧化鋅、砷化鎵、氧化秘和氧化鍺、氮化招和聚偏二氟乙烯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其中所述壓電材料是鈮酸鋰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其進(jìn)一步包括殼體和流體腔室，其中帶有所述錨定層的所述壓電材料的所述表面形成了所述腔室的壁。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器組件，其中所述錨定物質(zhì)是寡核苷酸或聚核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的生物傳感器組件，其進(jìn)一步包括聲波發(fā)生器和聲波接收器。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物傳感器組件，其中所述波發(fā)生器產(chǎn)生體聲波或表面聲波。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物傳感器組件，其中所述體聲波發(fā)生器產(chǎn)生選自由以下組成的群組的波:厚度剪切模式、聲波板模式和水平板模式。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物傳感器組件，其中所述表面聲波發(fā)生器產(chǎn)生選自由以下組成的群組的波:水平剪切表面聲波、表面橫波以及洛夫波。
12.一種用包括錨定物質(zhì)的生物膜涂覆壓電材料的表面的方法，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成，所述方法包括: a.處理壓電材料的晶體表面以增大所述晶體表面的表面能； b.將一層所述錨定物質(zhì)施加到所述晶體表面； c.在所述晶體表面上形成化學(xué)吸附型錨定層。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述處理步驟包括等離子體處理。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述等離子體處理包括暴露于大氣等離子體噴射流大約5到10秒。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述壓電材料選自由以下組成的群組:蘭格奈特晶體、鈮酸鉛鎂、鈦酸鉛、鋯鈮酸鉛、鈦酸鉛、鈮酸鋰、具有摻雜物的鈮酸鋰、四硼酸鋰、鉭酸鋰、石英、鈦酸鋇、塊磷鋁礦、正磷酸鎵、鈮酸鉀、鋯鈦酸鋇、氧化硼酸鑭鈣、蘭克賽晶體、硅酸鑭鎵、韓鈦礦型陶瓷結(jié)構(gòu)、鐵酸秘、錯鈦酸鉛、硫化鎘、氧化鋅、砷化鎵、氧化秘和氧化鍺、氮化招和聚偏二氟乙烯。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述壓電材料是鈮酸鋰。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述施加步驟包括將所述錨定物質(zhì)噴霧或接觸傳遞到所述表面層上以在所述表面上形成薄的均一的液體膜。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述薄的均一的液體膜是微點。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述錨定物質(zhì)是抗生物素蛋白，優(yōu)選地是抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述施加步驟進(jìn)一步包括干燥所述錨定層。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其進(jìn)一步包括:用包括捕捉試劑的組合物接觸所述結(jié)合的錨定物質(zhì)層，所述捕捉試劑具有特異性地識別生物流體中的分析物的特性，和使得所述捕捉試劑通過所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物結(jié)合到所述錨定物質(zhì)。
22.一種用包括錨定物質(zhì)的生物膜涂覆壓電材料的表面的方法，所述錨定物質(zhì)具有結(jié)合到捕捉試劑的性質(zhì)，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成，所述方法包括: a.向壓電材料的晶體表面施加硅酸鹽、鋯酸鹽或鈦酸鹽的溶液并且與酸反應(yīng)以分別形成二氧化硅、氧化鋯或二氧化鈦的中間層； b.將一層所述錨定物質(zhì)施加到所述中間層，以在所述晶體表面上形成錨定層。
23.—種聲波生物傳感器,其包括: a.壓電晶體，所述壓電晶體包括直接結(jié)合到所述壓電晶體的表面的錨定物質(zhì)層，所述層中的所述錨定物質(zhì)還結(jié)合到捕捉試劑，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成并且特異性地識別在生物流體中存在的分析物； b.聲波發(fā)生器，所述發(fā)生器產(chǎn)生波，其中所述捕捉試劑與分析物之間的反應(yīng)引起了所述聲波的特性的可檢測的改變。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述晶體是鈮酸鋰。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述錨定層是單層。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述捕捉試劑特異性地識別選自由以下組成的群組的分析物:全細(xì)胞、細(xì)菌、真核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒、真菌、寄生蟲和孢子，以及前述各項中的任何一個的片段、蛋白質(zhì)核酸和毒素。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述捕捉試劑對沙眼衣原體具有特異性。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述捕捉試劑對登革熱病毒具有特異性。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其中所述聲波是BAW。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其進(jìn)一步包括用于接收生物流體樣品的腔室。
31.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物傳感器，其在所述生物涂覆的壓電晶體上包括多個通道，其中每個通道包括不同的捕捉試劑層，或者是不包括捕捉試劑的對照通道，所述通道允許同時進(jìn)行多個分析。
32.一種用于確定生物流體樣品中的分析物的存在或數(shù)量的方法，所述方法包括: 用包括捕捉試劑的組合物接觸權(quán)利要求1的組件，所述捕捉試劑包括或由針對所述錨定物質(zhì)的特異性結(jié)合搭配物組成并且還特異性地識別分析物； 使得所述捕捉試劑結(jié)合到所述錨定物質(zhì)，形成捕捉試劑層；用生物流體樣品接觸所述結(jié)合的捕捉試劑層；和跨越所述壓電表面產(chǎn)生聲波；和測 量由分析物結(jié)合到所述捕捉試劑層引起的波的幅度、相位或頻率的任何改變。
【文檔編號】H01L41/113GK103946704SQ201280041654
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月26日
【發(fā)明者】利薩·勞里-克萊托普, 歐旭成, 赫爾曼·魯特納 申請人:艾維亞納分子技術(shù)有限公司