專利名稱:Na/K-ATP 酶配體、毒毛花苷G 拮抗劑及其測試方法和用途的制作方法
Na/K-ATP酶配體、毒毛花苷G拮抗劑及其測試方法和用途
發(fā)明人:Zi-Jian Xie, Shuyi Si, Zhongbing Zhang, Joseph I. Shapiro
與相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2009年9月16日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/243，036的權(quán)益，通過援引將其公開內(nèi)容并入本文。
有關(guān)聯(lián)邦贊助研究的聲明
本發(fā)明通過政府支持而進(jìn)行，由此政府根據(jù)National Institutes ofHealth (NIH)GM78565, HL366573 和 2007DFA31370 對本發(fā)明具有權(quán)益。
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域：
和工業(yè)應(yīng)用
本發(fā)明涉及Na/K-ATP酶配體及其用途。本發(fā)明也涉及用于篩選物質(zhì)的Na/K-ATP酶激動劑和/或拮抗劑活性的方法和試劑盒以及用通過本文描述的篩選方法鑒定的物質(zhì)來治療或預(yù)防疾病或障礙的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
Na/K-ATP酶，也稱為鈉泵，是通過水解ATP將Na+和K+跨過質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)钠毡榇嬖诘目缒っ?。其屬于P-類型ATP酶家族，其在泵循環(huán)期間在El和E2構(gòu)象狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。該功能酶主要由α和β亞單位構(gòu)成。α亞單位是全酶的催化組分，原因是其同時(shí)含有核苷酸和陽離子結(jié)合位點(diǎn)。有趣地，在過去數(shù)年期間的研究揭示了 Na/K-ATP酶的許多非泵功能比如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。特別是，信號傳導(dǎo)Na/K-ATP酶位于細(xì)胞質(zhì)膜微囊并與許多信號傳導(dǎo)蛋白比如Src、IP3受體和小窩蛋白-1相互作用。在Na/K-ATP酶與IP3受體之間的相互作用促進(jìn)Ca2+信號傳導(dǎo)，同時(shí)在Na/K-ATP酶與Src之間的動力學(xué)關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞Src活性并且使得強(qiáng)心類固醇(cardiotonic steroids)可能刺激蛋白激酶級聯(lián)。
強(qiáng)心類固醇(CTQ包括植物來源的洋地黃藥物比如地高辛和毒毛花苷G，和脊椎動物來源的苷配基比如蟾毒靈和內(nèi)源性海蟾蜍毒素(marinobufagenin) (MBG)。
盡管CTS自其發(fā)現(xiàn)以來僅被視為藥物，最近的研究指出毒毛花苷G和MBG是內(nèi)源性類固醇，其產(chǎn)生和分泌受包括血管緊張素II和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的多種刺激物所調(diào)節(jié)。在已鑒定并表征的循環(huán)CTS中，毒毛花苷G研究得最多。此外，在高鹽載量、慢性腎衰竭(CRF)和充血性心力衰竭(CHF)的臨床條件下，CTS濃度顯著增加。臨床上，能夠用洋地黃藥物來治療充血性心力衰竭，原因是它們對心臟具有確切記載的變力性效果。
臨床上，這些類固醇能夠用來治療充血性心力衰竭，原因是因?yàn)樗鼈儗π呐K具有確切記載的變力性效果。已知的是，Na/K-ATP酶充當(dāng)這些類固醇的受體。在CTS與Na/K-ATP酶的結(jié)合抑制泵功能的同時(shí)，其刺激Na/K-ATP酶的信號傳導(dǎo)功能。例如，毒毛花苷G與Na/K-ATP酶/Src受體復(fù)合物的結(jié)合刺激Src激酶。經(jīng)活化的Src又反式-活化受體酪氨酸激酶類比如EGF受體(EGFR)且轉(zhuǎn)化酪氨酸激酶信號以刺激絲氨酸/蘇氨酸激酶類、脂質(zhì)激酶類和脂酶以及增加的活性氧類別(R0Q產(chǎn)生。有趣的是，雖然CTS對Na/K-ATP酶的抑制對于這些藥物增加心臟收縮功能是必需的，但蛋白激酶的刺激和隨后通過這些類固醇產(chǎn)生的ROS增加也在動物研究中導(dǎo)致心臟肥大和纖維化。[0012]共同發(fā)明人中的幾位現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)〃 Na+/K+_ATP酶配體〃，其公開于2008年7月 31日提交的未決申請美國序列號12/087,976中(要求2007年1月30日提交的PCT/ US07/002365的優(yōu)先權(quán)(公開號WO 2007/089688, 2007年8月9日)，并且要求2006年1 月31日提交的美國序列號60/763，783的優(yōu)先權(quán))，通過援引將該申請明確地并入本文。
共同發(fā)明人中的幾位現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)〃 Src和Src家庭激酶類的Na+/K+_ATP酶-特異性肽抑制劑/活化劑"，其公開于2009年4月23日提交的未決申請美國序列號 12/446,856(要求2007年10月17日提交的PCT/US07/023011的優(yōu)先權(quán)(公開號WO 2008/054792，2008年5月8日)，并且要求2006年10月16日提交的美國序列號60/855，482 的優(yōu)先權(quán))，通過援引將其確切地并入本文。
另外，共同發(fā)明人中的幾位現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)"調(diào)節(jié)Na+/K+_ATP酶表達(dá)的方法及其作為癌癥治療藥物的用途"，其公開于2008年10月洲日提交的未決申請美國序列號 61/109, 386，通過援引將其確切地并入本文。
另外，共同發(fā)明人中的幾位現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)"作為CTS拮抗劑并且作為癌癥的治療劑的Na+/K+-ATP酶衍生的肽"，其公開于2008年12月12日提交的未決申請美國序列號 61/122，205，通過援引將其確切地并入本文。
發(fā)明概要
在一個(gè)寬泛方面中，本文提供不同于強(qiáng)心類固醇(CTS)的一類新化合物，其中所述化合物抑制Na/K-ATP酶而不活化蛋白激酶。
在又一寬泛方面中，本文提供一類化合物，其包含調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶的離子泵功能的Na/K-ATP酶配體。
在又一寬泛方面中，本文提供一類化合物，其包含拮抗CTS-誘導(dǎo)的蛋白激酶級聯(lián)活化的Na/K-ATP酶配體。
在又一寬泛方面中，本文提供使用Na/K-ATP酶配體的一種或多種測試。
通過參考下述優(yōu)選實(shí)施方式的詳述并參閱附圖，本發(fā)明的各種目的和優(yōu)勢將對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。


專利或申請文件可以包括一幅或多幅彩色附圖和/或一張或多張照片。專利局根據(jù)要求和所需費(fèi)用的繳納情況提供具有彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾埞_的副本。
圖IA 該圖顯示毒毛花苷G的濃度曲線(圖IA-上)和MB7 (3，4，5，6-四羥基咕噸酮)的濃度曲線(圖IA-下)。
圖IB 咕噸酮(左)和槲皮素(右)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2A-2B :MB7對Na+ (圖2A)和ATP (圖2B)依賴性的效果。按“實(shí)驗(yàn)程序“的描述測量Na/K-ATP酶活性是Na+或ATP濃度的函數(shù)。MB7以10 μ M使用。
圖3 :ΜΒ7和毒毛花苷G對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的效果。在10 μ M毒毛花苷G或1和10 μ M ΜΒ7存在下，將純化的Na/K-ATP酶O μ g)和純化的Src溫育15分鐘， 按"實(shí)驗(yàn)程序"的描述測試Src活化。其中各值是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 SE。女女P < 0.01，與對照相比。
圖4A :MB7和毒毛花苷G對Src和ERKs的效果。將A549細(xì)胞用毒毛花苷G或MB7 處理10分鐘，通過SDS-PAGE分離細(xì)胞溶解產(chǎn)物(50 μ g/道)，并如圖3分析Src活化。其中各值是四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 S. E.。*，ρ < 0. 05，與對照相比。
圖4B 將LLC-PKl細(xì)胞用MB7或毒毛花苷G處理10分鐘，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)用 ERK/MAPK (磷酸-Thr202/Tyr204)磷酸化/轉(zhuǎn)位細(xì)胞型測試試劑盒進(jìn)行免疫染色。按"實(shí)驗(yàn)程序"的描述收集圖像?？潭染€(scale bar)代表50 μ Μ。顯示來自代表性實(shí)驗(yàn)的圖像。 自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的40個(gè)不同區(qū)域收集p-ERK的定量數(shù)據(jù)，并表達(dá)為平均值士 S. Ε. *，ρ < 0. 05，與對照相比。
圖 5Α :Na/K-ATP 酶泵循環(huán)的 Albers-Post 方案。
圖5B :Na/K-ATP酶/Src相互作用的模型。Na/K-ATP酶中的A結(jié)構(gòu)域(N-末端和 ⑶2)標(biāo)記為藍(lán)色，P結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為綠色，N結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為黑色。Src的SH2結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為橙色，激酶結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為淺藍(lán)色。
圖6A =Na+和K+濃度變化對受體Na/K-ATP酶/Src活性的效果。將純化Na/K ATP 酶(2ug)再懸浮于規(guī)定離子濃度的Tris/HCl (pH7. 4)緩沖劑，與純化c_Src溫育15分鐘。 然后，將3mM Mg2+/ATP加入反應(yīng)混合物，再溫育10分鐘。通過蛋白質(zhì)印跡分析樣品。各值是四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。
圖6B =K+對受體Na/K-ATP酶/Src活性的效果。如圖6A中所示，在15mM NaCl和所指定的不同濃度KCl存在下進(jìn)行測試。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性蛋白質(zhì)印跡。
圖7A-7C :MB5對Na/K-ATP酶的劑量-依賴性抑制圖7A 低親和力和高親和力的二階段抑制。圖7B-7C :MB5 (圖7B)和MB7 (圖7C)的高親和力抑制的劑量-應(yīng)答，其指出 MB5比MB7更有效。
圖8 :MB5對毒毛花苷G與純化的Na/K-ATP酶的結(jié)合的效果。在不同濃度MB5存在下，將純化的Na/K-ATP酶O μ g)與20nM 3H毒毛花苷G進(jìn)行溫育。
圖9A :MB5對ERKs的效果。將LLC-PK1細(xì)胞暴露于不同濃度的MB5 (InM、10 μ Μ)， 持續(xù)10分鐘，然后按〃實(shí)驗(yàn)程序〃的描述測試活性的ERKs。顯示代表性組的圖像。相同實(shí)
驗(yàn)重復(fù)三次。
圖9B :MB5對ERKs的毒毛花苷G-誘導(dǎo)活化的效果。將LLC-PKl細(xì)胞用不同濃度的MB5 (InM, 10 μ Μ)預(yù)處理15分鐘，暴露至InM毒毛花苷G，持續(xù)10分鐘，如圖9Α的描述測試活性的ERKs。顯示代表性組的圖像。
圖9C :MB5對ERKs的毒毛花苷G-誘導(dǎo)活化的效果。將LLC-PKl細(xì)胞用不同濃度 MB5 (InM、10 μ Μ)預(yù)處理15分鐘，暴露至IOOnM毒毛花苷G，持續(xù)10分鐘，并且如圖9Α的描述測試活性的ERKs。顯示代表性組的圖像。
圖9D :MB5對ERKs的毒毛花苷G-誘導(dǎo)活化的效果。將LLC-PKl細(xì)胞用不同濃度 MB5 (InM、10 μ Μ)預(yù)處理15分鐘，暴露至InM毒毛花苷G，持續(xù)1小時(shí)，按圖9Α的描述測試活性的ERKs。顯示代表性組的圖像。
圖9E :MB5對ERKs的刺激物-誘導(dǎo)活化的效果。將LLC-PKl細(xì)胞用不同濃度 MB5 (InM、10 μ Μ)預(yù)處理15分鐘，暴露于表皮生長因子(EGF)或多巴胺刺激物，持續(xù)10或3 分鐘，按圖9Α的描述測試活性的ERKs。顯示代表性組的圖像。[0039]發(fā)明詳述
在本公開中，通過指明出處來援引各種出版物、專利和公開的書。通過援引將這些出版物、專利和公開的書的公開內(nèi)容并入本申請的公開中，從而更完全地描述與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明至少部分基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Na/K-ATP酶-介導(dǎo)的Src調(diào)節(jié)的新分子機(jī)制并且確定羥基咕噸酮衍生物i)降低Na+和ATP對Na/K-ATP酶的親和力，和ii)充當(dāng)能夠消除毒毛花苷G-誘導(dǎo)的激酶級聯(lián)活化的拮抗劑。
本發(fā)明在下述實(shí)施例中進(jìn)一步定義，其中全部份數(shù)和百分比按重量計(jì)而度是攝氏度，除非另有說明。應(yīng)理解，雖然這些實(shí)例指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是其僅以示例方式加以提供。從上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的必要特征，在不背離其主旨和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾使之適應(yīng)各種用途和條件。本說明書中提及的全部出版物，包括專利和非專利文獻(xiàn)，都通過援引清楚地加入。下述實(shí)施例期望說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式并且不應(yīng)理解為限制如權(quán)利要求
中所定義的本發(fā)明范圍，除非另外指定。
實(shí)施例I
材料ATP禾口毒毛花苷 G 得自 Sigma (St. Louis，MO)。BIOMOL GREEN 購自 BIOMOL(Plymouth Meeting, PA)。 ERK/MAPK(磷酸 _Thr202/Tyr204)磷酸化 / 轉(zhuǎn)位細(xì)胞型測試試劑盒購自Cayman化學(xué)公司(Ann Arbor, MI)。純化的重組Src得自 Upstate Biotechnology (Lake Placid，NY)。多克隆抗-Tyr(P)418-Src 得自 Invitrogen (Camarillo, CA) oifi-c-Src (B-12)單克隆抗體來自 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 0普通化學(xué)品為可獲得的最高純度。新鮮豬腎購自附近的屠宰場，并儲存在_80°C直至用于制備酶。
高通量篩選測試本研究中用于篩選的化學(xué)庫含有沈00種結(jié)構(gòu)不同的、類藥 (drug-like)的天然有機(jī)化合物或者它們的半合成衍生物。在96-孔板中以10mg/ml DMSO 溶液制備儲備化合物。
純化的Na/K-ATP酶制備自豬腎。各種腎制備物的Na/K-ATP酶的特異性活性為 900-1, 200μ mol/mg/h，其是大于95%的總ATP酶活性。高通量篩選以96-孔規(guī)格進(jìn)行，其中 100 μ 1 的最終反應(yīng)體積含有下述組分100mM NaCl, 20mM KCl,lmM MgCl2, ImM EGTA,20mM Tris-HCl (pH 7. 4)和0. 2 μ g的純化的Na/K-ATP酶。在加入化合物之后，在37°C溫育混合物15分鐘，加入2mM ATP. Mg混合物引發(fā)反應(yīng)。
反應(yīng)進(jìn)行15分鐘，然后通過加入100 μ 1冰冷的三氯乙酸停止。離心澄清反應(yīng)混合物，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)用BI0M0L GREEN 試劑測試釋放的磷酸。此外，在存在和不存在ImM 毒毛花苷G的情況下測量對照Na/K-ATP酶活性，將其視為100%。另外，5μΜ毒毛花苷G 和0. 的DMSO包括在各板中分別作為陽性對照和媒介物對照。對照實(shí)驗(yàn)顯示，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，Na/K-ATP酶催化的ATP水解在溫育30分鐘內(nèi)處于線性范圍。
細(xì)胞培養(yǎng)物豬腎上皮細(xì)胞(LLC-PK1細(xì)胞)和人類肺癌癥細(xì)胞(A549細(xì)胞)得自 ATCC,并且在5% CO2加濕溫育器中保持于Dulbecco修飾的fegle培養(yǎng)基(DMEM)中，該培養(yǎng)基中存在10% FBS, 100單元/ml青霉素，和100 μ g/ml鏈霉素。為了消除血清中各生長因子的混雜效果，在實(shí)驗(yàn)之前對細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓M小時(shí)，除非另有指定。[0049]蛋白質(zhì)印跡分析將細(xì)胞用PBS洗滌，在冰冷的RIPA緩沖劑中溶劑化，該緩沖劑含有Nonidet P-40，1 %脫氧膽酸鈉，150mM NaCl, ImM EDTA，ImM苯基甲基磺酰氟，ImM正釩酸鈉，ImM NaF，10 μ g/ml 抑肽酶，10 μ g/ml 亮肽素，和 50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，如前文描述(13)。然后，通過于14，OOOrpm離心澄清細(xì)胞溶解產(chǎn)物，將上清液用于蛋白質(zhì)測試并且進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。在SDS-PAGE (50 μ g/道)上分離樣品，轉(zhuǎn)移至纖維素膜。在室溫下， 在 TBST(Tris-HCl IOmM, NaC1150mM,吐溫 20,0. 1% ；pH 8. 0)中，將膜用 3%脫脂奶粉(總 Src和ERK)或者BSA+1%脫脂奶粉(磷酸化Src和ERK)封閉1小時(shí)，然后用特異性抗體探測。用ECL試劑盒檢測蛋白質(zhì)信號，并用Bio-Rad GS-670成像密度計(jì)定量。
用于受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的活化的測試測試受體Na/K_ATP酶/Src復(fù)合物的活性。簡言之，將純化的Src (4. 5U)用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中的2μ g純化的Na/ K-ATP酶在37°C溫育30分鐘。然后，將Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物暴露于毒毛花苷G或MB7， 持續(xù)10分鐘。加入2mM ATP/Mg2+引發(fā)反應(yīng)，在37°C繼續(xù)5分鐘，加入SDS樣品緩沖劑使其停止。通過蛋白質(zhì)印跡用抗-PW18抗體測量Src的活化。為了載量控制還探測總Src。
共焦成像和免疫細(xì)胞化學(xué)將生長在蓋玻片上的LLC-PKl細(xì)胞血清饑餓M小時(shí)，用MB7或毒毛花苷G處理不同的時(shí)間。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用可商購ERK/MAPK(磷酸-Thr202/Tyr204)磷酸化/轉(zhuǎn)位細(xì)胞型測試試劑盒進(jìn)行p_ERK的免疫染色。用Leica共焦顯微鏡檢測信號。用Leica共焦軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
數(shù)據(jù)分析所提供的數(shù)據(jù)為平均值士S. E.。用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，于ρ < 0. 05接受顯著性。
實(shí)施例I的結(jié)果
Na/K-ATP酶抑制劑的高通量篩選為了篩選Na/K-ATP酶抑制劑的化學(xué)庫，發(fā)明人開發(fā)了 96-孔規(guī)格的測試方法。
如圖IA的描述，作為陽性對照，毒毛花苷G產(chǎn)生Na/K-ATP酶的劑量-依賴性抑制。另一方面，在以低于反應(yīng)體積(數(shù)據(jù)未顯示)的濃度使用的情況下，作為媒介物的 DMSO未顯示出對Na/K-ATP酶活性的效果。毒毛花苷G的表觀IC5tl約5 μ M，其可與報(bào)告值比擬。用相同測試來測試最終濃度10 μ g/ml的全部沈00種化合物。因?yàn)槎鄶?shù)化合物具有約200的分子量，從而調(diào)節(jié)得到該濃度，使它們在約50 μ M進(jìn)行測試，其10倍于毒毛花苷G 的IC5(1。在各96-孔板中，將毒毛花苷G (5 μ M)用作陽性對照，而將0. 1 % DMSO用作陰性對照。重復(fù)進(jìn)行測試，產(chǎn)生對Na/K-ATP酶的至少25%抑制的化合物確認(rèn)為陽性結(jié)果。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，我們發(fā)現(xiàn)共15種陽性化合物(下表I)，其包括數(shù)種熟知的Na/K-ATP酶抑制劑
(楊梅酮、寡霉素、脂蟾毒配基和華蟾蜍毒素。
權(quán)利要求
1. Na/K-ATP酶配體，包含至少一種具有下述結(jié)構(gòu)的羥基咕噸酮衍生物
2.權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，用于抑制Na/K-ATP酶而不活化蛋白激酶。
3.權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，包含MB3，其中R1= OH, R3 = OH和R5 = OH0
4.權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，包含MB5，其中R3= OH, R4 = OH和R5 = OH0
5.權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，包含MB6，其中R1= OH, R3 = OH, R5 = OH和R6 =OH。
6.權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，包含MB7，其中民=OH,R4 = OH, R5 = OH和& =OH。
7.用于抑制Na/K-ATP酶的羥基咕噸酮組合物，包含權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，其中酚基數(shù)量的增多使得所述羥基咕噸酮的效力和效能增加。
8.用于抑制Na/K-ATP酶的羥基咕噸酮組合物，包含權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，其中完全或部分甲基化基本上阻斷所述羥基咕噸酮對所述Na/K-ATP酶的抑制效果。
9.用于抑制Na/K-ATP酶的羥基咕噸酮組合物，包含權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體，其中在酚基位于吡喃酮環(huán)中的氧的附近的情況下，它們對所述化合物的效能更有效果。
10.在有需要的細(xì)胞中抑制ATP酶活性而不刺激Na/K-ATP酶的受體功能的方法，包括給予有效量的至少一種權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體。
11.權(quán)利要求
11的方法，其中所述Na/K-ATP酶配體包含MB7。
12.用于抑制ATP酶活性而不實(shí)質(zhì)上活化受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的方法，包括給予至少一種權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體。
13.Na/K-ATP酶的抑制劑，包含四羥基咕噸酮。
14.CTS拮抗劑，包含至少M(fèi)B5或其衍生物。
15.用于篩選Na/K-ATP酶抑制劑的高通量測試方法，包括毒毛花苷G，(5μ M)作為陽性對照以及0. 1% DMSO用作陰性對照，其中鑒定對Na/K-ATP酶產(chǎn)生至少25%的抑制的化合物。
16.純化的Na/K-ATP酶和/或重構(gòu)的Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物，用于篩選新的激動劑和拮抗劑。
17.用作拮抗內(nèi)源性CTS升高-誘導(dǎo)的病理學(xué)變化的藥物的咕噸酮衍生物，所述病理學(xué)變化包括心血管和腎重塑，以及心臟和腎纖維化。
18.用于新一代受體Na/K-ATP酶拮抗劑的咕噸酮衍生物，所述咕噸酮衍生物比目前可獲得的組合物更有效、毒性更低且具有更佳藥代動力學(xué)特性。
19.導(dǎo)致細(xì)胞中Na/K-ATP酶-介導(dǎo)的Src調(diào)節(jié)的方法，包括向有需要的受試者給予，能夠充當(dāng)拮抗劑的至少一種羥基咕噸酮衍生物，所述拮抗劑能夠消除細(xì)胞中的強(qiáng)心類固醇比如毒毛花苷G-誘導(dǎo)的激酶級聯(lián)的活化。
20.防止Na/K-ATP酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)化的方法，該轉(zhuǎn)化使Src激酶結(jié)構(gòu)域能自Na/K_ATP酶釋放，其包括給予至少一種咕噸酮衍生物。
21.—類Na/K-ATP酶抑制劑，用于在有需要的受試者中增加心臟收縮功能而不刺激受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物。
22.用于改善收縮功能而不加速心臟肥大和/或纖維化的組合物，包含至少一種咕噸酮衍生物。
23.用于治療充血性心力衰竭的一種或多種臨床病癥的組合物，包含至少一種咕噸酮衍生物。
24.用于在有需要的一種或多種細(xì)胞中靶向Na/K-ATP酶/Src受體復(fù)合物和拮抗CTS-誘導(dǎo)的蛋白激酶級聯(lián)的組合物，包含至少一種權(quán)利要求
1的Na/K-ATP酶配體。
25.在有需要的受試者中抑制Src活性或拮抗CTS-誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，包括給予有效量的包含咕噸酮衍生物的一種或多種Na/K-ATP酶配體。
26.在有需要的一種或多種細(xì)胞中靶向Src的Na/K-ATP酶-相互作用庫并且充當(dāng)有效的毒毛花苷G拮抗劑的方法，包括給予有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
27.用于在有需要的受試者中阻斷毒毛花苷G-誘導(dǎo)的Src活化和下游信號傳導(dǎo)途徑，比如ERK1/2的方法，包括給予有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
28.用于確定Na/K-ATP酶和CTS的信號傳導(dǎo)功能的生理學(xué)和病理學(xué)意義的方法，包括將包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體用作探針。
29.在有需要的一種或多種細(xì)胞中能夠選擇性地靶向Src的Na/K-ATP酶-相互作用庫并且充當(dāng)有效的毒毛花苷G拮抗劑的組合物，包含包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
30.用于Na/K-ATP酶/Src受體受到過度刺激的心血管疾病和癌癥的治療組合物，包含包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
31.在有需要的受試者中誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制和/或細(xì)胞死亡的方法，包括向受試者給予治療有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
32.用于在有需要的受試者中阻止CTS-刺激的信號傳導(dǎo)途徑的組合物，所述組合物包含包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
33.在有需要的受試者的心臟中基本上消除毒毛花苷G-刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，包括給予有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體。
34.包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療癌癥有關(guān)的障礙或心臟病有關(guān)的障礙。
35.藥物組合物，其含有包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體，和生理學(xué)上可接受的載體。
36.權(quán)利要求
35的組合物，其中所述組合物適于用作心臟肥大、組織纖維化和/或充血性心力衰竭的治療。
37.用于在受試者中預(yù)防或治療由毒毛花苷G類固醇受體介導(dǎo)的病癥的方法，包括給予包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體，和/或其激動劑或拮抗劑。
38.權(quán)利要求
37的方法，其中所述病癥是癌癥、心臟肥大、組織纖維化或充血性心力衰竭中的一種或多種。
39.適于給藥至受試者用于預(yù)防或治療由類固醇受體介導(dǎo)的病癥的藥物組合物，包含有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體，或其激動劑或拮抗劑，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
40.適于治療罹患心臟障礙的患者的藥物組合物，包含治療有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體，或其藥學(xué)上可接受的
41.藥物組合物，包含有效量的包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體或者其激動劑或拮抗劑，和適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑或賦形劑。
42.適于給藥至受試者用于預(yù)防或治療由類固醇受體介導(dǎo)的病癥和由毒毛花苷G受體介導(dǎo)的病癥的藥物組合物，包含包含咕噸酮衍生物的至少一種Na/K-ATP酶配體和適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑或賦形劑。
43.基于化合物的特異性結(jié)合和/或?qū)a/K-ATP酶抑制或活化的效果來鑒定經(jīng)推定會引起或調(diào)節(jié)人類受試者中Na/K-ATP酶活性的化合物的體外方法，包括i)在檢測至少一種化合物的結(jié)合或功能測試中篩選一種或多種化合物，所述至少一種化合物特異性地結(jié)合受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物和/或活化或調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或抑制)受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的活化或者調(diào)節(jié)另一化合物對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的特異性結(jié)合和/或活化；并且 )鑒定經(jīng)推定會引起或調(diào)節(jié)受體Na/K-ATP酶活性的這類化合物中的至少一種i)基于所述化合物的特異性結(jié)合和/或活化或調(diào)節(jié)(抑制或增強(qiáng))作用；或者ii)基于所述化合物對所述功能測試中的另一化合物的特異性結(jié)合或活化的調(diào)節(jié)。
44.權(quán)利要求
43的方法，用于篩選分子、試劑、蛋白質(zhì)、肽和/或化學(xué)品庫以鑒定能夠結(jié)合至所述受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的分子、試劑、蛋白質(zhì)、肽和/或化學(xué)品。
45.權(quán)利要求
43的方法，其中所述庫是化學(xué)庫，抗體庫，噬菌體展示庫，肽庫或天然化合物庫。
46.權(quán)利要求
43的方法，其中所述分子、試劑、蛋白質(zhì)、肽和/或化學(xué)品是毒毛花苷G的拮抗劑或激動劑。
47.用于在受試者中鑒定潛在引起或調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶活性的化合物的方法，包括在檢測化合物的功能測試中篩選一種或多種化合物，所述受檢測的化合物活化受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物或者調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或抑制)另一化合物對受體Na/K_ATP酶/Src復(fù)合物的活化；并且鑒定潛在引起或調(diào)節(jié)Na/K-ATP酶活性的化合物，基于化合物i)對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的活化，和/或ii)對另一化合物活化受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或抑制)作用。
48.權(quán)利要求
45的方法，其中所述Na/K-ATP酶在細(xì)胞中表達(dá)。
49.權(quán)利要求
48的方法，其中所述細(xì)胞是完整的或經(jīng)透化的。
50.權(quán)利要求
49的方法，其中所述受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物在細(xì)胞表面上表達(dá)。
51.權(quán)利要求
49的方法，其中所述真核生物細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
52.權(quán)利要求
47的方法，其中所述功能測試檢測所述化合物對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的內(nèi)化的效果。
53.權(quán)利要求
47的方法，其中所述一種或多種化合物包含在組合化學(xué)庫中。
54.權(quán)利要求
47的方法，其中所述一種或多種化合物混合在小分子、草藥和細(xì)菌代謝物的隨機(jī)化庫中。
55.權(quán)利要求
47的方法，其中所述方法是高通量篩選方法。
56.權(quán)利要求
48的方法，其中所述功能測試篩選增強(qiáng)或抑制毒毛花苷G對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的活化的化合物。
57.權(quán)利要求
47的方法，其中所述功能測試篩選增強(qiáng)或抑制毒毛花苷G或其類似物與受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物的結(jié)合的化合物。
58.權(quán)利要求
47的方法，其中所述功能測試檢測化合物對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效果。
59.權(quán)利要求
47的方法，其中所述功能測試檢測化合物對受體Na/K-ATP酶/Src復(fù)合物與毒毛花苷G的配體特異性偶聯(lián)的效果。
60.用于篩選試驗(yàn)物質(zhì)對Na/K-ATP酶的激動劑或拮抗劑活性的測試，包括下述步驟i)在Na/K-ATP酶/Scr受體復(fù)合物存在下，將表達(dá)或含有毒毛花苷G-調(diào)節(jié)的Na/K-ATP酶的一種或多種細(xì)胞與所述試驗(yàn)物質(zhì)接觸； )測量或檢測Na/K-ATP酶/Scr受體復(fù)合物在細(xì)胞中存在的量；并且iii)比較在步驟ii)中測量或檢測的存在于細(xì)胞中的Na/K-ATP酶/Scr復(fù)合物受體，其中，在可比擬的條件下，經(jīng)測量或檢測的Na/K-ATP酶/Scr受體復(fù)合物通過在化合物存在下接觸含有或表達(dá)毒毛花苷G-調(diào)節(jié)的Na/K-ATP酶的細(xì)胞而獲得，由此確定所述試驗(yàn)物質(zhì)是否表現(xiàn)出激動劑或拮抗劑活性。
61.權(quán)利要求
60的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞或腎上皮細(xì)胞。
專利摘要
本申請公開Na/K-ATP酶/Src配體、測試方法及其用途。
文檔編號A01N43/16GKCN102573469SQ201080046743
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月9日
發(fā)明者J·I·夏皮洛, 司書毅, 張忠兵, 謝子建 申請人:托萊多大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan