專(zhuān)利名稱(chēng):表達(dá)載體及應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可在微藻中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，特別是涉及利用此表達(dá)載體提高微藻產(chǎn)油效率的方法。
背景技術(shù)：
微藻(microalgae)是一群微型生物的總稱(chēng)，包括眾多真核和原核種類(lèi)。微藻可以直接利用太陽(yáng)能生產(chǎn)高品質(zhì)的蛋白質(zhì)和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及特殊生物活性物質(zhì)。實(shí)際上微藻廣泛應(yīng)用在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，生產(chǎn)例如藻體粉、長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸、色素蛋白、或藻多糖等。近年來(lái)，隨著原油價(jià)格飛漲及使用化石燃料引發(fā)的全球暖化問(wèn)題，利用微藻制造生物燃料的構(gòu)想也持續(xù)受到全球關(guān)注。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2010/0167339A1記載提高微藻濃度的條件及步驟，利用固體顆粒激烈攪動(dòng)微藻，使其破裂，形成微藻漿，以吸收性泡沫分離步驟處理微藻漿，而形成流動(dòng)性佳的藻體生物質(zhì)，可應(yīng)用于生物燃料中。
鑒于微藻的應(yīng)用前景及高價(jià)值化，利用遺傳工程改良微藻細(xì)胞中的基因產(chǎn)物，已被廣泛使用。例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2009/0176272A1記載一種生產(chǎn)生物燃料用的核酸序列的表達(dá)，使編碼與形成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的脂肪酸生物合成相關(guān)的蛋白的基因通過(guò)重組質(zhì)粒pDs69i 在藻體中表達(dá)，提高脂肪酸的產(chǎn)量。
W02009/073822A2揭示一種提高微藻生產(chǎn)生物燃料的基因及化學(xué)工程策略，通過(guò)包含一表達(dá)盒、一基因堆棧表達(dá)載體及一表達(dá)載體的重組藻體所達(dá)成，其中該表達(dá)盒包括抑制編碼Cao、LHCII-b、DC、PFL1/PFLA或AGP酶的蛋白質(zhì)的代謝基因表達(dá)的siRNA分子； 該基因堆棧的表達(dá)載體包括編碼ACCase、DGAT, caleosin及oleosin多肽的核酸序列；以及該表達(dá)載體包括編碼PCC 7942ftp-l基因的核酸序列。
本發(fā)明人等鑒于先前技術(shù)的繁復(fù)操作步驟及產(chǎn)生油脂的效率，根據(jù)微藻的生理特性，設(shè)計(jì)新穎的表達(dá)載體，通過(guò)基因工程重組產(chǎn)油相關(guān)基因，突破野生型微藻無(wú)法兼具高光合效率、高二氧化碳固定效率及生長(zhǎng)速率的特性，在傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)系統(tǒng)中，提高產(chǎn)油效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種表達(dá)載體，包括一蛋白質(zhì)表達(dá)盒以及至少兩個(gè)同源重組DNA片段，分別位于該蛋白質(zhì)表達(dá)盒的兩側(cè)；其中該蛋白質(zhì)表達(dá)盒包括第一篩選標(biāo)記；啟動(dòng)子；多重克隆位點(diǎn)，鄰接于該啟動(dòng)子的下游；以及第二篩選標(biāo)記，其中該啟動(dòng)子包括花椰菜葉病毒(Cauliflower mosaic virus ;CaMV) 35S啟動(dòng)子、1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(Ribulose bisphosphate carboxylase ；RBCs)啟動(dòng)子、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adenine methyltransferase ；AMT)啟云力子、硝酸鹽還原酶(nitrate reductase ； NR)啟動(dòng)子或上述組合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種在微藻中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，包括將一外源基因克隆入上述表達(dá)載體中；將該具有外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至微藻中，以及表達(dá)該外源基因。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，包括提供一種如上述的表達(dá)載體；將至少一外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)；將該具有至少一外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至微藻中；以及于微藻中表達(dá)該至少一外源基因；其中，該外源基因包括編碼與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的酶的基因或與前述基因的序列同一性至少為80%的基因。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，該外源基因選自下組編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、甘油_3_磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因(SEQ IDNO 7 10)、編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因(SEQ IDNO :11 12)、編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、編碼二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、編碼乙?；?CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、編碼碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ IDNO :23)、以及與前述任一基因的序列同一性至少為80%的核苷酸序列。
本文所述的”表達(dá)載體”意指可將特定基因?qū)胨拗骷?xì)胞中使該基因表達(dá)的核酸分子，通常為質(zhì)粒，例如Ti質(zhì)粒(tumor inducing plasmid)、pBI121 二元載體(binary vector)、pBluescript II SK+噬菌粒(phagemid)、或類(lèi)似的載體或質(zhì)粒。為了基因的表達(dá)， 表達(dá)載體通常還包括調(diào)控序列(regulatory sequence)，例如增強(qiáng)子(enhancer)、啟動(dòng)子 (promoter)等；以及報(bào)道基因(importer gene)，例如編碼熒光蛋白質(zhì)的核苷酸序列。為了進(jìn)行克隆(cloning)，表達(dá)載體通常還包括篩選基因，例如抗生素基因；以及多重克隆位點(diǎn) (multiple cloning site ；MCS)。
本文所述的”蛋白質(zhì)表達(dá)盒”(protein expression cassette)意指由一個(gè)以上的基因及控制該基因表達(dá)的序列所組成的表達(dá)蛋白質(zhì)的盒。表達(dá)盒通常為表達(dá)載體的一部分，用于克隆及轉(zhuǎn)化。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)盒可包括啟動(dòng)子序列、開(kāi)放閱讀框(open reading frame)、該基因表達(dá)所需的核苷酸序列、或轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞所需的核苷酸序列。
本文所述的”同源重組 DNA 片段”(homologous recombinant DNAfragment)意指可與同源DNA序列配對(duì)進(jìn)行交換的序列片段，分別位于該蛋白質(zhì)表達(dá)盒的兩側(cè)，該”兩側(cè)” 代表位于兩翼位置(flanking)，即，緊鄰該蛋白質(zhì)表達(dá)盒的上游(5’側(cè)翼位置)及下游(3’ 側(cè)翼位置)。例如可與植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)同源交換的序列，可包括T-DNA序列中的左端 (left border ；LB)及右端(right border ；RB)，例如 SEQ ID NO 24 或 25 所示的序列、其部分序列、或的上述組合，但沒(méi)有特別限定。同源重組DNA片段可根據(jù)表達(dá)載體或宿主細(xì)胞的特性等條件以公知的DNA重組技術(shù)適當(dāng)設(shè)計(jì)、合成。
本文所述的”篩選標(biāo)記”包括用于特定基因的克隆及報(bào)導(dǎo)，例如編碼卡那霉素 (Kanamycin)抗生素的基因、編碼的遺傳霉素(Geneticin ；G418)抗生素的基因、編碼博萊霉素抗生素(Zeocin)的基因、編碼潮霉素抗生素(Hygromycin)的基因、編碼紅色熒光蛋白 (DsRed)的基因、編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因、編碼藍(lán)色熒光蛋白(BFP)的基因、或類(lèi)似的基因。篩選標(biāo)記基因可根據(jù)表達(dá)載體的特性及克隆的基因性質(zhì)適當(dāng)設(shè)計(jì)，沒(méi)有特定的限制。
本文所述的”啟動(dòng)子”意指在基因表達(dá)時(shí)容許RNA聚合酶連接的核苷酸序列，為轉(zhuǎn)錄作用(transcription)的開(kāi)始。本文的啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)，考量欲表達(dá)的核苷酸序列及表達(dá)載體的性質(zhì)，可采用單啟動(dòng)子、雙啟動(dòng)子或多啟動(dòng)子的模式，以提高欲表達(dá)基因的表達(dá)量。
本文所述的”多重克隆位點(diǎn)”意指具有一個(gè)以上的限制性酶切位點(diǎn)的序列片段，鄰接于啟動(dòng)子的下游，該”鄰接”表示其間隔距離僅為數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)，且仍然操作性連接(operatably linked)于啟動(dòng)子，可受啟動(dòng)子的調(diào)控。常用的限制性酶切位點(diǎn)，例如 SacI> Ecol、XbaI> Spel、SmaI> EcoRI> Hindlll、AccI、Sail、Scil、ApaI> KpnI> Acc65I、 MRrh4273I、MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、或 PspOMI等，可依克隆的基因片段適當(dāng)設(shè)計(jì)。
本文所述的”外源基因”，又可稱(chēng)為”異源基因”表示來(lái)自與宿主細(xì)胞不同種的生物體的基因或核苷酸片段。
本文所述的”序列同一性”(sequence homology)意指不同的核苷酸序列中堿基的相似度。序列同一性可通過(guò)例如 BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)、 FASTA(http://www. ebi. ac. uk/Tools/sss/fasta/)等公知軟件比對(duì)兩種以上的核苷酸序列而獲得相似度。序列同一性愈高的序列，通常表示具有相似的生物活性或在演化分類(lèi)中具有相近的親緣關(guān)系。
本文所述的”微藻”泛指微型生物，更具體地說(shuō)，包括小球藻(Chlorella sp.)、微星藻(Micractinium sp·)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、擬球藻(Nanno ch loropsis sp·)、雨生血紅藻(Haematococcus sp.)、柵藻Gcenedesmus sp.)、或這些藻類(lèi)的組合。
M
本文的表達(dá)載體的設(shè)計(jì)主要著眼于可在微藻中表達(dá)特定基因的載體，特別是與產(chǎn)生脂質(zhì)相關(guān)的基因。
本文一實(shí)施例選用pBluescript II SK+噬菌粒(phagemid)作為表達(dá)載體的骨架。 pBluescript II SK+噬菌粒為商業(yè)上可購(gòu)買(mǎi)的質(zhì)粒，包含具有21個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的多重克隆位點(diǎn)、大腸桿菌(E.coli)的復(fù)制起始點(diǎn)(ColEl ori)、及T7與T3啟動(dòng)子等區(qū)域，為公知用于克隆DNA片段的表達(dá)質(zhì)粒。
在此實(shí)施例中，如第IA IE圖所示，利用pBluescript II SK+噬菌粒為骨架，經(jīng)由限制性酶作用連接卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因(KanK)以及農(nóng)桿菌 (Agrobacterium)的基因復(fù)制起點(diǎn)(Inc W ori)。
另一方面，此實(shí)施例選用植物轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體pBI121進(jìn)行再構(gòu)建 (reconstruction)。表達(dá)載體pBI121已知具有T-DNA部位，該T-DNA部位包含一表達(dá)盒具有花椰菜葉病毒(Cauliflower mosaic virus) 35S啟動(dòng)子(PCaMV35S)、胭脂堿合酶(nopaline synthase ；N0S)啟動(dòng)子(PNOS)及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (neomycin phosphotransferase II ；NPTIIe)作為G418的篩選基因，以及位于該表達(dá)盒兩端的左端 (left border ；LB) (SEQ ID NO :24)及右端(right border ；RB) (SEQ ID NO :25)。當(dāng)該 PBI121載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，T-DNA部位的核苷酸序列由于左端(LB)及右端(RB)與宿主細(xì)胞的基因進(jìn)行同源交換(homologous recombination)，使左端至右端的間基因可嵌入宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中，而使該部分的基因被表達(dá)。
此實(shí)施例中，選用pBI121進(jìn)行再構(gòu)建，在其T-DNA部位以限制性酶作用連接編碼紅色熒光蛋白(DsRed)的基因或編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因及編碼藍(lán)色熒光蛋白(BFP)的基因、以及在緊鄰多重克隆位點(diǎn)的上游連接花椰菜葉病毒(Cauliflowermosaic virus) 35S 啟云力子(Pcaiv35s)。
之后，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使pBI121載體上的左端至右端的核苷酸序列擴(kuò)增(amplification)后，接合至上述重組的pBluescript II SK+噬菌粒，形成本文一實(shí)施例的表達(dá)載體(該表達(dá)載體保藏于德意志微生物及細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DEUT SCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UNDZELLKULTUREN GmbH ;DSMZ)，保藏日期為 2010 年 10 月 3日，保藏編號(hào)DSM 24099o
本文的表達(dá)載體，除上述的花椰菜葉病毒(Cauliflower mosaic virus) 35S啟動(dòng)子(PcaMv35s)以外，也可連接源自菊花(Chrysanthemum morifolium)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 力口氧酶小亞基啟云力子(Ribulose bisphosphate carboxylas印romoter ;PKBCs)、源自小球藻(Chlorella virus)的腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adenine methyltransferase ；AMT)啟動(dòng)子、源自小球藻(Chlorella vulgaris)的硝酸鹽還原酶(nitrate reductase ；NR)啟動(dòng)子、或上述啟動(dòng)子的組合。
由于此表達(dá)載體中LB至RB的序列可通過(guò)同源交換的方式，使該段序列嵌入宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中，而使該段序列被表達(dá)。再者，此表達(dá)載體包含抗生素基因與熒光蛋白基因的雙篩選標(biāo)記基因以及CaMV 35S啟動(dòng)子(PCaMV35S)、RBC啟動(dòng)子(Pkbcs)、AMT啟動(dòng)子(Pamt)、 NR啟動(dòng)子(Pnk)的多啟動(dòng)子。通過(guò)雙篩選標(biāo)記及多啟動(dòng)子模式，此表達(dá)載體可提高對(duì)宿主細(xì)胞的篩選效率及克隆基因的穩(wěn)定性，使后續(xù)連接于多重克隆位點(diǎn)上的特定基因容易表達(dá)。 而且表達(dá)載體上的多重克隆位點(diǎn)，可連接感興趣的核苷酸序列。為了達(dá)到提高生體內(nèi)脂質(zhì)生產(chǎn)量的目的，本文一實(shí)施例于多重克隆位點(diǎn)連接編碼與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的酶的基因。 然而本發(fā)明的表達(dá)載體不限于連接此序列片段，此技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識(shí)者可依其它目的，于上述表達(dá)載體的多重克隆位點(diǎn)連接感興趣的核苷酸序列，這些變化或應(yīng)用也包含于本文發(fā)明的范圍。
上述所謂”限制性酶作用”表示利用相同的限制性酶剪切欲克隆的DNA片段及載體，使兩者具有可互相配對(duì)(互補(bǔ))的核苷酸端，在堿基間形成氫鍵而連結(jié)克隆的DNA片段及載體。此述的限制性酶沒(méi)有特別限定，可根據(jù)克隆的片段及載體特性等條件適當(dāng)設(shè)計(jì)。
上述”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) ”為使用DNA聚合酶、寡核苷酸的引物對(duì)、模板及脫氧核糖核酸(dNTP)，通過(guò)溫度設(shè)定使模板變性(denaturation)、模板與引物黏合(anneal)、 及根據(jù)模板的核苷酸序列擴(kuò)增DNA的方法。選用的引物對(duì)可根據(jù)欲擴(kuò)增的DNA片段選擇商業(yè)上可購(gòu)買(mǎi)的套組，也可視需要適當(dāng)設(shè)計(jì)。引物對(duì)包括與模板5’端黏合的正向引物及與模板3’端黏合的反向引物，分別使模板的雙股DNA序列各自復(fù)制、擴(kuò)增。為避免引物的堿基自行配對(duì)而降低與模板的黏合及造成非特異性的PCR反應(yīng)，引物的設(shè)計(jì)可利用BLAST軟件 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)等分析引物內(nèi)的堿基相似度。PCR的反應(yīng)溫度可設(shè)定為， 94 95°C進(jìn)行30 60秒、55 56°C進(jìn)行30 60秒及72 73°C進(jìn)行1 2分鐘為1次循環(huán)，進(jìn)行20 40次循環(huán)。
上述所謂”與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的酶”是指于生物體內(nèi)合成脂肪酸、三酸甘油脂及脂質(zhì)的相關(guān)酶，特別是在植物體內(nèi)合成脂質(zhì)的關(guān)鍵酶。
植物體內(nèi)脂質(zhì)的合成途徑可分為兩部分，一部分于葉綠體中進(jìn)行脂肪酸的合成， 另一部分于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行脂肪酸的聚合，即合成甘油三酯(TGA)，又稱(chēng)為Kennedy pathway.
簡(jiǎn)單地說(shuō)明如圖2所示，圖2左圖表示在葉綠體中進(jìn)行的脂肪酸生物合成，包括來(lái)自光合作用、糖酵解作用或卡爾文循環(huán)(Calvin cycle)間接形成的乙酰輔酶A (acetyl-CoA)。乙酰輔酶A (acetyl-CoA)經(jīng)由乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase ；FAS)、硬脂酰-ACP 不飽和酶 (stearoyl-acyl carrier protein (ACP) desaturase ； Δ 9-desaturase)、酉先基-ACP 硫化酉旨酶(acyl-ACP thioesterase)、及?；?CoA 合成酶(acyl-CoA synthase)，形成非脂化脂肪酸(non-esterified fatty acid ;NEFA)、細(xì)胞質(zhì)中的?；o酶A (acyl-CoA)及二羥丙酮磷酸(Dihydroxyacetone phosphate ；DHAP)。
細(xì)胞質(zhì)中的?；o酶A (acyI-CoA)與甘油_3_磷酸(G_3P)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中三酸甘油脂合成途徑(Kennedy pathway)的底物，經(jīng)甘油_3_磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydroxylase ；G3PDH)把二羥丙酮磷酸(Dihydroxyacetone phosphate ；DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G-3P)。如圖2右圖表示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的Kennedy pattiway，包括第1步驟利用甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase ；GPAT)，將甘油-3-磷酸(G-3P)轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酸(Lyso-PA)；第2步驟利用溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶 (lysophophatidic acid acyltransferase ;LPAAT)，將溶血磷脂酸(Lyso-ΡΑ)轉(zhuǎn)化為磷脂酸(PA)；第3步驟利用磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase ;PAP)，將磷脂酸 (PA)轉(zhuǎn)化為二?；视?DAG)；以及第4步驟利用二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase ；DGAT)，將?；视?DAG)轉(zhuǎn)化為甘油三酯(TGA)。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)將編碼上述脂質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵酶的核苷酸序列，重組于上述表達(dá)載體的多重克隆位點(diǎn)，通過(guò)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至微藻而大量繁殖時(shí)，該編碼脂質(zhì)生物合成關(guān)鍵酶的核苷酸序列被大量表達(dá)，提高微藻的產(chǎn)油效率。
具體地說(shuō)，本文選用編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的核苷酸序列(SEQ ID NO 1 6)、甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的核苷酸序列(SEQ IDNO 7 10)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)的核苷酸序列(SEQ ID NO 11 12)、磷脂酸磷酸酶(PAP)的核苷酸序列 (SEQ ID NO 13 16)及二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的核苷酸序列(SEQ ID NO 17 21)，通過(guò)表達(dá)載體于宿主體內(nèi)表達(dá)。本文更進(jìn)一步選取編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)及編碼卡爾文循環(huán)中的碳酸酐酶(carbonic anhydrase ；CA) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :23)(圖2左圖)，希望從脂肪生物合成途徑的上游端來(lái)提高脂肪產(chǎn)量。
上列酶及編碼該酶的基因名稱(chēng)及來(lái)源如表1所示。
[表 1]
8
權(quán)利要求
1.表達(dá)載體，包括 蛋白質(zhì)表達(dá)盒；和至少兩個(gè)同源重組DNA片段，分別位于該蛋白質(zhì)表達(dá)盒兩側(cè)；其中該蛋白質(zhì)表達(dá)盒包括第一篩選標(biāo)記；啟動(dòng)子；多重克隆位點(diǎn)，鄰接于該啟動(dòng)子下游；以及第二篩選標(biāo)記，其中該啟動(dòng)子包括花椰菜葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(RBCs)啟動(dòng)子、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子、硝酸鹽還原酶(NR)啟動(dòng)子或上述組合 ο
2.如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體，其中，該至少兩個(gè)同源重組DNA片段包括LB片段 (SEQ ID N0:24)、RB片段(SEQ ID NO :25)、其部份序列、或上述組合。
3.如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體，其中，該第一篩選標(biāo)記包括編碼紅色熒光蛋白 (DsRed)的基因、編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因、或編碼藍(lán)色熒光蛋白(BFP)的基因，該第二篩選標(biāo)記包括編碼遺傳霉素(G418)的基因、編碼博萊霉素(Zeocin)的基因、或編碼潮霉素(Hygromycin)的基因。
4.如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體，其中，該多重克隆位點(diǎn)包括限制性酶切位點(diǎn)SacI、 EcoI、XbaI、SpeI、SmaI、EcoRI、HindIII、AccI、SalI Jci I、ApaI、KpnI、Acc65I、MRrh4273I、 MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、PspOMI 或上述組合。
5.如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體，其中，該蛋白質(zhì)表達(dá)盒還包括至少一個(gè)外源基因，其插入該多重克隆位點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求
5所述的表達(dá)載體，其中，該外源基因包括選自下組的基因 編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、編碼甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO 7 10)、 編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因(SEQ ID NO 11 12)、 編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、 編碼二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、 編碼乙?；?CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、 編碼碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID N0:23)、以及與前述任一基因的序列同一性至少為80%的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體在微藻中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求
7所述的表達(dá)載體，其中，該微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、擬球藻、 雨生血紅藻或柵藻。
9.一種在微藻中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，包括將一外源基因克隆入如權(quán)利要求
1-6中任一項(xiàng)的表達(dá)載體中； 將該具有外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至微藻中，以及表達(dá)該外源基因。
10.如權(quán)利要求
9所述的在微藻中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，其中該轉(zhuǎn)化步驟是使用電穿孔法。
11.如權(quán)利要求
9或10所述的在微藻中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，其中，該微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、擬球藻、雨生血紅藻或柵藻。
12.—種應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，包括提供一種如權(quán)利要求
1所述的表達(dá)載體；將至少一外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)；將該具有至少一外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至微藻中；以及于微藻中表達(dá)該至少一外源基因；其中，該外源基因包括編碼與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的酶的基因或與前述基因的序列同一性至少為80%的基因。
13.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其中，該外源基因包括選自下組的基因編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因(SEQ IDNO :1 6)、編碼甘油_3_磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO :7 10)、編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因 (SEQ ID NO :11 12)、編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、編碼二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、編碼乙?；?CoA羧基酶(ACCase) 的基因(SEQ IDNO :22)、編碼碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID NO :23)、以及與前述任一基因的序列同一性至少為80%的核苷酸序列。
14.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其中，該微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、擬球藻、雨生血紅藻、或柵藻。
15.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其中，該轉(zhuǎn)化步驟是使用電穿孔法。
16.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其將單一外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)，該單一外源基因?yàn)榫幋a甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因，具有SEQ ID N0:1 6所示的序列；或編碼甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID NO 7 10所示的序列；或編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID N0:11 12所示的序列；或編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID NO :13 16所示的序列；或編碼二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 17 21所示的序列。
17.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其將兩個(gè)外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)，該兩個(gè)外源基因?yàn)榫幋a溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID NO 12所示的序列；以及編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID N0:16所示的序列；或編碼甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID NO :8所示的序列；以及編碼二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID N0:20所示的序列。
18.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其將三個(gè)外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)，該三個(gè)外源基因?yàn)榫幋a二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 19 所示的序列；編碼溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID N0:12所示的序列； 以及編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID N0:16所示的序列。
19.如權(quán)利要求
12所述的應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，其將四個(gè)外源基因插入該多重克隆位點(diǎn)，該四個(gè)外源基因?yàn)榫幋a二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因，具有SEQ ID NO 19 所示的序列；編碼甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因，具有SEQ ID N0:10所示的序列；編碼溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因，具有SEQ ID NO :12所示的序列；以及編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因，具有SEQ ID NO: 16所示的序列。
專(zhuān)利摘要
一種表達(dá)載體，包括蛋白質(zhì)表達(dá)盒以及至少兩個(gè)同源重組DNA片段，分別位于該蛋白質(zhì)表達(dá)盒兩側(cè)；其中該蛋白質(zhì)表達(dá)盒包括第一篩選標(biāo)記；啟動(dòng)子；多重克隆位點(diǎn)，鄰接于該啟動(dòng)子下游；以及第二篩選標(biāo)記，其中該啟動(dòng)子包括花椰菜葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(Ribulose bisphosphate carboxylase)(RBCs)啟動(dòng)子、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子、硝酸鹽還原酶(NR)啟動(dòng)子或上述組合。
文檔編號(hào)C12N15/63GKCN102559727SQ201110278884
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年9月20日
發(fā)明者簡(jiǎn)良榮, 謝欣如 申請(qǐng)人:明志科技大學(xué), 財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan