專利名稱：抗噪音拾音器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1(E.C.2.7.6.1)作為新的除草活性成分作用靶標的鑒定。本發(fā)明也涉及編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的多肽的DNA序列SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3或者SEQ-IDNo.5或者其衍生物的一部分在建立鑒定具有除草作用活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統(tǒng)中的用途。本發(fā)明也涉及鑒定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物質(zhì)的方法或者檢測系統(tǒng)，以及使用此類方法或者這一檢測系統(tǒng)鑒定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的抑制劑。
植物能夠利用二氧化碳、水和無機鹽合成它們的細胞成分。
此過程只有通過利用合成有機物質(zhì)的生物化學反應才可能進行。植物體內(nèi)核苷酸是從頭合成的。作為核酸的成分，它們具有特別的重要性。通過與之共價結(jié)合，核苷酸活化碳水化合物進行多糖的生物合成。它們還活化用于脂類生物合成的頭部基團。核苷酸實際上參與了所有的代謝過程。三磷酸核苷，特別是ATP，驅(qū)動細胞中大部分能量依賴的反應。還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷是一些基本因子，如參與了大量細胞內(nèi)反應的輔酶A、煙酰胺和黃素輔酶的一種組成成分。5’-三磷酸鳥苷(GTP)的偶聯(lián)水解決定了多種細胞內(nèi)過程，如蛋白質(zhì)翻譯、微管組裝、小泡轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導和細胞分裂所需反應的方向。而且，核苷酸也構成了甲基黃嘌呤類，如茜草科(Rubiaceae)和山茶科(Theaceae)植物中咖啡因和可可堿生物合成的起始代謝物。
由于植物依賴于有效的核苷酸代謝，可以設想?yún)⑴c核苷酸生物合成的酶可作為除草劑的合適靶標蛋白質(zhì)。因此，現(xiàn)已有關于抑制植物從頭嘌呤生物合成的活性成分的描述。可以提到的一個例子是天然物質(zhì)hydanthocidin，其在植物體內(nèi)磷酸化后可抑制腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)。(Siehl等人，植物生理學(Plant Physiol.)110(1996)，753-758)。
磷酸核糖焦磷酸(PRPP)是植物新陳代謝中一個必需成分。其為嘌呤和嘧啶核苷酸，吡啶核苷酸輔酶NAD的從頭合成，以及已經(jīng)合成的嘌呤、嘧啶和吡啶的再利用所必需。此外，PRPP也為組氨酸和色氨酸的合成所必需(參見Krath和Hove-Jensen，植物生理學119(1999)，497-505)。負責PRPP合成的酶是PRPP合成酶，其使核糖-5-磷酸和MgATP轉(zhuǎn)換成AMP和PRPP。一些生物體的磷酸核糖焦磷酸合成酶還需要Mg2+。真核生物經(jīng)常具有超過一種的磷酸核糖焦磷酸合成酶。因而，例如，人類就具有功能冗余的三種形式同工酶。植物磷酸核糖焦磷酸合成酶，例如，在菠菜中就存在四種同工型，可被分為兩類，它們在位置和功能上是不同的，或者受植物細胞不同發(fā)育依賴調(diào)節(jié)機制的支配。例如，磷酸核糖焦磷酸合成酶2被運送至葉綠體中(Krath和Hove-Jensen，植物生理學119(1999)，497-505)。這也同在鼠耳芥屬(Arabidopsis)葉綠體中檢測到與嘌呤從頭生物合成有關的幾種酶的結(jié)果相吻合(Senecoff和Meager，植物生理學102(1993)，387-399；Ito等人，植物分子生物學(Plant Mol Biol.)26(1994)，529-533；Schnorr等人，植物雜志(Plant Journal)6(1994)，113-121)。在酵母中，已經(jīng)證明4種磷酸核糖焦磷酸合成酶同工型具有不同的功能(Cater等人，酵母(Yeast)10(1994)，1031-1044)。與人、其它高等真核生物和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸核糖焦磷酸合成酶相反，對植物磷酸核糖焦磷酸合成酶僅有極少數(shù)的研究。在美國專利(US Patents)5,780,253和5,780,254中已經(jīng)描述了鑒定植物嘌呤代謝抑制劑的一般方法。
從多種生物體中都已經(jīng)分離出了編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因。至于植物，已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(登錄號X 83764)和煙草中(Badur博士，G_ttingen大學，1998)分離到了其全長DNA序列。
一種酶作為除草劑的靶標是否合適可以通過降低酶活性，例如在轉(zhuǎn)基因植物中利用反義技術降低酶活性來確定。如果將某種基因的反義DNA導入植物中導致植物生長減慢，就提示活性降低的酶是適合作為除草劑活性成分作用位點的。例如，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中反義抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)，如同使用ALS抑制性除草劑處理對照植物一樣，導致了類似的表現(xiàn)型(H_fgen等人，植物生理學107(1995)，469-477)。
本發(fā)明的一個目的是提供在植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1是合適的除草劑作用靶標的證據(jù)，以及產(chǎn)生一種有效、簡便的磷酸核糖焦磷酸合成酶1檢測系統(tǒng)以進行抑制劑-酶結(jié)合研究。
我們發(fā)現(xiàn)，通過分離編碼植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因，構建植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的反義構建體和使其在植物中表達，以及在細菌或真核細胞中功能性表達植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，可以達到此目的。
為達到此目的，煙草(Nicotiana tabacum)和擬南芥編碼植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的cDNA以及展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的部分cDNA得到分離和測序，參見實施例1和實施例6，序列表SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5。
攜帶有義和反義磷酸核糖焦磷酸合成酶1構建體的擬南芥和枯斑三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN)煙草植株的性質(zhì)得到非常仔細的分析。這些反義植物顯示了不同程度的生長延遲。轉(zhuǎn)基因植株以及第一、第二代后代植株在土壤中生長減慢。Northern雜交顯示，生長減慢的植株與野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的RNA數(shù)量降低了，參見實施例5和圖3。此外，通過酶活性測定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因反義株系與野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的活性值也降低了。磷酸核糖焦磷酸合成酶1表達水平和活性的降低與生長延遲相關。盡管在植物中極可能存在數(shù)種磷酸核糖焦磷酸合成酶的同工型，但是令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)導入一種磷酸核糖焦磷酸合成酶反義構建體就可觀察到生長減慢。這種清楚的關系第一次明確地證明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可以作為除草劑活性成分的合適靶標蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一主題涉及通過高通量篩選來鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的方法。因此，本發(fā)明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，特別是煙草和擬南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)中的功能性表達，以及由此制備的酶在測定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的體外檢測系統(tǒng)中的用途。
為了能夠發(fā)現(xiàn)有效的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑，必須提供可以研究抑制劑-酶結(jié)合的合適檢測系統(tǒng)。例如，為此將磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列或者煙草或擬南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列的合適片段克隆入表達載體(pQE，Qiagen)并在大腸桿菌(E.coli.)中超量表達。
但是，作為選擇，也可以在其它種類的細菌中、在酵母、真菌、藻類、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中表達含有SEQ-ID No.1或者SEQ-ID No.3的DNA序列或者DNA亞序列，或者這些序列的衍生序列的表達盒。
本發(fā)明的另一主題涉及源自SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3、或者與這些序列之一雜交并編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白質(zhì)的DNA序列的用途。
在表達盒的幫助下表達的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白特別適合用于鑒定磷酸核糖焦磷酸合成酶1的特異性抑制劑。
至此，例如，將可以在待測活性成分存在或不存在的情況下測定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶分析方法中利用植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1。通過比較兩種情況下的活性測定結(jié)果，可對待測活性成分的抑制性作用進行定性和定量的評價，參見實施例7。
根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)允許對大量的化合物進行快速、簡便的檢測以確定其除草特性。使用此方法，具有有效作用的物質(zhì)可被特異性地和可重復地從大量的物質(zhì)中篩選出來，以利于接下來對這些物質(zhì)進行研究人員所熟悉的深入檢測。
本發(fā)明的另一個主題涉及通過克隆植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因并在合適的表達盒中超量表達一例如在昆蟲細胞中表達，裂解細胞并將細胞提取物直接，或濃縮，或分離磷酸核糖焦磷酸合成酶1后，應用于檢測系統(tǒng)以便在低分子量化合物存在的情況下測定酶活性以鑒定具有潛在除草劑作用的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的方法。
本發(fā)明的另一個主題涉及用以鑒定可抑制植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的具有除草作用的活性物質(zhì)的方法，該方法包括a)產(chǎn)生含有編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶以及能夠超量表達具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的額外DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物、植物組織或植物細胞；b)對轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官和未轉(zhuǎn)化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官使用一種物質(zhì)；c)在使用該化學物質(zhì)之后，確定轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；以及d)比較在使用該化學物質(zhì)之后，轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；當b)中使用的物質(zhì)可抑制未轉(zhuǎn)化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力，但是基本上不抑制轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力時，可以確認該物質(zhì)具有除草劑活性并可抑制植物中的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
本發(fā)明的另一個主題是可用以上描述的檢測系統(tǒng)鑒定的具有除草劑活性的化合物。
具有除草劑活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑可作為落葉劑、干燥劑、除莖桿劑，特別是除雜草劑使用。雜草在最廣義上講應理解為是指生長在不希望它們出現(xiàn)的地點的所有植物。在根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)幫助下鑒定出的活性成分是以廣譜除草劑還是選擇性除草劑的形式起作用將尤其取決于使用的量。
例如，具有除草劑活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑可用來清除下述雜草下列種屬的雙子葉雜草
白芥屬(Sinapis)、獨行菜屬(Lepidium)、拉拉藤屬(Galium)、繁縷屬(Stellaria)、母菊屬(Matricaria)、春黃菊屬(Anthemis)、牛膝菊屬(Galinsoga)、藜屬(Chenopodium)、蕁麻屬(Urtica)、千里光屬(Senecio)、莧屬(Amaranthus)、馬齒莧屬(portulaca)、蒼耳屬(Xanthium)、旋花屬(Convolvulus)、蕃薯屬(Ipomoea)、蓼屬(Polygonum)、田菁屬(Sesbania)、豚草屬(Ambrosia)、薊屬(Cirsium)、飛廉屬(Carduus)、苦苣菜屬(Sonchus)、茄屬(Solanum)、蔊菜屬(Rorippa)、節(jié)節(jié)菜屬(Rotala)、母草屬(Lindernia)、野芝麻屬(Lamium)、婆婆納屬(Veronica)、苘麻屬(Abutilon)、刺酸膜屬(Emex)、曼陀羅屬(Datura)、堇菜屬(Viola)、鼬瓣花屬(Galeopsis)、罌粟屬(Papaver)、矢車菊屬(Centaurea)、車軸草屬(Trifolium)、毛茛屬(Ranunculus)、蒲公英屬(Taraxacum)。
下列種屬的單子葉雜草稗屬(Echinochloa)、狗尾草屬(Setaria)、黍?qū)?Panicum)、馬唐屬(Digitaria)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、羊茅屬(Festuca)、蟋蟀草屬(Eleusine)、臂形草屬(Brachiaria)、黑麥草屬(Lolium)、雀麥屬(Bromus)、燕麥屬(Avena)、莎草屬(Cyperus)、高梁屬(Sorghum)、冰草屬(Agropyron)、狗牙根屬(Cynodon)、雨久花屬(Monochoria)、飄拂草屬(Fimbristyslis)、慈姑屬(Sagittaria)、荸薺屬(Eleocharis)、蔍草屬(Scirpus)、雀稗屬(Paspalum)、鴨嘴草屬(Ischaemum)、尖瓣花屬(Sphenoclea)、龍爪茅屬(Dactyloctenium)、剪股穎屬(Agrostis)、看麥娘屬(Alopecurus)、阿披拉草屬(Apera)。
本發(fā)明的主題也涉及編碼擬南芥或煙草磷酸核糖焦磷酸合成酶1或其功能等價物的表達盒序列在建立鑒定具有除草劑活性的化合物的檢測系統(tǒng)中的用途。例如，該核苷酸序列可以是DNA或cDNA序列。
這樣的表達盒還包含控制編碼序列在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)核苷酸序列。按照優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的表達盒包括上游(例如在編碼序列的5′末端)啟動子，和下游(例如在編碼序列的3′末端)聚腺苷酸化信號以及，如果適當?shù)脑挘僮餍缘剡B接磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因編碼序列的其它調(diào)節(jié)元件，所述編碼序列位于啟動子和聚腺苷酸化信號之間。操作性連接應理解為是指啟動子、編碼序列、終止予以及，如果適當?shù)脑挘渌{(diào)節(jié)元件均以一定的形式有序排列，以致每一調(diào)節(jié)元件都可象編碼序列得到表達時期望的那樣起作用。
根據(jù)本發(fā)明的這樣表達盒通過利用常規(guī)的，例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗操作(Experiments with genefusions)，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F(xiàn).M.等人，最新分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)所描述的重組和克隆技術將適當?shù)膯幼油线m的磷酸核糖焦磷酸合成酶1 DNA序列和聚腺苷酸化信號相融合而得到。
本發(fā)明的主題也涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據(jù)DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有40～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
本發(fā)明的優(yōu)選主題涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據(jù)DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有60～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
本發(fā)明的特別優(yōu)選主題涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據(jù)DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有80～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
按照本發(fā)明，編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的功能上等價序列是保持有期望功能的(不論是否是衍生核苷酸序列)那些序列。因而，功能等價物包括此處所描述的序列的天然變體，也包括人工的核苷酸序列，例如通過化學合成并經(jīng)改造過以適應植物密碼子使用的人工核苷酸序列。
功能等價物也應理解為尤其是指編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1并一直表現(xiàn)出期望功能的原始分離序列的天然或人工突變體。突變包括一個或多個核苷酸殘基的替代、添加、缺失、交換或者插入。因此，例如本發(fā)明也擴展至通過修飾核苷酸序列而得到的那些核苷酸序列。例如，此類修飾的目的可以是進一步界定包含在其中的編碼序列或引入其它的限制性酶切位點。
功能等價物也指那些與起始基因或起始片段相比較功能降低或增加了的變體。
此外，根據(jù)本發(fā)明的表達盒也可用于轉(zhuǎn)化細菌、藍細菌、酵母、絲狀真菌和藻類以產(chǎn)生足夠數(shù)量的磷酸核糖焦磷酸合成酶1。
本發(fā)明的另一個主題涉及煙草或擬南芥蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的特征在于具有SEQ-ID No.2和SEQ-ID No.4的氨基酸序列，或者該蛋白質(zhì)的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的衍生物或部分，在建立鑒定具有除草劑活性的化合物的檢測系統(tǒng)中的用途。
本發(fā)明的主題也涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有20～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統(tǒng)。
優(yōu)選地，還涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有50～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統(tǒng)。
特別優(yōu)選的是具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4和SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有80～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統(tǒng)。
在植物中，編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的SEQ-ID No.1或SEQ-IDNo.3基因序列的超量表達導致植物對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的抗性增高。由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物也是本發(fā)明的主題。
重組表達的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表達效率可通過，例如體外莖分生組織繁殖或萌芽測試來確定。此外，類型和水平已改變的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表達和其對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑抗性的作用情況，可利用測試植物通過溫室實驗來檢測。
本發(fā)明的主題還有用根據(jù)本發(fā)明的含有SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3 DNA序列的表達盒轉(zhuǎn)化的、通過額外表達SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3的DNA序列而對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑產(chǎn)生耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，以及此類植物的轉(zhuǎn)基因細胞、組織、器官和繁殖材料。特別優(yōu)選的是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，例如大麥、小麥、黑麥、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、萵苣，以及多種樹木、堅果和葡萄及豆類植物。
特別優(yōu)選確保靶向質(zhì)外體、原生質(zhì)體、液泡、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列，或由于缺少合適的操作性序列而確保表達產(chǎn)物保留在其形成的區(qū)室即細胞質(zhì)中(Kermode，植物科學重要綜述(Crit.Rev.Plant Sci).15，4(1996)，285-423)的序列。
例如，植物表達盒可以整合入植物轉(zhuǎn)化載體pBinAR之中。
原則上，表達盒的合適啟動子可以是能夠控制外源基因在植物中表達的任何啟動子。優(yōu)選使用尤其是植物啟動子或來源自植物病毒的啟動子。尤其優(yōu)選的是使用花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子(Frank等人，細胞(Cell)21(1980)，285-294)。該啟動子包含有不同的轉(zhuǎn)錄效應因子識別序列，它們作為整體導致所導入基因的永久和組成型表達(Benfey等人，歐洲分子生物學雜志(EMBO J.)，8(1989)，2195-2202)。
表達盒也可包含使外源磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在植物中可以受控在特定時間點表達的化學誘導型啟動子。在文獻中描述過的和可以使用的這樣的啟動子有，尤其是PRP1啟動子(Ward等人，植物分子生物學，22(1993)，361-366)、水楊酸誘導型啟動子(WO 95/19443)、苯磺胺誘導型啟動子(EP 388186)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatz等人，植物雜志(Plant J.)，2(1992)，397-404)、脫落酸誘導型啟動子(EP 0335528)，或者乙醇或環(huán)己酮誘導型啟動子(WO 93/21334)。
特別優(yōu)選的啟動子還有那些確保表達發(fā)生在嘌呤或其前體進行生物合成的植物組織或器官中的啟動子。特別要提到的是那些確保葉特異性表達的啟動子。必須提到的啟動子是馬鈴薯胞質(zhì)FBPase或馬鈴薯ST-LSI的啟動子(Stockhaus等人，歐洲分子生物學雜志，8(1989)，2445-245)。
在種子特異性啟動子的作用下，外源蛋白質(zhì)可在轉(zhuǎn)基因煙草種子中穩(wěn)定表達，直至占到種子全部可溶性蛋白質(zhì)的0.67％(Fiedler和Conrad，生物工程技術(Bio/Technology)，10(1995)，1090-1094)。因此，根據(jù)本發(fā)明的表達盒可包含，例如，種子特異性啟動子(優(yōu)選地，phasolin啟動子，USP啟動子或LEB4啟動子)，LEB4信號肽，待表達的基因和ER駐留信號(retention signal)。
編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的插入核苷酸序列可以通過合成產(chǎn)生，或者取自天然序列，或者是包含合成的或天然的DNA成分的混合序列。一般來講，使用植物優(yōu)選的密碼子來制備合成的核苷酸序列。植物優(yōu)選使用的密碼子可通過研究在最感興趣的植物品種中具有最高表達頻率的蛋白質(zhì)所使用的密碼子來確定。當制備表達盒時，可能需要操作多種DNA片段以獲得可在正確方向上順利閱讀和按正確讀碼框架拼接的核苷酸序列。為了將這些DNA片段彼此互相連接起來，可向片段增加銜接子或接頭。
其他合適的DNA序列是人工DNA序列，只要它們能造成期望的表達磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的性質(zhì)即可。此類人工DNA序列可通過，例如，從具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質(zhì)反翻譯來確定，或者它們可通過體外篩選而得出。特別合適的是按照宿主植物特異性密碼子使用反翻譯多肽序列所獲得的編碼DNA序列。特異性密碼子使用可容易地由熟悉植物遺傳學方法的技術人員利用計算機評價待轉(zhuǎn)化植物的其它已知基因而確定。
必須提到的根據(jù)本發(fā)明的其它合適的等價核苷酸序列是編碼融合蛋白質(zhì)的序列，該融合蛋白質(zhì)的組成成分是植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1多肽或者其功能上等價的部分。融合蛋白質(zhì)的第二部分可以是，例如，具有酶活性的其它多肽、或者抗原性多肽的序列，在其幫助下可以檢測磷酸核糖焦磷酸合成酶1的表達情況(例如myc標簽或者His標簽)。但是，優(yōu)選的是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)序列，例如是可將磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白質(zhì)引導到期望的作用位點的信號或轉(zhuǎn)運肽。
有利地啟動子和終止子區(qū)域應當在轉(zhuǎn)錄的方向上裝備有包含1個或多個限制性位點的接頭或多接頭以便插入該序列。通常，接頭有1至10，大部分是1至8，優(yōu)選地是2至6個限制性位點。一般來講，位于調(diào)節(jié)區(qū)域中間的接頭大小小于100bp，常常小于60bp，但至少有5bp。根據(jù)本發(fā)明的啟動子可以是宿主植物自身的，或者同源的，或者外來的，或者異種的啟動子。根據(jù)本發(fā)明，表達盒按5’-3’轉(zhuǎn)錄方向包含依照本發(fā)明的啟動子，任何序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。多種終止區(qū)可根據(jù)需要互相調(diào)換。
還可以進行提供適當限制性裂解位點或去除多余DNA或限制性裂解位點的操作。當適合出現(xiàn)插入、缺失或替代，例如轉(zhuǎn)換或顛換時，可以使用體外誘變、引物修復、限制性酶切或連接技術。在適當操作，例如限制性酶切、削平或補平粘性末端以產(chǎn)生平端的情況下可產(chǎn)生片段的互補末端以供連接。
優(yōu)選的聚腺苷酸化信號是植物聚腺苷酸化信號，優(yōu)選的是與根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA聚腺苷酸化信號基本上符合的，特別是與Ti質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章魚堿合成酶)(Gielen等人，歐洲分子生物學雜志，3(1984)，835)聚腺苷酸化信號基本上符合的那些，或者其功能等價物。
為了利用編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的DNA轉(zhuǎn)化宿主植物，將根據(jù)本發(fā)明的表達盒作為插入片段整合到重組載體中，所述載體DNA上包含其它功能調(diào)節(jié)信號，例如復制和整合所需的序列。適當?shù)妮d體在，尤其是 “植物分子生物學和生物工程技術方法(Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology)”(CRC出版社，第6/7章，71-119)一書中得到描述。
轉(zhuǎn)移外來基因到植物的基因組中術語稱為轉(zhuǎn)化。其利用以上描述的轉(zhuǎn)化和從植物的組織或植物細胞再生植物的方法進行瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。適當?shù)姆椒ㄊ抢镁垡叶颊T導的DNA攝入所進行的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，利用基因槍進行的生物轟擊方法、電穿孔、在含有DNA的溶液里浸泡干胚芽、微注射和農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移。上述提到的方法在，例如，B.Jenes等人，基因轉(zhuǎn)移技術，見轉(zhuǎn)基因植物(Transgenic Plants)，第一卷，工程化和應用，S.D.Kung和R.Wu主編，Academic Press(1993)，128-143，和Potrykus，植物生理學和植物分子生物學綜述年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mole.Biol.)，42(1991)，205-225，中得到描述。優(yōu)選地，將要表達的構建體克隆入適合轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌的載體，例如pBin19中(Bevan等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，12(1984)，8711)。
同樣地，以根據(jù)本發(fā)明的表達盒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可按已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，尤其是農(nóng)作物例如谷類作物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、萵苣，以及多種樹木、堅果和葡萄及豆類植物，方式有例如通過將采下的葉片或葉的切片浸泡在農(nóng)桿菌懸液中并接下來在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
嘌呤的生物合成位點通常是葉組織，因此磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在葉中特異性表達是有意義的。然而，很明顯嘌呤生物合成不一定限制在葉組織，也可在植物所有其余部分中以組織特異性的方式發(fā)生，例如在富含脂肪的種子中。
此外，組成型表達外源性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因是有益的。另一方面，也可能希望進行誘導型表達。
使用以上引用的重組和克隆技術，可以將根據(jù)本發(fā)明的表達盒克隆入適當?shù)妮d體中，所述載體能夠使它們例如在大腸桿菌中擴增。適當?shù)谋磉_載體為，尤其是pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特別適合的載體為二元載體，其能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌兩者中復制。
本發(fā)明的另一主題涉及依據(jù)本發(fā)明的表達盒在轉(zhuǎn)化植物、植物細胞、植物組織或植物器官中的用途。該用途的優(yōu)選目的是增加植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1的含量。
根據(jù)所選擇的啟動子，表達可特異性地發(fā)生在葉，種子或植物的其它部分。這樣的轉(zhuǎn)基因植物和它們的繁殖材料和它們的植物細胞、植物組織或植物器官是本發(fā)明的另一主題。
現(xiàn)在將通過下面的實施例來舉例說明本發(fā)明，實施例并不能限制本發(fā)明。
實施例所依據(jù)的重組方法普通克隆方法克隆方法，例如限制性酶切、DNA分離、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、轉(zhuǎn)移核酸至硝酸纖維素或尼龍膜、DNA片段連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞、細菌培養(yǎng)和重組DNA的序列分析按照Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社(1989)；ISBN 0-87969-309-6所描述的方法進行操作。轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌參照H_fgen和Willmtzer(核酸研究，16(1988)，9877)的方法進行操作。農(nóng)桿菌使用YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)(Vervliet等人，普通病毒學(Gen.Virol.)，26(1975)，33)。
重組DNA的序列分析重組DNA分子使用ABI激光熒光測序儀，按照Sanger法(Sanger等人，美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci。USA)，74(1977)，5463-5467)進行測序。對多聚酶鏈式反應的片段進行了序列測定和檢查以避免在將要表達的構建體中有聚合酶引入的錯誤。
植物組織中總RNA的分析植物總RNA依照Logemann等人的方法，分析生物化學(AnalyticalBiochem.)，163(1987)，16)分離并利用含有甲醛的瓊脂糖凝膠分開(Lehrach等人，生物化學(Biochem.)16(1977)，4743)。在20×SSC(1.5M氯化鈉，150mM檸檬酸鈉)中毛細作用過夜轉(zhuǎn)移至尼龍膜(GeneScreen，NEN)。在雜交緩沖液(500mM磷酸鈉(pH7.2)，7％SDS，0.5％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中預雜交2小時后，使用放射性標記的NtPrs1探針在65℃雜交16小時。然后，在下列條件下洗滌65℃下6×SSC，0.1％SDS中10分鐘，65℃下4×SSC，0.1％SDS中5分鐘。
除非有其它說明，使用的都是購自Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司的分析純級化學試劑。溶液使用由Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，Eschborn)制備的純化無致熱原的水，以下稱為H2O，配制。限制性內(nèi)切酶、DNA修飾酶和分子生物學試劑盒購自AGS(Heidelberg)、Amersham(Braunschweig)、Biometra(G_ttingen)、Roche(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynnhausen)、New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Freiburg)。除非有其它說明，試劑均按生產(chǎn)廠商的說明書使用。
大腸桿菌菌株(XL-1 Blue)購自Stratagene。轉(zhuǎn)化植物使用的農(nóng)桿菌菌株(含有質(zhì)粒pGV3850kan的C58C1)參見Debleare等人，核酸研究，13(1985)，4777)所描述。實施例1編碼煙草和擬南芥5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1(Prs1)的cDNA克隆的分離利用編碼擬南芥Prs1的cDNA序列(登錄號X 83764；Krath和Hove-Jensen，1995)，推導出具有下述序列的寡核苷酸RBPRPP3 5’-aag aat tcg gat cca cca tgg tct tga agt tgt tct ctg gta ctgc-3’RBPRPP4 5’-aag aat tcg gat cct cca agg aaa atg cta ctg ac-3’利用這些寡核苷酸，擴增(35個循環(huán)，94℃30秒，45℃45秒，72℃2分鐘)擬南芥(var.Landsberg erecta)葉cDNA的cDNA片段，進而經(jīng)EcoRV位點平端克隆入pGEM-T載體(Promega)。通過序列測定鑒定鼠耳芥屬Prs1 cDNA克隆的身份，參見SEQ-ID No.3。
利用此克隆篩選克隆入λZAPII的枯斑三生煙的葉cDNA文庫。該cDNA文庫以2.5×105噬斑形成單位的滴度鋪平板并利用噬斑篩選方法進行分析(T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY 1989)。分離到12個噬菌體群并用于進行第二輪篩選，結(jié)果分離得到遺傳學上一致的噬菌體群用于體內(nèi)切除。內(nèi)切酶分析在不同的cDNA克隆間未見任何差別，挑選具有最大插入片段的4個克隆進行序列測定。序列資料顯示它們是編碼5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的cDNA克隆。
cDNA克隆NtPrs1-參見SEQ-ID No.1-全長1251bp，在第21位有起始密碼子，第1089位有終止密碼子TAG。開放閱讀框架編碼包含356個氨基酸且分子量38.3 kD的蛋白質(zhì)。152bp的3’非翻譯區(qū)沒有聚腺苷酸化信號。在分析從cDNA克隆NtPrs1推導出的蛋白質(zhì)序列-參見SEQ-IDNo.2-時，計算機分析在最初的36個氨基酸內(nèi)鑒定出了葉綠體轉(zhuǎn)運肽。實施例2產(chǎn)生轉(zhuǎn)化煙草的二元載體為了在反義的方向上產(chǎn)生質(zhì)粒pBinAR-NtPrs1，利用BamH I在二元載體pBinAR(H_fgen和Willmitzer，植物科學(Plant Science)，66(1990)，221-230)的多接頭處進行酶切。長度為1226bp的NtPrs1 cDNA片段(SEQ-ID No.1)從質(zhì)粒pBluescript SK-NtPrs1(

圖1)中自pBluescript SK質(zhì)粒多接頭內(nèi)的BamH I位點和NtPrs1 cDNA中的BamH I位點處切下(1208bp)。將此片段連接入BamH I酶切的pBinAR載體中。連接入的NtPrs1 cDNA片段的插入方向通過Hind III限制性酶切鑒定。切下300bp的Hind III片段證明反向插入正確。pBinAR-NtPrs1-反義質(zhì)粒(圖2)由A、B和C3個片段組成。片段A包括作為pBinAR載體的組成部分的、導致轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子。此片段包括CaMV核苷酸的6909位至7437位(Franck，細胞(Cell)，21(1980)，285)。片段B包括1226bp的NtPrs1 cDNA片段，其作為BamH I片段分離自質(zhì)粒pBluescript SK-NtPrs1并克隆入pBinAR載體多接頭的BamH I位點。片段C包括Ti質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等人，歐洲分子生物學雜志，3(1984)，835)核苷酸11749-11939位的T-DNA的基因3(章魚堿合成酶，OCS)的聚腺苷酸化信號。
如圖1所示，cDNA文庫的構建包括提供具EcoR I/Not I接頭的各片段，然后將它們克隆入pBluescript多接頭的EcoR I限制性位點。因此，Not I切割位點不是pBluescript的原始成分。
A質(zhì)粒pBluescript SK的多克隆位點B NtPrsl cDNA 1251bpC質(zhì)粒pBluescript SK的多克隆位點圖2顯示了在煙草中以反義方向表達NtPrs1 cDNA(1226bp)的表達盒。
A花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，529bp，CaMV的6909至7437位核苷酸。
B自質(zhì)粒pBluescript SK-NtPrs1作為BamH I片段分離的反義方向的NtPrs1 cDNA(1226bp)，包括NtPrs1編碼區(qū)1-1208位的堿基。
cTi質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA基因3(章魚堿合成酶，OCS)的聚腺苷酸化信號(192bp)。實施例3利用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草煙草利用Rosahl S、Schell J和Willmitzer L，歐洲分子生物學雜志，6(1987)，1155-1159的方法進行轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pBinAR-NtPrs1-反義(圖2)同質(zhì)粒pGV3850kan(Debleare等人，核酸研究，13(1985)，4777)一起轉(zhuǎn)化入根瘤農(nóng)桿菌C58C1。使用10ml在YEB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落培養(yǎng)物(Vervliet等人，普通病毒學，26(1975)，33)轉(zhuǎn)化煙草(枯斑三生煙)。無菌植物的圓形葉片(每片大約1cm2)置平皿中在此溶液中浸泡5-10分鐘。然后在25℃下置含有0.8％BiTeKTM瓊脂(DIFICO Laboratories)的MS培養(yǎng)基(Murashige-Skoog培養(yǎng)基，Murashige和Skoog，植物生理學，15(1962)，473)上黑暗培養(yǎng)2天。2天后在16小時光照/8小時黑暗的條件下和以弱節(jié)律在含有500mg/LClaforan(氨噻肟頭孢霉素鈉)，100mg/L卡那霉素，1mg/L芐基氨基嘌呤(BAP)，0.2mg/L萘乙酸和1.6g/L葡萄糖的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。將生長的苗轉(zhuǎn)移至含2％蔗糖，250mg/L Claforan和0.8％BiTeKTM瓊脂的MS培養(yǎng)基上。在根長出后，將苗移至土壤中并在可控制環(huán)境的櫥柜中按16小時光照/8小時黑暗的條件培養(yǎng)2周。然后，移植到稍大些的盆中轉(zhuǎn)移到溫室中。實施例4轉(zhuǎn)基因植物的分析以pBinAR-NtPrs1反義構建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于與未轉(zhuǎn)化的野生型植物相比葉片上有大的萎黃區(qū)域和葉片強烈退色。一般來講，轉(zhuǎn)基因pBinAR-NtPrs1-反義植物包括其生長受到嚴重不利影響的植物。
此資料建立了降低的磷酸核糖焦磷酸合成酶1表達和煙草降低的生長之間的直接關系，因此證明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可作為具除草作用的活性成分的合適靶標蛋白質(zhì)。實施例5Northern分析確證NtPrs1反義基因表達通過NtPrs1 cDNA片段的鏈特異性標記來進行RNA分析。為了進行鏈特異性放射性標記，質(zhì)粒pBluescript SK-NtPrs1以EcoR I酶切，分離具有NtPrs1基因編碼區(qū)的1251bp片段。利用序列為5’-CTT CAA GTTCCA GAC AAC AGT GTC-3’的3’寡核苷酸進行反應。反應使用的試劑盒由Finnzymes Oy生產(chǎn)，按照說明書操作。反應混合物包含有大約10ng的DNA片段，0.1mM的寡核苷酸，5ml的10×緩沖液，1.5mM MgCl2，5mM脫氧核糖核苷酸(dGTP、dATP、dTTP、)，50mCi a-32P-dCTP(Amersham)和1ml DyNazyme聚合酶。擴增條件如下所示變性溫度95℃，5秒退火溫度45℃，30秒延伸溫度72℃，1分鐘循環(huán)數(shù)40為了進行Northern分析，自大約0.5-1.0cm大小的葉片匯集物中分離總RNA，然后在甲醛瓊脂糖凝膠中分離了20μg RNA，通過毛細管印跡法將片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。尼龍膜與鏈特異性標記的NtPrs1基因探針雜交。圖3顯示了野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因植物的雜交信號。
接下來雜交信號通過磷光影像分析儀(phospho-imager)進行定量。與植物的表現(xiàn)型一致，在45-1株中NtPrs1合成酶mRNA的轉(zhuǎn)錄本積累顯著地降低了。植株33.4、14.5和30.4僅僅顯示mRNA轉(zhuǎn)錄本積累降低了，以及類似地，較不太明顯的生長表型。實施例6自展葉劍葉蘚產(chǎn)生cDNA文庫本工作使用了來自Hamburg大學分子遺傳系公共收藏中心的植物品種展葉劍葉蘚(Hedw.)B.S.G.。所使用的品系16/14由H.L.K Whitehouse收集于Gransden Wood，亨廷登郡(英格蘭)并按照Engel的方法(美國植物學雜志(Am.J.Bot.)，55(1968)，438-446)經(jīng)孢子進行傳代培養(yǎng)。此苔蘚植物通過孢子和配子托的再生進行繁殖。單倍體孢子發(fā)育成的原絲體組織由高葉綠體的chloronema和低葉綠體的莖原絲組成，大約12天后其上形成芽。這些芽生長成為配子托，其含有精子器和頸卵器。受精之后產(chǎn)生二倍體的孢子體、短蒴柄(short seta)、和供正在成熟的孢子發(fā)育的孢子囊。
為了產(chǎn)生cDNA文庫，從自生長9天的原絲體所提取的PolyA+RNA起始，使用鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Roche，Mannheim，德國)和Oligo-d(T)引物，進行第一鏈的合成。通過與DNA聚合酶I，Klenow酶，RNaseH在12℃(2小時)，16℃(1小時)，22℃(1小時)孵備進行第二鏈的合成。65℃作用(10分鐘)后終止反應并移至冰上。利用T4 DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分鐘)作用補平雙鏈DNA，核苷酸通過酚/氯仿抽提去除然后經(jīng)Sephadex G50層析。EcoR I銜接子(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)通過T4 DNA連接酶(Roche，12℃，16小時)連接到cDNA末端，進而利用多核苷酸激酶(Roche，37℃，30分鐘)進行磷酸化。DNA片段通過凝膠電泳得到分離，大于300堿基對的片段利用酚抽提進行分離并經(jīng)Elutip-D柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德國)得到濃縮。使用Gigapack Gold試劑盒(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)按照廠家說明書操作將所得的雙鏈DNA連接入λZAPII。體內(nèi)切除產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL-1 Blue的質(zhì)粒DNA。來自單菌落的克隆利用液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA用于測序反應。通過同源性比較，鑒定出編碼5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的EST片段，見SEQ-ID No.5。實施例75-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1檢測系統(tǒng)為了獲得有活性的擬南芥5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1用于高通量篩選方法，通過限制性酶BamH I和EcoR I(經(jīng)引物RBPRPP3和RBPRPP4插入的識別位點)消化pGEM-T AtPrs1載體(圖2)獲得擬南芥Prs1片段并克隆入經(jīng)相同酶切的轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb(GibcoBRL)中。按照生產(chǎn)廠商的說明(GibcoBRL)應用所獲得的構建體pFAST HTb-AtPrs1產(chǎn)生重組桿狀病毒。按照生產(chǎn)廠商的說明(GibcoBRL)使用此種病毒感染昆蟲細胞Sf21以產(chǎn)生有活性的擬南芥5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1。細胞經(jīng)超聲破碎后，利用光度測定法測定5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1的比活性。每90gl反應液使用如下成分16.4mM磷酸二氫鈉緩沖液pH 7.8；0.3mM磷酸烯醇丙酮酸鹽(Sigma，P-71279)；0.3mM氯化鎂；0.15mM ATP(Sigma，A-3377)；0.06mM NADH(Sigma，N-8129)；0.3U丙酮酸激酶(Sigma，P-9136)；0.2U肌激酶(Sigma，M-5520)；0.3U L-乳酸脫氫酶(B_hringer/Roche127230)；用于抑制劑分析的0.5-5mM蛹蟲草菌素5′-三磷酸(Sigma，C-9137)；64mM核糖-5-磷酸(Sigma，R-7750)。
在細胞于裂解緩沖液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH 7.8)中超聲裂解后，使用18μg總蛋白質(zhì)。按照生產(chǎn)廠商的說明(Qiagen)，利用由載體引入的His標簽可經(jīng)親和色譜法進行進一步的純化。可利用PD-10柱(Pharmacia)和標準的濃縮方法，例如硫酸銨沉淀法更換蛋白質(zhì)的緩沖液。所測量的是NADH在340nm處光吸收值的降低。結(jié)果表明，蛹蟲草菌素5′-三磷酸(其它高等真核生物的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶抑制劑)也可以抑制植物5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1的酶活性。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>磷酸核糖焦磷酸合成酶1作為除草劑的靶標<130>BASF-OZ-0050/51207 PCT<140><141><160>6<170>patentIn Vers.2.0<210>1<211>1251<212>DNA<213>煙草<220><221>CDS<222>(22)..(1089)<400>1gcatccctct ctcttctcca c atg gca tct tta gct cta cct gga agc ttt51Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe1 5 10tta gct acc agc aaa cct agt cct tgt aga tat gct gcc gga gac tca99Leu Ala Thr Ser Lys Pro Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser
15 20 25att gta aga tgt aat gtg gca gaa cca tta agt ttt aac aag gag aat147Ile Val Arg Cys Asn Val Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn30 35 40ggg aga tca aac atg cct ctt cag att aat ggc gac act tca ttt aac195Gly Arg Ser Asn Met Pro Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn45 50 55aat ctt tgg aac gct aat caa gta aga aga ttt cca gtt cca cat gct243Asn Leu Trp Asn Ala Asn Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala60 65 70cag att gat act aga ctc cgc att ttc tcc ggc act gcc aat cct gca291Gln Ile Asp Thr Arg Leu Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala75 80 85 90ctt tct cag gaa ata gct tgc tac atg ggt ttg gaa ctt gga aag ata339Leu Ser Gln Glu Ile Ala Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile95 100 105atg ata aaa cgt ttt gct gat ggc gaa atc tat gtc cag tta caa gag387Met Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu110 115 120agt gtt agg ggt tgt gat gta tat ctt gtc caa cct acg tgt ctc ctg435Ser Val Arg Gly Cys Asp Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu125 130 135cta atg aaa tct gat gga ctc ttg ata atg att gat gct tgc cgt aga483Leu Met Lys Ser Asp Gly Leu Leu Ile Met Ile Asp Ala Cys Arg Arg140 145 150gcc tca gcc aaa aat att act gca gtg att ccg tac ttt ggg tat gcc531Ala Ser Ala Lys Asn Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala155 160 165 170cgt gct gat cgt aag act caa ggt cgt gaa tcg att gct gcc aaa ctt579Arg Ala Asp Arg Lys Thr Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu175 180 185gta gca aac ctg att aca gaa gct ggt gca gat cga gtt ctt gct tgt627Val Ala Asn Leu Ile Thr Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys190 195 200gat ctt cat tct ggc cag tca atg ggt tac ttt gat att cca gtg gat675Asp Leu His Ser Gly Gln Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp205 210 215cat gta cat ggc cag cct gtc ata ctt gat tac ctt gcc agc aag act723His Val His Gly Gln Pro Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Thr220 225 230atc tgc tct gat gat cta gtt gtg gta tct ccg gat gtt ggt ggg gtt771Ile Cys Ser Asp Asp Leu Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val235 240 245 250gca agg gca aga gct ttt gcc aaa aag tta tct gat gca cct cta gct819Ala Arg Ala Arg Ala Phe Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala255 260 265att gtg gat aaa agg cgt cat ggg cac aat gtt gct gag gta atg aat867Ile Val Asp Lys Arg Arg His Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn270 275 280ttg att ggc gat gtt agg gga aaa gtg gca gtt atg gtt gat gac atg915Leu Ile Gly Asp Val Arg Gly Lys Val Ala Val Met Val Asp Asp Met285 290 295att gat acg gct ggt act att gca aaa gga gct gcc ctt tta cat caa963Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Ala Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln300 305 310gga gcc agg gaa gtt tat gca tgc acc act cat gca gtt ttc agg gcg1011Gly Ala Arg Glu Val Tyr Ala Cys Thr Thr His Ala Val Phe Arg Ala315 320 325 330gct ttg agc ctt act ccg gat tgg gaa ttg att agt cct tcc tgt tca1059Ala Leu Ser Leu Thr Pro Asp Trp Glu Leu Ile Ser Pro Ser Cys Ser335 340 345ttg ctt gtt ttg aca ctg ttg tct gga act tgaagcagta tgttgatcag 1109Leu Leu Val Leu Thr Leu Leu Ser Gly Thr350 355atccaccaaa attttcgtcc agtaacaaag agagcatttt ctgttgtaca aatattttgt 1169gcggaatgtt acgttgtaaa tctttcaatc agtgacttgg atccatgtag tagatgagtt 1229ttttgattaa tatgaagttt ac 1251<210>2<211>356<212>PRT<213>煙草<400>2Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe Leu Ala Thr Ser Lys Pro1 5 10 15Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser Ile Val Arg Cys Asn Val20 25 30Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn Gly Arg Ser Asn Met Pro35 40 45Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn Asn Leu Trp Asn Ala Asn50 55 60Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala Gln Ile Asp Thr Arg Leu65 70 75 80Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala85 90 95Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile Met Ile Lys Arg Phe Ala100 105 110Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu Ser Val Arg Gly Cys Asp115 120 125Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu Leu Met Lys Ser Asp Gly
130 135 140Leu Leu Ile Met Ile Asp Ala Cys Arg Arg Ala Ser Ala Lys Asn Ile145 150 155 160Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala Arg Ala Asp Arg Lys Thr165 170 175Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu Val Ala Asn Leu Ile Thr180 185 190Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys Asp Leu His Ser Gly Gln195 200 205Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp His Val His Gly Gln Pro210 215 220Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Thr Ile Cys Ser Asp Asp Leu225 230 235 240Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val Ala Arg Ala Arg Ala Phe245 250 255Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala Ile Val Asp Lys Arg Arg260 265 270His Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn Leu Ile Gly Asp Val Arg275 280 285Gly Lys Val Ala Val Met Val Asp Asp Met Ile Asp Thr Ala Gly Thr290 295 300Ile Ala Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln Gly Ala Arg Glu Val Tyr305 310 315 320Ala Cys Thr Thr His Ala Val Phe Arg Ala Ala Leu Ser Leu Thr Pro325 330 335Asp Trp Glu Leu Ile Ser Pro Ser Cys Ser Leu Leu Val Leu Thr Leu340 345 350Leu Ser Gly Thr355<210>3<211>942<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(939)<400>3atg gtc ttg aag ttg ttc tct ggt act gca aat cca gca ctt gct cag48Met Val Leu Lys Leu Phe Set Gly Thr Ala Asn Pro Ala Leu Ala Gln1 5 10 15gaa att gct tgg tat atg ggc ttg gat ctt ggc aag gtt aat att aag96Glu Ile Ala Trp Tyr Met Gly Leu Asp Leu Gly Lys Val Asn Ile Lys20 25 30agg ttt gct gat gga gag atc tat gtt cag cta caa gag agc gtt agg 144Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu Set Val Arg35 40 45gga tgt gac gtc tat ttg gtg cag cct act tgc act ccc act aat gag 192Gly Cys Asp Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Thr Pro Thr Asn Glu50 55 60aat ctc atg gag ctt ttg att atg gta gat gct tgc cga aga gca tca 240Asn Leu Met Glu Leu Leu Ile Met Val Asp Ala Cys Arg Arg Ala Ser65 70 75 80gct aag aaa gtt aca gct gtg att ccg tat ttt gga tat gca aga gct 288Ala Lys Lys Val Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala Arg Ala85 90 95gac agg aag aca caa ggg cgt gaa tcc att gct gcc aaa ttg gtt gca 336Asp Arg Lys Thr Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu Val Ala100 105 110aat ctt atc act gaa gct ggt gca gat cga gtt ctt gct tgt gat ctt 384Asn Leu Ile Thr Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys Asp Leu115 120 125cat tca gga cag tcg atg ggt tat ttt gac att cca gtc gac cat gtg 432His Ser Gly Gln Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp His Val130 135 140tac tgc cag ccg gtg ata ctt gat tat ctt gct agc aag tca att ccc 480Tyr Cys Gln Pro Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Ser Ile Pro145 150 155 160tca gag gat ttg gta gtg gtt tct cct gat gtt ggt gga gta gcc agg528Ser Glu Asp Leu Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val Ala Arg165 170 175gcc cgc gct ttt gca aag aaa tta tca gat gca cca ctt gcc att gtc576Ala Arg Ala Phe Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala Ile Val180 185 190gat aaa agg cgt tct gga cac aat gtt gct gag gtc atg aac cta att624Asp Lys Arg Arg Ser Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn Leu Ile195 200 205ggt gat gta aga ggg aag gtg gca ata atg gtg gat gat atg att gat672Gly Asp Val Arg Gly Lys Val Ala Ile Met Val Asp Asp Met Ile Asp210 215 220act gct gga acc att gta aaa gga gca gct ttg tta cac cag gaa ggt720Thr Ala Gly Thr Ile Val Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln Glu Gly225 230 235 240gct cgg gag gta tat gcg tgc tgc aca cac gct gtt ttc agc ccg cca768Ala Arg Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Ala Val Phe Ser Pro Pro245 250 255gcg ata gag cga tta tca ggg ggt ttg ctg caa gaa gtg ata gtg aca816Ala Ile Glu Arg Leu Ser Gly Gly Leu Leu Gln Glu Val Ile Val Thr260 265 270aac aca tta cct gta gca gag aag aat tac ttc ccg cag tta aca ata864Asn Thr Leu Pro Val Ala Glu Lys Asn Tyr Phe Pro Gln Leu Thr Ile275 280 285tta tca gtg gct aat ctc ctg ggt gag acc att tgg cgt gtg cat gat912Leu Ser Val Ala Asn Leu Leu Gly Glu Thr Ile Trp Arg Val His Asp290 295 300gat agt tcc gtc agt agc att ttc ctt tga942Asp Ser Ser Val Ser Ser Ile Phe Leu305 310<210>4<211>313<212>PRT<213>擬南芥<400>4Met Val Leu Lys Leu Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala Leu Ala Gln1 5 10 15Glu Ile Ala Trp Tyr Met Gly Leu Asp Leu Gly Lys Val Asn Ile Lys20 25 30Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu Ser Val Arg35 40 45Gly Cys Asp Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Thr Pro Thr Asn Glu50 55 60Asn Leu Met Glu Leu Leu Ile Met Val Asp Ala Cys Arg Arg Ala Ser65 70 75 80Ala Lys Lys Val Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala Arg Ala85 90 95Asp Arg Lys Thr Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu Val Ala100 105 110Asn Leu Ile Thr Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys Asp Leu115 120 125His Ser Gly Gln Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp His Val130 135 140Tyr Cys Gln Pro Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Ser Ile Pro145 150 155 160Ser Glu Asp Leu Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val Ala Arg165 170 175Ala Arg Ala Phe Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala Ile Val180 185 190Asp Lys Arg Arg Ser Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn Leu Ile195 200 205Gly Asp Val Arg Gly Lys Val Ala Ile Met Val Asp Asp Met Ile Asp210 215 220Thr Ala Gly Thr Ile Val Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln Glu Gly225 230 235 240Ala Arg Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Ala Val Phe Ser Pro Pro245 250 255Ala Ile Glu Arg Leu Ser Gly Gly Leu Leu Gln Glu Val Ile Val Thr260 265 270Asn Thr Leu Pro Val Ala Glu Lys Asn Tyr Phe Pro Gln Leu Thr Ile275 280 285Leu Ser Val Ala Asn Leu Leu Gly Glu Thr Ile Trp Arg Val His Asp290 295 300Asp Ser Ser Val Ser Ser Ile Phe Leu305 310<210>5<211>530<212>DNA<213>展葉劍葉蘚<220><221>CDS<222>(1)..(528)<400>5cac gag ttg tcg ccg cac cct tgc cgc cga gga tcc ttg gct tcg ccg 48His Glu Leu Ser Pro His Pro Cys Arg Arg Gly Ser Leu Ala Ser Pro1 5 10 15caa gcg acg aga ggc agc ggc ctt ttc ctt gga gat aga aat tgg agg96Gln Ala Thr Arg Gly Ser Gly Leu Phe Leu Gly Asp Arg Asn Trp Arg20 25 30caa cgg aga gga ccg cta gcg cga ccg aaa tgt gcg cta gcg gat tcc144Gln Arg Arg Gly Pro Leu Ala Arg Pro Lys Cys Ala Leu Ala Asp Ser35 40 45tca gta tcc tgg aat gga agg cca gta gta cct gtt gtg ccg aat cag192Ser Val Ser Trp Asn Gly Arg Pro Val Val Pro Val Val Pro Asn Gln50 55 60aat tgg aat agc gtg gct ggg tca aaa gtg cta agg gat act gtg ctt240Asn Trp Asn Ser Val Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg Asp Thr Val Leu65 70 75 80cat gat atc cgc ttg gag aat cgc ctc aaa att ttc tct ggc act gca288His Asp Ile Arg Leu Glu Asn Arg Leu Lys Ile Phe Ser Gly Thr Ala85 90 95aat aag get ctt tcc caa gaa atc gcg tac tac atg ggt ctc gat tta336Asn Lys Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala Tyr Tyr Met Gly Leu Asp Leu100 105 110gga aag ata acc ata aag cgc ttc gcg gac gga gaa atc tac gta cag384Gly Lys Ile Thr Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln115 120 125cta caa gag agt gtt cgt ggt tgt gac gtg ttt cta gtg caa cca aca432Leu Gln Glu Ser Val Arg Gly Cys Asp Val Phe Leu Val Gln Pro Thr130 135 140tgt cca cct gca aat gag aat ctg atg gag ctc ctc att atg atc gat480Cys Pro Pro Ala Asn Glu Asn Leu Met Glu Leu Leu Ile Met Ile Asp145 150 155 160gca tgc cgc cga gct tct gct aag aac ata aca gct gtg ata cca tac528Ala Cys Arg Arg Ala Ser Ala Lys Asn Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr165 170 175tt 530<210>6<211>176<212>PRT<213>展葉劍葉蘚<400>6His Glu Leu Ser Pro His Pro Cys Arg Arg Gly Ser Leu Ala Ser Pro1 5 10 15Gln Ala Thr Arg Gly Ser Gly Leu Phe Leu Gly Asp Arg Asn Trp Arg20 25 30Gln Arg Arg Gly Pro Leu Ala Arg Pro Lys Cys Ala Leu Ala Asp Ser35 40 45Ser Val Ser Trp Asn Gly Arg Pro Val Val Pro Val Val Pro Asn Gln50 55 60Asn Trp Asn Ser Val Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg Asp Thr Val Leu65 70 75 80His Asp Ile Arg Leu Glu Asn Arg Leu Lys Ile Phe Ser Gly Thr Ala85 90 95Asn Lys Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala Tyr Tyr Met Gly Leu Asp Leu100 105 110Gly Lys Ile Thr Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln115 120 125Leu Gln Glu Ser Val Arg Gly Cys Asp Val Phe Leu Val Gln Pro Thr130 135 140Cys Pro Pro Ala Asn Glu Asn Leu Met Glu Leu Leu Ile Met Ile Asp145 150 155 160Ala Cys Arg Arg Ala Ser Ala Lys Asn Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr165 170 17權利要求
1.具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1編碼區(qū)的DNA序列SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5在制備鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統(tǒng)中的用途。
2.權利要求1的DNA序列的用途，所述DNA序列可與SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5 DNA序列或者其部分序列、或者通過對所述的序列進行插入、缺失或替代產(chǎn)生的并編碼具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白質(zhì)的衍生物雜交。
3.權利要求1或2的DNA序列在導入原核或真核細胞中的用途，此序列任選地同控制元件相連接，該控制元件可確保在細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯并導致造成植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1合成的可翻譯mRNA表達。
4.具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質(zhì)在制備用于鑒定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的物質(zhì)的檢測系統(tǒng)中的用途。
5.權利要求4的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質(zhì)的用途，其中蛋白質(zhì)包含如SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6所示的氨基酸序列。
6.權利要求5的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質(zhì)的用途，其中蛋白質(zhì)包含SEQ-ID No.2或SEQ-ID No.4的至少100個氨基酸的氨基酸亞序列。
7.用于鑒定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物質(zhì)的方法，其包括，第一步，使用權利要求1、2或3中所提出的DNA序列產(chǎn)生磷酸核糖焦磷酸合成酶1，和第二步，在測試物質(zhì)的存在下檢測植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性。
8.權利要求7的方法，其中植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1通過高通量篩選(HTS)步驟來測定。
9.鑒定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的具除草作用的活性物質(zhì)的方法，該方法包括a)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物組織或植物細胞，其包含有編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶的額外DNA序列，并且能夠超量表達具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1；b)對轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物組織或植物器官和未轉(zhuǎn)化的植物、植物細胞、植物組織或植物器官使用一種物質(zhì)；c)在使用該化學物質(zhì)之后，確定轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；以及d)比較在使用該化學物質(zhì)之后，轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；當未轉(zhuǎn)化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力受到抑制，但是轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力基本上不受抑制時，證實b)中的物質(zhì)具有除草劑活性并可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
10.一種檢測系統(tǒng)，其基于權利要求1、2或3所述的SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5或者其部分、或者衍生物的DNA序列的表達，用于鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
11.權利要求10的用于鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統(tǒng)，其包括將酶同待研究的測試物質(zhì)一起孵育，在適當?shù)姆磻獣r間后，測定酶的酶活性并同未受抑制的酶的活性相比較。
12.植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
13.使用權利要求10或11的檢測系統(tǒng)鑒定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
14.權利要求12或13之一的用做除草劑的抑制劑。
全文摘要
一種組合型抗噪音拾音器,將多個抗噪音拾音器組合在一起,彼此的位置及相對關系通過安裝在支座上的共模信號抑制電路進行調(diào)整、確定;組合型抗噪音拾音器抗噪音的功能比單個拾音器狀態(tài)下增強一倍以上,在極惡劣環(huán)境的高噪音狀態(tài)下,仍有較高的信噪比性能。
文檔編號H04R17/02GK1390432SQ00815753
公開日2003年1月8日 申請日期2000年10月24日 優(yōu)先權日1999年11月18日
發(fā)明者程滋頤 申請人:程滋頤