用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球及其制備方法，本發(fā)明磁性微球表面含有NHS（N-羥基丁二酰亞胺）基團，無需經(jīng)EDC/NHS或戊二醛活化，可直接共價偶聯(lián)含伯氨基的生物配基，具有操作簡單、偶聯(lián)條件溫和、生物配基偶聯(lián)快速高效的優(yōu)點；此外，NHS通過5～50?的手臂鏈與微球表面連接，可減少生物配基與目標結(jié)合物相互作用時的空間位阻，使生物配基的活性及有效利用率大大提高；本發(fā)明NHS修飾磁性微球表面NHS含量為50～1000μmol/g，與現(xiàn)有技術相比具有更高的NHS基團含量，能偶聯(lián)更多的生物配基，從而提高磁性微球與目標物質(zhì)的結(jié)合量及靈敏度。
【專利說明】用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種磁性微球及其制備方法，具體是一種可與含伯氨基生物配基快速 高效偶聯(lián)的磁性微球及該磁性微球的制備方法，屬于生物材料領域。
【背景技術】
[0002] 生物磁性微球是近年發(fā)展起來的一項新免疫學技術，其原理包括：首先運用核/ 殼等方法合成外殼為無機材料、高分子材料、生物大分子等的磁性微球，這些磁性微球具有 良好的理化穩(wěn)定性、生物相容性和超順磁性，且容易利用熒光等物質(zhì)進行后期標記；其次利 用磁性微球物質(zhì)表面的功能基團如氨基、羧基、環(huán)氧基、醛基、巰基等進行蛋白、抗體、酶、核 酸等生物分子的共價偶聯(lián)或者物理包被，制備成磁性微球免疫試劑；最后經(jīng)過活性位點封 閉便可用于分離純化、核酸提取、細胞分選、檢測診斷等領域。正是因為生物磁性微球?qū)⒐?化試劑的特點與免疫學反應的高度特異性結(jié)合于一體，使得生物磁性微球的應用已經(jīng)滲透 到病理、生理、藥理、微生物、生化以及分子遺傳學等各個領域。
[0003] 其中，羧基磁性微球的應用最為廣泛，其原理是利用磁性微球表面的羧基基團與 EDC/NHS反應后，生成NHS活化的磁性微球中間體，繼而利用NHS基團與含伯氨基的生物配 基共價鍵結(jié)合，最終將含伯氨基的生物配基偶聯(lián)到羧基磁性微球上。末端含N-羥基丁二酰 亞胺（N-Hydoxysuccinimide，NHS)基團的磁性微球共價結(jié)合含伯胺基團的配基，是制備 免疫親和介質(zhì)的首選，同時也可偶聯(lián)特定短肽等小分子配基。NHS磁性微球與配基偶聯(lián)時速 度快、效率高，且NHS基團可使磁性微球和蛋白形成酰胺鍵，在使用過程中很少發(fā)生配基泄 露，在pH為13的條件下仍很穩(wěn)定。
[0004] 但現(xiàn)有利用羧基、氨基磁性微球偶聯(lián)生物分子仍存在不足。如中國專利 CN103275217公開了一種利用羧基磁性微球進行的抗體純化技術，其主要步驟是在MES緩 沖液中將羧基磁性微球和SPA蛋白通過EDC/NHS試劑共價鍵結(jié)合，然后利用該材料去純化 抗體；如中國專利CN103323603公開了一種羧基磁性微球表面共價偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法，其 主要步驟是在MES緩沖溶液中進行羧基磁性微球表面的活化，得到NHS活化磁性微球后再 與蛋白質(zhì)結(jié)合，最后將殘余的NHS活性基團進行封閉以便后續(xù)利用。
[0005] 上述羧基磁性微球偶聯(lián)生物分子之前，必須要使用NHS對磁性微球進行預活化， 需對活化條件進行長時間的摸索，這無疑使得羧基磁珠使用不便，操作繁瑣，增加產(chǎn)品成 本；此外，由于羧基磁性微球進行NHS活化時是在水溶液中進行，而NHS基團在水溶液中非 常容易水解，其水解半衰期在1?15min不等，這使得NHS活化基團含量偏低，大大降低生 物分子的偶聯(lián)量。氨基磁性微球在偶聯(lián)生物配基過程中，也需要事先用戊二醛對氨基進行 活化，然后再通過醛基與生物配基上的氨基進行共價偶聯(lián)，同羧基磁性微球一樣，其操作繁 瑣，使用不方便，且戊二醛的引入有可能會損害某些生物配基的活性。因此開發(fā)一種含高密 度NHS活化基團，無需活化可直接與含伯氨基生物分子高效、快速偶聯(lián)的磁性微球能夠為 用戶使用帶來極大的便利性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為克服現(xiàn)有技術中的不足，本發(fā)明提供一種用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微 球及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術方案是：
[0008] -種用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球，所述磁性微球表面含有NHS基團， 其結(jié)構(gòu)式如下：
[0009]
【權利要求】
1. 一種用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述磁性微球表面含有 NHS基團，其結(jié)構(gòu)式如下：
所述NHS基團與磁性微球表面通過鏈長5?50人的手臂鏈連接，每克磁性微球表面含 有50?1000iimol的NHS基團。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述 手臂鏈為直鏈或枝鏈。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用于偶聯(lián)含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述 磁性微球包括二氧化娃磁性微球或高分子磁性微球，所述高分子磁性微球包括聚苯乙烯磁 性微球、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、聚苯乙烯共聚甲基丙烯酸縮水甘油醚磁性微球、瓊脂 糖磁性微球、葡聚糖磁性微球。
4. 權利要求1至3所述任意一種磁性微球的制備方法，其特征在于包括如下步驟： ① 對磁性微球本體的表面基團進行基團修飾，使其表面最終變?yōu)轸然?，形成磁性微?本體一手臂鏈一竣基結(jié)構(gòu)的羧基磁性微球； ② 將①中羧基磁性微球上的羧基在有機溶劑中進行NHS活化，得到表面含有NHS基團 的磁性微球； ③ 將②制得的表面含有NHS基團的磁性微球用有機溶劑制成懸浮液進行保存，所述懸 浮液的濃度為lmg/mL?100mg/mL。
5. 根據(jù)權利要求4所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：所述步驟②中有機溶劑 為N，N-二甲基乙酰胺、丙酮、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺、異丙醇、二甲基亞砜中的一種 溶劑或一種以上溶劑所組成的混合溶劑，所述步驟③中有機溶劑包括異丙醇、丙酮、N，N-二 甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺的一種或多種組合。
6. 根據(jù)權利要求5所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：所述羧基磁性微球上的 羧基進行NHS活化，包括如下步驟： 首先，采用有機溶劑洗滌羧基磁性微球，除去水分； 其次，除水后的羧基磁性微球依次加入有機溶劑和NHS，室溫反應1?48h得到表面含 有NHS基團的磁性微球，其中，羧基磁性微球與有機溶劑的固液比為lmg:O.OlmL?lmg: 10mL，羧基磁性微球與NHS質(zhì)量比為1 : 0. 1?1 : 10。
7. 根據(jù)權利要求4所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：步驟①所述表面基團包 括輕基、環(huán)氧基、氣基、竣基。
8. 根據(jù)權利要求7所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：表面基團為羥基時，采用 以下方法改性為羧基： 方法一，當磁性微球本體為二氧化娃磁性微球時，將二氧化娃磁性微球本體分散至有 機溶劑中，加入含氨基的硅烷偶聯(lián)劑對二氧化硅磁性微球進行改性，得到表面基團末端含 有氨基的磁性微球，接著將氨基磁性微球與酸酐反應，得到羧基磁性微球； 所述有機溶劑包括甲苯、異丙醇或乙醇，所述含氨基的硅烷偶聯(lián)劑包括N-W-氨乙 基）-Y-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-(@-氨乙基）-y_氨丙基-甲基-三甲氧基硅烷、氨 丙基-三甲氧基硅烷或Y-氨丙基-三乙氧基硅烷，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 方法二，當磁性微球本體為磁性瓊脂糖或磁性葡聚糖微球時，采用活化試劑對磁性微 球本體上的羥基進行活化，再與氨基酸反應得到羧基磁性微球； 所述活化試劑包括溴化氰、羰基二咪唑、環(huán)氧氯丙烷或1，4-丁二醇二縮水甘油醚，所 述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基 庚酸。
9. 根據(jù)權利要求7所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：表面基團為環(huán)氧基時，將 含有環(huán)氧基的磁性微球本體在pH為8?11的條件下與氨基酸反應得到羧基磁性微球，所 述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基 庚酸。
10. 根據(jù)權利要求7所述的磁性微球的制備方法，其特征在于：表面基團為氨基時，將 含有氨基的磁性微球本體與酸酐在pH為5?9的條件下反應，酸化后得羧基磁性微球，所 述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 或者將表面為氨基的磁性微球在甲醇中與丙烯酸甲酯反應得到丙烯酸甲酯改性的磁 性微球，然后將丙烯酸甲酯改性的磁性微球在甲醇中與乙二胺反應得到乙二胺改性的磁性 微球，最后將乙二胺改性的磁性微球在pH為5?9的條件下與酸酐反應得到枝化的羧基磁 性微球；所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐。
【文檔編號】H01F1/42GK104402003SQ201410492000
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】任輝, 譚建雄 申請人:海貍納米科技（蘇州）有限公司