專利名稱：：分子分析的裝置和方法分子分析的裝置和方法相關(guān)申請的交叉參照本申請是于2004年9月17日提交的未決的美國實用專利申請10/944,106的部分繼續(xù)申請，此處完整引用作為參考。本申請也對分別于2005年1月31日和2005年2月9日提交的美國臨時申請?zhí)?0/649,009和60/651,846要求優(yōu)先權(quán)，這兩^f分申請在此處引用作為參考。
背景技術(shù)：
：自從熒光相關(guān)光譜學(FCS)的應(yīng)用以來，照射和信號檢測的約束一直公認為分子診斷學的一個重要工具。FCS包括對含有焚光標記分子的樣品體積照射，以及檢測由于分子擴散進出有效觀觀'j體積而產(chǎn)生的熒光信號波動。如果觀測體積內(nèi)僅包含少量的焚光分子，并且背景信號較低，將最好地分析分子熒光強度的波動。這可以通過結(jié)合使用嚴格限制的檢測體積和低樣品濃度來實現(xiàn)。傳統(tǒng)FCS的檢測體積大約為0.5飛升(或0.5x10"5升)，并通過使用高數(shù)值光圈的顯微鏡物鏡來緊密聚焦一個激光束而實現(xiàn)。在這個檢測體積中，在濃度最高約為1納摩爾的溶液中可以觀察到單分子(singlemolecules)。對于大部分的生化反應(yīng)來說，這個濃度范圍低得不可接受，典型的反應(yīng)常數(shù)應(yīng)該是在微摩爾或高于微摩爾范圍。在較低濃度時，這些反應(yīng)進行得不夠快，并且其表現(xiàn)方式與在大多數(shù)分析中可用的方式在性質(zhì)上不同。為了在更高更相關(guān)的濃度下觀測單分子，一般需要將觀測體積降至更小。最近幾年來，由于納米制造技術(shù)的進展，使得可以生產(chǎn)整合了電子、光學、化學和/或機械元件的納米尺寸的裝置。然而，為了提供在生物學或診斷上更相關(guān)的條件下觀測單分子反應(yīng)的能力，仍然非常需要更快速、更便宜、更精確的生物化學分析。同時還需要批量生產(chǎn)的小的一次性裝置，其通過提供適合在高濃度條件下進行單分子分析的光約束能夠達到這些目的。本發(fā)明能滿足這些需求并還有相關(guān)的優(yōu)點。發(fā)明概述本發(fā)明的一個主要方面是用于表征分子和/或監(jiān)測化學反應(yīng)的光學裝置和方法的設(shè)計。本發(fā)明的裝置和方法特別適用于單分子(single-molecule)分析。因此，本發(fā)明提供了一種表面密度超過4xl0"個約束每平方毫米，甚至超過105個約束每平方毫米的光約束(opticalconfinement)陣列。在一個方面，陣列中單個約束提供了小于1納升(xl0力升)、小于l皮升、或小于1飛升甚至仄升數(shù)量級的有效觀測體積。在其它一些方面，每個單個約束提供小于1000仄升、100仄升、80仄升、或小于50仄升甚至小于10仄升的有效觀測體積。在其它一些方面，每個單獨約束產(chǎn)生一個有效觀測體積，這個有效觀測體積允許對濃度高于1納摩爾，或高于100納摩爾，甚至達到微摩爾數(shù)量級的單分子(individualmolecules)進行分辨。在特定優(yōu)選方案中，每個單約束產(chǎn)生的有效觀測體積允許分析以生理學相關(guān)的濃度，例如，高于約1微摩爾或者高于50微摩爾甚至高于100微摩爾的濃度存在的單分子。這種陣列可以包含一個零模波導(zero-modewaveguide)或其它納米級光學結(jié)構(gòu)。這種光約束陣列還可以包含另外一個約束陣列，這另外一個陣列不產(chǎn)生上述的有效觀測體積或者不能分辨單分子。例如，這種光約束陣列可結(jié)合或整合到微量滴定板，在多孔反應(yīng)板上的每個不同孔中可以設(shè)置了一個獨立的光約束陣列。這種光約束陣列可包含至少約2xl()S個光約束，或至少約106或至少約107個光約束。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有上述特征的多個光約束的方法。該方法包括以下步驟(a)提供基板(substrate);和(b)形成表面密度超過每平方毫米4xl04個約束的光約束陣列，其中在每個單獨的約束中包含一個零模波導，該零模波導包含一個圍繞芯(core)的包層(cladding),其中設(shè)置所述包層用于阻止波長大于截止波長的電磁能縱向穿過零模波導的芯傳播，和(c)用頻率小于截止頻率的電磁輻射照射該陣列，由此產(chǎn)生了多個光約束。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生可分辨單分子的光學觀測體積的方法。該方法包括提供一個零模波導，這個零模波導包括圍繞芯的包層，其中設(shè)置所述包層是為了阻止頻率低于截止頻率的電磁能縱向穿過零模波導的芯傳播，其中在用頻率低于截止頻率的電磁輻射照射零模波導時，零模波導就產(chǎn)生了可分辨單分子的有效觀測體積。在某些方面，這個有效觀測體積小于1納升(10-9升)，小于1皮升，或小于1飛升，優(yōu)選為仄升的數(shù)量級。使用本發(fā)明的零模波導，一般可以獲得小于IOO仄升(100x10'21升)，或小于50仄升，甚至小于IO仄升的有效觀測體積。在其它方面，該方法產(chǎn)生的有效觀測體積允許分辨濃度高于1納摩爾，通常高于IOO納摩爾，優(yōu)選為微摩爾數(shù)量級的單分子。在優(yōu)選實施方案中，以高于約5微摩爾，高于7.5微摩爾，甚至高于50微摩爾范圍的濃度存在的單分子能使用本發(fā)明的方法分辨。本發(fā)明還提供了一種檢測多分子間相互作用的方法。該方法包括以下步驟(a)將多分子緊密接近地置于零模波導陣列上，其中陣列中各個波導相距一個合適的距離，該距離足以在用入射波長照射該陣列時產(chǎn)生多種衍射級別的可檢測的衍射散射強度；(b)以入射波長照射零模波導陣列；和(c)檢測多種衍射級別的入射波長衍射散射強度的變化，從而檢測多分子間的相互作用。本發(fā)明還提供了一種在用入射波長照射光約束陣列時減少衍射散射的方法，其中此陣列至少包括一個第一光約束和一個第二光約束，所述方法包括形成光約束陣列，其中光約束與第二光約束相距一段距離，使得在入射波長照射下，在給定角度下由第一光約束產(chǎn)生的衍射散射強度要小于在沒有該光約束的情況下用相同入射波長照射第一光約束產(chǎn)生的強度。在優(yōu)選方案中，上述光約束是零模波導。本發(fā)明還包括一種使用光約束陣列檢測生物分析物的方法，該光約束陣列在基板上的密度超過每平方毫米4x104個約束或本文提到的任何其它密度或其等同密度。該方法一般包括用一入射光束照射陣列中至少一個懷疑包含分析物的光約束。本發(fā)明還提供了一種使用光約束陣列來進行多個化學反應(yīng)的方法，該光約束陣列在基板上的密度超過每平方毫米4xl04個約束或本文提到的任何其它密度或其等同密度。該方法包括以下幾個步驟，將含有標記的反應(yīng)物的多個反應(yīng)樣品放入陣列中的光約束內(nèi)，其中不同的反應(yīng)樣品放入陣列中的一個不同的約束內(nèi)；將陣列置于適合化學反應(yīng)形成產(chǎn)物的條件下；并用上述光學系統(tǒng)枱r觀>|產(chǎn)物的形成。此外，本發(fā)明還提供了一種對多種靶核酸分子進行測序的方法。該方法一般包括以下步驟(a)提供一種在基板上的密度超過每平方毫米4xl0"個約束或本文提到的任何其它密度或其等同密度的光約束陣列，其中所述光約束提供能觀測單分子的有效觀測體積；和與該光約束可操作連接的光學系統(tǒng)，其檢測來自所述約束的有效觀測體積的信號；(b)在光約束中混合多種靶核酸分子、互補于把核酸分子的引物、聚合酶和一種以上類型的將要摻入新生核苷酸鏈中的核普酸或核苷酸類似物，每條鏈與各自的靶核酸分子互補；(c)使步驟(b)中的混合物在適宜通過模板引導的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成新生核苷酸鏈的條件下進行聚合反應(yīng)；(d)用入射光束照射該光約束；和(e)鑒定摻入每個新生核苷酸鏈中的核苷酸或核苦酸類似物。本發(fā)明還提供了一種裝置，其包括在填充分數(shù)(fillfraction)大于約0.0001的固體載體(support)上的波導陣列，其中所述波導適合容納生物試劑，并且其中所述波導提供可觀測所述生物試劑中存在的單分子的有效觀測體積；和一個光學系統(tǒng)，其檢測所述波導中的所述單分子，如通過檢測來自有效觀測體積的信號。在一個方面，該陣列的填充分數(shù)大于約0.001。在另一方面，該陣列的填充分數(shù)大于約0.01，在有些情況下大于O.l，或處于約0.001到約0.1的范圍內(nèi)。本發(fā)明也提供了多種使用這樣的高填充分數(shù)陣列的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測生物分析物的方法。該方法包括任選地捕獲光約束中的分析物，該光約束是如下產(chǎn)生的(a)提供填充分數(shù)高于約0.0001的波導陣列；和(b)使用入射光束照射陣列中的至少一個懷疑包含分析物的波導，從而檢測分析物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種使用所述高填充分數(shù)陣列進行涉及多種反應(yīng)樣品的多個化學反應(yīng)的方法。該方法包括(a)提供一個所述的高填充分數(shù)陣列；(b)將含有標記反應(yīng)物的多種反應(yīng)樣品置于陣列中的波導內(nèi)，其中一個獨立的反應(yīng)樣品置于陣列中一個不同的波導內(nèi)；(c)將該陣列置于適合化學反應(yīng)形成產(chǎn)物的條件下；和(d)利用光學系統(tǒng)檢測產(chǎn)物的形成。該檢測步驟包括用入射光束照射不同的波導和檢測從反應(yīng)樣品中發(fā)出的光信號。適用的化學反應(yīng)包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、核酸-蛋白質(zhì)相互作用和核酸-核酸相互作用。特別地，本發(fā)明提供了一種使用大于約0.0001的填充分數(shù)對多個靶核酸分子進行測序的方法。本發(fā)明進一步提供了使用具有高填充分數(shù)的陣列對核酸進行測序的方法。該方法一般包括(a)提供一個填充分數(shù)大于約0.0001或0.001或0.01或甚至0.1的波導陣列；(b)在波導中混合多個耙核酸分子、互補于靶核酸分子的引物、聚合酶和一種以上類型的將要摻入到多個新生核苷酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物，每個鏈與各自的靶核酸分子互補；(c)使步驟(b)中的混合物在適合通過模板引導的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成新生核苷酸鏈的條件下發(fā)生聚合反應(yīng)；(d)使用入射光束照射波導；和(e)鑒定摻入每個新生核苷酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物。本發(fā)明也包括一種豐余測序方法。該方法包括(a)使乾核酸分子在多種類型的核苷酸或核苷酸類似物和顯示出鏈置換活性的聚合酶的存在下發(fā)生模板引導的聚合反應(yīng)，產(chǎn)生與靶核酸分子互補的新生核酸鏈；以及(b)記錄核苷酸或核苦酸類似物摻入到新生核苷酸鏈中的時序。在該實施方案的一個方面，靶核酸分子是一種環(huán)形核酸，或者是由環(huán)形核酸序列合成的線形或環(huán)形模板鏈，從而使合成的鏈包括原環(huán)形鏈的多個重復拷貝，然后進行本發(fā)明的測序操作。在該實施方案的另一方面，用聚合酶對靶核酸分子多次測序，例如一次以上，或者兩次以上。在該實施方案的又另一方面，該聚合酶是DNA聚合酶，例如修飾的或未修飾的<D29聚合酶。本發(fā)明還包括一種具有表面的固體載體，其中所述表面上附著有聚合酶陣列，其中陣列中的成員包括具有鏈置換活性的能單獨光學分辨的聚合酶。本發(fā)明還包括一種零模波導，它包括固定在其中的第一分子復合物，所述分子復合物包括與靶核酸復合的聚合酶，其中所述聚合酶通過模板依賴的靶核苷酸復制多次處理靶核酸中的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了一種制作顯示最小的入射波長衍射散射強度的光約束陣列的方法。該方法包括提供一個基板；在該基板上形成光約束陣列，使該陣列中的每個單獨的光約束彼此相距的距離小于波長的一半。最后，本發(fā)明還包括一種制作光約束的方法，該光約束包括圍繞芯的包層，所述方法包括(a)提供涂覆有光致抗蝕劑層的基板；(b)使所述光致抗蝕劑層形成圖案，以限定所述芯的邊界；(c)去除圍繞所述限定的邊界的所述光致抗蝕劑層，使得還有足夠量的光致抗蝕劑占據(jù)所述芯；(d)將一層包層材料沉積到所述保留的光致抗蝕劑和所述基板上；(e)去除至少一部分沉積在所述保留的光致抗蝕劑上的所述包層材料；和(f)去除(e)步驟的所述光致抗蝕劑，從而形成所述光約束的由所述包層圍繞的所述芯。在一個方面，所述光致抗蝕劑為負性圖案(negative)，并且所述圖案形成步驟使用正性圖案。在另一方面，所述光致抗蝕劑為正性圖案(positivepattern),并且所述圖案形成步驟使用負性圖案。所述去除步驟可以采用選自蝕刻、機械拋光、離子研磨和溶劑溶解的技術(shù)來實現(xiàn)。包層材料層可以使用熱蒸發(fā)法或蒸汽沉積法來沉積。附圖簡述圖1顯示的是一種示例性光約束陣列的頂視圖，其中零模波導排列成正方形格式。圖2顯示的是一種示例性光約束陣列的頂視圖，其中零模波導排列為非正方形格式。圖3顯示的是一種示例性二維陣列的頂視圖，有一個示例性的角和兩個不同的單位向量長度。圖4顯示的是一種示例性ZMW規(guī)則排列的頂視圖。圖5顯示的是多個陣列組成的陣列，其中子陣列71是超級陣列72的一部分。圖6顯示的是負性制造的工藝。圖7顯示與光學系統(tǒng)光學連接的ZMW陣列。圖8顯示通過正性抗蝕劑(左邊)或負性抗蝕劑(右邊)制作的ZMW結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片。這種多晶膜的顆粒結(jié)構(gòu)在圖像上可見為斑點，ZMW為暗的圓形結(jié)構(gòu)。圖9顯示使用人工預(yù)形成的復制叉，ZMW中的單分子DNA序列模式識別。圖IO顯示的是與基板105結(jié)合的涂覆的ZMW101。ZMW包括側(cè)壁102、上表面上的包膜103和金屬膜104。圖11顯示的是一個校準(alignment)策略和光學設(shè)置。圖12顯示一個在基板93上由多孔膜91構(gòu)成的備選光約束，92表示膜上的小孔。圖13A和B顯示的是一個校準檢測系統(tǒng)及相關(guān)的部件。圖14顯示的是幾個示例性的光致切割阻斷劑和用于切割阻斷基團的合適的波長。圖15顯示的是一種示例性的可逆延伸終止子，其中光致切割阻斷劑與可檢測標記(如焚光標記)結(jié)合。圖16顯示的是使用該光約束得到的熒光爆發(fā)鐠，其對應(yīng)于在單分子測序反應(yīng)中摻入兩種類型的標記核苷酸或核苷酸類似物的時序。發(fā)明詳述除非另外說明，本發(fā)明的實施將使用集成電路(IC)加工、生物化學、化學、分子生物學、基因組學和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技能。參見，如，StanleyWolf等，SILICONPROCESSINGFORTHEVLSIERA,Vols1-4(LatticePress);MichaelQuirk等，SEMICONDUCTORMANUFACTURINGTECHNOLOGY;Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第二版(1989);METHODSINENZYMOLOGY系歹'J(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.HamesandG.R.Tayloreds.(1995),以上所有在此引用作為參考。定義在說明書和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一種"和"一個"包括復數(shù)形式，除非上下文中有明確的說明。"發(fā)光(Luminescence)，，指的是除自身溫度上升以外其它任何原因?qū)е挛镔|(zhì)發(fā)出光。一般來說，原子或分子當它們從激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到較低能態(tài)(一般是基態(tài))時發(fā)出電磁能的光子(如光)；這個過程一般稱為"衰變"。存在多種激發(fā)原因，如果激發(fā)原因是光子，這個發(fā)光過程就被稱為"光致發(fā)光"。如果這個激發(fā)原因是電子，這個發(fā)光過程就被稱為"電致發(fā)光"。更具體而言，電致發(fā)光是由于直接注入和失去電子而形成電子空穴對，隨后電子空穴對重組發(fā)出光子而引起的。由于化學反應(yīng)而引起的發(fā)光一般被稱為"化學發(fā)光"。由活生物體產(chǎn)生的發(fā)光一般被稱為"生物發(fā)光"。如果光致發(fā)光是由于自旋容許躍遷造成的(如單態(tài)(singlet)-單態(tài)躍遷，三重態(tài)(triplet)-三重態(tài)躍遷)，這種光致發(fā)光過程一般被稱為"熒光"。典型地，熒光發(fā)射在激發(fā)原因消失后就不再持續(xù)了，這是由于通過這種自旋容許躍遷可能快速衰減的短暫的激發(fā)態(tài)而造成的。如果光致發(fā)光是由于自旋禁戒躍遷(如三重態(tài)-單態(tài)躍遷)，這種光致發(fā)光過程一般被稱為"磷光"。典型地，磷光發(fā)射在激發(fā)原因消失后仍然持續(xù)很長時間，這是由于僅通過自旋禁戒躍遷才會衰減的長久激發(fā)態(tài)而造成的。"發(fā)光標記物"或"發(fā)光信號"可能具有上述任一種特性。術(shù)語"電磁輻射"指的是帶有能量的電磁波，包括，例如，按照頻率升序排列(或按照波長降序排列)，紅外輻射、可見光、紫外(uv)光、X-射線和y射線。在文中使用的"有效觀測體積"一般指的是通過用于特定用途的檢測手段可以觀測的體積。例如，關(guān)于基于焚光的檢測，所述體積暴露于激發(fā)輻射，和/或其發(fā)射的輻射被相鄰的光學系統(tǒng)/檢測器采集。例如，關(guān)于用于某些用途的零模波導，激發(fā)輻射傳播到波導芯內(nèi)確定了有效觀測體積，特別是，所述體積暴露的光強至少為進入波導芯的原激發(fā)輻射強度的1%,優(yōu)選至少10%。這樣的強度和體積可根據(jù)所述應(yīng)用的特定條件容易地計算，包括激發(fā)輻射的波長和波導芯的尺寸(見,例如美國專利No.6,917,726，此處引用作為參考)。"引物"是一種短的多核苷酸，一般具有游離的3，-OH基，它通過與靶核酸雜交結(jié)合到靶樣品中可能存在的靶核酸(或模板)上，隨后促進與靶標互補的多核普酸的聚合。術(shù)語"可4喿作地連接于"或"可操作地偶聯(lián)于"這兩個詞在這里可以交互使用。它們指的是一種并置關(guān)系，其中所述組件的關(guān)系使得它們能夠以預(yù)期的方式執(zhí)行功能。術(shù)語"核苷酸"通常指的是包含堿基、糖和一個或更多的陰離子基團，優(yōu)選磷酸基的分子。該分子可以包括一個、兩個、三個、四個、五個或更多的磷酸基團和/或其它基團如硫酸基團。該術(shù)語還包括核普酸類似物，核苷酸類似物在結(jié)構(gòu)上和天然核苷酸類似，并且能夠基本4象核苷酸一樣起作用，例如顯示出與DNA或RNA中存在的一個或多個堿基的堿基互補性，和/或能夠在聚合酶的作用下堿基互補地摻入到正在合成的核苷酸鏈中。"核苷酸類型"指的是擁有將要檢測的共同特性的一組核苷酸。例如，核苷酸類型可以分為四類DNA為A、T、C和G，或者RNA為A、U、C和G,在一些實施方案中，反應(yīng)中使用的每一類核苷酸用一個獨特的標記物標記以和其它的區(qū)分開來。術(shù)語"多核苷酸"指的是任意長度的"核苷酸"的聚合形式。術(shù)語"光約束"指的是用于預(yù)期反應(yīng)的反應(yīng)物被限制在該約束內(nèi)并通過光學手段分析的區(qū)域。"多核苷酸探針"指的是用于通過雜交反應(yīng)檢測或鑒定其相應(yīng)的耙多核苷酸的多核苷酸。術(shù)語"雜交"在用于多核苷酸時指的是多核苷酸在雜交反應(yīng)中形成復合物的能力，該復合物通過核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化。氫4建4建合可以通過Watson-Crick石威基配對、Hoogstein結(jié)合作用或其它任何序列特異性的方式發(fā)生。這種復合物可以包括形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復合物的三條或更多條鏈，自雜交的單條鏈，或這些結(jié)構(gòu)的任意組合。雜交反應(yīng)可以構(gòu)成更廣泛的過程中的一步，如PCR反應(yīng)的起始，或4吏用核酶對多核苷酸的酶切。雜交反應(yīng)能在不同"嚴格性"的條件下進行。相關(guān)條件包括溫度、離子強度、溫育時間、反應(yīng)混合液中是否存在諸如曱酰胺這樣的其他溶質(zhì)和洗滌步驟。較高嚴格條件是這樣的條件，例如較高的溫度和較低的鈉離子濃度，這種條件下需要雜交成分之間具有較高的最低互補性才能形成穩(wěn)定的雜交復合物。一般來說，低嚴格雜交反應(yīng)在大約40x:在ioxssc中，或在相等離子強度的溶液/溫度下進行。中等嚴格的雜交一般是在6xssc中在約5(TC下進行的，嚴格雜交一般是在1xxSSC中在大約60。C下進行的。當在兩條單鏈多核普酸之間以反向平行結(jié)構(gòu)發(fā)生雜交時，這種反應(yīng)被稱為"退火"，那些多核苷酸被描述為"互補的"。如果雜交能發(fā)生在第一多核苷酸和第二多核苷酸鏈中的一條之間，則該雙鏈多核苷酸與另一條多核苷酸可以是"互補的"或"同源的"。"互補性，，或"同源性，，(一個多核苷酸與另一個多核苷酸互補的程度)可以根據(jù)公認的堿基配對原則，根據(jù)相對鏈中預(yù)期相互形成氫鍵的堿基比例來確定。本發(fā)明的光約束的結(jié)構(gòu)本發(fā)明的一方面是用于表征分子和/或監(jiān)測化學反應(yīng)的光學裝置和方法的設(shè)計。本發(fā)明的光學裝置允許在生理學相關(guān)條件下多路分析(multiplexing)大量單分子。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種高密度光約束陣列，其表面密度超過每平方毫米4xl0"個約束，優(yōu)選超過105個，其中陣列中的單個約束提供仄升級別的有效觀測體積。陣列中可包括至少約2xl05、至少約106、或至少約107個光約束。優(yōu)選地，陣列中單個約束提供小于約IOOO仄升、更優(yōu)選小于約900仄升、更優(yōu)選小于約80仄升、甚至更優(yōu)選小于約IO仄升的有效觀測體積。需要時，能提供小于1仄升的有效觀測體積。在一個優(yōu)選方面，單個約束產(chǎn)生可分辨以生理學濃度存在的單分子的有效觀測體積。對大多數(shù)生化反應(yīng)而言，生理學相關(guān)的濃度是在微摩爾到毫摩爾之間，因為絕大多數(shù)酶的米氏常數(shù)就處在這個范圍。相應(yīng)的，優(yōu)選的光約束陣列具有能檢測濃度高于約l微摩爾(jLiM)，或更優(yōu)選高于50jaM、或者甚至高于100|nM的單分子的有效觀測體積。陣列需包括零模波導或可替代的納米級的光學結(jié)構(gòu)。這種可替代結(jié)構(gòu)包括但不限于具有反射率介質(zhì)(reflectiveindexmedia)的多孔膜，和使用與反射率相匹配的固體的約束。如同這里所用的，"零模波導"指的是其中大部分入射輻射都衰減了的光波導，優(yōu)選超過80%，更優(yōu)選超過90%,甚至更優(yōu)選超過99%的入射輻射都衰減了。由于如此高水平的衰減，波導內(nèi)不存在明顯的電磁輻射傳播模式。結(jié)果在進入該波導時入射電磁輻射的快速衰減產(chǎn)生了可有效地檢測單分子的極小的觀測體積來，甚至當它們以高達微摩爾級的濃度存在時依然如此。本發(fā)明的零模波導一般包括一個圍繞芯的包層(即部分的或全部的)，其中設(shè)置包層是為了阻止波長高于截止波長的電磁能縱向穿過零模波導的芯進行傳播。這種包層一般使用能防止電磁輻射產(chǎn)生的電磁場顯著穿透的材料制成。適合制造包層的材料包括但不僅限于合金、金屬、半導體材料及其任意組合。合金包括具有金屬性質(zhì)，但是包含兩種或多種成分，其中至少有一種成分是金屬的任意物質(zhì)。合金在各種成分一無論金屬還是非金屬的一的含量或量上可能不同。優(yōu)選的合金與純成分的材料相比一般改善了某些所需的特性?？梢酝ㄟ^使用材料的混合物來改善的特性包括，耐化學性、導熱性、導電性、反射性、粒度、熱膨脹系數(shù)、脆性、耐溫性、傳導性和/或降低包層的粒徑。一般來說，適用于本發(fā)明的合金可包括其中一種成分的比例低至0.0001%的混合物。在其它例子中，可能需要高比例的一種以上成分的合金。ZMW的一個實施方案是使用鋁來作為ZMW結(jié)構(gòu)的包層。作為說明合金是如何有益于ZMW結(jié)構(gòu)的一個例子，這有益于考慮不同的鋁合金是怎樣影響ZMW的。在冶金工藝中，很多材料和鋁做成合金。適合和鋁形成合金的材料的非限制性例子有銻、砷、鈹、鉍、硼、鎘、4丐、碳、鈰、鉻、鈷、銅、鎵、氫、銦、鐵、鉛、鋰、鎂、錳、汞、鉬、鎳、鈮、磷、硅、釩、鋅等。作為說明引入其它成分是如何有利地影響ZMW性能的一個例子，眾所周知，在鋁中加入硼能提高鋁的導電性。金屬膜導電性的增加能通過減少穿透深度而降低觀測體積從而提高性能。優(yōu)選的實施方案包括含有超過0.0001%摻雜劑的鋁合金。更優(yōu)選的實施方案包括含有超過0.005%摻雜劑的鋁合金。再更優(yōu)選的實施方案包括含有超過0.1%摻雜劑的鋁合金。與之相反，有些材料預(yù)計降低ZMW結(jié)構(gòu)的性能，在這些情況中，需要采取措施去除某些雜質(zhì)。例如，在某些應(yīng)用中出于裝置毒性的考慮可能需要降低鉛或砷的含量。該裝置的一個優(yōu)選的實施方案包括含砷量小于1%的金屬膜。該裝置的一個更優(yōu)選的實施方案包括含砷量小于0.1%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含砷量小于0.001o/o的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含砷量小于0.00001%的金屬膜。另外一個優(yōu)選的實施方案包括含鉛量小于1%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含鉛量小于0.1%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含鉛量小于0.01%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含鉛量小于0.001%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含鉛量小于0.00001%的膜。在光約束的性能非常重要的其它應(yīng)用當中，雜質(zhì)往往會降低其導電性，從而使約束變差，這是不希望的。例如釩在冶金工藝中被認為是降低鋁導電性的。一個優(yōu)選的實施方案包括含釩量小于0.1%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含釩量小于0.01%的金屬膜。一個更優(yōu)選的實施方案包括含釩量小于0.001%的膜。適合制造包層的半導體材料通常是不透明的，包括硅、硅酸鹽、氮化硅、磷化鎵、砷化鎵或其任意組合?？梢栽诹隳２▽О鼘由贤扛膊牧弦蕴岣咂浔砻嫣匦?。例如，涂覆能加強包層材料的耐用性。此外，如果芯內(nèi)包含的反應(yīng)物易與包層材料反應(yīng)或附著，特別需要涂覆。在該領(lǐng)域內(nèi)有多種多樣的適用的涂覆材料。有一些材料能共價結(jié)合到表面，其它的則可通過非共價相互作用結(jié)合到表面上。涂覆材料的非限制性例子包括氧化鋁膜，例如二曱基氯硅烷、二曱基二氯硅烷、六曱基二硅氮烷或三曱基氯硅烷的硅烷化劑，聚馬來酰亞胺，以及諸如氧化硅、Aquasil和Surfasil的滲石圭劑。一個示例的涂覆的ZMW(101)如圖10所示。ZMW(101)結(jié)合到基板(105)。ZMW包括側(cè)壁(102)、上表面上的涂覆材料(103)和金屬膜(104)。在某些實施方案中，使用超過一種金屬的異質(zhì)金屬組合物制造約束可能會是有益的。例如，對于某些應(yīng)用來說，一種混合物包含一層以上，每層具有每種不同組成，或每層中的組成不同可能是有益的。這可以有利地影響約束的幾個方面的性能，包括但不限于光約束的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)強度和裝置的性能、裝置的表面化學性質(zhì)等。在一個實施方案中，約束包含有兩層，其中一層是用于加強第二層和基板的粘著力。在另一個實施方案中，包層膜的組成隨著相對于約束的軸向位置而不同，從而提供與一層均一組合物不同的光學性能。在這個實施方案的一個特別形式中，該膜包含一種緊靠基板表面的具有較高趨膚深度值(valueofskindepth)的組合物，并且包含另一種遠離基板表面的具有較低趨膚深度值的組合物，使得這種約束的特性是在接近表面處形狀更一致，隨著遠離基板而很快逐漸減少。在另一個實施方案中，選擇包含約束包層的兩種不同層的厚度，從而在裝置的基板上獲得特定的光學條件，例如，相長干涉和相消干涉。只要能有效阻止電磁輻射的傳播模式，包層圍繞的內(nèi)腔(即芯)可以采用適宜的大小、形狀或體積。通常芯具有小于截止波長(？k:)的側(cè)向尺寸。對于直徑為d、擁有良好導體包層的圓形波導，)ic大概為1.7Xd。芯的橫斷面可以是環(huán)形、橢圓形、卵形、圓錐形、矩形、三角形、多面體或其它任何形狀。各種形狀可能特別適用于特定的應(yīng)用。例如，延長的橫斷面可用于更好地接近具有機械持續(xù)性或剛性的分子，例如DNA。從各種縱橫比的拉長的狹縫到卵形的范圍中的橫斷面顯著提高持續(xù)性分子對于結(jié)構(gòu)的檢測區(qū)的可達性，且輻射的軸向衰減沒有過度的損失。盡管優(yōu)選均一的橫斷面積，但是需要時橫斷面積在波導的任意特定深度可以不同。優(yōu)選的平均橫斷面積是100nm2到10,000nm2。在一個優(yōu)選實施方案中，芯是非圓柱形的。在該實施方案的一個方面中，非圓柱形芯在上表面上包括一個開口，在完全^皮包層包裏的下表面上有一個基底，其中該開口的側(cè)向尺寸較基底窄。這種構(gòu)造顯著限制了反應(yīng)物的擴散，由此增加了在觀測體積中的平均滯留時間。該構(gòu)造特別可用于測量化學反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)(on-rate)。在另一方案中，芯包括一個側(cè)向尺寸較基底寬的開口。該構(gòu)造允許較容易地接近大分子，如果零模波導的開口端與由于光學性能原因所需的基底一樣小，那么大分子在進入該構(gòu)造時將產(chǎn)生空間或熵阻礙。例子包括長鏈多電解質(zhì)，如DNA分子的可達性，其承受與進入小開口相反的熵力。本發(fā)明包括的零模波導具有較高的填充分數(shù)比，通常大于0.0001，優(yōu)選大于0.001，更優(yōu)選大于O.Ol,再更優(yōu)選大于0丄在此處所用的圖案的"填充分數(shù)"是指該圖案前景(foreground)所占面積與圖案所占總面積(前景和背景(background)之和)之比。術(shù)語"填充分數(shù)比"和"填充分數(shù)"兩者可以互換使用。對于零模波導而言，認為前景是零模波導的芯所占據(jù)的區(qū)域，背景是零模波導之間的區(qū)域(例如，某些設(shè)計中形成包層的鋁膜)。具有高填充分數(shù)比的零模波導對于進行同質(zhì)分析尤其有用?？梢酝ㄟ^將陣列中所有零模波導的總面積加起來，并且除以總有效面積，包括零模波導以及它們之間的區(qū)域，從而計算填充分數(shù)。例如，如果一個零模波導的直徑為50nm,那么該零模波導的面積是7,850nn^的四分之一，或者說是1962.5nm2。如果這些零模波導位于正方形的陣列中，相距100nm，那么每個零模波導的總有效面積是10，OOO平方納米。因此，該陣列的填充分數(shù)為78°/。的四分之一或是19.6%，與填充分數(shù)為0.01%級別的零模波導相比，這種零模波導在表面結(jié)合測定中提供高近4個數(shù)量級的信號強度。在生物測定，例如ELISA和其它的分子結(jié)合生物測定中，一種限制是不能同質(zhì)地進行操作，或者其中可以將溶液加入混合物中但不去除任何物質(zhì)的模式。這使得高度多路的測定變得復雜，因為從大量孔中加入和去除物質(zhì)比僅僅添加物質(zhì)顯然更加復雜。至于ELISA試驗，去除物質(zhì)是必須的，因為在試驗結(jié)束時仍游離在溶液中的熒光(或其它)標記物會干擾對反應(yīng)表面結(jié)合的標記物的檢測能力。為了克服這一缺點，設(shè)計了利用某些放射性同位素的窄譜放射性發(fā)射的技術(shù)，但是這些技術(shù)在人員安全和廢物處理方面有其固有的困難。已經(jīng)設(shè)計出了其它將測定的靈敏性限制在表面的技術(shù)，如全內(nèi)反射限制(TIR)和共焦檢測。與這些技術(shù)中的任一種相比，零模波導光子結(jié)構(gòu)允許較簡單的、較便宜的光學系統(tǒng)配置，并且在靈敏性限制于表面的方面大大優(yōu)于這兩種技術(shù)。在生物測定中填充分數(shù)很重要，因為有效^:針面積局限于檢測區(qū)域中零模波導底部的表面積。這種測定中能檢測的信號量與有效區(qū)面積成正比，零模波導占據(jù)較大比例的有效表面將增加該種測定的信號強度。高填充分數(shù)結(jié)構(gòu)通常可以用于任何表面靈敏性用途，并不局限于ELISA方法。截止波長是這樣一種波長，高于它的波長在使用的照射幾何圖形下基本不能沿波導傳播電磁能。如果給出芯的幾何圖形、包層材料的性質(zhì)以及入射電磁輻射的波長，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過解麥克斯韋方程可以容易地推導出截止波長(參見，如，JohnD.Jackson，CLASSICALELECTRODYNAMICS(經(jīng)典電動力學)，第二版，JohnWilleyandSons)。入射波長的選擇取決于使用陣列的特定用途。在有些方案中，入射波長可以選自大約lOnm到大約lmm的范圍。檢測熒光信號時，入射波長一般選自大約380nm到大約800nm的范圍。為了產(chǎn)生所需的觀測體積，通常采用極化(線性，或優(yōu)選圓極化)和非極化的入射輻射來照射陣列。在一項單獨的實施方案中，本發(fā)明提供一種稱為外反射約束(ERC)的可替代的光約束。與傳統(tǒng)的全內(nèi)反射約束(IRC)不同，低指數(shù)介質(zhì)是電磁輻射的栽體，高指數(shù)(且不透明的)介質(zhì)是反射器。因此其折射率的作用與IRC是相反的。通常ERC需要一定種類的在不透明相中提供分析物(即待測分子)的方法。IRC依賴于入射的電磁輻射在高指數(shù)折射與低指數(shù)折射之間界面上的反射。如果光的入射角高于全內(nèi)反射的臨界角(本領(lǐng)域公知)，所有入射電磁輻射都被反射，不能傳播到低指數(shù)相。迅衰輻射的窄區(qū)建立在接近低指數(shù)側(cè)的界面處。這種輻射場典型地是指數(shù)式衰減場，衰減長度的范圍為大約1OOnm到大約200nm，取決于入射角和兩相的折射率。如果低指數(shù)相為含有分析物的溶液，則可以應(yīng)用迅衰輻射檢測溶液中的分析物，其具有高度的表面敏感性。在ERC中，電磁輻射的傳播載體是透明的低指數(shù)膜，而承載分析物的介質(zhì)是不透明的高指數(shù)金屬膜。在該情況下，大部分輻射被反射，而與入射角無關(guān)，沒有反射的光根據(jù)金屬的趨膚深度快速衰減。通常會采取一些手段轉(zhuǎn)移金屬相中的分析物。這些手段可以利用在金屬層內(nèi)形成的納米毛細管的形式。當足夠小的時候，這種納米毛細管的存在對能量在兩種介質(zhì)中的分配影響較小，但是可以大到足以用于傳送活性分子。為了足夠小，金屬膜的任何缺陷都要小于照射波長。這一點可以達到，因為可見光波長與目的生物分子的典型大小之間的比例較大。可見光的波長通常在400nm到750nm之間，目的生物分子的直徑通常在l-30nm左右?？梢岳媒缑嫣庉椛涞乃p將輻射限制在分析物的極小區(qū)域內(nèi)。在高指數(shù)基板上指數(shù)匹配(與水)的膜上的小孔可以產(chǎn)生側(cè)向約束，這超過了在TIR中使用衍射限制的光學所可能產(chǎn)生的。原則上，這樣可以產(chǎn)生IOO仄升的約束。在該方法中，使用全內(nèi)反射約束形式，其中將與分析物溶液指數(shù)匹配的固體材料加到基板表面上，隨后穿刺出納米級小孔。當用于TIR模式時，該結(jié)構(gòu)將提供比單獨應(yīng)用TIR更多的約束。其它可替代的約束包括指數(shù)匹配的固體。作為一個說明性的例子，這種光約束的制作開始于一個透明的高指數(shù)基板，如藍寶石，PMMA(聚甲基丙烯酸曱酯)抗性樹脂的200nm旋涂膜。通過暴露于電子束光刻可以使分離的斑點依照所用圖案成為可溶的。顯影以后，該裝置在PMMA層有納米級小孔，由于其與含有分析物的溶液的折射率相似，軸向約束不受PMMA層的影響，但是倘若側(cè)向限制的程度是由小孔的直徑?jīng)Q定的，則溶液在物理上被阻止接近除小孔所處區(qū)域之外的表面。可以通過能夠在單分子水平上檢測和/或監(jiān)測反應(yīng)物之間相互作用的光學系統(tǒng)提供光約束。該光學系統(tǒng)通過如下步驟完成這些功能首先產(chǎn)生入射波長并將其傳送到約束中所含的反應(yīng)物；隨后收集、分析反應(yīng)物發(fā)出的光信號。通常這種系統(tǒng)采用光具組(opticaltrain),將來自約束陣列的信號引導到基于陣列的檢測器的不同位置上，同時檢測來自多個不同約束的多個不同的光信號。特別地，光具組通常包括光柵和楔形棱鏡，將來自陣列中的每個約束的光譜特征不同的信號同時引導和分離到基于陣列的檢測器上的不同位置，如CCD。通過將來自各個約束的信號分別引導到檢測器上的不同位置，此外將來自每個約束的分量信號分離到不同的位置，可以同時監(jiān)測多個約束，以及來自每個約束的多種信號。適用于本發(fā)明的光學系統(tǒng)至少包括兩個組件，也就是一個激發(fā)源和一個光子探測器。激發(fā)源產(chǎn)生并傳送對光約束中的反應(yīng)物進行光學激發(fā)的入射光。根據(jù)應(yīng)用目的，入射光的光源可以是激光、激光二極管、發(fā)光二極管(LED)、紫外線燈泡和/或白光源。如果需要，可以同時使用一個以上的光源。在采用具有不同激發(fā)光鐠的多種不同化合物的應(yīng)用中，尤其需要采用多個光源，可以同時檢測一種以上熒光信號，追蹤一個以上或一種類型的分子的相互作用。在該領(lǐng)域有大量不同的光子探測器。代表性的檢測器包括但不局限于光閱讀器、高效光子探測系統(tǒng)、光敏二極管(例如，雪崩光敏二極管(APD))、照相機、電荷耦合器件(CCD)、電子倍增電荷耦合器件(EMCCD)、增強型電荷耦合器件(ICCD)和配備有前面任一探測器的共焦顯微鏡。如果需要，光約束陣列可以包括各種校準輔助裝置或標記，以便于光約束和激發(fā)源、光子探測器或下面所述的光傳輸組件的適當空間放置。1本發(fā)明光系統(tǒng)可能還包括具有多種功能的光傳輸組件。首先，它收集和/或引導入射波長進入含有反應(yīng)物的光約束中。第二，它將光約束中反應(yīng)物發(fā)出的光信號傳送和/或引導到光子探測器中。第三，它可的說明性例子包括衍射光柵、陣列波導光柵(AWG)、光學纖維、光開關(guān)、平面鏡、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準直器(collimators)。其它的例子包括光學衰減器、偏振濾光片(例如，二向色濾光片)、波長濾波器(低通、通帶、高通)、波片、延遲線(delayline)。在一些實施方案中，光傳輸組件可以是與光約束陣列光連接的平面波導。例如，平面波導可以與零模波導陣列可操作地連接，將入射波長直接引導到零模波導的各個芯，以使波能的損失降到最低?？梢园ㄆ矫嫱ǖ雷鳛槲挥陉嚵谢宓撞康目刹饐卧?，或可與基板結(jié)合作為陣列的一個組成部分。適合用于本發(fā)明的光傳輸組件包括將光以改變或未改變的狀態(tài)從一個位置引導到另一個位置的多種光學裝置。該種光傳輸裝置的非限制性例子包括光導纖維、衍射光柵、陣列波導光柵(AWG)、光開關(guān)、平面鏡(包括二向色鏡)、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準直器、濾波器、棱鏡以及其它任何利用適當?shù)恼凵渎屎蛶缀涡螤钜龑Ч饩€傳播的裝置。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的光約束與光子探測器可操作地連接。例如，光約束陣列與相應(yīng)的、單獨的光子檢測器可操作地連接。光約束與相應(yīng)的探測器可以空間對齊(例如1:1對應(yīng))，從而便于采集來自波導的光信號。一個特別優(yōu)選的設(shè)置包括零模波導陣列，其中每個波導可以與相應(yīng)的微透鏡或納米透鏡可操作地連接，優(yōu)選對齊以優(yōu)化信號收集效率?；蛘撸诠饩呓M中可以使用物鏡、濾波器組、分辨不同波長的信號的棱鏡、和成像透鏡的組合，將不同光約束中發(fā)出的光信號引導到陣列檢測器，例如CCD，并且同時將每個不同約束發(fā)出的信號分離為對應(yīng)于每個約束中發(fā)生的不同反應(yīng)的多種組成信號單元。圖7示出了一個示例性的光學設(shè)置，其中ZMW陣列與一個光學系統(tǒng)可操作地連接。該系統(tǒng)包括ZMW陣列膜(81)、蓋玻片(82)，光線可以通過蓋玻片(82)傳播，并且通過集成透鏡組(83)聚焦，代表ZMW結(jié)構(gòu)，85代表經(jīng)集成透鏡如包埋式微透鏡聚焦到ZMW上的光線。圖11示出了一種校準策略和光學系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一個光電探測器131,—個任選的用于收集光線的透鏡132，具有與基板135連接的金屬膜134的ZMW133,和一個與入射光束137對準的物鏡136。圖13顯示一種示例性的校準檢測系統(tǒng)及其相關(guān)組件。示例性的系統(tǒng)13A包括一個光約束，例如具有與基板114連接的金屬膜113的零模波導111。零模波導111通常含有信號發(fā)生分子112,與相關(guān)組件光學連接，這些組件包括物鏡115、光束分離器/二向色棱鏡117、任選的長焦透鏡120(用于無限遠校正系統(tǒng))、光電探測器122(例如四象限光電探測器)。116代表通過系統(tǒng)傳播的光線。118代表入射照射線。119代表射向探測器112的反射光線。圖13B示出了四象限光電二極管的前視圖。圖中央示出了在四象限探測器中心上未正確對準的光束。可以通過處理四個象限產(chǎn)生的四種電壓，確定光束和光約束，如ZMW,未正確對準的程度和方向。本發(fā)明陣列在基板表面可以有單行或是多行光約束，其中具有多條路徑，例如通常至少兩條，更加常見10條以上，或是更加常見100條以上。光約束陣列可以沿基板的X軸或Y軸水平或?qū)蔷€對齊。各個光約束可以在穿過基板表面或在基板表面上以任意形式排列，例如成行或是成列排列，從而形成網(wǎng)格，或形成環(huán)形、橢圓形、卵形、圓錐形、矩形、三角形或是多面體形。為使相鄰光約束之間的最近間距最小，優(yōu)選六邊形陣列。可以將光約束陣列結(jié)合到便于分析、具有高通量或其它優(yōu)點的一種結(jié)構(gòu)中，例如微量滴定板等。這種設(shè)置在此也被稱為"陣列的陣列"。例如，可以將本發(fā)明陣列組合到另一個陣列中，如微量滴定板或多孔板，其中該板的每個微孔中含有一個本發(fā)明光約束陣列。通常，這種多孔板包括多個反應(yīng)槽或孔，例如，48孔、96孔、384孔或1536孔的形式。在這種情況下，這些孔通常分別排列在18mm、9mm、4.5mm或2.25mm中心上。圖5示出了一種陣列的陣列的例子，其中子陣列71是超級陣列72的一部分。陣列還可以以點陣排列。例如，圖4顯示的是一個"i兌明性的ZMW規(guī)則排列的頂視圖。在此構(gòu)造中有一個由參數(shù)dl、d2和角53限定的點陣。除了每個陣點處有一個ZMW外，還有在一個排列中包括多個ZMW的復合晶胞，這種排列由一系列角和間距限定，晶胞內(nèi)的每個組分具有一個角和一個間距。具體來說，52代表第一點陣間距，53代表點陣角，54代表第二點陣間距，55代表晶胞的第一間距，56代表晶胞的第一角。該圖顯示了包括兩個組分的晶胞的陣列，但是晶胞可以有任意多個組分。如上所述，本發(fā)明陣列包括多個光約束。在一些實施案例中，陣列至少有大約20x104個不同的光約束，優(yōu)選至少約20x106個不同的約束，更優(yōu)選至少約20x108個約束。在某些實施方案中，固體表面上點的密度至少為約4x104個約束/mm2，通常至少約8x104，至少約1.2xl05,或至少約4xl06個約束/mm2，但不超過4x1012個約束/mm2，通常不超過約4x101Q個約束/mm2。陣列的總體尺寸通常是，厚度為幾納米到幾毫米，寬或長為幾毫米到50厘米。優(yōu)選的陣列具有厚度大概為幾百微米的總體尺寸.，根據(jù)所需光約束的數(shù)量可以具有任意的寬度或長度。在圖1所示的一個例子中，光約束例如零模波導陣列為正方形排列。該陣列包括代表性的零模波導21，它與毗鄰的波導相隔距離"d"(22代表兩個零模波導之間的距離)。在圖2所示的另一個例子中，光約束例如零模波導陣列以非正方形的格式排列。該陣列包括一個單獨性的零模波導31，它與毗鄰的波導的距離為"d"(32代表兩個零模波導之間的距離)。圖3顯示另一個示例性的二維陣列的俯視圖。其中一個維度上相鄰光約束之間的距離為"dl"，另一個維度上距離為"d2"，單位向量角為43。可以根據(jù)使用本發(fā)明陣列的特定用途調(diào)整各個光約束之間的距離。例如，如果目標用途需要暗視野照射陣列，沒有或者具有低水平的來自光約束的入射光衍射散射，那么通常相對于入射波長，使各個約束彼此靠近。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種零模波導陣列，其包括至少一個第一和至少一個第二零模波導，其中第一零模波導與第二零模波導之間有一段距離，便得在用入射波長照射時，以特定角度觀察到的第一零模波導的衍射強度低于在沒有第二零模波導時用相同入射波長照射第一零模波導時的衍射強度。如果陣列包括以規(guī)則間隔的點陣排列的零模波導，其中零模波導與最近的零模波導之間的距離小于入射波長的一半，則衍射散射可以減小或明顯消除。在這種方案中，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為零級光柵。這些光柵不能散射入射光，盡管其含有本身能非常有效地散射的大量組件。這種排列非常適用于某些照明方法，如暗視野照明，其中表面散射將導致可被物鏡采集到的激發(fā)輻射，從而增加背景噪音。用于照射的波長范圍為250nm到8微米，也就是說間距小于4000nm的零才莫波導陣列仍可以按此方式應(yīng)用。在此方面，間距小于2000nm時更優(yōu)選，間距小于lOOOnm更優(yōu)選。如果不對稱地使用照射，或是將收集錐度定在90度以下，一些間距大于波長一半的構(gòu)造可能具有相同的優(yōu)點。除了減少衍射散射的優(yōu)點以外，各個約束之間的較小間距還減小了照射面積，從而降低了功率需量。相對于入射波長而言光約束之間距離較遠的陣列也有合乎需要的特性。盡管角相關(guān)的散射增強了背景信號，不利于某些應(yīng)用，但它提供了一種非常適合于表征描述光約束的尺寸和形狀的方法。此外還適用于對分子相互作用進行總體的、大量的測定，尤其是涉及未標記的分子。適于此用途的陣列通常包括多個光約束，各個光約束之間的距離大于一倍入射波波長，通常為入射波波長的1.5倍，但通常不超過入射波波長的150倍。試劑盒本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的光約束陣列的試劑盒。本發(fā)明包括的試劑盒包括可以表征分子和/或在單分子水平上監(jiān)測化學反應(yīng)的那些。每個試劑盒通常包括使這種表征和/或監(jiān)測程序成為可能的裝置和試劑。根據(jù)試劑盒的預(yù)期用途，試劑盒的內(nèi)容物和包裝各不相同。如果用于DNA測序，試劑盒通常包括(a)光約束陣列，優(yōu)選本發(fā)明的零模波導，其可以分辨單分子或單分子反應(yīng)，例如濃度大于約l微摩爾的那些分子；(b)測序試劑，通常包括聚合酶、含水緩沖液、鹽、引物、核香酸或核苷酸類似物。需要時，還可以包括一種已知序列的"控制"核酸，用于監(jiān)測反應(yīng)的準確性或進程。試劑可以以固體形式、固定化形式提供，和/或溶解/懸浮在適于貯存及以后在進行試驗時置換或是添加到反應(yīng)介質(zhì)中的緩沖液中。通常提供適當?shù)母鞣N包裝。試劑盒任選地可以提供在該程序中有用的其他組分。這些任選的組分包括但不限于緩沖液、捕獲劑、顯影劑、標記物、反應(yīng)表面、對照樣品、說明書和說明信息。使用該發(fā)明試劑盒的診斷或預(yù)測程序可由臨床實驗室、實驗性實驗室、醫(yī)生或個人進行。光約束的制備本發(fā)明陣列可以用本發(fā)明提供的納米加工技術(shù)制造，此外還可以采用在集成電路(IC)和微電子機械系統(tǒng)(MEMS)領(lǐng)域已知的技術(shù)制作。制造過程通常包括，選擇陣列基板，然后用合適的IC加工方法和/或MEMS顯微才幾械加工技術(shù)構(gòu)建和集成光約束和其它有關(guān)元件。陣列基板在一些實施方案中，光約束陣列位于剛性基板上。在例如涉及具有折射率介質(zhì)的多孔膜的另一些實施方案中，可以采用柔性材料。通常，剛性載體不易彎曲。本發(fā)明所用的不是剛性載體的固體材料的例子包括膜、柔性金屬或塑料膜等等。這樣，在使用陣列的試驗條件下，特別是在高通量處理條件下，本發(fā)明陣列的剛性基板足以為位于其上或是其內(nèi)部的光約束提供物理支持和結(jié)構(gòu)。其上排布有本發(fā)明陣列圖案的基板根據(jù)陣列的預(yù)期用途可以采用從簡單到復雜的多種構(gòu)造。因此，基板可以具有全部為片狀或是板狀的構(gòu)造，如矩形或圓盤形構(gòu)造，如在標準微量滴定板和顯微鏡載玻片中所見的總體為矩形的構(gòu)造是優(yōu)選的。通常，剛性基板的厚度至少為約0.01mm,也可以為lcm或是更厚，j旦通常不超過約5cm.。剛性基板的長度和寬度根據(jù)將要在其上或內(nèi)部制作的光約束陣列的大小而不同。很多種材料可以用來制作本發(fā)明陣列的基板。制作基板的材料優(yōu)選地可以透過可見光和紫外光。合適的材料包括玻璃、半導體(例如，硅酸鹽、硅、硅酸鹽類、氮化硅、二氧化硅、石英、熔融石英和砷化鎵)、塑料和其它有機聚合材料。在優(yōu)選的方案中，使用基于硅基基板如玻璃、石英和熔融石英作為下面的透明基板材料。本發(fā)明陣列的基板至少包括一個表面，上面安置光約束圖案，該表面可以是光滑的，或是基本平面的，或是不規(guī)則的，例如具有凹陷或隆起?？梢杂靡粋€或多個不同的化合物層對表面進行修飾，用理想的方式調(diào)節(jié)表面性質(zhì)。目標修飾層包括有機和無機層，例如金屬、金屬氧化物、聚合物、有機小分子、功能部分如抗生物素蛋白/生物素等等。選擇涂覆涂層材料的方法取決于所使用的涂覆材料的種類。通常通過直接將材料涂覆在零模波導表面，隨后從表面上洗去基質(zhì)多余的未結(jié)合的涂覆涂料，進行涂覆。此外，還可以用傳統(tǒng)的技術(shù)沉積涂覆涂料，如化學蒸汽淀積(CVD)、濺射、旋涂、原位合成等等。某些涂覆材料可以通過加熱、輻射和/或化學反應(yīng)交聯(lián)到表面上。在優(yōu)選的方案中，通過共價反應(yīng)或通過離子或疏水/親水相互作用將合適的涂覆材料結(jié)合到基質(zhì)表面。對于硅基基板，例如，曱硅烷化學方法特別適合將涂覆材料共價連接到表面上，例如偶聯(lián)基團、特異性結(jié)合部分等等。這些化學方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且不需要過多的實驗即可實施。制作程序本發(fā)明陣列基板的制作可以根據(jù)下述方法或IC-加工和/或MEMS顯農(nóng)i機械加工的其它標準:技術(shù)進行。本領(lǐng)域已知的標準，技術(shù)包括但不限于電子束曝光技術(shù)、光刻技術(shù)、化學蒸氣或物理蒸氣沉積、干法或濕法蝕刻、離子注入、等離子體蝕刻、壓焊和電鍍術(shù)。其它制作方法在美國專利申請公布No.2003/0174992中有詳細記述，其內(nèi)容在此引用作為參考。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種負性制作工藝(negativetonefabricationprocess),相比可能產(chǎn)生不同尺寸的光約束的傳統(tǒng)正性制作工藝，該負性制作工藝可以產(chǎn)生尺寸更均一并且更一致的光約束。下面的表1中列出了這兩種制作工藝的比較。表1制作零模波導的正性和負性加工步驟<table>complextableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在負性工藝中，將負性抗蝕劑涂覆到基板上。如果通過施加某些因素會使一種抗蝕劑可溶，則該抗蝕劑是負性的，對于光致抗蝕劑或e-束抗蝕劑來說，相應(yīng)的因素分別是光能或是電子束能。此外，正性抗蝕劑可以與負性圖案一起使用。負性圖案的特征是，在除了光約束例如零模波導的位置以外的所有區(qū)域施加因素，而不同于僅向光約束區(qū)域施加因素的正性圖像。在每一種情況中，在抗蝕劑顯影之后，抗蝕劑僅存在于光約束預(yù)期所處的位置。在許多情況中，使用工具獲得這些殘留抗蝕劑特征的下切側(cè)壁剖面(undercutsidewallprofile)是有用的。本領(lǐng)域有很多技術(shù)可以獲得下切側(cè)壁，例如，電子束光刻。例如，當應(yīng)用負性抗蝕劑時，一種方法是將電子束抗蝕劑層連續(xù)涂覆在表面上，上層膜對電子束傳遞給它的能量具有較高的敏感性。因為電子束有擴散的趨勢，因此上層膜與下層膜相比有較大的面積不溶，如期望的在上層下方形成一個懸垂部分。通過本領(lǐng)域中公知的顯影和適當?shù)那逑催^程，例如等離子體清洗過程之后，包含光約束的金屬膜可以通過幾種方法之一進行涂覆，包括金屬蒸發(fā)、分子束外延技術(shù)等等。如果抗蝕劑剖面如上所述下切，那么沉積在抗蝕劑仍然占據(jù)的區(qū)域中的金屬將留在抗蝕劑頂部而不是留在裝置表面。隨后通過任一種技術(shù)將抗蝕劑層去除，包括采用或不采用超聲處理或其它機械攪拌的溶劑溶解技術(shù)，活性等離子體蝕刻技術(shù)、蒸發(fā)等。當抗蝕劑被去除時殘留在抗蝕劑上的金屬被去除("浮脫")，同時直接存留在基板上的抗蝕劑仍然形成光約束的壁。該工藝的優(yōu)點是光約束的尺寸由抗蝕劑特征決定，并不是取決于活性離子蝕刻圖案傳遞機制的精確度，該機制對于金屬膜，特別是鋁，是高度可變的，鋁是用于這些裝置的一種理想的金屬。正性工藝具有抗蝕劑特征尺寸的固有的變化以及圖案轉(zhuǎn)移引起的變化，而負性工藝僅具有第一種可變性而沒有第二種。金屬薄膜技術(shù)有更少的側(cè)向變化，因此總體精確度較好。該方法也不依賴于適當蝕刻對所述金屬的有效性，因此該工藝可應(yīng)用的金屬比正性工藝有更廣的選擇。圖6是制作零模波導的一種示例性負性工藝的示意圖。在此工藝中，首先在基板11上涂覆一層負性抗蝕劑12。任選地，可以在基板上涂覆第二抗蝕劑層13。將抗蝕劑暴露于與正性工藝中使用的相同圖案的電子束光刻工具，產(chǎn)生與原來觀察到的相反的圖案，即殘留抗蝕劑小柱以及小柱之間的空隙15的循環(huán)陣列之一。通過在該圖案上涂覆金屬薄層，如鋁層17,隨后溶解負性抗蝕劑柱18,產(chǎn)生最終的零模波導結(jié)構(gòu)。因為該工藝不依賴于鋁層的厚度或金屬膜的晶體結(jié)構(gòu)或形態(tài)，因此產(chǎn)生非常一致的構(gòu)造，并且在臨界特征尺寸上提供更精細的控制。圖8示出了用正性抗蝕劑(左圖)或負性抗蝕劑(右圖)制作的ZMW結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片。多晶膜的顆粒結(jié)構(gòu)在圖像上可見為斑點，ZMW為暗的圓形結(jié)構(gòu)。一種負性工藝變型被稱為納米澆鑄。除了不用雙層抗蝕劑以外，納米澆鑄的制作步驟相似。該工藝首先是在基板表面沉積抗蝕劑(該例子中用的是單層抗蝕劑)。隨后是電子束曝光和顯影，曝光圖案上的每一個點形成一個圓柱體。該工藝中，理想的是使金屬沉積技術(shù)既可以將材料涂覆在抗蝕劑結(jié)構(gòu)的頂面，又可以涂覆在抗蝕劑結(jié)構(gòu)的側(cè)壁。該工藝是三維的，因為三維抗蝕劑結(jié)構(gòu)外表面的復制陰模(negativereplica)在構(gòu)成光約束壁的金屬膜的內(nèi)表面再現(xiàn)。在這種情況下，下切(undercut)抗蝕劑剖面和其各種產(chǎn)生方法都不是必要的，因為在負性工藝中，它們特別用來防止沉積的膜與抗蝕劑結(jié)構(gòu)的側(cè)面接觸。在納米澆鑄方法中，沉積的膜準確地再現(xiàn)抗蝕劑的外表面，所以只在需要非圓柱狀約束時使用下切圖形。在納米澆鑄的操作中，一般要小心地把金屬從納米澆鑄"母版"(抗蝕劑結(jié)構(gòu))上除去，這種抗蝕劑結(jié)構(gòu)在一些實例中可能完全埋藏而無法除去。然而，這可以用許多方法補救。當沉積技術(shù)在沉積中具有高度的各向異性時(例如金屬蒸發(fā))，側(cè)壁在靠近抗蝕劑結(jié)構(gòu)的頂端將會非常薄，在一些實例中可能是圓柱形柱。這個弱點能夠?qū)е陆饘僦苯悠屏?，從而使金屬從抗蝕劑結(jié)構(gòu)上因而從ZMW位置上去除?？梢岳靡环N溶液相或等離子體的各向同性蝕刻使膜進一步變薄直到這個弱點被分離，達到相同的效果。如果金屬沉積步驟有著程度較低的各向異性(例如賊射或者電鍍)，則可以通過化學機械拋光或者離子碾磨使抗蝕劑材料暴露。在除去抗蝕劑結(jié)構(gòu)上的金屬帽的同時或是之后，通過溶劑溶解或活性離子蝕刻除去抗蝕劑材料。如果應(yīng)用適當?shù)膱D案并正確選擇其他參數(shù)，就能完成制造步驟。本發(fā)明光約束和其他裝置的使用本發(fā)明裝置，包括光約束和聯(lián)合的光學系統(tǒng)，為分析分子和實時監(jiān)測化學反應(yīng)提供了一種有效的方法。本發(fā)明裝置和檢測/監(jiān)測方法可以應(yīng)用于多個方面，包括用于診斷和研究應(yīng)用的生物化學反應(yīng)和生物反應(yīng)分析。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明適用于說明關(guān)于研究應(yīng)用的核酸序列，尤其是作為預(yù)防醫(yī)學一部分的人類個體基因組測序，基因型-表型相關(guān)性的快速假設(shè)檢驗，多細胞生物發(fā)育各個階段的體外和原位基因表達模式分析，確定個體克隆的廣泛突變組和多種疾病或疾病狀態(tài)。其他應(yīng)用包括測定酶動力學，鑒別靶分子與靶分子的候補調(diào)切劑之間的特異性相互作用。更進一步的應(yīng)用包括描述細胞受體多樣性，鑒別已知的和新的病原體，為農(nóng)業(yè)、環(huán)境和治療目的研究多樣性。在某些實施方案中，本發(fā)明裝置和方法允許進行高通量單分子分析。單分子分析為研究生物學事件提供了幾個令人注目的優(yōu)于傳統(tǒng)方法的優(yōu)點。首先，這種分析提供單分子的信息，而該分子的特性隱藏在那些通過普通總體測量技術(shù)記錄的統(tǒng)計學平均信息中。另外，由于這種分析可以多路進行，它有助于高通量的完成，只需要少量試劑，利用高帶寬的光學系統(tǒng)如現(xiàn)代雪崩光敏二極管進行快速數(shù)據(jù)收集。此外，由于單分子計數(shù)自動產(chǎn)生一定程度的抗照射性和光收集波動，因此單分子分析在測量物質(zhì)量上比本體熒光或者光散射技術(shù)具有更高的準確度。這樣，單分子分析大大地提高了基因分型、基因表達模式分析、DNA測序、核苷酸多態(tài)性檢測、病原體檢測、蛋白質(zhì)表達模式分析和藥物篩選的效率和準確度。單分子測序本發(fā)明裝置，包括不同形式的光約束和聯(lián)合的光學系統(tǒng)，尤其適合多路單分子測序。因此，本發(fā)明提供了一種對多種耙核酸同時測序的方法。該方法一般包括(a)提供本發(fā)明光約束的陣列；(b)在約束中混合多種耙核酸分子、與靶核酸分子互補的引物、聚合酶和超過一種類型的將要摻入到多條與相應(yīng)靶核酸分子互補的新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸或核苷酸類似物；(c)使混合物在適合通過模板引導的聚合作用形成新生核苷酸鏈的條件下發(fā)生聚合反應(yīng)；(d)用入射光束照射波導；和(e)鑒別摻入到每條新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸或者核苷酸類似物。本發(fā)明測序方法可用于測定任何核酸分子的核酸，包括雙鏈或單鏈的、線性的或環(huán)狀的核酸(如環(huán)狀DNA)、單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)、DNA/RNA雜合體、具有聚合酶識別位點的RNA或RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法適用于復雜核酸結(jié)構(gòu)的測序，如5，或3，非翻譯序列、串聯(lián)重復片段、外顯子或內(nèi)含子、染色體片段、整個染色體或者基因組。一方面，對核酸單分子確定在聚合反應(yīng)期間加入石威基的時間順序。這個確定步驟發(fā)生時在光約束中發(fā)生模板引導的引物延長或者聚合反應(yīng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，單分子測序在均相測定中進行，不需要在每個堿基添加事件后轉(zhuǎn)移、分離或洗去任何反應(yīng)物或副產(chǎn)物(如從核苦酸上切下的焚光團)。在均相測定法的某些方面，單分子測序的進行無需在讀耳又下一個堿基序列之前向混合物中加入反應(yīng)物。在這個測定中，逐步加入核苷酸或者在每個堿基添加事件后除去副產(chǎn)物都不是必需的，因為光約束上大量試劑的反應(yīng)物的擴散不會干擾摻入的檢測。序列信息隨著聚合酶不斷將合適的核苷酸或者核普酸類似物加入到新生DNA鏈中而不斷地產(chǎn)生。關(guān)于這種單分子測序的詳細論述參見如公開的美國專利申請第2003/0044781號，此處引用全部作為參考，M丄Levene，J.Korlach，SW.Turner,M.Foquet,H.G.Craighead,W.W.Webb,SCIENCE299:682-686,2003.1,Zero-ModeWaveguidesforSingle-MoleculeAnalysisatHighConcentrations(用于高濃度單分子分析的零模波導)。沒有同步化損耗，因為個單分子被分別觀測。該方法也能使直接來自生物樣品的耙核酸分子得到利用，使能夠進行測序之前對靶核酸的克隆、亞克隆或擴增的需要最小化。在一個優(yōu)選的實施方案中，將聚合酶錨定在光約束內(nèi)的有效觀測體積內(nèi)。在觀測該體積的同時，利用例如用于脫保護等的，能夠無中斷地連續(xù)摻入生長鏈內(nèi)的標記核苷酸類似物，進行依賴模板的互補鏈合成。在優(yōu)選的方面，在該方法中使用如下的核苷酸類似物，其在非摻入的磷酸基或衍生物如核苷酸多聚磷酸的P、y、5等上帶有標記，該標記在摻入過程中從該類似物上切下。這種核普酸類似物的優(yōu)點在于能夠連續(xù)摻入到生成生長核酸鏈中，并且在摻入過程中除去它們的標記基團，從而不增大合成過程中的信號噪音，而如果這些標記物仍然與合成鏈結(jié)合，則將會導致這種增大的信號噪音。另外，由于摻入事件導致觀測體積內(nèi)標記類似物的存在延長(與7見測體積內(nèi)非4參入的類似物的隨機擴散相比)，與摻入有關(guān)的信號是很容易識別的。在特別優(yōu)選的方面，單分子核酸測序應(yīng)用使用一種模板核酸，從而對特定目標序列段的串聯(lián)重復序列進行多次或反復的讀取/合成。特別地，本發(fā)明系統(tǒng)一般用多種方法提供豐余性，以校正用聚合酶在模板依賴的合成中可能產(chǎn)生的任何錯誤。例如，由于本發(fā)明方法集中在單分子上，采用豐余過程確保由聚合酶引起的錯摻事件在數(shù)據(jù)分析時被校正。第一方面，這種豐余性通過利用多種不同的應(yīng)用于特定目標序列的約束陣列來提供，如在多孔板的一個孔中。除了這種豐余性之外，本發(fā)明也提供在一個約束中對特定序列段(或者它的拷貝)多次反復測序。在第一優(yōu)選方面，這樣的反復測序可能通過以環(huán)狀模板形式提供目標序列段來完成，因此聚合酶在環(huán)形模板周圍多次處理(允許說明這種模板的序列)。核苷酸片段環(huán)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，依據(jù)本發(fā)明能夠容易地應(yīng)用于模板序列。另一方面，通過利用具有目標序列段的模板依賴的環(huán)狀模板獲得類似的結(jié)果。尤其是這種合成產(chǎn)物一般包括一條線性鏈、環(huán)狀模板的多個拷貝，并且，提供目標序列段的反復測序。更進一步地說，豐余性是通過環(huán)化這種線性、多拷貝模板并對多拷貝多次反復測序而完成的。另一方面，通過連環(huán)化以單分子擴增策略產(chǎn)生的擴增子獲得類似的結(jié)果，基中一些策略是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些策略可以利用稀釋達到單分子水平，或者在擴增過程中在雙相乳液中從小微嚢中分離出分子。連環(huán)化的鏈隨后作為單個模板被測序，以這種方式從單分子產(chǎn)生豐余信息。在另一方面，通過利用一個長的在沿著它的多個位置處有切口和/或缺口的雙鏈模板獲得類似的結(jié)果。這個分子然后能在沿著鏈的幾個位點處開始單分子測序，每個位點包含一個能獨立對鏈測序的約束。因為有幾個約束作用于相同的鏈，結(jié)果就是相同的模板被測序若干次從而得到來自一個單分子的豐余信息。示例性的實驗裝置在實施本發(fā)明的測序方法中，將包含靶核酸、與靶核酸互補的引物、聚合酶和一種以上類型的核普酸或者核苷酸類似物的反應(yīng)混合物加到光約束陣列上。優(yōu)選地每個光約束只接收一個待測序的靶核酸分子。它可以通過在大量包含測序過程需要的其他反應(yīng)物的溶液中稀釋微量靶核酸來完成。可替代的，其開口的側(cè)向尺寸比底部窄的非圓柱形波導可以用于限制多種靶核酸的進入。靶核酸或聚合酶在光約束上的固定可以通過許多方法^^靶核酸固定在光約束的內(nèi)面。例如，通過附著(1)引物或(2)單鏈靶核酸或(3)雙鏈或者部分雙鏈靶核酸分子，可以將靶核酸固定在光約束上。此后，或是(l)耙核酸分子與附著的寡核苷酸引物雜交，(2)寡核香酸引物與固定化的耙核酸分子雜交形成引物靶核酸分子復合物，或者(3)在雙鏈或部分雙鏈靶核酸上產(chǎn)生聚合酶識別位點(例如，通過諸如引發(fā)酶的輔助蛋白的相互作用)。引物靶核酸分子復合物上的核酸聚合酶在適合沿著耙核酸分子移動并且在聚合位點處使寡核苦酸引物延長的位置上提供。在優(yōu)選的方面，如先前所描述的那樣，聚合酶首先附著到本光約束的表面上該約束的有效觀測體積內(nèi)，在適合耙核酸分子復合物相對于聚合酶移動的位置處。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多方法可以使核酸和酶固定在光約束上，不論是共價的還是非共價的，通過連接部分或者將它們限定到一個固定的部分。這些方法是固相合成和微陣列領(lǐng)域眾所周知的(Beier等，NucleicAcidsRes.27:1970-1-977(1999))。用于將核酸或聚合酶連接到固體載體上的結(jié)合部分的非限制性例子包括鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素連接、氨基曱酸酯鍵、酯鍵、酰胺、硫脂、(N)-官能化的硫脲、官能化的順丁烯二酰亞胺、氨基、二疏化物、酰胺、腙鍵等等。特異性結(jié)合靶核酸或聚合酶的抗體也可以作為結(jié)合部分。另外，利用本領(lǐng)域公知的方法曱硅烷基部分可以使核酸直接連接到諸如玻璃的基板上。我們所期望的是，聚合酶可以經(jīng)過修飾包含一個或多個表位如Myc、HA(來自流感病毒血凝素)、多組氨酸和/或FLAG,它們的特異性抗體可以在商業(yè)上獲得。另外，聚合酶經(jīng)修飾可包含異源結(jié)構(gòu)域如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、特異性結(jié)合肽區(qū)(參見例如，美國專利5,723,584,5,874,239和5,932,433)或者免疫球蛋白的Fc部分。上述區(qū)域各自的結(jié)合劑即谷胱甘肽、麥芽糖和抗免疫球蛋白Fc部分的抗體是可以獲得的，并且可以用于涂覆本發(fā)明的光約束的表面。采用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)化學技術(shù)可以將它們固定的聚合酶或核酸的結(jié)合部分或試劑加至載體上。一般來說，這些操作包括載體的標準化學表面修飾，載體在不同溫度水平及在包含結(jié)合部分或試劑的不同介質(zhì)中的溫育，以及隨后可能的洗滌和清潔步驟。反應(yīng)混合物標記的核苦酸、聚合酶和引物根據(jù)單分子測序法利用的各種類型的核普酸與可檢測標記物偶聯(lián)，以便于光子探測器能夠檢測和辨別它們在本發(fā)明光約束中的存在。優(yōu)選的標記物是發(fā)光標記物，尤其是焚光標記物或生色標記物。在本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)了許多種在核苷酸中作為可檢測標記物使用的官能團。表1列舉了很多這種官能團的例子。其余的例子參見美國專利第6,399,335號、公布的美國專利申請第2003/0124576號，以及名為"熒光4罙針和標記4支術(shù)(AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies)，第十版，，(2005)的手冊(可從Invitrogen,Inc.,/MolecularProbes獲得)，均在此處引用作為參考。表1可檢測標記官能團示例4-氨基苯酚6-氨基萘酚4-賄基苯酚6-硝基萘酚4-曱基酚6-氯萘酚4-甲氧基酚6-溴萘酚4-氯苯酚6-硤萘酚.4-溴苯酚4，4'-二羥基聯(lián)苯基4-石典苯酚8-羥基查啉4-硝基萘酚3-羥基吡咬4-氨基萘酚7-羥基香豆素4-曱基萘酚9-羥基異吩p塞唑4-曱氧基萘酚8-羥基芘4-氯萘酚9-羥基蒽4-溴萘酚6-硝基-9-羥基蒽4-硪萘酚3-羥基黃酮6-曱基萘酚螢光素6-曱氧基萘酚3-羥基苯并黃酮利用這些或者其他本領(lǐng)域公知的合適的官能團，可以產(chǎn)生適合本測序方法的多種熒光團。它們包括但不限于4-乙酰胺基-4，-異硫氰酸芪-2,2，-二磺酸、吖啶及其衍生物如吖啶和吖啶異硫氰酸酯、5-(2，-氨乙基)氨基萘-l-磺酸(EDANS)、4-氨基-氮-[3-乙烯砜基/苯基]萘酰亞胺-3,5-二磺酸脂(熒光黃VS)、N-(4-苯胺基-l-萘基)順丁烯二酰亞胺、鄰氨基苯甲酸、亮黃、香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆?jié)M151);焰紅染料(cyanosine);4，，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI);5，，5"-二溴鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7-二乙氨基-3-(4，-異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸；4，4，-二異硫氰酸二氫-芪-2，2，-二磺酸；4，4，-二異硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4-(4，-二曱氨基苯偶氮基)苯曱酸(DABCYL);4-二甲氨基苯偶氮基苯基-4，-異硫氰酸酯(DABITC);曙紅及其衍生物如曙紅異硫氰酸酯；赤蘚紅及其衍生物如赤蘚紅B及赤蘚紅異硫氰酸酯；乙啡啶；熒光素及其衍生物如5-羧基焚光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(DTAF)、2，，7，-二甲氧基-4，,5，-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)和QFITC(XRITC);熒光胺；IR144;IR1446;異碌u氰酸孔雀綠；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅；B-藻紅蛋白；鄰苯二醛；芘及其衍生物如芘、芘丁酸酯及琥珀酰亞氨基-l-芘丁酸酯；活性紅4(Cibacron.RTM.亮紅3B-A);羅丹明及其衍生物如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B、磺酰氯羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺酰羅丹明B、磺酰羅丹明101和磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N,N,N，，N，-四曱基-6-羧基羅丹明(TAMRA);四曱基羅丹明；四曱基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC);核黃素；玫紅酸和鋱螯合衍生物。其他能應(yīng)用于本發(fā)明測序方法的熒光團在美國專利第5,866,366號和WO01/16375中公開，這兩項在此處引用作為參考。標記物可以連接到磷酸主鏈的44基、核糖單位或其組合上。優(yōu)選的標記物是基本上不會妨礙在測序反應(yīng)中連續(xù)添加核苷酸的那些。這樣的標記物包括與a磷酸、p磷酸、末端磷酸、或者在四、五或六磷酸核苷酸中的5或更遠端磷酸、或者核苷酸的堿基單位連接的那些。包含標記末端磷酸(如dNTP中的y磷酸)的核苷酸是特別優(yōu)選的，因為在測序過程中不需要其他的方法來除去標記物。在核酸聚合過程中，核苷酸的a和(3磷酸之間發(fā)生鍵斷裂，導致|3和末端磷酸(如dNTP的Y磷酸)從聚合位點釋放出來。這樣，核苷酸一旦摻入，連接到末端磷酸上的標記物就從新生鏈上分離出來。一般而言，末端磷酸連接的核苷酸可能包含三個或者更多磷酸，一般是大約3到6個磷酸，優(yōu)選大約3到大約5個磷酸。表1列舉了許多帶有標記末端磷酸的核香酸的例子。已經(jīng)開發(fā)了其他許多末端磷酸連接的核苷酸，并且在美國專利申請第2003/0124576號中有詳述，此處引用作為參考。表2腺苷-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸鳥苷_5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸胞苷-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸胸苷_5，_(Y-4-硝基苯基)三磷酸尿嘧啶-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸3，-疊氮基-3，-脫氧胸苷-5，-(y-4-硝基苯基)三磷酸3，-疊氮基-2，，3，-二脫氧胸苷-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸2，，3，-二脫氫-2，,3，-二脫氧胸苷-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸腺苷-5，-(丫-4-氨基苯基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-甲基苯基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-曱氧基苯基)三磷酸腺苷-5，-(y-4-氯苯基)三磷酸腺苷-5，-(y-4-溴苯基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-硤苯基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-硝基萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-氨基萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-甲基萘基)三磷酸腺苷_5，_(Y-4-甲氧基萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-氯萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-溴萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-4-碘萘基)三磷酸腺苷-5，-(Y-6-曱基萘基)三磷酸腺苷-5'-(，6-曱氧基萘基)三磷酸腺苷-5'-(Y-6-氨基萘基)三磷酸腺苷-5'-(Y-6-硝基萘基)三磷酸腺苷-5'-(，6-氯萘基)三磷酸腺苷-5'-(6-溴萘基)三磷酸腺苷-5'-(Y-6-碘萘基)三磷酸腺苷-5'-(Y-4，-羥基聯(lián)苯基)三磷酸腺苷-5'-(Y-8-喹啉基)三磷酸腺苷-5'-(Y-3-吡啶基)三磷酸腺苷-5'-(Y-傘形酮)三磷酸腺苷-5，-(Y-試卣靈)三磷酸腺苦-5，畫(Y-芘)三磷酸腺苷-5，-(Y畫蒽)三磷酸腺苷-5，-(Y_6—硝基蒽)三磷酸腺普-5,-(Y-黃酮基)三磷酸腺苷陽5，-(y-熒光素)三磷酸腺苷-5,畫(Y-苯并黃酮)三磷酸腺苷-5，-(Y_(4-硝基苯基)-Y-(4-氨基苯基)三磷酸腺苷-5，-(Y—(4-硝基苯基)個(4-硝基萘基)三磷酸也可以使用包含修飾的磷酸主鏈的核苷酸。例如，修飾成分可以磷酰二胺、曱基膦酸酯、烷基磷酸三酯、甲酰縮醛(formacetal)、二硫代磷酸酯、一硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、氨基磷酸酯或它們的類似物。在一些實施方案中，用于本發(fā)明的核苷酸或核苷酸類似物是包含可逆阻斷基的可逆延伸終止子。在一些實施方案中，可逆延伸終止子上的可逆阻斷基與可檢測標記物相連接。在其他實施方案中，阻斷基和可4全測標記物位于核普酸上的不同位點。還有一些實施方案中，阻斷基本身也是標記物。一個用作說明的可逆延伸終止子包含3，端的標記核糖單位。在核糖單位上的每一個標記物一般充當可逆阻斷基，在聚合反應(yīng)時下一個核苷酸加入事件發(fā)生前必須被除去。優(yōu)選的3，-核糖標記物包含暴露在適當波長的光束下能夠被脫保護的光致除去的官能團。在另外一個實例中，可逆阻斷基位于核苷酸核糖單位的2，或4，位置處。然而在另外一些實施方案中，可逆阻斷基是與核苷酸的堿基(腺噤呤、胸腺嘧啶、胞嗜啶、鳥噪呤或尿嘧啶)相連接或結(jié)合的?？赡孀钄嗷?，尤其是光致切割阻斷基的非限制性例子包括但不限于那些圖14和圖15所示的及序列號為60/649,009的未決的申請中描述的分子，該申請在此處引用作為參考。用于切割光致切割阻斷基的波長依賴于阻斷基的選擇。波長可能在大約320nm到大約800nm之間。在一些實施方案中，用于切割阻斷基的波長與用來檢測標記物的波長差不多相同。在另一些實施方案中，用于切割阻斷基的波長與用來檢測標記物的波長是不同的。在一些實施方案中，使用基本上不含未標記核香酸的標記核香酸混合物是有利的。這種混合物及其在測序中的應(yīng)用在序列號為60/651,846的未決的申請中有詳述，該申請在此處引用作為參考。簡要地說，這種混合物的制備是通過用特異性修飾未標記或錯誤標記的核苷酸或核苷酸類似物的試劑處理包含標記和未標記的核苷酸或核苷酸類似物的混合物，來降低它們用于雜交和測序分析中的能力。優(yōu)選地，使用的試劑特異性地修飾未標記或錯誤標記的核苷酸類似物，使這些核苷酸類似物不能用于雜交或測序分析。例如，核香酸可以被修飾，使其不再含有在雜交或模板引導的測序試驗中WatsonCrick堿基配對通常所需要的結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，核苷酸或核苷酸類似物的磷酸基尤其是末端磷酸基被修飾，生成在模板引導的聚合反應(yīng)過程中較低程度地摻入新生核酸鏈內(nèi)的分子。在更優(yōu)選的實施方案中，核苷酸或核苷酸類似物的末端磷酸基被修飾，生成在模板引導的聚合反應(yīng)過程中不能或是基本上不能摻入新生核酸鏈內(nèi)的分子。試劑可以包括一種或多種酶。本領(lǐng)域公知的許多種酶適合用于修飾核苷酸或核苷酸類似物，如通過切割或改變糖、堿基或磷酸基的構(gòu)型來破壞特定的WatsonCrick堿基配對?？勺鳛槭纠脑噭┌ǖ遣幌抻邙B嘌呤或腺嘌呤P-核糖基轉(zhuǎn)移酶、噪呤核苷-粦酸化酶、AMP核苷酶、嘌呤的核苷脫氧核糖基轉(zhuǎn)移酶、乳清酸P-核糖基轉(zhuǎn)移酶、胸苷磷酸化酶、胸苷或尿苷核苷酶、尿香磷酸化酶、嘧咬核苦磷酸化酶、核苷脫氧核糖基轉(zhuǎn)移酶。適用于修飾核苷酸或核苷酸類似物的末端磷酸基的酶包括多種磷酸酶。這種酶的一個例子是能夠除去脫氧核苷三磷酸(dNTP)的y和P磷酸的蝦堿性磷酸酶(SAP)。這種酶可以將特異性未標記的dNTP轉(zhuǎn)化成一般在模板引導的測序反應(yīng)中不能被聚合酶利用的一磷酸核苷dNMP。據(jù)顯示這種磷酸酶能夠選擇性地修飾未被標記的核苷酸，如在末端磷酸處。因此，在末端磷酸標記和未標記的核苷酸混合物中，SAP將優(yōu)先作用于未標記的核苷酸，留下大部分的標記核苷酸用于在測序反應(yīng)中4參入。其他可用的適合的磷酸酶包括但是不限于小牛小腸堿性磷酸酶和/或其他哺乳動物、曱殼類動物和其他動物的磷酸酶。對實施本發(fā)明有用的磷酸酶的例子在US20040203097、US20040157306、US20040132155和US20040110180中可以找到。任何其他的天然發(fā)生或合成的磷酸酶或是通過重組DNA技術(shù)制備的磷酸酶，只要它們特異性地或優(yōu)先地使未標記的核苷酸或類似物(與標記的核苷酸相比而言)轉(zhuǎn)化成基本上不能被聚合酶利用的分子，也都是可以使用的。定向分子進化也可用于提高和擴大相關(guān)酶的活性，以產(chǎn)生上述期望的性質(zhì)。許多種芯片(/ww7z'cow)和原位誘變技術(shù)都可用于本領(lǐng)域。產(chǎn)生這種酶的誘變和篩選實驗的一個例子包括用未標記的核苷酸廢除系統(tǒng)內(nèi)聚合反應(yīng)的第一項試驗，和檢查在標記核苷酸存在下聚合活性的保留的第二項篩選。這兩種篩選可以在高度多路傳送平行測定中進行。顯示出某些有益特異性的酶可以保留，用一些方法突變，然后再次篩選。諸如這些的方法已經(jīng)在特異性和表現(xiàn)上產(chǎn)生了相當大的改善。也可以使用能夠選擇性或優(yōu)先修飾一部分未標記的核苷酸的酶。例如，肌酸激酶能夠特異性切除三磷酸腺苷上的磷酸，但是不作用于其他堿基。其他的選擇性或優(yōu)先作用于一種或多種類型的未標記核苷酸的酶同樣可以使用。上述核苦酸修飾酶可用于預(yù)處理核苷酸或核苷酸類似物，或用在雜交和/或測序反應(yīng)混合物中，例如，同其他雜交或測序試劑一起。核苷酸修飾發(fā)生的反應(yīng)條件隨著修飾酶的選擇而不同。一方面，條件可按照下列參數(shù)設(shè)定pH值介于4.0和12.0之間，更優(yōu)選pH6.0-10.0、更優(yōu)選7.0~9.0、更優(yōu)選小于8、更優(yōu)選7~8，最優(yōu)選pH7.5~8.5，優(yōu)選用緩沖液控制。緩沖液可以是基于Tris的，優(yōu)選pH7.5至pH8.5。其他可用的緩沖液如下但不〗義限于有才幾緩沖液如MOPS、HEPES、TRICINE等，或者無機緩沖劑如磷酸鹽或醋酸鹽。可以添加緩沖液或其他試劑控制溶液的pH值從而提高酶的穩(wěn)定性。期望時，可以加入還原劑例如但是不限于二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇來限制可能不利地影響酶穩(wěn)定性的酶的氧化。特定反應(yīng)條件包括各種緩沖液和pH條件的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，因此在此處不再-洋細i兌明。在預(yù)處理完成后，可以通過使反應(yīng)溫度升高到至少約65°C，優(yōu)選約65。C-約80。C來對酶進行熱滅活?？晒┻x4奪地，可以通過采用如透過具有小于酶大小的分子量截止值的濾器(如Millipore)離心，而從反應(yīng)混合物中除去酶。處理之后，混合物一般含有低于約30%,優(yōu)選低于約20%,更優(yōu)選低于約10%、更優(yōu)選低于約5%、更優(yōu)選低于約1%、更優(yōu)選低于約0.5%或者更優(yōu)選低于約0.1%,甚至更優(yōu)選低于約0.01%的未標記的核苷酸或未標記的核苷酸類似物。這種富集的標記核苷酸或核香酸類似物的混合物對在單分子測序反應(yīng)中標記核普酸的高分辨率檢測特別有用。重要的是，前述處理的結(jié)果是一種用于核酸合成的方法，優(yōu)選為了基本只利用核苷酸來說明模板序列，例如用核苷酸類似物特別是標記的類似物基本上完全取代天然核苷酸。這種在測序操作中基本只存在核苷酸類似物尤其是標記的類似物，也被稱為基本完全取代的模板依賴性合成，與以前描述的測序方法有很大不同，以前的方法是將一個核苷酸置換為其余三個天然核苷酸中的一個標記的鏈終止核苷酸，或者每次只用一個類似物探詢聚合酶模板合成物，以確定這種類似物是否捧入。用于本發(fā)明測序方法的另一種類型的適宜核苷酸允許通過熒光共振能量傳遞(FRET)檢測。在FRET中，受激發(fā)的熒光團(供體)以依賴于距離的方式把它激發(fā)態(tài)的能量傳遞給光吸收分子(受體)。限制能量可以傳遞的距離能夠使人看出標記分子和緊密靠近的物質(zhì)的相互作用。這種類型的核苷酸可能包含連接在堿基、核糖或優(yōu)選磷酸主鏈(例如，連接在末端磷酸上)上的供體焚光團，和連接在堿基、核糖或磷酸主鏈上所述供體不會連接之處的受體熒光團。在一個優(yōu)選的實施方案中，供體熒光團連接在末端磷酸上，受體熒光團連接到核苷酸的堿基或核糖單位上。一旦這種類型的核苷酸摻入新生鏈中，即可以檢測到熒光信號，這可能由不再被猝滅的多聚磷酸的釋放而引起。通過測定在聚合反應(yīng)過程中摻入互補核苷酸后釋放的焚光多聚磷酸的順序，人們可以推斷出靶核酸的堿基序列。這種類型的核普酸的其他例子在美國申請20030194740中公開，此處引用作為參考。在另一種實施方案中，供體熒光團可以存在于核苷酸中，而受體存在于聚合酶中，或反之亦然。需要時，焚光團可由綠色焚光蛋白(GFP)或其突變體提供，該突變體具有與野生型綠色焚光蛋白不同的發(fā)射和/或吸收光譜。例如在399nm處激發(fā)并在511nm處發(fā)射的GFP突變體H9-40(Tsien等人，Ann.Rev.Biochem.67:509(1998))可作為熒光團供體與BODIPY、熒光素、羅丹明綠和俄勒岡綠合用。此外，四甲基羅丹明、麗絲胺TM、德克薩斯紅和萘熒光素可作為該GFP突變體的受體熒光團。其它能夠進行熒光團能量轉(zhuǎn)移的代表性供體和受體包括但不限于4-乙酰胺基-4，-異硫氰酸芪-2，2，-二磺酸;吖啶及其衍生物吖咬、吖啶異硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-l-磺酸(EDANS);4-氨基-N-〖3-乙烯基磺酰)苯基]萘亞胺-3，5-二磺酸；N-(4-苯胺基-l-萘基)馬來酰亞胺；鄰氨基苯曱酰胺；BODIPY;亮黃；香豆素及其衍生物香豆素、7-氨基-4-曱基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆?jié)M151);花青染料；焰紅染料；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI);5',5"-二溴鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7-二乙基氨基_3-(4'-異硫氰酸苯基)4-甲基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸；4,4'-二異硫氰酸二氫-芪-2，-2'-二磺酸；4，4'-二異硫氰酸芪-2，-2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-l-磺酰氯(DNS,丹酰氯)；4-二曱基氨基苯基偶氮苯基_4'-異硫氰酸酯(DABITC);曙紅及其衍生物曙紅、曙紅異硫氰酸酯；赤蘚紅及其衍生物赤蘚紅B、赤蘚紅異硫氰酸酯；乙啡啶；熒光素及其衍生物5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三溱-2-基)氨基-熒光素(DTAF)、2'，7，-二曱氧基-4，5，-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸焚光素、OFITC、(XRITC);熒光胺；IR144;IR1446;孔雀綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；鄰曱酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅；B-藻紅蛋白；鄰苯二醛；芘及其衍生物芘、芘丁酸酯、琥珀酰亞氨基-l-芘丁酸酯；丁酸酯量子點；活性紅4(Cibacron.TM.亮紅3B-A);羅丹明及其衍生物6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B、磺酰氯羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺酰羅丹明B、磺酰羅丹明101、磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N,N，N，，N，-四曱基-6-羧基羅丹明(TAMRA);四曱基羅丹明；四曱基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC);核黃素；玫紅酸；鋱螯合衍化物；Cy3;Cy5;Cy5.5;Cy7;IRD700;IRD800;拉霍亞藍(LaJollaBlue);酞菁；萘酞菁。在替代構(gòu)型中，每一核苷酸類似物上都存在供體和受體熒光團，其中供體發(fā)出基本均一的激發(fā)光譜，但是給予受體能量，受體發(fā)出對于每一類型的類似物如A、T、G或C而言不同的發(fā)射光譜。這種構(gòu)型能將單一激發(fā)源用于多種不同的發(fā)射譜，降低所用系統(tǒng)的能量輸入需求。此外，口占噸染料，包括熒光素和羅丹明染料，可作為供體和受體對。這些染料中有許多在苯基部分上含有修飾的取代基，可用作同核苷酸的末端磷酸或堿基鍵合的位點。需要時，可以使用充當猝滅劑能夠猝滅多種波長的焚光的受體。這些猝滅劑的代表性的例子包括4-(4'-二曱基氨基苯基偶氮基)-苯曱酸(DABCYL)、二硝基苯(DNP)和三硝基苯(TNP)。適用于本發(fā)明的聚合酶可以是任何能夠以合理的合成保真度催化模板引導的聚合的核酸聚合酶。聚合酶可以是DNA聚合酶或RNA聚合酶，野生型或修飾型熱穩(wěn)定聚合酶或熱降解聚合酶。適用的熱穩(wěn)定聚合酶包括來自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)、Thermuscaldophilus、絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis)、熱堅芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophus)、嗜熱芽孑包才于菌(Thermusthermophilus)、；^夭氏火J求菌(Pyrococcuswoesei)、5敫到、火J求菌(Pyrococcusfuriosus)、Thermococcuslitoralis牙口》每棲熱^包菌(Thermotogamaritime)的聚合酶。適用的熱降解聚合酶包括大腸桿菌DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶。能用于測定核苷酸序列分子序列的其它聚合酶的例子包括大腸^干菌T7，T3,SP6RNA聚合酶和AMV，M-MLV和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。聚合酶能夠結(jié)合引物單鏈核酸處的引物靶核酸序列，復制起點，雙鏈核酸中的切口或缺口，單鏈核酸中的二級結(jié)構(gòu)，輔助蛋白生成的結(jié)合位點，或引物單鏈核酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，在添加非常規(guī)或修飾后的核苦酸例如同熒光團連接的核苷酸方面，聚合酶顯示出比野生型酶更高的效率。重組DNA技術(shù)可用于修飾野生型酶。此類技術(shù)一般包括表達載體或表達載體庫的構(gòu)建，在發(fā)生表達的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細胞。通過使用任一常規(guī)測序方法以及此處公開的測序方法能夠選擇能夠添加非常規(guī)或修飾后的核苦酸的聚合酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，用表現(xiàn)出高度持續(xù)合成能力的聚合酶進行測序，該能力即通過保持穩(wěn)定的核酸/酶復合物合成長核酸段力。加工聚合酶一般可以合成一條大約10000堿基對的新鏈。在輔助酶(例如解旋酶/引發(fā)酶)的幫助下，一些加工聚合酶甚至可以合成超過50,000的堿基對。例如，與解旋酶/引發(fā)酶復合的T7DNA聚合酶可以合成幾百個kb的核苷酸，同時還保持了與靶核酸.的穩(wěn)定的復合物(Kelman等人，"ProcessivityofDNAPolymerases:TwoMechanisms,OneGoal(DNA聚合酶的持續(xù)合成能力兩種機制，同一目標)，，Structure6:121-125(1998))。在另一優(yōu)選實施方案中，測序用能夠滾環(huán)復制的聚合酶進行，即能夠復制環(huán)狀DNA模板，包括但不僅限于質(zhì)粒和噬菌體DNA。優(yōu)選的滾環(huán)聚合酶表現(xiàn)出鍵置換活性，而且優(yōu)選具有降低的或基本上沒有5，至3'外切核酸酶活性。鍵置換引起環(huán)狀DNA模板的串聯(lián)拷貝的合成，/人而可以對同一DNA才莫板進4亍再測序一次以上。對同一DNA模板的再測序大大增加了聚合酶所產(chǎn)生的任何錯誤的檢出機會，因為聚合酶不太可能重復發(fā)生同一個錯誤，而且在聚合酶鏈反應(yīng)中，同一個錯誤肯定不會指數(shù)擴增。適用于本發(fā)明的滾環(huán)聚合酶的非限制性實例包括但不僅限于，T5DNA聚合酶(Chatterjee等人，Gene97:13-19(1991)),T4DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5:149-157(1995)),謹菌體M2DNA聚合酶(Matsumoto等人，Gene84:247(1989))，嗟菌體PRDIDNA聚合酶(Jung等人，Proc.Natl.Aced.Sci.USA84:8287(1987)，和Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219:267-276(1994))，DNA聚合酶IKlenow片段(Jacobsen等人，Eur.J.Biochem.45:623-627(1974))。優(yōu)選的一類滾環(huán)聚合酶利用蛋白質(zhì)引發(fā)作為開始復制的途徑。該類別中示例性的聚合酶是經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的DNA聚合酶，選自或來源于噬菌體0>29、PRD1、Cp-l、Cp-5、Cp-7、015、0>1、<D21、025、BS32L17、PZE、PZA、Nf、M2Y(或M2)、PR4、PR5、PR722、B103、SF5、GA-1,及短尾病毒科中的有關(guān)成員。特別的是，野生型噬菌體029基因組由19,285個堿基對的線形雙鏈DNA(ds-DNA)組成，其末端蛋白(TP)同每一5，端共價連接。為了開始復制，組蛋白樣病毒蛋白質(zhì)同復制起點形成核蛋白復合物，這樣可能促成DNA兩末端的雙螺旋解螺旋(Serrano等人，EMBOJournal16(9):2519-2527(1997))。DNA聚合酶催化第一dAMP向TP提供的羥基上的添加。此蛋白質(zhì)引發(fā)的事件的發(fā)生同模板中的第二3'核苷酸相反，并且起始產(chǎn)物(TP-dAMP)滑回DNA中的某一位置以恢復末端核普酸。起始后，同一DNA聚合酶復制DNA鏈中的一條，而同時置換另一條。029DNA聚合酶的高持續(xù)合成能力和鏈置換能力使其有可能在沒有解旋酶或輔助持續(xù)性因子的情況下完成含有0)29TP的基因組(TP-DNA)的復制(綜述見Serrano等人，EMBOJournal16(9):2519-2527(1997))。5，至3'外切核酸酶活性降低的修飾的0>29DNA聚合酶也已經(jīng)描述(美國專利5,198,543和5,001，050，此處引入)。這些聚合酶作為5'至3'外切核酸酶用于測序是特別理想的，如果過量存在，可以降解正在合成的新生鏈。利用多種輔助蛋白質(zhì)可以加強鏈置換。輔助蛋白質(zhì)包括但不僅限于解旋酶(Siegel等人，J.Biol，Chem.267:13629-13635(1992))、單純皰滲病毒蛋白質(zhì)ICP8(Skaliter和Lehman，Proc.Natl，Acad.Sci.USA91(22):10665-10669(1994))、單鏈DNA結(jié)合蛋白(Rigler和Romano,J.Biol.Chem.270:8910-8919(1995))、腺病毒DNA結(jié)合蛋白(Zijderveld和vanderVliet,J.Virology68(2):1158-1164(1994))和BMRF1聚合酶輔助亞基(Ts腦mi等人，J.Virology67(12):7648畫7653(1993))。在一優(yōu)選的實施方案中，測序反應(yīng)涉及鏈置換聚合酶和環(huán)狀輩巴DNA的單一復合物，其固定于光約束上。混合標記的核香酸或核香酸類似物和引物之后，鏈置換聚合酶引導新鏈的合成，并記錄各種類型的標記核苷酸或核苷酸類似物摻入新鏈的時序。需要時，鏈置換聚合酶可以合成靶DNA的多個串聯(lián)重復，從而實現(xiàn)同一環(huán)狀DNA耙標的多次重測序。優(yōu)選地記錄核苷酸或核苦酸類似物摻入耙DNA分子的至少兩個串聯(lián)重復，更優(yōu)選至少大約3個至大約10個或至少大約3個至大約IOO個串聯(lián)重復，優(yōu)選不超過大約IOO萬個串聯(lián)重復的時序。這種多輪的或豐余的測序可在等溫條件和/或室溫下進行。使用本發(fā)明的方法，可以以每秒至少一個堿基的速度進行測序，優(yōu)選至少每秒10個堿基，更優(yōu)選至少每秒100個堿基。據(jù)報道，聚合酶在體內(nèi)每秒能夠聚合1,000個堿基，在體外每秒能夠聚合750個堿基(見，例如Kelman等人,"ProcessivityofDNAPolymerases:TwoMechanisms,OneGoal(DNA聚合酶持續(xù)合成能力兩種機制，同一目標)"Structure6:121-125(1998);Carter等人，"TheRoleofExonucleaseandBetaProteinofPhageLambdainGeneticRecombination.II.SubstrateSpecificityandtheModeofActionofLambdaExonuclease(遺傳重組中外切核酸酶和喧菌體K的卩蛋白的作用.II.X核酸外切酶的底物特異性和作用方式)"J.Biol.Chem.246:2502-2512(1971);Tabor等人，"EscherichiacoliThioredoxinConfersProcessivityontheDNAPolymeraseActivityoftheGene5ProteinofBacteri叩hageT7(大腸桿菌硫氧還蛋白使噬菌體T7基因5蛋白的DNA聚合酶活性具有持續(xù)合成能力)，，J.Biol.Chem.262:16212-16223(1987);和Kovall等人，"ToroidalStructureofLambda-Exonuclease(X核酸外切酶的環(huán)型結(jié)構(gòu))"Science277:1824-1827(1997),在此引入作為參考)。反應(yīng)條件本發(fā)明的測序過程可在利用聚合酶能夠進行模板引導的聚合的任何條件下進行。一方面，將聚合酶的底物，即測序反應(yīng)中存在的不同類型的核苷酸，調(diào)整至生理學相關(guān)濃度。例如，測序反應(yīng)中使用的核苷酸以大約為聚合酶米氏常數(shù)的濃度存在。這一濃度一般從大約1微摩爾到大約50微摩爾或大約100微摩爾。測序過程同樣可以通過使用少于4個的標記物來實現(xiàn)。使用3個標記物，序列可通過核酸鏈測序推斷，(1)如果可以檢測第4種堿基，則作為其他標記物信號之間的恒定暗時間延遲(darktimedelay),或者(2)明確地通過對兩條核酸鏈測序，因為此種情況下，可以從每一堿基對獲取正焚光信號。使用兩種標記物的另外一種可能的方案是將一種堿基用一種熒光團標記，將另外三種堿基有另外一種熒光團標記。此種情況下，其它的三種堿基無法給出序列，而僅僅給出在用該另外一種熒光團標識的特定堿基之間產(chǎn)生的大量堿基。通過在不同的測序反應(yīng)中通過不同堿基循環(huán)這種標識焚光團，可由連續(xù)的測序過程推斷出整個序列。充分利用這個僅使用2種標記物的方案，通過每一測序過程僅使用兩種標記的堿基，甚至有可能獲得完整的序列。測序過程可在等溫條件下、在室溫或循環(huán)變溫加熱條件下進行。緩沖液、pH等等的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，因此此處不加以詳述。檢測本發(fā)明的測序法需要限制在光約束中的單(獨)分子的成像。使用當某一特定類型的核苷酸摻入新鏈中時發(fā)出可辨別的光信號的熒光團標記聚合酶和/或核香酸。隨著核苷酸持續(xù)加到光約束內(nèi)的新鏈中，檢測可辨別信號的順序。在一個優(yōu)選實施方案中，在每一個核苷酸加入事件后無需轉(zhuǎn)運、分離或洗脫任何反應(yīng)物或副產(chǎn)物(例如從核苷酸上切下的熒光團)，即可進行這種檢測。在該優(yōu)選實施方案的一個方面，在讀取下一個即將摻入的堿基序列核苷酸之前無需向混合物中添加反應(yīng)物即可實現(xiàn)序列的測定。通過光學系統(tǒng)的協(xié)助進行限制在本發(fā)明的光約束內(nèi)的單分子的成像。此系統(tǒng)一般包括至少兩個單元，即激發(fā)源和光子探測器。眾多有關(guān)這些單元的例子在上面已有表述。在一個優(yōu)選的實施方案中，激發(fā)源是激光，優(yōu)選偏振激光。激光的選擇取決于連接到不同類型核普酸和/或聚合酶上的焚光團。對于大多數(shù)熒光化合物而言，其所需的激發(fā)光范圍為大約300nm至大約700nm之間。對于蛋白質(zhì)性質(zhì)的焚光團而言，如綠色熒光蛋白及其突變體，激發(fā)波長的范圍可以是大約488nm至大約404nm之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實驗應(yīng)當知道或者能夠確定激發(fā)特定熒光團的適當?shù)募ぐl(fā)波長(參見，例如TheHandbook-'AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies,第十版(2005)(可從Invitrogen,Inc./MolecularProbes獲得)，此處引用作為參考)。選擇激發(fā)源的另一個考慮是選擇熒光的單光子激發(fā)還是多光子激發(fā)。多光子激發(fā)同檢測配合使用，也被稱為多光子顯微術(shù)("MPM")，能夠提供較高的靈敏度和空間分辨率。MPM是激光掃描顯微鏡的一種形式，它利用局部非線性激發(fā)來激發(fā)薄光柵掃描平面內(nèi)的熒光。同傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微術(shù)一樣，在MPM中，激光被聚焦，并且穿過樣品光柵掃描。影像由熒光強度測量矩陣組成，這種測量是在激光來回掃描樣品時通過將檢測器信號數(shù)字化而進行的。雙光子激發(fā)的概率是非常小的，而且聚焦增加了在焦點處的局部強度。雖然雙光子激發(fā)的熒光通常是MPM中的主要信號源，但三光子或更多光子激發(fā)的熒光和二次或三次諧波振蕩也可用于成像。參見，例如多光子顯微術(shù)的綜述，Webb等人.NatureBiotechnology(2003)21:(11)1251-1409。一種優(yōu)選的MPMi殳置包括MPM激光掃描顯樣K竟和二次諧波成1象，配備工作波長為約700nm-1000nm的飛秒鎖才莫(mode-lock)鈦藍寶石激光。此設(shè)置在常規(guī)成像多光子顯微鏡中能捕捉超過約100個光子/像素?？杀鎰e信號的順序也可以通過其它的光學系統(tǒng)進行檢測，這些系統(tǒng)包括諸如光閱讀器、高效光子探測系統(tǒng)、光倍增管、閘敏(gate-sensitive)FET、納米管FET、光敏二極管(例如雪崩光敏二極管(APD))、照相機、電荷耦合器件(CCD)、電子倍增電荷耦合器件(EMCCD)、增強型電荷耦合器件(ICCD)和共焦顯微鏡等部件。一個優(yōu)選的實施方案包括寬場CCD或ICCD及具有數(shù)字圖像處理能力的增強型電視成像顯微鏡，以及熒光光脫色恢復技術(shù)(FPR)和熒光相關(guān)光譜學(FCS)，同時具備共焦多光子能力和連續(xù)數(shù)據(jù)采集和控制。此設(shè)置還可包括用于準彈性光散射、激光DIC干涉測量、相關(guān)光譜學儀器操作、光學力顯微鏡檢查和時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)的模塊裝置。這些光學系統(tǒng)也可包括光傳輸組件，如衍射柵、陣列波導光柵(AWG)、光學纖維、光開關(guān)、平面鏡、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準直器。其它的一些實例包括光學衰減器、偏振濾光片(例如二向色濾光片)、波長濾波器(低通、帶通或高通)、波片及延遲線。在一些實施方案中，光傳輸組件可以是與光約束陣列光學連通的平面波導。本領(lǐng)域中已知的上述及其它的光學組件可以以多種方式組合和裝配，從而實現(xiàn)由測序反應(yīng)所發(fā)出的可辨別信號的4全測。優(yōu)選的裝置允許利用具有大量光約束的陣列進行平行數(shù)據(jù)收集，其中發(fā)生同時的和獨立的核苷酸測序。一方面，優(yōu)選的系統(tǒng)能夠收集和處理來自超過104、超過2xl04、或超過105、或超過2xl05、或優(yōu)選超過106、或優(yōu)選超過2xl06、更優(yōu)選超過107或2xl(^個光約束的信號。另一方面，優(yōu)選的設(shè)置可以每秒約1個堿基的速度實時監(jiān)測同時且獨立的核酸測序，優(yōu)選以每秒約10個堿基的速度，更優(yōu)選以每秒約100個;咸基的速度，更優(yōu)選以每秒1000個石咸基的速度。這樣，與快速測序反應(yīng)結(jié)合的群并行性可以提供超過100,000堿基/秒的總測序輸出?？倻y序輸出可擴大至至少1兆堿基/秒，優(yōu)選10兆堿基/秒或更高。進一步通過從多種不同序列片段中獲取數(shù)據(jù)，例如從2個或2個以上不同反應(yīng)體積中獲取數(shù)據(jù)，人們可以獲得獨立的序列，例如從基因組DNA的連續(xù)片段獲得，使其具有可直接應(yīng)用于基因組測序的高通量。其它的單分子應(yīng)用本發(fā)明的光約束和光約束陣列可應(yīng)用于期望進行單分子分析的其他許多化學和生物應(yīng)用中。一般來說，本發(fā)明的光約束適用于與任何試劑有關(guān)的任何單分子分析，該試劑可以附著在表面上，并且其底物可以被標記，包括酶、核酸、抗體、抗原等等。這些應(yīng)用包括鑒別與諸如蛋白質(zhì)、糖蛋白、核酸、類脂以及無機化學物質(zhì)或其任意組合的生物分子有關(guān)的相互作用。這些相互作用可能發(fā)生在核酸分子之間，核酸和蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)和小分子之間。長時間以來人們已經(jīng)認可與生物分子有關(guān)的相互作用的異?？山忉尨罅康募膊?，包括多種形式的癌癥、血管疾病、神經(jīng)元疾病和內(nèi)分泌疾病。現(xiàn)已知異常的相互作用，例如信號復合物的組成型激活和過早失活的形式，導致疾病細胞的異常行為。對于癌癥，兩種信號轉(zhuǎn)導分子，如生長因子受體及其相應(yīng)的配體之間異常的相互作用可能導致細胞過程的功能障礙，將最終導致生長失調(diào)、缺乏錨定抑制作用、基因組不穩(wěn)定性和/或細胞轉(zhuǎn)移傾向。生物學分子或化學分子之間特定的相互作用一般涉及一個正在研究的靶分子和能夠與該靶分子特異性相互作用的探針。在實施本發(fā)明的方法時，將靶分子和探針置于光約束中。靶分子-探針復合物可以是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物、糖蛋白-蛋白質(zhì)復合物(例如受體和配體復合物)、蛋白質(zhì)-核酸復合物(例如轉(zhuǎn)錄因子和核酸復合物)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復合物以及有機或無機小分子的復合物。優(yōu)選地，每個光約束僅含有一個研究中的靶分子。這可以如下實現(xiàn)通過在大量溶液中稀釋少量的靶分子，使得在約束陣列上的沉積導致初級分布，或者大多數(shù)約束將排列有單個靶分子?；蛘撸梢允褂梅菆A柱形波導，其中波導芯的開口其橫向尺寸要比底部窄，來限制多個標記蛋白的進入，同時允許大量較小的探針進入。利用任何適用于使上述聚合酶固定和沉積的方法可以將耙標或探針固定在光約束的內(nèi)面上。這些方法包括使用通過多種結(jié)合部分實現(xiàn)的共價和非共價連接。結(jié)合部分的選擇取決于靶標和/或探針的性質(zhì)。例如結(jié)合部分可通過合成與蛋白質(zhì)靶標或探針相連接，或者通過重組方法制備為融合基序或標簽。固定靶蛋白或蛋白質(zhì)探針的一種優(yōu)選方法包括使用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素結(jié)合對，以及上面提到的其它任何結(jié)合部分或結(jié)合因子。反應(yīng)條件取決于研究中的特定相互作用?？梢愿淖兎磻?yīng)溫度、反應(yīng)持續(xù)時間、緩沖液強度和靶標濃度或探針濃度。例如，為了測定探針同靶蛋白的結(jié)合親和力，可以改變探針濃度。為了確定靶標-探針復合物的熱穩(wěn)定性，可以改變反應(yīng)溫度。還可以通過改變pH或緩沖鹽濃度決定靶標-探針復合物的穩(wěn)定性。希望時，可以在生理學相關(guān)溫度和緩沖液條件下研究相互作用。生理學相關(guān)溫度的范圍從大約室溫到大約37。C。一種生理學緩沖液含有生理濃度的鹽，為中性pH,范圍為約6.5至約7.8，優(yōu)選約7.0至約7.5。為了鑒別特定靶標和探針之間的特定體外相互作用而調(diào)整反應(yīng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，在此不再詳述。靶標和/或探針一般用可檢測的標記物進行標記，使光子探測器可以探測到指示相互作用的信號。合適的標記物包括在"單分子測序，，部分提到的所有那些標記物。優(yōu)選的標記物是發(fā)光標記物，特別是熒光或發(fā)色標記物。在一個實施方案中，用熒光團標記靶標，在熒光團同相應(yīng)的結(jié)合有適當猝滅劑的探針發(fā)生相互作用時，熒光團的信號會猝滅。上述部分描述了多種合適的熒光團-猝滅劑對，因此不再詳述。這一實施方案的一種變化是用供體和受體熒光團標記靶標和探針(或反之亦然)，當兩個分子彼此結(jié)合時發(fā)出可辨別的信號。范圍較寬的適用的供體和受體熒光團在上面已有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道多種多樣的可檢測標記物以及他們的組合，用來產(chǎn)生指示生物學分子和/或化合物之間的特定相互作用的可辨別信號。在本文所述光學系統(tǒng)的幫助下完成對指示特定相互作用的可辨別信號的檢測。任何適用于單分子測序的系統(tǒng)同樣適用于檢測其它生物學分子和/或化合物之間的相互作用。一個優(yōu)選的系統(tǒng)允許利用具有大量光約束的陣列實現(xiàn)平行數(shù)據(jù)收集，在此系統(tǒng)中，可以發(fā)生同時且獨立的靶標-探針相互作用。一方面，優(yōu)選的系統(tǒng)可以從超過104個光約束、超過2xl0"個光約束、超過105個光約束、超過2xl()S個光約束、優(yōu)選超過106、或者優(yōu)選超過2xl(^個光約束、甚至更優(yōu)選超過107或2xl(^個光約束中收集和處理信號。上面提到的方法在檢測特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用是特別有意義的。這一應(yīng)用一般利用置于光約束中的蛋白質(zhì)探針和靶蛋白。在該實施方案的一方面，特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在細胞表面受體和它相應(yīng)的配體之間。細胞表面受體是錨定在或插入到細胞質(zhì)膜中的分子。他們組成了蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂質(zhì)的一個大家族，他們不但是作為質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)組成成分，還是控制多種生物學功能的調(diào)控元件。另一方面，特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用涉及細胞表面受體和免疫脂質(zhì)體或免疫毒素。又另一方面，特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用能夠涉及胞質(zhì)蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)，侶伴蛋白質(zhì)或錨定在其它細胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)。又另一方面，特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在輩巴蛋白質(zhì)(例如抗原)和該抗原的特異性抗體之間?？乖涂贵w之間的特異性相互作用已在免疫測定法中利用。本領(lǐng)域中有多種免疫測定法，但沒有一種可以進行單分子檢測。例如，常*見》丈射免疫測定法#全測免疫印跡上一組抗原和一組放射性標記的抗體之間的相互作用。另一種常^見免疫測定法^^皮稱為ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)，它利用抗原-特異性抗體以及與該特異性抗體結(jié)合的酶聯(lián)屬抗體。在加入連接的酶的底物后，顯示抗原和抗體之間的特異性相互作用。對免疫印跡再進行這種測定，為所有4妻受檢測的相互作用提供一個總體的測量。常>見免疫測定法不同，可以在單分子水平上分析抗原和抗體之間的特異性相互作用。盡管本發(fā)明中包括的所有光約束都適用于進行單分子免疫測定，但是一個特別理想的系統(tǒng)包括具有較高填充分數(shù)比的光約束陣列。例如，一個優(yōu)選系統(tǒng)包括填充分數(shù)大于0.0001，更優(yōu)選大于約0.001，更優(yōu)選大于約0.01,再更優(yōu)選大于0.1的波導陣列。在實施本發(fā)明的免疫測定的過程中，可用合適的標記物標記抗體，該標記物選自方t射性標記物、熒光標記物、化學發(fā)光標記物、酶標簽，如洋地黃毒苷、(3-牛乳糖苷酶、脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶、親和素/生物素復合物以及在此公開的任何可4企測標記物。本發(fā)明的免疫測定法可用于表征生物實體、篩選抗體治療劑和確定耙抗原的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。例如，已經(jīng)常規(guī)使用涉及生物實體特異性抗體抗體-實體復合物鑒定該實體。免疫測定法還可用于篩選具有治療潛能的能夠激活或下調(diào)靶抗原生物活性的抗體。通過利用能夠區(qū)分折疊為不同構(gòu)象的耙蛋白的抗獨特型抗體，免疫測定法也可用于確定結(jié)構(gòu)構(gòu)象。前面提到的單分子分析的另外一個重要的應(yīng)用是研究酶動力學，包括確定酶的轉(zhuǎn)化循環(huán)，動態(tài)行為，折疊和展開的中間體以及結(jié)合親和力。所研究的酶可以固定在光約束內(nèi)或者存在于在本發(fā)明的光約束內(nèi)限制的溶液中。本發(fā)明中包括的所有光約束可用于研究酶動力學。對特定光約束的選擇取決于所研究的具體特性。例如，測量酶促反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)(on-rate)優(yōu)選一種光約束，其包含非圓柱形芯，該芯在其上表面有一個開口，該開口要比在光約束的底部窄。這種結(jié)構(gòu)顯著地限制了反應(yīng)物或底物的擴散，因此增加了在觀測體積內(nèi)的平均滯留時間。另一方面，包含一個有開口的芯，而該開口的橫向尺寸比底部寬的光約束施加了進入結(jié)構(gòu)的立體或熵阻礙，因此對測定大酶或酶復合物的可達性是很有用的。本發(fā)明光約束在總體測量中的應(yīng)用本發(fā)明的光約束尤其可以用于進行單分子分析，該本發(fā)明光約束也適用于高通量的總體大量測量。因此，本發(fā)明提供了一種檢測多種分子之間相互作用的方法，包括將所述的緊密靠近的多種分子加入到零模波導陣列上，其中所述陣列中的每個波導都相隔一定的間距，該間距足以在應(yīng)用入射波長的光束照射所述陣列時產(chǎn)生可探測3ij的強度的多衍射級的衍射散射；應(yīng)用所述的入射波長照射所述的零模波導陣列；檢測所述多衍射級的所述入射波長的衍射散射的強度變化，由此檢測所述的多種分子之間的相互作用。用于該方法的陣列一般包括相對于入射波長而言遠距離間隔的光約束。這種相對于照射輻射(例如，半個波長的照射輻射)而言遠距離的光約束間隔對遠離鏡反射角的特定角度的入射光的衍射散射產(chǎn)生較大影響。在該實施方案的一方面，該陣列包括相隔一個以上入射輻射波長的各個約束，通常是入射波長的1.5倍以上，但通常不超過入射波長的150倍。具有相對于入射波長而言遠距離間隔的光約束的陣列也有預(yù)期的性質(zhì)。盡管依賴于角度的散射可能提高不利于某些特定用途的本底信號，但是它提供了一種尤其適用于表征光約束的大小和形狀的方法。它也能夠方便地進行分子相互作用的總體大量測量，尤其涉及未標記的分子。適用于該用途的陣列一般包括相隔一個以上入射輻射波長的各個約束，通常是入射波長的1.5倍以上，但通常不超過入射波長的150倍。一般借助于本文所述的光學系統(tǒng)進行總體大量測量。適用于單分子測序的任何方案同樣也適用于該分析。下面的實施例部分提供了關(guān)于制作本發(fā)明的光約束的進一步說明以及其在測序中的應(yīng)用。這些實施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了指南，并不意味著限制。實施例實施例1下面提供了一種示例性的制作零模波導的方法。在此描述的參數(shù)旨在舉例說明，而不是進行限制。1.基板基板進行兩次拋光，60/40劃痕/刺孔(scratch/dig)的表面質(zhì)量，熔融氧化硅晶片，切至直徑為100毫米(+/-0.2毫米)，并且厚度為175微米(+/-25微米)，總厚度的偏差小于25微米。2.清洗5份去離子水、1份30%v/v的過氧化氬水溶液、l份30%v/v的氫氧化銨水溶液的混合溶液在一個熱板上加熱至75°C。利用特氟綸容器或其他抗化學腐蝕的容器，將上述晶片浸入該混合溶液中15分鐘。3.沖洗將載有晶片的容器從RCA清洗浴中取出，浸入去離子水浴中。晶片放置在該第二浴中2分鐘。將仍然載有該晶片的容器從去該浴中取出，并用去離子水噴灑直至沖洗階段完成。4.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，仍然在該容器內(nèi)，使用干燥清潔的氮氣流進行干燥。5.氧等離子體處理將晶片裝入GlennlOOOp等離子灰化機中，使用等離子體蝕刻模式(晶片放在一個動力板(poweredshelf)上，另一個動力板下)、140m托的壓強、400瓦特的正向功率，40千赫的頻率。等離子體保持10分鐘。使用18sccm的分子氧流。6.蒸氣涂覆在氧等離子體處理后的3分鐘內(nèi)，將晶片放到Y(jié)ieldEngineeringSystems蒸氣涂覆爐中，涂覆一層六曱基二硅氮烷(HMDS)粘合增進劑。7.電子束抗蝕劑涂覆在蒸氣涂覆后的15分鐘內(nèi)，應(yīng)用NEB涂覆晶片。大約有3毫升涂覆在晶片上，然后以4500轉(zhuǎn)/分的速率旋轉(zhuǎn)60秒。初始加速和減速均設(shè)定為3秒。8.抗蝕劑烘烤將晶片放在115。C的CEE熱板上烘烤2分鐘。該熱板配有真空機構(gòu)，可以使晶片和熱板表面有良好的熱接觸。9.金蒸發(fā)然后將一層10nm的金熱蒸發(fā)到晶片上抗蝕劑涂覆的那一面。蒸發(fā)前，壓強必須達到低于2xl(rM乇。蒸發(fā)以大約2.5埃/秒的速率進行，并使用Inficon控制儀進4亍監(jiān)控。10.電子束曝光使用諸如LeicaVB6-HR的高分辨率電子束光刻工具將由零模波導組成的圖案在晶片上曝光。零模波導形成單個exel特征的圖案。在標稱l納安的電流、可變分辨單位為1、以及5納米的exel設(shè)置，劑量范圍可以是10000微庫倫/平方厘米-300000微庫倫/平方厘米。11，曝光后烘烤將晶片放置在同樣配備有真空機構(gòu)的95。C的熱板上，進行2分鐘的曝光后烘烤。12.金蝕刻移開電子束系統(tǒng)后，用金蝕刻劑TFA(GE8148，TranseneCorporation)在室溫下保持10秒鐘除去10納米的金層。將晶片放在與步驟2中使用的相似的特氟綸容器中。13.沖洗從金蝕刻劑浴中取出裝有晶片的容器，將其浸入去離子水浴中。晶片在該第二浴中放置2分鐘或更短的時間并輕輕手工攪拌。從去離子水浴中取出含有晶片的容器，并用去離子水噴灑直至徹底地完成沖洗過程?；蛘咭部梢詫⒀b有晶片的容器放入一個新的裝有新鮮去離子水的容器中。14.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮氣流在該容器內(nèi)進行晶片干燥。15.曝光后烘烤將晶片放置在同樣配備有真空機構(gòu)的95。C的熱板上，進行2分鐘的曝光后烘烤。16.顯影在室溫下，將仍然在抗化學腐蝕的容器中的晶片浸入顯影液MF畫321(ShipleyChemicals,Rohm-Haas)中，放置30秒。17.沖洗從顯影蝕刻劑浴中取出裝有晶片的容器，并浸入去離子水浴中。晶片在該第二浴中放置2分鐘并輕輕地攪拌。從去離子水浴取出含有晶片的容器，并用去離子水噴灑直至徹底地完成沖洗過程。18.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮氣流在該容器內(nèi)進行晶片干燥。19.表面清除將晶片裝入以灰化模式運行的Glenn1000p等離子體灰化才幾中(晶片放在一個底板(groundedplate)上，動力板下)，并以140毫《^的壓強、400瓦特的正向功率在40千赫下進^亍30秒的氧等離子體表面清除。使用18sccm的分子氧流。20.鋁蒸發(fā)在表面清除后的5分鐘內(nèi)將該晶片放入金屬蒸發(fā)器中。將一層1OOnm的熱蒸發(fā)的鋁沉積在該晶片上。蒸發(fā)在不小于2x1(T6托的壓強下以25埃/秒的速率進行，并使用Inficon控制器進行監(jiān)控。21.鋁厚度測量應(yīng)用P-IO表面光度儀(Tencor)測量鋁的厚度。22.零模波導剝離(decasting):通過將特氟綸容器或其他抗化學腐蝕的容器中的零模波導浸入1165剝離劑(ShipleyChemicals,Rohm-Haas)浴中或AZ-300T剝離劑(ShipleyChemicals,Rohm-Haas)浴中，將其從包覆的鋁膜上剝離。通過將裝有剝離劑和晶片的容器放入超聲波儀中，對其進行超聲處理。晶片在剝離浴中放置30分鐘或更長至大約45分鐘，并輕輕地攪拌。23.沖洗將剝離浴從超聲波儀中移開。從剝離浴中取出晶片，并浸入去離子水浴中。晶片在該第二浴中放置2分鐘并輕輕地手動攪拌。從去該浴中取出晶片，并用去離子水噴灑直至徹底地完成沖洗過程。24.干燥在最后沖洗的l分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮氣流在該容器內(nèi)進行晶片干燥。25.光致抗蝕劑涂覆以1500轉(zhuǎn)/分的速度用Shipley1827光致抗蝕劑旋轉(zhuǎn)涂覆晶片。涂覆約5毫升的抗蝕劑。加速和減速設(shè)定為5秒。26.抗蝕劑烘烤將晶片放在115。C的CEE熱板上烘烤15分鐘。該熱板配有真空機構(gòu)，可以使晶片和熱板表面有良好的熱接觸。27.切割使用K&S-7100切割機(Kulicke&Soffa)使用樹脂/金剛石刀片(ADT00777-1030-010-QIP600)對晶片進行切割。晶片在切割之前要放置到低粘性膠帶上。28.模具去除用手從膠帶上取下模具并儲存。29.抗蝕劑去除通過將模具首先浸入丙酮浴中l(wèi)分鐘，然后浸入2-丙醇浴中2分鐘并輕輕地手動攪拌，除去1827光致抗蝕劑層。30.模具干燥從2-丙醇浴中取出模具后，用干燥的清潔空氣進行干燥。31.等離子體清潔將晶片放入Drytek100等離子體蝕刻機中，并在140毫托的壓力、85sccm氧的分子氧流和500瓦特正向功率的射頻功率下以13兆赫進行1分鐘的氧等離子體處理?；蛘?，也可以在2托的壓力、10.5瓦特的功率下用Harrick等離子體清潔機PDC-32G進行5分鐘的干燥清潔空氣等離子體處理。實施例2單個DNA聚合酶分子酶促合成DNA鏈的實時監(jiān)測該實驗可以利用如下詳述的光學系統(tǒng)和反應(yīng)混合物進行。但是，提到任何具體的光學系統(tǒng)和參數(shù)、緩沖液、試劑、濃度、pH、溫度等并不是限制性的。其作為實施本發(fā)明的方法的一個示例性的實施例。使用熒光標記的核苷酸實時跟蹤單個DNA聚合酶分子酶促合成DNA鏈。應(yīng)用稀釋的酶溶液，通過非特異性結(jié)合，將單個的Phi29N62DDNA聚合酶(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)固定在零模波導(ZMWs)中。固定化后，清洗ZMW結(jié)構(gòu)除去未結(jié)合的酶，然后暴露于含有反應(yīng)試劑的溶液。并于DNA模板，使用一種70bp的預(yù)引發(fā)的環(huán)狀DNA序列，其以特;f正性的不對稱間距包含兩個鳥噪呤堿基(圖9A)。鏈置換聚合酶如Phi29DNA聚合酶將繼續(xù)環(huán)繞該環(huán)狀模板并因此產(chǎn)生一個長的、高度重復的互補DNA鏈。R110-dCTP(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)凈皮用作焚光標記的核苷酸類似物，其中熒光團通過一個與y磷酸連接的連接體連接到核苷酸上。與更為常用的堿基標記的核苷酸類似物相反，隨著連接的核苷酸摻入到不斷增長的DNA鏈內(nèi)，y磷酸連接的類似物可以通過DNA聚合酶的酶活4生切割，然后該標記自由地擴散到DNA聚合酶周圍的有效觀察體積之外。熒光團的有效去除確保持續(xù)較低的本底水平，并防止明顯干擾DNA聚合酶的活性。y磷酸連接的焚光團的這些特征可優(yōu)選用于該用途，因為他們能夠用熒光團標記的類似物替換所有四種堿基。核苷酸的結(jié)合及其后續(xù)向核酸內(nèi)的摻入與錯配事件不同，因為這兩個過程的速率常數(shù)明顯不同，并且核苷酸摻入包括幾個阻止零延遲事件的后續(xù)步驟。所有其他的核苷酸都不進行標記。我們已經(jīng)建立了一個非常有效的方法去除核苷酸類似物制劑中剩余的痕量的天然dNTP,通過在聚合試驗前使用堿性磷酸酶進行酶純化，以確保不會由于摻入未標記的dNTP而引入這些錯誤。為了研究這些條件下Phi29N62DDNA聚合酶的速率和持續(xù)合成能力，在溶液中并且使用固定在玻璃表面的酶，在反應(yīng)混合物中使用R110-dCTP完全替代dCTP測量摻入特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶能夠有效地利用這種類似物，合成幾千個堿基對長度的互補DNA，而在滾環(huán)合成方案中沒有中斷，使用兩個小的預(yù)形成的復制叉(圖9A)和較大的環(huán)狀DNA如M13DNA。只有兩個不對稱間隔的R110-dCTP被整合入該模板內(nèi)。相似的實驗表明DNA聚合酶可以被固定在ZMW底部，而不丟失其催化活性。通過記錄單個ZMW中發(fā)出的焚光爆發(fā)，跟蹤滾環(huán)DNA合成期間熒光標記的dCTP核苷酸的摻入。觀察多個波導中的DNA聚合酶活性，其為持續(xù)幾分鐘的不同的熒光爆發(fā)。熒光時間軌跡顯示特征性的雙爆發(fā)模式(圖9B)，每個爆發(fā)對應(yīng)于一個R110-dCTP類似物向DNA鏈內(nèi)的摻入事件和隨后焚光團的切割。在由全時軌跡得到的爆發(fā)間隔直方圖中，可見兩個峰，它們與沿短(14個堿基，約l秒)和長(54個堿基，約4秒)DNA模板片段的DNA合成相對應(yīng)，這與這些條件下在本體溶液中測量的總平均速度一致，即每秒約10個堿基對。值得注意的是，在10fim的熒光團濃度時，單分子活性較易觀察到。在常規(guī)產(chǎn)生的激發(fā)體積內(nèi)，熒光團的數(shù)量很大以至于不能觀察到DNA聚合酶的各個酶轉(zhuǎn)化。這些實驗通過證實以下幾點證實了基于ZMW的單分子DNA測序方法的有效性(a)ZMW中DNA聚合酶的固定化不影響其酶活性；(b)焚光y磷酸連接的核苷酸類似物不抑制DNA聚合酶的活性；(c)ZMW提供了一個適當?shù)募s束來檢測在試劑的生理學濃度下單分子DNA聚合酶的活性。一般來說，這些結(jié)果證明了ZMW允許進行酶動力學的單分子分析，尤其涉及任何能附著在表面上并且其底物可以被焚光標記的酶。實施例3應(yīng)用多種不同標記的核苷酸的實時測序使用兩種不同的標記核苷酸類似物進行與以上實施例2所述相似的實驗。該實驗可以利用如下詳述的光學裝置或系統(tǒng)以及反應(yīng)混合物進行。但是，提到任何具體的光學裝置和參數(shù)、緩沖液、試劑、濃度、pH、溫度等并非限制性的。其作為實施本發(fā)明的方法的一個示例性的實施例。制備反應(yīng)樣品在一個測序反應(yīng)中使用大約10pl的反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物通常含有0.5-1mM的MnCl2、0.1-1pM的DNA模板、10的dATP、10pM的dAGP、lO^M的SAP處理過的Alexa488-dC4P、10|iM的SAP處理過的Alexa568-dT4P以及DNA聚合酶。標記的dC4P和dT4P也可以用標記的dA4P和dG4P代替。制備零模波導在聚合反應(yīng)之前，零模波導一般要在等離子體清洗機中再生。將覆蓋ZMW的PDMS墊圈放置在波導上方，蓋住每個光約束。添加一份不含DNA聚合酶的上述反應(yīng)混合物而不接觸波導表面。檢測擴散背景。如果背景(即ZMW發(fā)出的熒光爆發(fā))較低并且可以接受，就可將DNA聚合酶加至ZMW，并將其固定在上面。固定混合物一般含有0.5至1mM的MnCl2、0.1-1pM的模板、15nM的DNA聚合酶，在25mMTris-HCL，pH7.5以及10mM(3-巰基乙醇的緩沖液中。在約(TC溫育約15分鐘后，可以將聚合酶吸附于ZMW表面。然后去除固定反應(yīng)混合物，替換成上述反應(yīng)混合物。使用一種配備有適宜激光例如Ar/Kr激光的顯微鏡系統(tǒng)，其包括用于同時收集和檢測來自多個不同波導的信號以及用于分辨存在的A488和568熒光團的光學裝置。該系統(tǒng)包括一個物鏡和一系列用于從反射的激發(fā)光中分離發(fā)出的熒光的二向色/缺口關(guān)閉的(notch-off)濾光器。發(fā)出的信號經(jīng)過一個楔形濾光片，將每一種熒光團的信號組分在空間上分開，并將每個信號在EMCCD照相機上成像。聚合酶活性檢測將ZMW放置于顯微鏡下。開啟透射照明光后，使用照像機在需要的時間內(nèi)，例如2分鐘或更長的時間，監(jiān)測聚合反應(yīng)。數(shù)據(jù)被自動傳輸?shù)接嬎銠C上，該計算機存儲并跟蹤ZMW中每個反應(yīng)的熒光爆發(fā)。一種環(huán)狀DNA根據(jù)上述的操作過程進行測序，該DNA有一段重復的A堿基之后是一段G堿基，或者具有一系列重復的A-G堿基。圖16顯示了一個代表性的熒光爆發(fā)譜，其對應(yīng)于標記核苷酸的每個摻入事件，表明用一種以上類型的標記核苷酸已經(jīng)實現(xiàn)了實時單分子測序。來自多個不同重復和多個不同波導的脈沖數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析建立了對標記堿基摻入的依賴于序列的實時檢測。盡管為了舉例說明而進行了詳細描述，但是應(yīng)當指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或了解的許多變化可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)實施。本文中提到的所有公開的參考文獻和專利文件都完整引入作為參考。權(quán)利要求1.一種裝置，包括在基板上的密度大于每平方毫米4×104個約束的光約束陣列，其中所述光約束適合容納生物學試劑，并且所述光約束提供有效的觀測體積以允許觀測所述生物學試劑中存在的單分子；和與所述光約束可操作地連接的光學系統(tǒng)，其用來檢測來自所述約束的有效觀測體積的信號。2.如權(quán)利要求l所述的裝置，其中所述密度超過每平方毫米105個約束。3.如權(quán)利要求1或2所述的裝置，其中所述光約束容納一種生物學試劑。4.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述生物學試劑包括酶。5.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述生物學試劑還包括所述酶的底物，所述酶的底物以大約為所述酶對于所述底物的米氏常數(shù)(Km)的濃度存在。6.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中所述濃度高于約1微摩爾。7.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中所述濃度高于約50微摩爾。8.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中所述底物是經(jīng)過標記的。9.如權(quán)利要求5所述的裝置，其中所迷單分子是所述生物學試劑中含有所述酶與底物之間反應(yīng)的產(chǎn)物。10.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述單分子是DNA/聚合酶復合物。11.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述單分子應(yīng)是選自核酸、多肽及其組合的生物分子。12.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述單分子是有機或無機化合物。13.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中至少一個單個約束與所述陣列中至少一個另外的光約束之間的間隔不超過約1000納米。14.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述陣列中的所述光約束彼此之間相互間隔約200納米到約1000納米。15.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述陣列包含至少大約2xl05個光約束。16.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述陣列包含至少大約107個光約束。17.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述單分子被可檢測標記所標記。18.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述可檢測標記選自焚光標記、化學發(fā)光標記和放射性標記。19.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述光約束由多孔膜制成。20.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中在所述陣列中的每個單個約束是與傳輸入射光的光傳輸組件可操作地連接。21.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述光學系統(tǒng)還包括光子探測器。22.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述光約束是包括圍繞芯的包層的波導，其中所述包層阻止了大部分波長大于截止波長的入射光穿過所述芯的傳播。23.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述波導阻止了90%以上24.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述波導阻止了99%以上的波長大于截止波長的入射光穿過所述芯的傳播。25.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述包層包括片層，和一個或多個穿過所述片層延伸的孔，其中每一個孔都構(gòu)成了芯。26.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述芯是圓柱形的。27.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述芯是非圓柱形的。28.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述包層包括金屬合金。29.如權(quán)利要求28所述的裝置，其中所述合金是鋁合金。30.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述每個單個約束提供小于約1000仄升的有效觀測體積。31.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述每個單個約束提供小于約80仄升的有效觀測體積。32.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述每個單個約束提供小于約IO仄升的有效觀測體積。33.—種試劑盒，包括權(quán)利要求3所述的光約束的陣列以及所述陣列的使用說明書。34.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中在所述陣列中的多個所述光約束的每一個都容納靶核酸和聚合酶的單個復合物，并且一種以上類型的標記過的核苷酸或核苷酸類似物以約1fiM到約50iuM的濃度存在。35.如權(quán)利要求34所述的裝置，其中所述光約束是零模波導。36.—種檢測生物學分析物的方法，包括光學地捕獲在光約束內(nèi)的分析物，這種光約束是如下產(chǎn)生的(a)提供一個光約束陣列，其在基板上的密度大于每平方毫米4xl04個約束，其中所述光約束提供了允許觀測單分子的有效觀測體積；和任選的與該光約束可操作連接的光學系統(tǒng)，其用來檢測來自所述約束的有效觀測體積的信號；并且(b)以入射光束照射至少一個在陣列中的、疑為包含分析物的光約束，以此^r測該分析物。37.—種進行由多個反應(yīng)樣品參與的多種化學反應(yīng)的方法，包括(a)提供權(quán)利要求1所述的光約束陣列；(b)將包含標記的反應(yīng)物的多種反應(yīng)樣品放入陣列中的光約束內(nèi)，其中將單獨的反應(yīng)樣品放入陣列中不同的約束內(nèi)；(c)將該陣列置于適于形成化學反應(yīng)產(chǎn)物的條件之下；并且(d)利用所述光學系統(tǒng)檢測產(chǎn)物的形成。38.—種對多個靶核酸分子進行測序的方法，包括(a)提供一個光約束陣列，其在基板上的密度大于每平方毫米4xl04個約束，積；和與該光約束可操作連接的光學系統(tǒng)，其檢測來自所述約束的有效觀測體積的信號；(b)在光約束中混合多個靶核酸分子、與靶核酸分子互補的引物、聚合酶以及將要摻入多個新生核普酸鏈內(nèi)的一種以上類型的核苷酸及核苷酸類似物，每一條鏈都與相應(yīng)的靶核酸分子互補。(c)將上述步驟(b)中的混合物置于適于通過模板引導的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成新生核苷酸鏈的條件下，進行聚合反應(yīng)；(d)利用一束入射光照射光約束；并且(e)鑒定摻入每一條新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸或核苷酸類似物。39.如權(quán)利要求1-32和34-35中任意一項所述的裝置在檢測生物學試劑中存在的單分子中的用途。40.—種裝置，包括位于固體載體上的波導陣列，所述陣列有大于約0.0001的填充分數(shù)，所述波導適于容納生物試劑，并且其中所述波導提供了允許觀測在所述生物試劑中存在的單分子的有效觀測體積；和與所述波導可操作連接的光學系統(tǒng)，其檢測來自所述波導的有效觀測體積的信號。41.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述陣列的填充分數(shù)大于約0.001。42.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述陣列的填充分數(shù)大于約0.01。43.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述陣列的填充分數(shù)大于約0.1。44.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述陣列的填充分數(shù)在約0.001與0.1的范圍之間。45.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述生物學試劑包括一種酶，所述酶的底物以大約為所述酶對于所述底物的米氏常數(shù)(Km)的濃度存在。46.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中所述濃度高于約1微摩爾。47.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中所述濃度高于約50微摩爾。48.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中所述濃度高于約IOO微摩爾。49.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中所述底物是經(jīng)過標記的。50.如權(quán)利要求45所述的裝置，其中所述單分子是由所述酶與所述生物試劑中包含的所述底物之間反應(yīng)的產(chǎn)物。51.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述單分子是DNA/聚合酶復合物。52.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述單分子是選自核酸、多肽及其組合的生物分子。53.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述單分子是有機或無機化合物。54.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述單分子是經(jīng)可檢測標t己所才示^己的。55.如權(quán)利要求54所述的裝置，其中所述可檢測標記選自焚光標記、化學發(fā)光標記和放射性標記。56.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述波導是由多孔膜制成的。57.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述波導與傳輸入射光束的光傳輸組件可操作地連接。58.如權(quán)利要求57所述的裝置，其中所述光傳輸組件包括選自微透鏡、納米透鏡、陣列波導光柵、光開關(guān)、光導纖維、光學衰減器、人造偏振濾光鏡、波片以及延遲線的組件。59.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述光學系統(tǒng)另外還包括一個光子探測器。60.如權(quán)利要求59所述的裝置，其中所述光子探測器選自光閱讀器、高效光子探測系統(tǒng)、光敏二極管、照相機、電荷耦合器件、電子倍增電荷耦合器件、增強型電荷耦合器件。61.如權(quán)利要求40所述的裝置，其阻止了大部分波長大于截止波長的入射電磁能的傳播。62.如權(quán)利要求61中所述的裝置，其中所述陣列的單個波導包括圍繞芯的包層，并且其中所述單獨的波導阻止了90%以上的波長大于截止波長的入射電磁能穿過所述芯的傳播。63.如權(quán)利要求61所述的裝置，其中所述陣列的單獨的波導包括環(huán)繞芯的包層，并且其中所述單獨的波導阻止了99%以上的波長大于截止波長的入射電磁能穿過所述芯的傳播。64.如權(quán)利要求62所述的裝置，其中所述陣列單獨的波導的每一個包括環(huán)繞芯的包層，并且其中所述單獨的波導阻止了90%以上的波長大于截止波長的入射電磁能穿過所述芯的傳播。65.如權(quán)利要求61所述的裝置，其中所述包層包括片層，和通過所述片層延伸的一個或多個孔，其中每一個孔都構(gòu)成了一個單獨的波導的芯。66.如權(quán)利要求61所述的裝置，其中所述陣列的單獨的波導包括環(huán)繞圓柱形芯的包層。67.如權(quán)利要求61所述的裝置，其中所述陣列的單獨的波導包括環(huán)繞非圓柱形芯的包層。68.如權(quán)利要求61所述的裝置，其中所述包層含有金屬合金。69.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述每個單獨的波導提供小于1000仄升的有效觀測體積。70.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述每個單獨的波導提供小于80仄升的有效觀測體積。71.如權(quán)利要求40所述的裝置，其中所述每個單獨的波導提供小于80仄升的有效觀測體積。72.—種試劑盒，包括權(quán)利要求40所述的波導陣列，以及用于所述陣列的使用說明書。73.—種檢測生物學分析物的方法，包括光學地捕荻在光約束內(nèi)的分析物，這種光約束是如下產(chǎn)生的(a)提供一個填充分數(shù)大于約0.0001的波導陣列；和(b)應(yīng)用入射光束照射陣列內(nèi)至少一個疑為包含分析物的波導，如此;f企測該分析物。74.—種進行由多個反應(yīng)樣品參與的多種化學反應(yīng)的方法，包括:(a)提供一個填充分數(shù)大于0.0001的波導陣列；(b)將包含經(jīng)過標記的反應(yīng)物的多種反應(yīng)樣品放入陣列中的光約束內(nèi)，其中將分別的反應(yīng)樣品放入陣列中不同的約束內(nèi)；(c)將陣列置于適于形成化學反應(yīng)產(chǎn)物的條件之下；并且(d)利用所述光學系統(tǒng)檢測產(chǎn)物的形成。75.—種對多個靶核酸分子進行測序的方法，包括(a)提供一個填充分數(shù)大于約0.0001的波導陣列；(b)在光約束中混合多個靶核酸分子、與靶核酸分子互補的引物、聚合酶以及將摻入多個新生核苷酸鏈的一種以上類型的核苷酸及核苷酸類似物，每一條鏈都與相應(yīng)的靶核酸分子互補。(c)將上述步驟(b)中的混合物置于適于通過模板引導的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成新生核普酸鏈的條件下進行聚合反應(yīng)；(d)利用入射光束照射光約束；并且(e)鑒定摻入每一條新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸或核苷酸類似物。76.如權(quán)利要求1-31任一項所述的裝置在檢測生物學試劑中存在的單分子中的用途。77.—種核苷酸測序的方法，包括使靶核苷酸分子進行模板引導的聚合反應(yīng)，在多種類型的核苷酸或核苷酸類似物和顯示鏈置換活性的聚合酶的存在下，產(chǎn)生與靶核苷酸分子互補的新生核酸鏈；以及記錄核苷酸或核苷酸類似物摻入新生核苷酸鏈中的時序。78.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述靶核酸分子是一種環(huán)狀核酸。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述靶核酸分子是一種環(huán)狀DNA。80.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述模板引導的聚合反應(yīng)多次處理靶核酸分子中相同的核苷酸序列。81.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述靶核酸分子包括在靶核酸分子內(nèi)多次存在的核苦酸序列。82.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸的依賴于模板復制的產(chǎn)物。83.如權(quán)利要求77所述的方法，其中利用聚合酶對所述靶核酸分子測序一次以上。84.如權(quán)利要求77所述的方法，其中利用聚合酶對所述把核酸分子測序兩次以上。85.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述核苷酸或核苦酸類似物還包4舌一個標記。86.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述標記在核苷酸或核香酸類似物的堿基、糖部分、ot磷酸鹽或p磷酸鹽處連接到所述核苷酸或核苷酸類似物上。87.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述標記在末端磷酸鹽處連接到核苦酸或核苦酸類似物上。88.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述標記在核苷酸或核香酸類似物的末端磷酸鹽上，包括選自一磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、四磷酸鹽、五磷酸鹽和六磷酸鹽的磷酸鹽部分。89.如權(quán)利要求77所述的方法，其中各類核苷酸或核苷酸類似物都有在所述記錄步驟過程中區(qū)分彼此的標記。90.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述標記是熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體或受體。91.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述粑核酸分子附著到載體上。92.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述耙核酸分子與附著到載體上的引物雜交。93.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述聚合酶附著到載體上。94.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述記錄是在模板引導的聚合反應(yīng)發(fā)生時進行的。95.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述記錄步驟包括鑒定在所述多種類型的核苷酸或核苷酸類似物中提供的核苷酸或核苷酸類4以物。96.如權(quán)利要求77所述的方法，其中模板引導的聚合反應(yīng)在一個光約束中發(fā)生。97.如權(quán)利要求77所述的方法，其中模板引導的聚合反應(yīng)在一個光約束陣列中發(fā)生。98.如權(quán)利要求77所述的方法，其中模板引導的聚合反應(yīng)在一個零模波導中發(fā)生。99.如權(quán)利要求77所述的方法，其中靶核酸分子和聚合酶形成了在一個光約束中固定化的單個復合物。100.如權(quán)利要求97所述的方法，其中光約束陣列的填充分數(shù)大于約0,0001。101.如權(quán)利要求97所述的方法，其中光約束陣列在基板上的密度超過4xl04約束/平方毫米。102.如權(quán)利要求97所述的方法，其中光約束陣列在基板上的密度超過105約束/平方毫米。103.—種具有表面的固體載體，其中該表面附有一個聚合酶陣列，其中該陣列的成員包括具有鏈置換活性的、可以被單獨和光學分辨的聚合酶。104.如權(quán)利要求103所述的固體栽體，其中陣列內(nèi)至少一個單個聚合酶與一種靶核酸相連，由該靶核酸通過聚合酶引起的模板引導的聚合作用可以生成新生鏈。105.如權(quán)利要求103所述的固體載體，其中每個單獨的且光學可分辨的聚合酶被分別限制在光約束中。106.如權(quán)利要求105所述的固體載體，其中所述約束是一個零模波導。107.—種零模波導，包括固定在其中的第一分子復合物，所述分子復合物包括與耙核酸復合的聚合酶，其中該聚合酶通過依賴于模板的把核酸復制多次處理所述輩巴核酸內(nèi)的核苷酸序列。108.如權(quán)利要求107所述的零模波導，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸。109.如權(quán)利要求107所述的零模波導，其中所述靶核酸包括多次存在于靶核酸內(nèi)的核苷酸序列。110.如權(quán)利要求108所述的零模波導，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸。111.如權(quán)利要求108所述的零模波導，其中所述耙核酸序列包括線性核酸。112.—種構(gòu)建包含環(huán)繞芯的包層的光約束的方法，包括(a)提供涂覆有光致抗蝕劑層的基板；(b)使所述光致抗蝕劑層形成圖案，以限定所述芯的邊界；(c)除去圍繞所述限定的邊界的所述光致抗蝕劑層，使足量的光致抗蝕劑仍然占據(jù)所述芯；(d)將一層包層材料沉積在所述剩余的光致抗蝕劑和基板上；(e)除去沉積在所述剩余的光致抗蝕劑上的至少一部分所述包層材料；并且(f)除去步驟()中的所述光致抗蝕劑，形成被所述光約束的所述包層圍繞的所述芯。113，如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述包層由半導體制成。114.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述包層由合金制成。115.如權(quán)利要求114所述的方法，其中所述合金是鋁合金。116.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述鋁合金含有多于0.0001%的雜質(zhì)。117.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述包層涂覆有涂層材料。118.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述芯是圓柱形的。119.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述芯是非圓柱形的。120.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述光約束阻止了大部分波長大于截止波長的入射光穿過所述芯的傳播。121.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述光約束阻止了90%122.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述光約束阻止了99%以上的波長大于截止波長的入射光穿過所述芯的傳播。全文摘要本發(fā)明涉及光約束，其制備方法，和使用光約束來分析分子和/或監(jiān)控化學反應(yīng)的方法。本發(fā)明包括的裝置和方法在高通量和低成本單分子分析中特別有用。文檔編號H05H3/04GK101199241SQ200580031483公開日2008年6月11日申請日期2005年9月16日優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日發(fā)明者J·科爾拉赫,S·特納申請人:加利福尼亞太平洋生命科學公司