一種免疫磁性納米微粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種免疫磁性納米微粒的制備方法。本發(fā)明利用硅酸酯對四氧化三鐵磁納米微粒進行表面包覆，降低其表面活化能，從而大大提高磁納米微粒的穩(wěn)定性，同時可調(diào)節(jié)硅酸酯的濃度包覆厚度，然后在其表面進行羧基修飾，整個過程反應條件溫和，無需惰性氣體環(huán)境、不用高溫高壓等苛刻條件，無需復雜裝置與大型設備，原物料易得、無需大量有機溶劑，同時合成的磁微粒粒徑可調(diào)控，將羧基修飾的磁微粒通過活化劑活化后與生物活性分子的游離氨基通過酰胺鍵共價結合，相較于醛胺縮合反應的亞胺結構以及膠體金的非共價結合更加牢固。
【專利說明】
一種免疫磁性納米微粒的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種免疫磁性納米微粒的制備方法。
【背景技術】
[0002] 四氧化三鐵納米微粒具有良好的生物相容性和磁學性能，其在外加磁場作用下， 可迅速聚集并與其它組分分離，使其在細胞分選和標記，蛋白質(zhì)分離純化，藥物輸送，磁共 振造影、細胞標記、靶向藥物載體等方面得到廣泛應用；然而，未經(jīng)表面修飾處理的四氧化 三鐵納米微粒在溶液中由于其粒徑小，表面活化能大，顆粒間靜磁與電偶矩相互作用，導致 其穩(wěn)定性很差，容易團聚，產(chǎn)生沉積，同時還容易被氧化。因此需要對其進行修飾，改變其表 面性質(zhì)，防止其被氧化并能夠更好地分散在水相中。同時其表面經(jīng)修飾的高密度活性基團 能夠與生物分子、細胞表面以及其它活性分子進行偶聯(lián)以滿足不同的應用。
[0003] 目前已經(jīng)有多種四氧化三鐵納米微粒的制備、表面修飾以及偶聯(lián)生物分子的方 法。公開號分別為CNI01241130A、CN1667413A的發(fā)明專利為包覆聚苯乙烯等有機高分子聚 合物的結構，公開號分別為CNI015196482B和CN1872028A的發(fā)明專利是通過修飾和活化羧 基制備出免疫磁性微粒。公開號為CN 103357359 A利用Schiff反應生成亞胺來偶聯(lián)磁納米 微粒與生物活性分子，公開號為CN 102766191 B是通過在磁微粒表面多次修飾與基團保護 從而與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。目前這些磁微粒的制備技術存在的問題是工藝條件要求較高、制備過 程繁瑣、涉及有機毒性物質(zhì)、需要大型儀器設備、批間重復性差、難以大量穩(wěn)定制備、生物活 性分子偶聯(lián)效率低、容易脫落等，因此在工業(yè)化應用上受到較大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服現(xiàn)有技術工藝條件要求較高、制備過 程繁瑣、涉及有機毒性物質(zhì)、難以大量穩(wěn)定制備、偶聯(lián)效率低、穩(wěn)定性差、易脫落等技術瓶 頸，從而提出一種偶聯(lián)效率高、粒徑均勻、穩(wěn)定性好、工藝簡單、周期短、低毒、低成本、無需 大型設備的免疫磁性納米微粒的制備工藝。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種免疫磁性納米微粒的制備方法，所述方 法包括如下步驟：
[0006] a.制備四氧化三鐵納米微粒內(nèi)核
[0007] 配制二價鐵鹽溶液，然后加至含檸檬酸鈉以及高濃度硝酸鹽的堿性溶液中攪拌； 然后進行沉淀離心分離，得到磁懸浮液；
[0008] b.制備表面娃包覆的納米磁微粒
[0009] 用步驟a制備的納米磁微粒，磁性分離，用堿液洗滌懸液，重分散于堿液中；將正硅 酸乙酯溶解于乙醇中，并加入至分散液中，攪拌，在磁微粒表面生成的一層二氧化硅得到的 包覆，磁分離得到表面娃包覆的磁微粒；
[0010] c.制備表面羧基修飾的磁微粒
[0011]稱取氨基化硅烷與酸酐，在無水溶劑中攪拌，得到羧基化硅烷;將羧基化硅烷溶解 于無水乙醇中，加入納米磁微粒，加堿液，并攪拌，然后用無水乙醇與純化水洗滌，磁分離， 得到表面羧基修飾的納米磁微粒；
[0012] d.制備免疫磁微粒
[0013] 將步驟C制備的羧基磁微粒洗滌分散于緩沖液中，用SulfO-NHS與EDC活化反應后， 磁分離，加入抗原、抗體或其它生物活性分子，振蕩反應，磁分離即得免疫磁性納米微粒。
[0014] 優(yōu)選的，所述方法步驟如下：
[0015] a.制備四氧化三鐵納米微粒內(nèi)核
[0016] 配制二價鐵鹽溶液，加至劇烈攪拌的含檸檬酸鈉以及高濃度硝酸鹽的堿性溶液 中，在2 5~9 0 °C條件下攪拌5分鐘以上，得到穩(wěn)定的磁懸浮液；
[0017] b.制備表面娃包覆的納米磁微粒
[0018] 用步驟a制備的納米磁微粒，磁性分離，用pH值為10~13的堿液洗滌懸液3次，重分 散于堿液中，調(diào)節(jié)pH值為10~13,將正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并按比例加入至分散液中， 30~50 °C條件下混合物攪拌4~5小時，在磁微粒表面生成的一層二氧化娃得到的包覆;磁 分離得到表面娃包覆的磁微粒；
[0019] c.制備表面羧基修飾的磁微粒
[0020] 按酸酐基團與氨基摩爾比（1.2~2): 1將稱取氨基化硅烷與酸酐在無水溶劑中攪 拌10到60分鐘，得到羧基化硅烷。將羧基化硅烷溶解于無水乙醇中，加入1.2制備的納米磁 微粒，用堿液調(diào)節(jié)pH值至10~13，30~50°C攪拌4~5小時，然后用無水乙醇與純化水洗滌， 磁分離，得到表面羧基修飾的納米磁微粒；
[0021] d.制備免疫磁微粒
[0022]優(yōu)選的，將步驟c制備的羧基磁微粒用pH值為6.0~7.0的MES緩沖液洗滌三次，再 分散于此緩沖液中，用Sulfo-NHS與EDC在室溫下活化振蕩反應0.5~1小時后，磁分離，洗滌 除去未反應的試劑，加入抗原、抗體、鏈霉親和素分子，室溫振蕩反應3h，磁分離，緩沖液洗 滌后即得。
[0023]優(yōu)選的，所述氨基包括伯胺基和仲胺基。
[0024]優(yōu)選的，所述二價鐵鹽為硫酸亞鐵、氯化亞鐵中的一種;三價鐵鹽為氯化鐵、硫酸 鐵、硝酸鐵、檸檬酸鐵中的一種;堿液為氨水或四氨基氫氧化銨中的一種。
[0025]優(yōu)選的，所述二價鐵鹽摩爾濃度比為0.01m〇l/L~lmol/L;三價鐵鹽的摩爾濃度為 O.Olmol/L~2mol/L;鹽酸濃度為0.1mol/L~2mol/L;二價鐵鹽、三價鐵鹽與堿液的摩爾比 為（1~2):(1~2):(4~20)。
[0026]優(yōu)選的，所述正硅酸乙酯與四氧化三鐵的質(zhì)量比為（1~5): (1~20)。
[0027]優(yōu)選的，所述酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、馬來酸酐、鄰苯二甲酸酐中的 一種;氨基化硅烷為γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基三甲氧基硅烷、二乙烯三氨基丙基 二甲氧基硅烷、Ν-(β-氛乙基)-γ -氛丙基二乙氧基硅烷、Ν-(β-氛乙基)-γ -氛丙基甲基二 甲氧基硅烷中的一種;無水溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜中的一種。
[0028]優(yōu)選的，所述酸酐與羧基化硅烷的摩爾比為（1~5): (1~20)。
[0029]更為優(yōu)選的，所述磁納米微粒與EDC，Sulf O-NHS的質(zhì)量摩爾比為Ig : (1~ IOOmmol): (1~50mmol);加入的所述磁微粒與抗體的質(zhì)量比Ig: (0.1~IOmg)。
[0030]本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：
[0031] (I)本發(fā)明的羧基修飾的磁納米微粒，包括四氧化三鐵內(nèi)核，二氧化硅殼層以及表 面修飾的活性基團羧基，羧基通過活化可偶聯(lián)體外診斷所需的抗體、抗原、半抗原、親和素、 鏈霉親和素等生物活性分子，由于磁微粒表面修飾的羧基密度大，偶聯(lián)效率更高，可通過外 磁場將待測物與其它分子快速有效分離，因此在體外診斷、微生物分離、細胞標記、靶向藥 物等領域具有著廣泛的應用前景。
[0032] (2)制得的磁微粒粒徑均一、穩(wěn)定好、大小可調(diào)節(jié)，可滿足不同需求，室溫下存放半 年以上均無沉降。
[0033] (3)制備工藝簡單易行、周期短，所有原物料均低毒、價廉、易得，無需大型設備與 復雜裝置，易于大規(guī)模制備。
【具體實施方式】
[0034] 實施例1本實施例公開了一種免疫磁性納米微粒(親和素/鏈霉親合素包被的免疫 磁納米微粒)的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0035] (1)四氧化三鐵磁微粒內(nèi)核的制備:稱取40mmol FeCl2,溶于4mL純化水中，將混合 溶液倒入250ml含lmmol/L檸檬酸鈉、0 · 8mo 1/L硝酸鈉、0 · lmol/L氫氧化鈉中，70°C條件下劇 烈攪拌60min，冷卻至室溫，用1 % TMAH洗滌兩次，磁力分離，棄上清。沉淀用0.1 % TMAH洗滌2 ~3次。重懸于25mL 0.1 %TMAH中。
[0036] (2)表面二氧化硅修飾的磁微粒:取25mL(l)制備的磁微粒內(nèi)核，加入3ml 10%的 正硅酸乙酯的乙醇溶液，室溫下劇烈攪拌3小時，0.1 %TMAH洗滌2次，即得表面二氧化硅包 覆的磁納米微粒
[0037] (3)表面羧基修飾的磁微粒:稱取25mmol丁二酸酐，IOmmol Ν-(β-氨乙基)-γ -氨 丙基甲基二甲氧基硅烷溶解于Iml無水DMF中室溫振蕩反應30min，然后將混合物溶于20ml 乙醇中，與（2)制備的二氧化硅包覆的磁微?；旌?，TMAH調(diào)節(jié)pH至12.0，50°C條件下攪拌5小 時，冷卻至室溫，磁分離，用丙酮與純化水洗滌除去未結合物，最后分散于純化水中 [0038] (4)磁微粒與鏈霉親和素偶聯(lián):取20ml 10mg/ml羧基修飾磁微粒，加入3mmol EDC， 2mmol Sulfo-NHS，室溫下振蕩反應2小時，磁分離，加入Img親和素/鏈霉親合素，室溫振蕩 反應4小時以上，磁分離，保留上清液用于測定鏈霉親和素的偶聯(lián)效率。用MES緩沖液洗滌分 離物，即得所述的親和素/鏈霉親合素包被的免疫磁納米微粒。
[0039]實施例2本實施例公開了一種免疫磁性納米微粒(兔抗FITC抗體修飾的免疫磁納 米微粒)的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0040] (1)四氧化三鐵磁微粒內(nèi)核的制備:稱取15mmol Fe2(S〇4)3,溶解于4mL純化水中， 將混合溶液倒入100mL含0.5mmol/L檸檬酸鈉、lmol/L硝酸鉀的1%TMAH溶液中，加熱至60 °C，劇烈攪拌反應30min。冷卻至室溫，磁性分離，棄上清。用0.1 % TMAH洗滌分離物2~3次。 重懸于15mL 0.1%TMAH中，得到穩(wěn)定的磁懸浮液。
[0041 ] (2)表面二氧化硅修飾的磁微粒:取15mL(1)制備的磁微粒內(nèi)核，加入3ml 30 %的 四乙氧基正硅烷的乙醇溶液，室溫下劇烈攪拌3小時，1 % TMAH洗滌2次，即得表面二氧化硅 包覆的磁納米微粒
[0042] (3)表面羧基修飾的磁微粒:稱取15mmol丁二酸酐、IOmmol γ -氨丙基三乙氧基娃 烷溶解于Iml無水DMF中40°C條件下反應30min，將混合物溶于20ml乙醇中，與（2)制備的二 氧化娃包覆的磁微粒混合，TMAH調(diào)節(jié)pH至12.0，50 °C條件下攪拌5小時，冷卻至室溫，磁分 離，用乙醇洗滌除去未結合的試劑，再純化水洗滌，重懸于純化水中。
[0043] (4)磁微粒與兔抗FITC抗體偶聯(lián):移取200mg羧基修飾磁微粒，重分散于pH值為6.5 的MES緩沖液中，加入4mmo I EDC，2mmo I Su I f 〇-NHS，室溫下振蕩反應1小時，磁分離，加入 Img兔抗FITC抗體，室溫振蕩反應4小時，磁分離，保留上清液用于測定兔抗FITC抗體的偶聯(lián) 效率，用MES緩沖液洗滌分離物，即得所述的兔抗FITC抗體包被的免疫磁納米微粒。
[0044] 實驗例
[0045] 將實施例1與實施例2所得的免疫納米微粒的偶聯(lián)效率與穩(wěn)定性與現(xiàn)有的技術所 得進行對比，得到如下表格：
[0047]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種免疫磁性納米微粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： a. 制備四氧化三鐵納米微粒內(nèi)核 配制二價鐵鹽溶液，然后加至含檸檬酸鈉以及高濃度硝酸鹽的堿性溶液中攪拌;然后 進行沉淀離心分離，得到磁懸浮液； b. 制備表面娃包覆的納米磁微粒 用步驟a制備的納米磁微粒，磁性分離，用堿液洗滌懸液，重分散于堿液中；將正硅酸乙 酯溶解于乙醇中，并加入至分散液中，攪拌，在磁微粒表面生成的一層二氧化硅得到的包 覆，磁分離得到表面娃包覆的磁微粒； c. 制備表面羧基修飾的磁微粒 稱取氨基化硅烷與酸酐，在無水溶劑中攪拌，得到羧基化硅烷;將羧基化硅烷溶解于無 水乙醇中，加入納米磁微粒，加堿液，并攪拌，然后用無水乙醇與純化水洗滌，磁分離，得到 表面羧基修飾的納米磁微粒； d. 制備免疫磁微粒 將步驟c制備的羧基磁微粒洗滌分散于緩沖液中，用Sulfo-NHS與EDC活化反應后，磁分 離，加入抗原、抗體或其它生物活性分子，振蕩反應，磁分離即得免疫磁性納米微粒。2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述方法步驟如下： a. 制備四氧化三鐵納米微粒內(nèi)核 配制二價鐵鹽溶液，加至含有檸檬酸鈉和硝酸鹽的堿性溶液中，在25~90°C條件下攪 拌5分鐘以上，得到的沉淀離心分離后，用堿液洗滌三次，得到穩(wěn)定的磁懸浮液； b. 制備表面娃包覆的納米磁微粒 用步驟a制備的納米磁微粒，磁性分離，調(diào)節(jié)pH值為10~13，將正硅酸乙酯溶解于乙醇 中，并按一定比例加入至分散液中，30~50°C條件下混合物攪拌4~5小時，在磁微粒表面生 成的一層二氧化硅得到的包覆;磁分離得到表面硅包覆的磁微粒； c. 制備表面羧基修飾的磁微粒 按酸酐基團與氨基摩爾比（1.2~2): 1將稱取氨基化硅烷與酸酐在無水溶劑中攪拌10 到60分鐘，得到羧基化硅烷。將羧基化硅烷溶解于無水乙醇中，加入1.2制備的納米磁微粒， 用堿液調(diào)節(jié)pH值至10~13,30~50 °C攪拌4~5小時，然后用無水乙醇與純化水洗滌，磁分 離，得到表面羧基修飾的納米磁微粒； d. 制備免疫磁微粒 將步驟c制備的羧基磁微粒用pH值為6.0~7.0的MES緩沖液洗滌三次，再分散于此緩沖 液中，用EDC與Sulfo-NHS在室溫下活化振蕩反應0.5~1小時后，磁分離，洗滌除去未反應的 試劑，加入抗原、抗體或其它生物活性分子，室溫振蕩反應3h，磁分離，緩沖液洗滌后即得。3. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述氨基包括伯胺基和仲胺基。4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述二價鐵鹽為硫酸亞鐵、氯化亞鐵中 的一種;硝酸鹽為硝酸鈉、硝酸鉀中的一種;堿液為氨水、四甲基氫氧化銨、氫氧化鈉中的一 種。5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述二價鐵鹽摩爾濃度比為0.01m〇l/L ~lmol/L;朽1檬酸鈉濃度為0.5mmol/L~10mmol/L，硝酸鹽濃度為0.2mol/L~3mol/L。6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述正硅酸乙酯與四氧化三鐵的質(zhì)量比 為（1~5):(1~20)。7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述酸酐為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸 酐、馬來酸酐、鄰苯二甲酸酐中的一種；氨基化硅烷為γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基 三甲氧基硅烷、二乙烯三氨基丙基三甲氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ -氨丙基三乙氧基硅烷、 Ν-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的一種;無水溶劑為Ν，Ν-二甲基甲酰胺、二 甲亞砜中的一種。8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述酸酐與氨基化硅烷的摩爾比為（1~ 5):(1~20)〇9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述磁納米微粒與EDC，Sulf o-NHS的質(zhì) 量摩爾比為lg: (1~lOOmmol): (1~50mmol);加入的所述磁微粒與抗體的質(zhì)量比lg: (0.1~ 10mg)〇
【文檔編號】H01F41/02GK106057394SQ201610381722
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】鄭招榮, 劉金超
【申請人】深圳市瀚德標檢生物工程有限公司