本發(fā)明屬于生物檢測(cè)，具體涉及一種通過(guò)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（mln）預(yù)測(cè)針對(duì)非小細(xì)胞肺癌（nsclc）的新輔助免疫治療后預(yù)后的預(yù)測(cè)模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、非小細(xì)胞肺癌（nsclc）是肺癌中最常見的亞型，其發(fā)病率逐漸上升。最近，一系列新輔助免疫療法的臨床試驗(yàn)顯示，可切除的非小細(xì)胞肺癌患者在新輔助免疫聯(lián)合化療后，表現(xiàn)出顯著增高的腫瘤退縮率和顯著降低的復(fù)發(fā)率，這導(dǎo)致新輔助免疫療法在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用逐漸增加，已成為部分nsclc的標(biāo)準(zhǔn)治療。

2、目前新輔助免疫相關(guān)研究關(guān)注點(diǎn)主要放在了原發(fā)腫瘤灶的微環(huán)境中，經(jīng)典理論認(rèn)為免疫治療主要通過(guò)重新激活腫瘤微環(huán)境中的耗竭型t細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，然而目前越來(lái)越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)（tumor-draining?lymph?nodes,?tdln）的新啟動(dòng)和新擴(kuò)增的效應(yīng)t細(xì)胞可能發(fā)揮了更重要的抗腫瘤免疫作用。一方面，tdln在腫瘤免疫中具有重要生理功能。抗原呈遞細(xì)胞在原發(fā)腫瘤組織中捕獲腫瘤抗原后，遷移到tdln中并啟動(dòng)抗原特異性t細(xì)胞的活化，隨后新啟動(dòng)和新擴(kuò)增的t細(xì)胞重新浸潤(rùn)至原發(fā)腫瘤中并發(fā)揮抗腫瘤作用。另一方面，tdln內(nèi)包括免疫和非免疫細(xì)胞在內(nèi)的各種成分在免疫治療應(yīng)答中也發(fā)揮了重要作用。有研究在動(dòng)物模型中證實(shí)手術(shù)切除tdln會(huì)大大降低免疫治療療效。

3、近期研究發(fā)現(xiàn)，同一肺癌患者的腫瘤原發(fā)灶與區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)對(duì)新輔助免疫治療可能出現(xiàn)截然不同的反應(yīng)，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可能反應(yīng)不佳且遠(yuǎn)處淋巴結(jié)反應(yīng)更差，提示我們主病灶與淋巴結(jié)的免疫微環(huán)境可能存在諸多差異，轉(zhuǎn)移tdln中的腫瘤細(xì)胞可能代表了一個(gè)特殊亞群，不僅能夠逃避免疫監(jiān)視、抵抗免疫治療，而且是腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵來(lái)源。然而，究竟何種免疫細(xì)胞亞群或免疫微環(huán)境特征結(jié)構(gòu)在影響mln新輔助免疫療效中起到關(guān)鍵作用，尚未見充分研究。

4、目前，少數(shù)探索nsclc的mln新輔助免疫后免疫微環(huán)境特征的研究，局限于少數(shù)指標(biāo)的免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，僅能大致描繪免疫微環(huán)境的細(xì)胞大類，未見有針對(duì)mln免疫微環(huán)境的單細(xì)胞水平精細(xì)刻畫。成像質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（imaging?mass?cytometry，imc）是空間蛋白組學(xué)的一種新興技術(shù)，其將不同目標(biāo)抗體與稀土金屬耦聯(lián)并在同一張組織玻片上進(jìn)行孵育，采用高分辨率激光系統(tǒng)逐點(diǎn)掃描樣本后使用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)幾十種蛋白標(biāo)志物，并能夠保留細(xì)胞的空間微信息，從而實(shí)現(xiàn)具有空間分辨的單細(xì)胞表型分析。

5、本發(fā)明人通過(guò)對(duì)接受新輔助免疫治療（pd-1單抗）聯(lián)合化療的nsclc患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)進(jìn)行成像質(zhì)譜流式（imc）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分析，探索新輔助免疫后mln的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群、免疫微環(huán)境拓?fù)涮卣鹘Y(jié)構(gòu)和三級(jí)淋巴小體相關(guān)功能細(xì)胞亞群。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種新型的基于mln免疫微環(huán)境的針對(duì)nsclc的新輔助免疫預(yù)后的預(yù)測(cè)模型及其構(gòu)建方法。

6、現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)相關(guān)研究成果的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種新型的通過(guò)轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（mln）預(yù)測(cè)針對(duì)非小細(xì)胞肺癌（nsclc）的新輔助免疫治療后預(yù)后的預(yù)測(cè)模型及其構(gòu)建方法。

2、為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)mln預(yù)測(cè)針對(duì)nsclc的新輔助免疫治療后預(yù)后的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法，所述預(yù)測(cè)模型使用成像質(zhì)譜流式（imc）技術(shù)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)nsclc的新輔助免疫治療后預(yù)后，所述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法包括以下步驟：

4、步驟1：采用imc技術(shù)對(duì)新輔助治療后mln的樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲得mln與免疫治療療效相關(guān)的細(xì)胞簇（ct）類型，以確定mln在新輔助免疫治療后呈現(xiàn)出腫瘤微環(huán)境ct成分的差異特征；

5、步驟2：進(jìn)一步對(duì)mln的細(xì)胞鄰域（cn）和細(xì)胞相互作用進(jìn)行分析，確定差異性免疫治療響應(yīng)的mln的cn富集程度的差異，以確定mln在新輔助免疫治療后呈現(xiàn)出腫瘤微環(huán)境cn成分的差異特征；

6、步驟3：進(jìn)一步分析cn的空間位置特征，將以b細(xì)胞為主的區(qū)域定義為“補(bǔ)丁”，以此標(biāo)定出三級(jí)淋巴小體（tls）的結(jié)構(gòu)，將“補(bǔ)丁”周圍區(qū)域劃定為補(bǔ)集，發(fā)現(xiàn)所述空間位置特征與影響免疫響應(yīng)的關(guān)鍵免疫微環(huán)境結(jié)構(gòu)tls緊密相關(guān)，通過(guò)分析tls內(nèi)外的療效相關(guān)的cn差異性分布，確定決定免疫治療療效的關(guān)鍵cn位于tls內(nèi)，并驗(yàn)證tls內(nèi)cn對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；

7、步驟4：采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)確定tls內(nèi)與mln的新輔助免疫療法的療效相關(guān)的細(xì)胞；

8、步驟5：基于在步驟1中獲得的新輔助免疫治療后治療響應(yīng)患者與治療抵抗患者之間的腫瘤微環(huán)境ct成分的差異特征，在步驟2中獲得的位于tls內(nèi)的決定免疫療效的關(guān)鍵cn的差異特征以及在步驟3和步驟4中獲得的tls內(nèi)與新輔助免疫療效相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞亞群的差異特征，利用最小絕對(duì)收縮和選擇算子（lasso）回歸模型，構(gòu)建所述預(yù)測(cè)模型。

9、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟1中，采用imc技術(shù)對(duì)于標(biāo)記物集合進(jìn)行鑒定，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類定義ct，進(jìn)行ct分布狀況與mln對(duì)于新輔助免疫治療反應(yīng)狀態(tài)的析因相關(guān)性分析，以確定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的腫瘤微環(huán)境成分的差異特征。

10、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟2中，cn的識(shí)別是基于中心細(xì)胞及其10個(gè)最近的鄰居細(xì)胞進(jìn)行的，根據(jù)每個(gè)cn中原始細(xì)胞簇的豐度，鑒定出不同的cn，顯示差異性免疫治療響應(yīng)的mln的cn富集程度的差異，并使用配對(duì)wilcox檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

11、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟3中，利用imcrtools（1.5.4版），根據(jù)細(xì)胞間最大距離為20?μm的標(biāo)準(zhǔn)確定“補(bǔ)丁”，要求至少聚集10個(gè)細(xì)胞。隨后，再將“補(bǔ)丁”擴(kuò)大20?μm，以全面劃分其環(huán)境，即“補(bǔ)集”，并通過(guò)對(duì)比tls內(nèi)部及外部的cn差異性分布，確定決定免疫療效的關(guān)鍵cn位于tls內(nèi)，使用kaplan-meier曲線擬合，驗(yàn)證tls內(nèi)cn預(yù)測(cè)預(yù)后的準(zhǔn)確性。

12、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟4中，基于無(wú)監(jiān)督聚類和spot特征，將免疫微環(huán)境劃分為macrophage、t?cell、b?cell、nk?cell、epithelial?cell、neutrophils、fibroblast、endothelial?cell、plasma?cell、lamp3+?dc、mast?cell、smooth?muscle?cell、pdc的13個(gè)細(xì)胞群，主要針對(duì)macrophage、t細(xì)胞、b細(xì)胞進(jìn)行亞簇降維與亞簇表達(dá)差異分子互作和定位分析，并利用tcga非小細(xì)胞肺癌數(shù)據(jù)庫(kù)及免疫治療數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證各種細(xì)胞群亞型的表達(dá)與治療后預(yù)后之間的關(guān)系。

13、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟5中，治療響應(yīng)患者為經(jīng)綜合病理評(píng)估，肺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)無(wú)殘余腫瘤細(xì)胞，達(dá)到完全病理緩解（pathologicalcompletely?response,?pcr），即為淋巴結(jié)治療響應(yīng)患者；治療抵抗患者為經(jīng)綜合病理評(píng)估，肺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)存在殘余腫瘤細(xì)胞，未達(dá)到完全病理緩解，即為淋巴結(jié)治療抵抗患者。

14、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法中，在步驟5中，利用lasso回歸模型將ct（包括療效好和療效不好的ct）、tls內(nèi)cn、單細(xì)胞空轉(zhuǎn)算法鑒定的flor2細(xì)胞亞群，進(jìn)行變量篩選，賦予相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建模型。

15、在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了上述第一個(gè)方面所述的預(yù)測(cè)模型構(gòu)建方法構(gòu)建的通過(guò)mln預(yù)測(cè)針對(duì)nsclc的新輔助免疫治療后預(yù)后的預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)。

16、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)中，采用imc技術(shù)獲得的與mln的新輔助免疫療法療效相關(guān)的細(xì)胞簇類型包括epithelial、cd4t&fibroblast、myofibroblast、neutrophil、nk&epithelial、treg&infmp、matureb、na?ve?cd8t、trm&cd8+?t、activatedcd8t、b&fdc、cd4t&b、cd8t&b、b。

17、進(jìn)一步地，與mln的新輔助免疫療法的療法的療效負(fù)相關(guān)的細(xì)胞簇類型為epithelial、cd4t&fibroblast、myofibroblast、neutrophil、nk&epithelial和treg&infmp。

18、進(jìn)一步地，與mln的新輔助免疫療法的療效正相關(guān)的細(xì)胞簇類型為matureb、naivecd8t、trm&cd8+t、activated?cd8t、b&fdc、cd4t&b、cd8t&b和b。

19、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)中，tls內(nèi)的cn8：b?enriched、cn9：tlscompartment、cn11：b&t?interaction顯著增強(qiáng)mln的新輔助免疫療法的療效。

20、作為可選的方式，在上述療效預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)中，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)確定的與nsclc的新輔助免疫療法的療效相關(guān)的細(xì)胞包括mln中的exhausted?cd8?tem和b?cell。

21、作為可選的方式，在上述預(yù)測(cè)模型系統(tǒng)中，基于在新輔助免疫治療后治療響應(yīng)患者與治療抵抗患者之間的腫瘤微環(huán)境ct成分的差異特征、位于tls內(nèi)的決定免疫療效的關(guān)鍵cn的差異特征以及tls內(nèi)與新輔助免疫療效相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞亞群的差異特征，利用最小絕對(duì)收縮和選擇算子（lasso）回歸模型，構(gòu)建出如下模型：m=0.21b（ct）+0.03cd8t&b（ct）+0.02b&fdc（ct）-0.22cd4t&fibroblast（ct）-0.40neutrophil+0.95cn8+0.44cn11，并驗(yàn)證預(yù)測(cè)效能良好。

22、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下有益效果：

23、本發(fā)明利用多種空間高通量測(cè)序生物信息學(xué)技術(shù)解析新輔助免疫治療后的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群、免疫微環(huán)境拓?fù)涮卣鹘Y(jié)構(gòu)和三級(jí)淋巴小體相關(guān)功能細(xì)胞亞群，提出了一種新型的通過(guò)mln預(yù)測(cè)針對(duì)nsclc的新輔助免疫治療后預(yù)后的預(yù)測(cè)模型及其構(gòu)建方法。此前在本領(lǐng)域并沒(méi)有針對(duì)mln新輔助免疫療效緊密相關(guān)的精細(xì)細(xì)胞亞群的報(bào)道，也沒(méi)有基于mln中關(guān)鍵細(xì)胞亞群的新輔助免疫治療后的預(yù)后預(yù)測(cè)模型報(bào)道。此外，本發(fā)明綜合利用了成像質(zhì)譜流式、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組等空間多組學(xué)分析手段，建立的預(yù)后預(yù)測(cè)模型更加符合治療后的免疫微環(huán)境空間組織學(xué)特征改變，更加準(zhǔn)確地表征了免疫治療后的空間腫瘤免疫微環(huán)境改變，能夠通過(guò)真正影響免疫療效的細(xì)胞靶點(diǎn)，更加精確地預(yù)測(cè)nsclc新輔助免疫治療后的預(yù)后。

24、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。