專利名稱:一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)植物生長(zhǎng)物質(zhì)的方法，尤其涉及一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法，可靠地確定描述產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長(zhǎng)起始溫度、最適生長(zhǎng)和高溫致死臨界溫度)的方法。
背景技術(shù)：
溫度是生物生命活動(dòng)不可缺少的因素，是影響生命進(jìn)程的基本因子。像細(xì)菌一類的變溫生物，本身產(chǎn)熱量低，代謝熱和環(huán)境熱比起來(lái)所起的作用較小，菌株的體溫隨著外界環(huán)境溫度變化而改變。在自然選擇和人工選擇壓力下，大多數(shù)細(xì)菌不同生態(tài)菌株，在一定條件下，都有一個(gè)特定的溫度適應(yīng)范圍。在一定時(shí)空范圍內(nèi)，細(xì)菌把這種對(duì)溫度的適應(yīng)性，表現(xiàn)為在種群水平上生態(tài)學(xué)參數(shù)的差異，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)、數(shù)學(xué)建模來(lái)量化菌株的溫度特征。
目前，有許多數(shù)學(xué)模型可以用來(lái)作為這種量化的工具。與線性數(shù)學(xué)模型相比，“溫度-發(fā)育速率”非線性模型由于在建模過(guò)程中，一般都具有較為堅(jiān)實(shí)的生理、生化信息等基礎(chǔ)，因而常常被廣泛應(yīng)用。但是在不同條件下，各種數(shù)學(xué)模型的適應(yīng)性有著明顯的差別。
冠菌素(Coronatine，COR, C18H25NO4)是一種新型高效的生物源植物生長(zhǎng)物質(zhì)，多由丁香假單胞菌屬的植物致病菌變種分泌于胞外，能有效促進(jìn)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，提高植物抗逆性，活性比茉莉酸高100 10000倍。因此，冠菌素合成有著廣闊的市場(chǎng)前景。目前，獲得冠菌素的途徑主要有化學(xué)合成和生物合成?；瘜W(xué)合成冠菌素的過(guò)程繁雜，得率僅有6.98%，合成費(fèi)用高。生物合成冠菌素主要通過(guò)植物疫病的致病菌發(fā)酵產(chǎn)生。冠菌素產(chǎn)生菌株的經(jīng)典菌株為Pseudomonas syringae pv.glycinea PG4180,早期研究表明經(jīng)典菌株不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此新菌株的選育成為后期研究的基礎(chǔ)，但大部分產(chǎn)冠菌素菌株為植物病原菌，獲得相對(duì)困難，因此對(duì)于經(jīng)典菌株的誘變選育成為研究熱點(diǎn).[0005]張國(guó)棟、李召虎和吳慧玲等利用紫外和亞硝基胍等物理化學(xué)誘變法提高傳統(tǒng)菌株的冠菌素產(chǎn)量。焦睿利用了 Tn5轉(zhuǎn)座子對(duì)冠菌素產(chǎn)生菌株丁香假單胞菌大豆致病變種(P.syringae.pv.glycinea) PG4180進(jìn)行誘變；Bender等向hRcC基因中加入抗卡那霉素基因，獲得APVl菌種，它可以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)冠菌素的溫度(26°C)要求，并且菌種沒有致病性；吳曉玉等分別以菌株對(duì)萘代謝的溫度敏感性及對(duì)紅霉素抗性為篩選標(biāo)志，依次采用亞硝基胍、5-溴尿嘧啶、紫外線、吖啶橙與紫外線混合等誘變方式，經(jīng)系列推理選育，獲得產(chǎn)冠菌素能力為100μ g/mL的突變菌株，比野生菌株產(chǎn)量提高了 7.3倍。誠(chéng)然，紫外誘變與亞甲基胍結(jié)合誘變使冠菌素產(chǎn)量得到了一定提高，然而也曝露出了工作量大、效率低的問題，這是傳統(tǒng)誘變育種的共同問題，而且無(wú)論如何誘變選育，到目前為止，所獲得的新菌株耐受溫度仍然停留28°C (與野生菌株的冠菌素發(fā)酵極限溫度一致)，因此要獲得適宜工業(yè)應(yīng)用的菌株，篩選耐溫新型冠菌素產(chǎn)生菌株極為必要。
申請(qǐng)人:前期成功篩選到一株桑丁香 假單胞菌株(Pseudomonas syringaeP V.mori)M4-13(CGMCC N0.3621)具有產(chǎn)冠菌素特性，且在高溫(32°C )下檢測(cè)到冠菌素的產(chǎn)生(專利公開號(hào)CN 101948764A)。這表明溫度不僅是冠菌素生物合成關(guān)鍵因素，也是菌株本身生長(zhǎng)關(guān)鍵因子，對(duì)其溫度特征描述、界定與保護(hù)成為這方面技術(shù)所必須部分，但目前未見確定產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長(zhǎng)起始溫度、最適生長(zhǎng)和高溫致死臨界溫度)方法的報(bào)道與專利，而目前已經(jīng)發(fā)表的這方面應(yīng)用論文都沒有考慮到模型參數(shù)在擬合后的顯著性，以及生長(zhǎng)起始溫度、最適生長(zhǎng)和高溫致死臨界溫度獲得的可靠性檢測(cè)，這往往造成擬合獲得的參數(shù)不切合實(shí)際。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題:
針對(duì)以上問題，本發(fā)明的目的是為了便于調(diào)控和優(yōu)化植物生長(zhǎng)物質(zhì)冠菌素的發(fā)酵過(guò)程，提供一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法。通過(guò)此方法，來(lái)描述桑丁香假單胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13 (CGMCC N0.3621)生長(zhǎng)起始溫度、最適生長(zhǎng)和高溫致死臨界溫度。
技術(shù)方案:
一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法，步驟為:
(I)菌株培養(yǎng)
將菌株在LB固體平板上涂布，32°C培養(yǎng)ld，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)1山將菌液稀釋20000倍，再次涂布，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)ld，將菌液轉(zhuǎn)移到含有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶?jī)?nèi)，在14°C 40°C范圍內(nèi)選取不同溫度條件下，搖床280r/min培養(yǎng)。
(2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線
每隔Ih取3mL發(fā)酵液并回注液體培養(yǎng)基3mL，于550nm處分光光度計(jì)法測(cè)定菌液吸光度，繪制菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線，建立菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線。
(3)溫度處理點(diǎn)生長(zhǎng)速率
以菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的斜率m(菌體濃度由分光光度法測(cè)得，λ =
550)，下列公式:
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法，其特征在于步驟為: (1)菌株培養(yǎng): 將保藏號(hào) CGMCC N0.3621 的桑丁香假單胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株在LB固體平板上涂布，32°C培養(yǎng)ld，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)Id,將菌液稀釋20000倍，再次涂布，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中32°C試管培養(yǎng)ld，將菌液轉(zhuǎn)移到含有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶?jī)?nèi)，在14°C 40°C范圍內(nèi)選取不同溫度條件下，搖床280r/min培養(yǎng)； (2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線 每隔Ih取3mL發(fā)酵液并回注液體培養(yǎng)基3mL，于550nm處分光光度計(jì)法測(cè)定菌液吸光度，繪制菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線，建立菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線； (3)溫度處理點(diǎn)生長(zhǎng)速率 以菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的斜率m，菌體濃度由分光光度法測(cè)得，λ =550，由下列公式:
專利摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度的測(cè)定方法，包括(1)菌株培養(yǎng)，(2)構(gòu)建菌體濃度-溫度生長(zhǎng)曲線，(3)溫度處理點(diǎn)生長(zhǎng)速率，(4)溫度速率模型選擇與擬合。溫度是產(chǎn)冠菌素菌株生長(zhǎng)關(guān)鍵因素，也是生產(chǎn)上調(diào)控和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵因素。本發(fā)明提供菌種生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵溫度(生長(zhǎng)起始溫度、最適生長(zhǎng)和高溫致死臨界溫度)的測(cè)定方法，可以穩(wěn)健地提供菌種種群溫度特征，為今后冠菌素菌株選育提供穩(wěn)健可靠的實(shí)用技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GKCN102517370 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110343220
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年11月3日
發(fā)明者王俊, 吳福安, 梁垚, 成杰 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),